NSP1 inhibition effects on Human 40s ribosomes in comparison to intermediate carrier animals

Document Type : Research Paper

Authors
Afagh Bapirzadeh 1
mitra salehi 2
zarrin minuchehr 3
Bijan Bambai 4
1 Islamic Azad University,Tehran branch,Heravy Sq.,South makran St.,P.O. BOX:1651153311
2 Faculty of Islamic Azad University, North Tehran Branch, Department of Biological Sciences, Heravi Square, South Makran St., Postal Code 1651153311
3 Head of Nanotechnology Committee in National Institute of Genetic Engineering & Biotechnology.
4 faculty member of national institute of genetic engineering and biotechnology
Abstract
NSP1 protein is the first produced proteins of SARS-CoV-2, the virus which is responsible for Corona disease, sited at the beginning of 5́ end of virus gene number one. NSP1 bonds to Human 40S ribosomal subunits has potential roles in host cells mRNA translation inhibition.to clarify subtle molecular reasons of carrier animal’s pathogenicity, we used bioinformatics tools and 7k5i file structure acquired from PDB data bank to investigate interactions and internal bonds of 40S ribosomes. Majority of NSP1 interactions involve 18SrRNA ribosomal subunit and one of ribosomal proteins. These bonds are at A605and G600,601 nucleotide positions in 18SrRNA leading to both physically and spatially disrupting existing internal interactions in this subunit which eventually could cause ribosome to lose its function. Additional to 18SrRNA, NSP1 also bonds with three ribosomal proteins: S2, S3 and S30.alignment comparison of these molecules in Human and other mammalian in one hand and between Human and carrier animals such as camel and manis in another hand showed for example camel S2 protein is more like manis instead of being genetically close to human or cows. These crucial findings strongly support important role of NSP1 in translation inhibition of host cells

Keywords

Subjects

مقایسه برهم کنش های ریبوزم 40S انسانی و حیوانات ناقل با پروتئین NSP1 ویروس

SARS-CoV-2

آفاق باپیرزاده ۱و۲، دکتر میترا صالحی۱، دکتر زرین مینوچهر۲ و دکتر بیژن بمبئی۲*

۱ ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال

۲ ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 27/10/1401          تاریخ پذیرش: 15/01/1402

چکیده

پروتئین NSP1 پروتئین تولید شده در ویروس SARS-CoV-2 ،عامل بیماری کرونا، میباشد که جایگاه آن در ابتدای ژن شماره ی یک از انتهای ۵́ ژنوم ویروس است. اتصالات NSP1 با زیرواحدهای 40S ریبوزوم های انسانی، نقش احتمالی این پروتئین در مهار فرآیند ترجمه یmRNAs  سلولهای میزبان را توجیه می کند. با هدف آشکار کردن دلایل مولکولی عدم بیماریزایی این ویروس در حیوانات ناقل، ابزارهای بیوانفورماتیکی و ساختار کمپلکس NSP1 با زیرواحد های 40S ریبوزومی در فایل 7k5I از بانک اطلاعات پروتئین (PDB)، برهمکنش ها و پیوندهای داخلی این زیرواحد هادرحالت طبیعی مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین NSP1 در سلولهای میزبان بطور عمده به زیرواحد 18SrRNAی ریبوزومی و یکی از پروتئین های ریبوزومی اتصال برقرار میکند. اتصالاتی که در موقعیت نوکلئوتیدهایA605 وG600,601 میباشد با تداخل در شکل گیری پیوند های داخلی و همچنین ایجاد ممانعت فضایی در برقراری تعداد دیگری ازاتصالات درون_ریبوزومی ، عامل بسیار مهمی در مهار عملکرد ریبوزوم ها فراهم می آورند. علاوه بر 18SrRNA ،NSP1 در این کمپلکس با سه پروتئین ریبوزومی دیگر به نام های S2,S3,S30 نیز برهمکنش هایی را برقرار می کند. مقایسه توالی های این مولکول ها بین انسان و چند پستاندار دیگر و موجودات ناقل مانند شتر و مورچه خوار نشان داد که مثلا پروتئین S2 شتر از نظر تکاملی به مورچه خوار شبیه تر است در حالیکه از نظر عمومی شتر قرابت ژنتیکی بیشتری با انسان یا گاو دارد. این یافته های کلیدی تایید کننده ی نقش پروتئین NSP1 به عنوان یکی از عوامل اصلی مهار ترجمه توسط ریبوزوم ها در سلولهای میزبان می باشد.

