نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

چکیده

مطالعات نشان داده است که متیلاسیون نابه جای ژنهای سرکوبگرتومور باعث خاموش شدن آنها و درنتیجه کاهش بیان آنها شده و زمینه برای ایجاد سرطان مهیا می شود. هدف از این مطالعه، بررسی متیلاسیون سه ژن سرکوبگرتومورp14,p15و p16 در مبتلایان به سرطان بافت سنگفرشی مری (ESCC) و ارتباط آن با خصوصیات دموگرافی و پاتولوژیکی بیماران می باشد. به این منظور از 44نفر بیمار ESCC غیرخویشاوند، 44عدد نمونه بافت توموری و 19عدد نمونه سالم(مجاور تومور)تهیه و مورد استخراجDNA وRNAقرار گرفت. سپس باپرایمر اختصاصی حالتهای متیله وغیرمتیله این ژنها،واکنش زنجیره ای پلیمراز ویژه متیلاسیون(MSPCR)انجام شد. بیان این ژنها نیزباRT-PCRبررسی گردید. نتایج نشان داد درمیان نمونه های توموری، درصد متیلاسیون برای ژنهایp14،p15وP16 به ترتیب عبارتست از 53%،9%و27% و در هیچ یک از نمونه های نرمال(مجاور تومور)متیلاسیونی مشاهده نشدونیزمیزان بیان این ژنها با میزان متیلاسیون نسبت عکس داشت(p<0.05). فراوانی متیلاسیون پروموتر ژنهای p15وp14در نمونه های توموری SCCE به ترتیب 41%، 9% وفراوانی وجود متیلاسیون همزمان در ژنهای p15+p16 و p14+p15 به ترتیب 6/13% و 5/4% بود درحالیکه فراوانی متیلاسیون در ژن های p14+p16، 9% مشاهده شد (P=0.0036).بدین معنا که در تمامی بیماران متیله برای ژن p14،متیلاسیون p16 مشاهده شداما در بیشتر بیمارانی کهp15متیله بود، ژن های p14ویا p16 متیلاسیون نشان نداد.مقایسه این نتایج با سایر یافته های مشابه در جهان،نشان میدهد وضعیت متیلاسیون ژن های p15،p14،p16در جمعیت ایرانی مورد بررسی ‌در محدوده گزارشاتی از شمال چین قرار دارد. بعبارتی احتمالاً مکانیسم‌های مولکولی و عوامل اتیولوژیک مشابهی میتوانند در بروز سرطان ESCC در این دو جمعیت (ایران و چین) نقش داشته باشند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Investigation of the aberrant DNA methylation of p14, p15, p16 genes in patients with ESCC in Iran

نویسندگان [English]

  • shahla Mohammad Ganji
  • Sadaf mahboudi
  • Ferdous rastgar-Jazii

چکیده [English]

Studies have shown that aberrant methylation of the tumor suppressor genes could be lead to silencing and reducing of their gene expression, consequently occurring the cancer.The aim of this study was investigation of the aberrantDNAmethylation of p14,p15,p16 genes in Iranian patients with Esophageal Squamous cell carcinoma(ESCC) and its association with demographic and pathological characteristics. Therefore we extracted the DNAs and RNAs of44 tumor tissues and 19 normal tissues from 44 unrelated Iranian patients with ESCC. The methylation specific PCR(MSPCR)was performed for both methylated and unmethylated status of these genes and the expression of these genes have done with RT-PCR.The results showed the 53%,9% and 27% methylation for the p14,p15 and P16 genes respectively in the tumor tissues and no methylation frequency in none of the normal sample. Regarding the gene expression, there was an inverse relationship between methylation status and gene expression(p<0.05).The frequency of methylation of p15 and p14 in tumor samples was 41%,9% respectively and abundance of methylation the p15+p16 and p14+p15, was 6/13%, and 5/4%, respectively, while the frequency of methylation in p14+p16 genes was observed 9% (P = 0.0036). It means that all patients which are methylated for the p14 had the methylation in p16 too while in most patients with p15 methylated, the p14 or p16 methylation was not found. Comparing these results with other reports shows a similarity between the Iranian population and Chinese population (North of China) maybe because of a similar molecular mechanisms and etiology of ESCC cancer in these populations.