واژه های کلیدی: SARS-CoV-2 ،NSP1 ، Bioinformatics، 40s ribosomal subunits ، Bats ،Manis

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: Bambai2biotech@gmail.com

مقدمه

 

در ماه مارچ سال ۲۰۲۰ طبق اطلاعیه ی سازمان بهداشت جهانی (WHO) به دلیل شیوع گسترده و پاندمیک بیماری ویروسی کرونا حالت فوق العاده ی بهداشتی در جهان اعلام شد (3).

بیماری کرونا حاصل ورود ویروس SARS-CoV-2 از طریق اتصال پروتئین ساختاری Spike یا S به گیرنده ی سطحی ACE2 سلولهای انسانی است (4). ژنوم این ویروس از یک رشته RNA ی با سنس مثبت تشکیل شده است. این ژنوم تولید ۶ ORF یا قالب خوانش باز می کند. پروتئازهای ویروسی شامل پروتئاز اصلی (Mpro )، پروتئاز شبه پاپایین (PLP)و پروتئاز شبه کموتریپسین (3C1pro) ، پلی پروتئین های تولید شده توسط  ORFها را مورد برش قرار میدهند و پروتئین های مورد نیاز ویروس برای تکثیر و بقایش را فراهم می آورند.NSP1 یکی از پروتئین های غیر ساختاری ویروس است (5و6). این پروتئین ۲۰ کیلودالتونی در سیتوپلاسم سلولهای آلوده یافت میشود و طبق بررسیهای Yoshimotoو همکارانش نام دیگر این پروتئینLeader protein  است .یکی از نقش های اصلی این پروتئین مهار بیان ژن های سلول میزبان میباشد کهYoshimoto  و همکارانش احتمال میدهند به دلیل اتصال NSP1 به زیرواحدهای ریبوزومی 40S باشد (7) .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ریبوزوم ها از اندامک های بسیار مهم سلولی هستند که از پروتئین و RNA ساخته شده اند و وظیفه ی سنتز پروتئین ها را برعهده دارند. پروتئینNSP1  برای اعمال عملکردهای متفاوتش در ابتدا نیاز به برقراری اتصال به زیرواحدهای ریبوزومی 40S دارد .اتصال این پروتئین از ویروس کرونا بطور قطع سبب تغییراتی در ساختار ریبوزومی میشود (8). فرض ما در این تحقیق بر این امر استوار بود که اتصالاتی که  NSP1با زیرواحدها و پروتئین های موجود در ساختار ریبوزوم ها برقرار میکند ، اتصالات قبلی را قطع خواهد کرد. برقرارسازی ارتباطات جدید به مفهوم از دست رفتن اتصالات قبلی در کمپلکس ریبوزومی می باشد. پیوندهای جدید مابین NSP1 و اجزای کمپلکس ریبوزومی گاهی با ایجاد ممانعت فضایی از پیوند طبیعی اسیدهای آمینه ی مجاور و یا بازها جلوگیری می کند و یا عمل آنها را تحت الشعاع قرار می دهد.

کرونا ویروس جدید به وسیله ی یکسری موجودات حدواسط ناقل به انسان منتقل شده است. خفاش ها یکی از این موجودات هستند که به احتمال قوی طی فرایند نوترکیبی متوالی این ویروس را ایجاد کرده اند (9). Masked palm civet از دیگر ناقلان و موجودات حد واسط انتقال کرونا به انسان هستند ، این حیوانات از دسته ی همه چیزخوارها یا مورچه خواران میباشند (10). تحقیقات روی خرگوشهای سفید نیوزیلندی ، موش خرما و همستر ها مشخص کرد که این حیوانات نیز از ناقلان بدون علامت عفونت ویروسی ناشی از کرونا هستند ولی مخزن ویروس به حساب نمی آیند (11). توجه به این امر ضروری است که این ناقلان حد واسط حیوانی در اثر مواجه با ویروس SARS-CoV-2 یا اصلا به بیماری کرونا مبتلا نمیشوند و یا مبتلایان بدون علامتی خواهند بود (12). در این مقاله مشخص خواهد شد که برهمکنش های پروتئین NSP1 با اجزای کمپلکس ریبوزوم ۴۰ انسانی در مقایسه با این حد واسط ها یکسان نیست و دچار حذف، اضافه و یا تغییر ماهیت شده است .این امر امکان مطرح کردن این فرضیه را به وجود می اورد که همین تغییرات در محل اتصال پروتئین NSP1 عاملی برای اتصال نیافتن و یا اتصال ضعیف پیدا کردن آن در این حد واسط ها میباشد. این شیوه ی برقراری اتصال توسط پروتئین NSP1 با اجزای ریبوزومی این حیوانات ممکن است یکی از عوامل تاثیرگذار در ناقل بودن آنها و عدم ایجاد بیماری کرونا در این موجودات حد واسط باشد .

جهت راستی آزمایی این نظریه، در این تحقیق ابتدا با بررسی ساختاری پروتئین NSP1 و شناسایی نوع ، تعداد و نحوه ی برهم کنش های آن با ریبوزوم ۴۰ انسانی ، نقاط مهم ایجاد پیوند در آنها شناسایی شد. پس از به دست آوردن نقاط اتصالی با انجام مقایسه ای جامع بین اجزای تشکیل دهنده 40S ریبوزوم انسان و موجودات حد واسط ناقل به بیان دلایل احتمالی عدم وقوع بیماری کرونا در بعضی از حیوانات پرداخته شد .

مواد و روشها

Shi و همکارانش در اواخر دسامبر سال ۲۰۲۰ ، ساختار کریستالوگرافی شده ی پروتئینNSP1 در کمپلکس با ریبوزوم 40S را در دسترس محققان قرار دادند (12). این فایل که تحت عنوان 7K5I در پایگاه اطلاعات داده ی PDB (Protein Data Bank) موجود است ، مبنای تحقیق حال حاضر قرار گرفت. با به کارگیری نرم افزار غیر تجاری PyMOL نسخه ی 2.4.1 به بررسی نحوه ی اتصال پروتئین غیر ساختاری شماره ی یک ویروس کرونا یا NSP1 در ارتباط با ریبوزوم 40S پرداخته شد. پروتئین NSP1 با چهار جز در این کمپلکس اتصالاتی را برقرار کرده است. 18SrRNA یکی از زیرواحدهای ریبوزومی 40S انسانی میباشد که پروتئین NSP1 هم پیوندهایی قطبی و هم غیر قطبی با تعدادی از بازهای آن برقرار کرده است. علاوه بر این زیرواحد ، سه پروتئین ریبوزومی دیگر به نام های S30،S3،S2 نیز با اتصالات قطبی و غیر قطبی خود به پروتئین NSP1 متصل شده اند (جدول ۱).

 با توجه به ارتباطات متعددی که بین پروتئین NSP1 و کمپلکس ریبوزومی 40S برقرار میشود ، انطباق توالی های ریبوزوم انسانی و پروتئین های آن در جانداران حد واسط مشخص شد. .خفاش ها (.Rhinolophus,Myotis) ، مورچه خوارها (Manis pentadactyla,Manis javanica) ، خرگوش بی دم آمریکایی (Ochotona princeps) و شتر (Camelus dromedaries,Camelus ferus) از جمله ی این موجودات حد واسط ناقل هستند. علاوه بر جانداران حد واسط ، گونه های نزدیک انسانی که ساختار ژنومی آنها بسیار مشابه انسان میباشد مانند موش (Mus musculus) ، گاو (Bos taurus) ، انواع گونه های میمون ها (Saimiri و Mandrillus) ، گوریل (Gorilla gorilla) ، شامپانزه (Pan troglodytes ) و قوچ (Ovis aries) نیز در این مقایسه شرکت داده شدند .

برای انجام این مقایسه بین توالی های جانداران ذکر شده ابتدا توالی ها با جست و جو در سایت مرکز اطلاعات ملی بیوتکنولوژی NCBI  (National Center for Biotechnology Information) ، برای تک تک پروتئین ها و نیز 18SrRNA بدست آورده شد .به منظور بررسی ترتیب توالی های به دست آمده با استفاده از سایت Clustal Omega ، مقایسه ی جامع و دست جمعی صورت گرفت. نتایج به دست آمده به طور خلاصه در جداول ۵،۶،۷ و ۸ قابل مشاهده است. اطلاعات در مورد بعضی از پروتئین ها وژنوم بعضی جانداران هنوز بطور کامل در دسترس نیست و دلیل آن عدم انجام توالی یابی بر روی آنها می باشد.

 

جدول ۱.ارتباطات پروتئین NSP1 با کمپلکس ریبوزومی۴۰ انسانی

 

Glu-176

 

Gly-150

 

Thr-151

 

Glu-155

 

Leu-149

 

Glu-159

 

Asn-160

 

Asn-156

 

Asn-152

 

Phe-157

 

Trp-161

 

Met-174

 

Gln-158

 

Asn-178

 

Glu-172

 

Lys-164

 

His-165

 

Ser-167

 

Arg-171

 

Arg-175

 

NSP1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

U-607

G-625*

C-624*

U-631

U-630*

U-607

G-600*

G-601

G-600*

G-601*

U-607

G-606*

A-605*

 

18SrRNA

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Phe-124

Ile-109

Phe-124

Thr-122

Pro-111

 

Val-106

 

Val-147*

Glu-146

Phe-124

Val-106*

 

 

 

 

 

 

S2

 

 

Arg-117*

Leu-113

Arg-117*

 