کلیدواژه‌ها [English]

  • methylation
  • p14
  • p15
  • p16
  • Esophageal Squamous cell carcinoma(ESCC)

متیلاسیون پروموتر ژنهای p14, p15 و p16 در مبتلایان ایرانی سرطان بافت سنگفرشی مری

شهلا محمدگنجی*، صدف مهبودی و فردوس رستگار جزی

تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 27/8/92                تاریخ پذیرش: 16/1/93 

چکیده

مطالعات نشان داده است که متیلاسیون نابه جای ژنهای سرکوبگرتومور باعث خاموش شدن آنها و درنتیجه کاهش بیان آنها شده و زمینه برای ایجاد سرطان مهیا می شود. هدف از این مطالعه، بررسی متیلاسیون سه ژن سرکوبگرتومور p15، p14 و p16 در مبتلایان به سرطان بافت سنگفرشی مری (ESCC) و ارتباط آن با خصوصیات دموگرافی و پاتولوژیکی بیماران می باشد. به این منظور از 44نفر بیمار ESCC غیرخویشاوند، 44عدد نمونه بافت توموری و 19عدد نمونه سالم (مجاور تومور)تهیه و مورد استخراج DNA وRNA قرار گرفت. سپس باپرایمر اختصاصی حالتهای متیله وغیرمتیله این ژنها، واکنش زنجیره ای پلیمراز ویژه متیلاسیون(MSPCR) انجام شد. بیان این ژنها نیزباRT-PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد درمیان نمونه های توموری، درصد متیلاسیون برای ژنهای p14، p15 و p16 به ترتیب عبارتست از 53، 9 و 27 درصد و در هیچ یک از نمونه های نرمال (مجاور تومور) متیلاسیونی مشاهده نشد و نیز میزان بیان این ژنها با میزان متیلاسیون نسبت عکس داشت (p<0.05). فراوانی متیلاسیون پروموتر ژنهای p15 و p14 در نمونه های توموری SCCE به ترتیب 41، 9 درصد و فراوانی وجود متیلاسیون همزمان در ژنهای p15+p16 و p14+p15 به ترتیب 6/13 و 5/4 درصد بود در حالی که فراوانی متیلاسیون در ژنهای p14+p16، 9% مشاهده شد (P=0.0036). بدین معنا که در تمامی بیماران متیله برای ژن p14، متیلاسیون p16 مشاهده شد اما در بیشتر بیمارانی کهp15 متیله بود، ژنهای p14 و یا p16 متیلاسیون نشان نداد. مقایسه این نتایج با سایر یافته های مشابه در جهان، نشان می دهد وضعیت متیلاسیون ژنهای p15، p14 و p16 در جمعیت ایرانی مورد بررسی ‌در محدوده گزارشاتی از شمال چین قرار دارد. به عبارتی احتمالاً مکانیسمهای مولکولی و عوامل اتیولوژیک مشابهی می توانند در بروز سرطان ESCC در این دو جمعیت (ایران و چین) نقش داشته باشند.

واژه های کلیدی: متیلاسیون، ژنهای p14، p15، P16، سرطان بافت سنگفرشی مری

* نویسنده مسئول، تلفن: 44787466-021 پست الکترونیکی: shahlamg@yahoo.com

مقدمه  

 