Val-115

Ala-114

Arg-116

Leu-113

Arg-117

Arg-143

Arg-143

Arg-143

Arg-116*

Arg-117

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

S3

Lys-52*

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Lys-52

S30

 

نتایج

 در جدول ۱، بیشترین ارتباط قطبی پروتئین NSP1 با 18SrRNA ، بزرگترین زیرواحد RNAای ریبوزوم 40S نشان داده شده است. این ارتباط شامل نه پیوند قطبی وچهار پیوند غیر قطبی زیر ۴آنگستروم (4A0) است. پروتئین NSP1 در موقعیت اسیدهای آمینه ی Ser-167,Arg-171,Arg-175 His-165, وLys-164 با بازهای نوکلیوتیدهای 18SrRNA پیوند قطبی برقرار کرده است. از میان این پیوندها Arg-175 با G606 و A605 ،Arg-171 با G600، G601 و U607 پیوندهایی تماما قطبی داشت.

برخلاف آن ، اسید های آمینه ی Ser-167 ، His-165 وLys-164 هم پیوندهایی قطبی و هم غیر قطبی با نوکلئوتیدهای 18SrRNA دارند. Ser-167با باز G600 پیوندی قطبی ولی با بازG601 پیوندی غیر قطبی برقرار کرده بود. His-165نیز پیوندی قطبی با U630 ، اما با U607 پیوندش غیر قطبی بود. در مورد Lys-164 همانطور که در جدول ۱ مشخص شده است سه پیوند برقرار میکند که G625 وC624 پیوندهای قطبی ان و U631 پیوند غیر قطبی اش است.Glu-172 نیز تنها یک پیوند غیرقطبی با باز U607 دارد.(شکل ۱).

 

 

شکل ۱.پیوندهای پروتئین NSP1(قرمز رنگ) با 18SrRNA(فیروزه ای رنگ) ریبوزوم ۴۰ انسانی

 

شکل۲.پیوندهای پروتئین  NSP1 (قرمز رنگ) و پروتئین  S30(آبی رنگ) ریبوزوم ۴۰ انسانی

از بین پروتئین هایی که در سیستم ترجمه ی ریبوزومی به زیرواحد های 40S کمک میکنند و پروتئین NSP1 برای اعمال عملکرد خود به آنها اتصال میابد میتوان به سه پروتئین S2 ،S3  و S30 اشاره کرد. همانند ارتباط NSP1 با 18SrRNA در اینجا هم بین اسیدهای آمینه ی پروتئین  NSP1با پروتئین های گفته شده پیوندهایی قطبی و غیر قطبی شکل میگیرد. از میان این سه پروتئین ریبوزومی ، پروتئین S30 کمترین ارتباط را در قالب یک پیوند قطبی ویک پیوند غیر قطبی داشت. اسید آمینه ی لیزین ۵۲ از پروتئین S30 با اسیدآمینه ی Glu-176 یک پیوند قطبی و با Arg-175 یک پیوند غیر قطبی برقرار کرد که عامل اتصالش به NSP1 شده است (شکل ۲ ).

 پروتئین S3 برخلاف پروتئین S30 بیشترین ارتباط را با NSP1 داشت . Arg117 از S3 دو پیوند قطبی با Thr-151وGly-150 و چندین پیوند غیر قطبی با Asp-152 ،Leu-149،Gly-150 و Thr-151 از پروتئین NSP1 برقرار می کرد. Arg143 نیز مانند Arg117 با سه اسید آمینه ی NSP1 ، Asp-156، Asn-160 و Glu-159پیوند داشت.

Arg116 از S3 در موقعیت اسیدآمینه Asp-152 هم پیوند قطبی و هم غیر قطبی دارد و با اسید آمینه های Glu-155 نیز یک پیوند غیر قطبی داشت.

شکل ۳.پیوندهای پروتئین NSP1 (قرمز رنگ) و پروتئین S3 ( سبز رنگ) ریبوزوم ۴۰  انسانی

شکل۴.پیوندهای پروتئین  NSP1(قرمز رنگ) و پروتئین S2 (بنفش رنگ) ریبوزوم ۴۰ انسانی

از دیگر اسیدآمینه های درگیر در اتصال به  NSP1،Leu113 بود که با اتصال غیر قطبی به اسید آمینه ی Leu-149 و Gly-150 متصل میشد. از NSP1 اسید آمینه ی Glu-155 علاوه بر Arg116 با Ala114 و Val115 پیوند غیر قطبی داشت (شکل ۳ ) .

آخرین پروتئین مورد بحث ما پروتئین S2 از کمپلکس ریبوزومی 40S بود.NSP1 در دو اسید آمینه ی Asn-178 و Gln-158 با به ترتیب Val106 و Val147 پیوند قطبی برقرار کرد. این دو پیوند تنها پیوندهای قطبی این پروتئین با پروتئین NSP1 بود و بقیه ی پیوندهای آن غیر قطبی بودند. Gln-158 در سه موقعیت Glu146 ،Val147 و Phe124 پیوند غیر قطبی داده بود. Trp-161 از پروتئین NSP1 با Phe124 ،Thr122 و Pro111 ارتباطی غیر قطبی داشت. Phe-157هم با Phe124 وIle109 از پروتئین S2 اتصالی غیر قطبی برقرار کرد. علاوه بر Asn-178˛Met-174 نیز یک پیوند غیر قطبی با Val106 از پروتئین  NSP1داشت (شکل ۴) .

مرحله ی بعدی در بررسی ارتباط NSP1 با کمپلکس ریبوزومی انطباق پذیری 18SrRNA ی ریبوزومی و پروتئین های وابسته به آن در انسان و جانداران حد واسط ناقل است. یکی از مهمترین تفاوتهای چشمگیر محل اتصال پروتئین NSP1 با ریبوزوم های انسانی در مقایسه با خصوصا شتر ، خفاش و مورچه خوار در پروتئین S2 مشهود است. در توالی پروتئین S2 ای که مختص شتر می باشد (Camelus dromedaries) و در جدول ۲ قرار دارد ، حذف قطعه ی بزرگی مشاهده شد که از اسید آمینه ی ۴۸ شروع شده و تا اسید آمینه ی شماره ی ۸۰ ادامه یافته است. در بین این اسید آمینه های حذفی دو اسید آمینه ی گلوتامات- ۱۴۶ و والین-۱۴۷قرار داشتند که محل اتصال پروتئین NSP1 به پروتئین S2 ریبوزوم انسانی بودند. این حذف در توالی مشابه پروتئین S2 ریبوزوم های انسانی وجود نداشت. دو تفاوت شاخص بعدی در موقعیت اسید آمینه های شماره ی ۳۴ و ۳۷ توالی پروتئین S2 ریبوزوم های شتر مشاهده گردید ، که به جای اسید آمینه های آرژنین و فنیل آلانین ˛ به ترتیب گلوتامین و لوسین جایگزین شده اند. قابل ذکر است که شتر یکی از حد واسط های ناقل ویروس SARS-CoV-2 میباشد که مبتلا به کرونا نمیشود. پروتئین S2 از ایزوفرم X1 نوعی میمون (Mandrillus leucophaeus) نیز به جای ایزولوسین موقعیت ۱۰۹ پروتئین S2 ریبوزوم انسانی ، ترئونین داشت (جدول ۲ ).

پروتئین ریبوزومی S3 نیز همانند پروتئین S2 تفاوتهایی را مابین توالی انسانی و حدواسط ها از خود بروز داد. بطور مثال یک قطعه ی حذف شده ۱۲۶ اسید آمینه ا ی در ابتدای این پروتئین وجود داشت که در  ایزوفرم هایX3 وX2  از Manis pentadactyla  و Manis jvanica مشاهده شد این حذف عامل یک تفاوت بزرگ در اندازه ی پروتئین بود. در کنار این امر در این ناحیه ی حذف شده پنج نقطه ی اتصال پروتئین NSP1 ، شامل لوسین-۱۱۳، آلانین-۱۱۴، والین -۱۱۵، آرژنین -۱۱۶ و آرژنین-۱۱۷ نیز واقع شده بود که مورد حذف قرار گرفته بودند (جدول ۳ ).

در مورد انطباق توالی بین توالی ژنومی 18SrRNA از ریبوزوم ۴۰ انسانی ، تفاوت شاخصی در بررسی ها حاصل نشد و در تمامی جانداران مورد بررسی نقاط اتصال به پروتئین NSP1 وجود داشت. این امر در مورد پروتئین S30  نیز به همین منوال بود. نکته ی بسیار مهم در مورد پروتئین S30 این بود که این پروتئین در ریبوزوم های انسانی تنها ۵۹ اسید آمینه داشت در حالی که جانداران دیگر توالی های طولانی تری از این پروتئین را داشتند.

مرحله ی بعدی بررسی ارتباط نقاط پیوندی موجود در جدول ۱ ، در حالت طبیعی سلول بود که سیستم ترجمه ای در حال ترجمه ی  mRNAمیباشد.با بررسی فایل 5VYC از سایت pdb که توسط Lomakin و همکارانش در سال ۲۰۱۷ منتشر شد (11)، کمپلکس ریبوزومی ۴۰ انسانی در حال ترجمه یک mRNA بدست آمد. این کمپلکس نشان دهنده ی پیوند درونی اکثر این نقاط با دیگر بازهای ریبوزومی بود. اگر چه در موقعیتهایA-605  و U-607 و G-625 از زیرواحد 18S ریبوزومی با اسیدهای آمینه ی Lys22 از پروتئینS9 ، Arg143 از پروتئین S3 و Asn63 از پروتئینS23  به ترتیب توسط NSP1 در سلولهای آلوده به ویروس قطع میگردند (جدول ۴ ).