بیماری سرطان دومین عامل مرگ و میر بعد از بیماریهای قلبی و عروقی در کشور های صنعتی و کشورهای در حال توسعه می باشد. از بین انواع سرطان، سرطان مری با رتبه ششم مرگ و میر در بین انواع سرطانها در دنیا، شیوع بالایی دارد بنابراین امروزه توجه زیادی معطوف تشخیص و درمان این بیماری شده است. در ایران نیز سرطان مری یکی از شایع ترین سرطانها است و بالاترین شیوع آن در نواحی شمال و شمال شرقی کشور که جزء ناحیه کمربند سرطانی دنیا است، مشاهده می شود. بر اساس گزارش منتشر شده توسط انستیتو سرطان ایران، 9 درصد کل سرطانها و 27 درصد سرطانهای معده ای- روده ای مربوط به کارسینومای مری است (7) و از هر 100 مرگ حاصل از سرطان، 6 مورد مربوط به سرطان مری می باشد. در مراحل اولیه که تومور رشد کندی دارد، بیمار معمولاً فاقد نشانه می باشد با این وجود زمانی که نیمی از محیط مری به وسیله تومور اشغال شود، dysphagia یا عدم توانایی بلع رخ می دهد که یکی از متداول ترین نشانه های سرطان بافت سنگفرشی مری می باشد. نحوه درمان ESCC به مرحله بیماری بستگی دارد. در مراحل اولیه بیماری، نواحی آسیب دیده توسط جراحی برداشته می شود و در صورتی که نواحی میان سینه درگیر شده باشد، کل مری برداشته می شود. درمان با جراحی در مراحل اولیه بیماری مفید است اما پس از انتشار نئوپلاسم به بخش زیر مخاطی، رشد تومور سریع بوده و به گره های لنفاوی، کبد، شش و استخوان متاستاز می دهد (1).

از جمله فرآیندهای مولکولی سرطان متیلاسیون دی نوکلئوتید CpG است که در تمام انواع سرطانها متداول می باشد. امروزه فرآیند هایپرمتیلاسیون پروموتر، افقهای نوینی را در جهت دستیابی به مارکرهای مولکولی سرطان گشوده است. تقریباً 90- 60 درصد از دی نوکلئوتیدهای CpG ژنوم پستانداران متیله است با این وجود عمده CpGهای غیر متیله در توالیهای غنی از CpG (جزایر CpG) که در ناحیه پروموتر ژنها قرار دارند متمرکز شده اند (18). در شرایط طبیعی، جزایر CpG که پروموتر و جایگاه آغاز رونویسی را در بر می گیرند غیر متیله اند (به جز ژنهای Imprint و ژنهای موجود بر روی کروموزم x غیر فعال) و در صورتی که این ناحیه هایپرمتیله شود بیان ژن متوقف می شود(5). البته این در حالی است که الگوی متیلاسیون ژنومی در سلولهای سوماتیک، پایدار و قابل توارث می باشد. تغییر الگوی متیلاسیون در بسیاری از انواع سرطانها رخ می دهد که باعث مهار بیان ژنها و ناپایداری کل ژنوم می گردد (3). ثابت بودن موقعیت متیلاسیون نابه هنجار در ژنهای هدف (یعنی جزایر CpG)، تشخیص وجود آن را نسبت به جهشهای متعدد، آسان تر می­کند. موقعیت جهشهایی از این دست در ژن ممکن است حتی برای یک نوع خاص تومور از یک بیمار به بیمار دیگر متفاوت باشد اما برای هر ژن می توان با یک تست تشخیصی نابهنجاری متیلاسیون پروموتر را بررسی کرد. یکی از کاربردهای متیلاسیون به عنوان مارکر توموری این است که جزایر CpG ناحیه پروموتر ژنها در سلول های نرمال متیله نمی شود بنابراین مشاهده ناحیه هایپرمتیله، سیگنالی مثبت دال بر وجود نابه هنجاری می باشد (9). مزیت دیگر استفاده از هایپرمتیلاسیون جزایر CpG به عنوان مارکر توموری، وجود روشهای بسیار حساس نظیر Methylation Specific PCR برای شناسایی توالیهای متیله بوده که می تواند مقادیر جزیی از DNA متیله را آشکار سازد (5).

در این پروژه، متیلاسیون پروموتر ژنهای p14 و p15 و P16 در بیماران مبتلا به سرطان بافت سنگفرشی مری مورد بررسی قرار گرفت. این ژنها در واقع، ژنهای سرکوبگر تومور هستند که محصول آنها پروتئینهای مهاری اختصاصی می باشد. این پروتئینهای مهاری اعضای خانواده INK بوده که به ترتیب به صورت p15INK4b, p16INK4a, p14INK4c نام گذاری شده و باعث مهار اینترکشن سیکلینها با cdks می شوند.