 

 

جدول ۲ .انطباق توالی پروتئین ریبوزومیS2

 

Human S2 ribosomal protein

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Camelus dromedarius

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQQTRLKAFVATGDDKG-----------------

Camelus bactrianus

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Mus musculus

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Bos taurus

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Manis pentadactyla

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Manis javanica

LKDDVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGHYNGHVGLGX—SKEVATAIR

Myotis brandtii

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Ochotona princeps

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Gorilla gorilla

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Mandrillus leucophaeus isoform X1

LKDEVLKIMTVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Mandrillus leucophaeus

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Pan paniscus

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Rhinolophus ferrumequinm

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Saimiri boliviensis

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKEFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

Ovis aries

LKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIADYNGHVGLGVKCSKEVATAIR

جدول ۳.انطباق توالی پروتئین ریبوزومی S3

 

Human S3 ribosomal protein

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Camelus dromedarius

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Mus musculus

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Bos taurus

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Manis pentadactyla isoform X1

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Manis pentadactyla isoform X2

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Manis pentadactyla isoform X3

--------------------------MESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Manis javanica isoform X1

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Manis javanica isoform X2

--------------------------MESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Myotis brandtii

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Ochotona princeps

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Gorilla gorilla

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Pan troglodytes

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Rhinolophus ferrumequinum

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Saimiri boliviensis

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

Ovis aries

QAESLRYKLLGGLAVRRACYGVLRFIMESGAKGCEVVVSGKLRGQRAKSMKFVDGLMIHS

 

جدول ۴.مقایسه نقاط پیوندی  18SrRNA در حضور ویروس و در شرایط طبیعی سلول

Interaction points between NSp1 and 18SrRNA in the presence of coronavirus

Interaction points of 18SrRNA in normal cell conditions

G-600

C-622/U-630

G-601

G-6/C-621

A-604

C-603/C-639

A-605

C-603/C-638/G-598/Lys-22(Protein S9)

G-606

NON

U-607

Arg-143(Protein S3)

C-624

G-623/G-617/U-631

G-625

Asn-63(Protein S23)/C-615/G-617

U-630

G-600

U-631

G-623/A-629/C-624

 

 

 

شکل ۵.پیوندهای داخلی پروتئین S2 در شرایط طبیعی-اسیدهای آمینه مشخص شده به رنگ صورتی در ارتباط با NSP1 نقش دارند و اسیدهای آمینه ی بنفش رنگ در عدم حضور NSP1 به صورت داخل پروتئینی با آنها اتصال برقرار میکنند.

 

شکل ۶.پیوندهای داخلی پروتئین S3 در شرایط طبیعی-اسید های آمینه ی مشخص شده به رنگ صورتی در ارتباط با NSP1 نقش دارند و اسیدهای آمینه ی بنفش رنگ در عدم حضور NSP1 به صورت داخل پروتئینی با آنها اتصال برقرار میکنند.

 

در شکل ۵ نقاط پیوندی Phe124 و Glu146 و Val147 نشان داده شده است که در پروتئین S2 توسط پروتئین NSP1 قطع شده و با چهار اسید آمینه ی دیگر ˛ Ser144˛Thr149 ˛ Ala150 وIle151 به ترتیب در حالتی که سلول در شرایط طبیعی است پیوند قطبی تشکیل داده است (شکل ۵).

در شکل ۶ به بررسی پیوند S3 با پروتئین NSP1 پرداخته شده است. Arg116 از این پروتئین که با چندین اسید آمینه ی پروتئین NSP1 در ارتباط بود ، در حالت عادی با Cys119 یک پیوند قطبی برقرار کرده است (شکل ۶).

در رابطه با بقیه ی پروتئین های متصل شونده به پروتئین NSP1 در کمپلکس ریبوزومی مورد خاصی از اتصال در فایل 5VYC مشاهده نشد. دلیل این امرکمبود اطلاعات کریستالوگرافی میباشد و به همین دلیل ارتباط این اسید های آمینه با اجزای دیگر در کمپلکس ۴۰ ریبوزوم انسانی را نمیتوان  بطور کامل و قطعی رد کرد.

بحث

کرونا ویروسها (CoVs ) ، باعث ایجاد انواع بیماریها از جمله بیماریهای تنفسی ، روده ،کلیه ،مغز و اعصاب در انسان و حیوانات میشوند (2).در این تحقیق به بررسی بیوانفورماتیکی نقش پروتئین NSP1 برعملکرد ویروس کرونا پرداخته شد.سیستم ریبوزومی بخاطر ترجمه mRNAs موجب بقا، رشد و تکثیر سلول ها میگردد. ویروس SARS-COV2 با جلوگیری از ترجمه mRNAs  سلول میزبان و ترجمه mRNAs ویروس موجب مرگ سلول میزبان و رها شدن تعداد زیادی ویروس به فضای میان بافتی و آلوده کردن سلول های بیشتری میگردد (13). پروتئین NSP1 که یک پروتئین غیر ساختاری ویروس با 180 اسید آمینه است، مسئول مهار ترجمه mRNAs سلول میزبان می باشد (14). با توجه به مطالعات کریستالوگرافی، انتهای کربوکسیلیک این پروتئین به دهانه زیرواحد 40S ریبوزوم می چسبد و مانع ورود mRNAs سلولی و در نتیجه ترجمه آن می شود (15). ما با بررسی برهم کنش های مولکولی این پروتئین با اجزای تشکیل دهنده زیر واحد 40S نقاط اتصال را شناسایی نمودیم. این اجزا عبارت بودند از 18S rRNA و پروتئین های S2 ، S3، و  S30. برای مثال اتصالات بین توالی 5’ مولکول های mRNA و توالی های 18S RNA نقش مهمی در تنظیم ترجمه این مولکول ها بازی میکنند. بنابر این در گام بعدی توالی مولکولهای فوق در نرم افزار Clustal Omega با همان مولکول ها اما در گونه های دیگر بویژه موجودات ناقل مانند خفاش و مورچه خوار و همچنین شتر (در بیماری SARS-CoV با منشا عربستان شتر بعنوان ناقل معرفی شده بود) مقایسه شدند (16و17).در سالهای اخیر خفاش ها به طور فزاینده ای به عنوان مخازن بالقوه برای این ویروسها و پایدار شدن عفونتهای ناشی از آنها شناخته شده اند (1). نتایج مقایسه توالی ها نشان داد که موجودات ناقل در توالی های فوق با موجوداتی که بیمار می شوند ، دارای تفاوت های مشخصی هستند. برای مثال پروتئین S2 در شتر و مورچه خواردارای تغییرات جهشی و یا حتی حذف قسمتی از توالی هستند. این امر میتواند دلیل ناقل بودن این موجودات مانند شتر را نشان دهد. رسم نمودار قرابت تکاملی بین مولکولهای مختلف نشان داد که پروتئین S2 شتر به مورچه خوار نزدیک تر می باشد تا گاو و یا انسان. از طرف دیگر مطالعات  Yuan-Qin Minو همکاران (9) که توالی NSP1 مختلف را مقایسه نموده اند ، نشان دادند که اسید آمینه های کلیدی مانند آرژنین های 171 و 175 دربعضی از گونه های دیگر کروناویروس ها مانند MERS-CoV تغییر یافته اند. اسید آمینه آرژنتین 175 همزمان به لیزین 52 از پروتئین S30 و همچنین آدنین 605 و گوانین 606 از مولکول 18S rRNAاتصال برقرار کرده است ، بنابراین این اسید آمینه نقش کلیدی در اتصال NSP1 به کمپلکس ریبوزومی بازی می کند. موتاسیون جایگاه 175 در NSP1 می تواند تفاوت مرگ و میر بالای SARS-CoV-2 در مقایسه با بیماریزایی MERS-CoV را بخوبی توجیه نمایید و نتایج بررسی ارتباطات این نقاط پیوندی در حالت طبیعی ترجمه توسط کمپلکس ریبوزومی ۴۰ انسانی گویای این واقعیت است که اتصال با پروتئین NSP1  مانع برهم کنش های طبیعی میشود.

نتایج حاضر راه را برای طراحی موتان های خاصی از NSP1 بعنوان یک دارو و یا حتی یک واکسن باز می کند (18و 19 و 20).

نتیجه گیری

پروتئین NSP1 از ویروس SARS-CoV-2 قادر است با اتصال به زیرواحدهای ریبوزومی سلول میزبان در پروتئین های S2 ، S3 و S30 و نیز 18SrRNA ، سبب برهم زدن اتصالات طبیعی این پروتئین ها شود و همین امر اختلالاتی را در عملکرد ترجمه ای سیستم ریبوزومی سلول میزبان بوجود می آورد.هنوز اطلاعات کافی در مورد اینکه چگونه سیستم ریبوزومی به صورت انتخابی تنها mRNA های ویروسی را ترجمه میکند اما از ترجمه ی mRNA های سلول میزبان جلوگیری به عمل می آورد ،در دسترس نیست ،اما بر طبق اطلاعات بدست آمده در این تحقیق ،این پروتئین به طور مشخصی بسیاری از اتصالات داخل پروتئینی زیرواحدهای ریبوزومی را هدف قرار میدهد و همین امر میتواند در کارکرد طبیعی آنها مداخله ایجاد کند.در توالی های مورد بررسی در حیوانات ناقل حد واسط بسیاری از این نقاط اتصالی مربوط به NSP1 در سیستم ترجمه ای میزبان وجود ندارند ( احتمالا دچار حذف تکاملی شده اند ) و همین امر میتواند توضیح دهنده ی تفاوتهایی باشد که در شدت ابتلا و مرگ و میر ویروس SARS-CoV-2 در میان آنها در مقایسه با موجودات دیگری مثل انسان وجود دارد.