ژنهای P14 و  p16که به صورت CDKN2A نیز نشان داده می شوند در کنار ژن p15 (CDKN2B ) و بر روی کروموزوم 9p21 انسان قرار دارد. ژن p15 در کنار CDKN2A و در منطقه ای قرار دارد که اغلب اوقات و در طیف وسیعی از تومورها دچار موتاسیون یا حذف می شود. این ژن مهار کننده، CDK ای را کد می کند که با تشکیل کمپلکس با CDK4 یا CDK6، از فعال شدن کینازهای CDK جلوگیری می کند. بنابراین پروتئینی را کد می کند که به عنوان تنظیم کننده رشد سلول، پیشروی مرحله  G1 چرخه سلولی را کنترل می کند. بیان این ژن تحت تأثیر TGF beta قرار دارد و پیشنهاد شده است که نقش مهاری در القاء رشد TGF beta دارد.

حاصل رونویسی از ژن p16، چند رونوشت متفاوت است که تفاوت این رونوشتها در اگزون اولشان می باشد. Kamb در 1994 نشان داد ژن CDKN2A واجد سه اگزون E1، E2 و E3   می باشد (شکل 1). طول اگزونهای یک، دو و سه به ترتیب 125bp،  307bpو 12bp می باشد(13 و 14). مطالعاتQuelle  نشان داد اگزون E1 شامل بخشهای آلفا و بتا است و نقش اگزون آلفا، کد کردن رونوشت p16(INK4a) می باشد که سبب القاء اتمام رشد در فیبروبلاست پستانداران می گردد(20 و 21). محصول ترجمه ژن CDKN2A، حداقل سه واریانت مشخص پروتئینها است که یکی از آنها (p16) بوده که از نظر ساختمانی و عملکردی، ایزوفرمهای مهار کننده کینازی CDK4 است. P16 در فسفریلاسیون رتینوبلاستوما نقش دارد و در کنترل رشد با مهار CDK4 و CDK6 در ارتباط است. کاهش بیان p16 با بسیاری از سرطانهای انسانی، از جمله گلیوما، سرطانهای مری و معده ارتباط دارد (11). آنالیز بیان مولکول  p16می تواند در پیشگویی رفتار تومورهای astrocytic جهت درمان بسیار مفید باشد (24).   

 

شکل 1- کروموزوم 9 و لکوسهای مربوط به p14، p16، p15 (14)

بدین منظور در این پروژه تحقیقاتی، به بررسی مارکرهای چندگانه ژنتیکی در ایجاد سرطان بافت پوششی سنگفرشی مری در مبتلایان ایرانی پرداخته شد. بررسی هایپرمتیلاسیون پروموتر های چند ژن مهم مهار­کننده کینازی وابسته به سیکلینها (p14، p15 و p16)، به عنوان یکی از مهمترین فرآیندهای مولکولی متداول در تمام انواع سرطانها از جمله سرطان مری، از اهداف انجام این پروژه تحقیقی بود.

مواد و روشها

روش کار: در این مطالعه ابتدا جامعه آماری مورد نظر و حجم نمونه با توجه به عواملی چون شیوع سرطان مری در ایران، مطالعات انجام شده قبلی توسط سایر محققین  بر روی این ژن و نتایج حاصله، درنظر گرفتن خطاهای نوع اول و دوم، تعداد 44 نمونه توموری و19 عدد نمونه سالم تعیین گردید. این تعداد نمونه از میان بیماران مراجعه کننده به بیمارستان امام خمینی و تومور بانک ایران تهیه شد. همراه با نمونه های بافتی، اطلاعات کاملی در مورد دموگرافی و پاتولوژی بیماران مبتلایان به سرطان مری به دست آمد. بافتها به صورت تازه و در شرایط ازت مایع به فریزر 70 – درجه سانتی گراد پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری منتقل گردید. همچنین به منظور رعایت قوانین اخلاق زیستی، قبل از نمونه گیری از تمامی بیمارانی که مایل به شرکت در این پروژه تحقیقاتی بودند، رضایت نامه ای گرفته شد. در ادامه، اطلاعات حاصل از بیماران و نمونه ها مورد بررسی دقیق قرار گرفت و تعدادی از نمونه ها از ادامه مطالعه در این پروژه خارج شد. در واقع، اینها نمونه هایی بودند که فاقد شرایط لازم زیر بودند: اگر محل اولیه سرطان نامشخص بود، اگر بیمار علاوه بر مری به نوع دیگری از سرطان مبتلا بود، اگر از نظر هیستولوژیکی برای تومور، تشخیصی غیر از مری تأیید شده بود، اگر اطلاعات دقیقی در مورد تاریخچه یا گزارشات پاتولوژی بیماران در دسترس نبود و در صورتی که بیماران با هم نسبت فامیلی داشتند.