1.     پوی و همکاران،  بررسی مهارپذیری متابولیت های ثانویه گیاهی در مقایسه با داروهای شیمیایی بر روی پروتئاز اصلی Mpro و Spike گلیکوپروتئین ویروس SARS-CoV-2 (nCov-19) به روش داکینگ مولکولی. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی, 2020. 33(4): p. 484-498.
2.     خالدی و همکاران، مروری بر فیلوژنتیک و سیتوپاتوژنز فیلوویروس‌ها، رتروویروس‌ها و کرونا ویروس‌های منتقل شونده از خفاش به انسان. پژوهش‌های سلولی و مولکولی(مجله زیست شناسی ایران), 2022. 35(3): p. 415-424.
 
3.     Abdi, M., Coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak in Iran: Actions and problems. Infection Control & Hospital Epidemiology, 2020. 41(6): p. 754-755.
4.     Artika, I.M., A.K. Dewantari, and A. Wiyatno, Molecular biology of coronaviruses: current knowledge. Heliyon, 2020. 6(8): p. e04743.
5.     Connor, R.F. and R.L. Roper, Unique SARS-CoV protein nsp1: bioinformatics, biochemistry and potential effects on virulence. Trends in microbiology, 2007. 15(2): p. 51-53.
6.     Dhama, K., et al., Coronavirus Disease 2019–COVID-19. Clinical Microbiology Reviews, 2020. 33(4): p. e00028-20.
7.     El-Sayed, A. and M. Kamel, Coronaviruses in humans and animals: the role of bats in viral evolution. Environmental Science and Pollution Research, 2021. 28(16): p. 19589-19600.
8.     Lomakin, I.B., et al., Crystal structure of the human ribosome in complex with DENR-MCT-1. Cell reports, 2017. 20(3): p. 521-528.
9.     Min, Y.-Q., et al., SARS-CoV-2 nsp1: bioinformatics, potential structural and functional features, and implications for drug/vaccine designs. Frontiers in microbiology, 2020. 11: p. 587317.
10.  Mykytyn, A.Z., et al., Susceptibility of rabbits to SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections, 2021. 10(1): p. 1-7.
11.  Narayanan, K., et al., Coronavirus nonstructural protein 1: Common and distinct functions in the regulation of host and viral gene expression. Virus research, 2015. 202: p. 89-100.
12.  Preziuso, S., Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) exhibits high predicted binding affinity to ACE2 from lagomorphs (rabbits and pikas). Animals, 2020. 10(9): p. 1460.
13.  Schubert, K., et al., SARS-CoV-2 Nsp1 binds the ribosomal mRNA channel to inhibit translation. Nature structural & molecular biology, 2020. 27(10): p. 959-966.
14.  Semper, C., N. Watanabe, and A. Savchenko, Structural characterization of nonstructural protein 1 from SARS-CoV-2. IScience, 2021. 24(1): p. 101903.
15.  Yoshimoto, F.K., The proteins of severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS CoV-2 or n-COV19), the cause of COVID-19. The protein journal, 2020. 39(3): p. 198-216.
16.  Zhao, J., W. Cui, and B.-p. Tian, The potential intermediate hosts for SARS-CoV-2. Frontiers in microbiology, 2020. 11: p. 580137.
17.  Zhou, P., et al., A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. nature, 2020. 579(7798): p. 270-273.
18.  Butt, M.H., et al., Appraisal for the Potential of Viral and Nonviral Vectors in Gene Therapy: A Review. Genes (Basel), 2022. 13(8).
19.  Deng, S., et al., Viral Vector Vaccine Development and Application during the COVID-19 Pandemic. Microorganisms, 2022. 10(7).
20.  Yuan, Y., et al., Advances of mRNA vaccine in tumor: a maze of opportunities and challenges. Biomarker Research, 2023. 11(1): p. 6.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 37, Issue 4
Winter 2025
Pages 419-434

  • Receive Date 17 January 2023
  • Revise Date 03 February 2023
  • Accept Date 04 April 2023