از تمامی نمونه های بافتی، استخراجDNA  به روش فنل - کلروفرم انجام شد. سپس DNA ها توسط کیت EZDNA Methylation-GoldTM Kit (ZymoResearch Co.,CA,USA) مورد تیمار با بی سولفیت سدیم قرار گرفت. پرایمر اختصاصی برای حالتهای متیله و غیرمتیله ژنهای  P16 و P14 ,  P15طراحی شده مطالعه قبلی همین گروه مورد استفاده قرار گرفت (9). آزمایش Methylation Specific PCR (MSP) برای ژن فوق به شرح زیر انجام شد. برای آزمایش MSP ، مواد زیر در حجم 12.5 µL   به میکروتیوب اضافه شد 1 mM dNTPs (Fermentase Co., Burlington, Ontario, Canada), 0.2 µM specific oligonucleotide primers, 100 ng modified DNA, U/µL Taq polymerase (Hot start,Qiagen,Valencia, CA, USA).

میکروتیوبهای بالا در شرایط دمایی 95 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه، و سپس 35 سیکل به صورت 95 درجه سانتی گراد، annealing  64 درجه سانتی گراد برای پرایمر های متیله و غیر متیله ژن P14 و دمای 60 درجه سانتی گراد برای پرایمرهای متیله و غیر متیله ژن P15)  و 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه برای هر دما و در نهایت 10 دقیقه در 72 درجه سانتی گراد و در دستگاه ترموسیکلر مدل PeQLab, 96 universal gradient, UK thermal cycler قرار داده شد. نمونه کنترل مثبت نیز از شرکت New England Biolab خریداری گردید. پس از الکتروفورز محصول  PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد، مشاهده باند با طول 122bp نشانه وجود متیله بودن پروموتر ژن P14 و وجود باند با طول132 bp نشانه عدم متیله بودن آن می باشد. همچنین مشاهده باند با طول 148bp نشانه وجود متیله بودن پروموتر ژن P15 و وجود باند با طول154 bp نشانه عدم متیله بودن این ژن می باشد. توالی پرایمرهای اختصاصی برای حالت  متیله و غیر متیله پروموتر ژنهای مورد نظر برای آزمایش MSPCR عبارتست از:

p14_meth_F: 5' GTG TTA AAG GGC GGC GTA GC 3'

p14_meth_R: 5' AAA ACC CTC ACT CGC GAC GA 3'

p14_Un meth_F: 5' TTT TTG GTG TTA AAG GGT GGT GTA GT 3'

p14_Un meth_R: 5' CAC AAA AAC CCT CAC TCA CAA CAA 3'

 

p15_meth_F: 5'GCG TTC GTA TTT TGC GGT T 3'

p15_meth_R: 5' CGT ACA ATA ACC GAA CGA CCG A 3' 

p15_Un meth_F: 5' TGT GAT GTG TTT GTA TTT TGT GGT T 3'

p15_Un meth_R: 5' CCA TAC  AAT AAC CAA ACA ACC AA 3'

 

p16_meth_F: 5' TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CGC 3'

p16_meth_R: 5' CCA CCT AAA TCG ACC TCC GAC CG 3'

p16_Un meth_F: 5' TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TGT 3'

p16_Un meth_R: 5' CAA CCC CAA ACC ACA ACC ATA A 3'

در مرحله بعد، استخراج RNA از بافتهای سرطانی و نرمال (بافت مجاور تومور) به کمک کیت استخراج RNA شرکت Intron و مطابق پروتکل آن انجام شد. در ادامه سنتز cDNA به کمک کیت Intron و مطابق دستور کار مربوطه انجام گرفت.

بیان ژنهای p14  و P15 با آزمایش RT-PCR بررسی گردید. ژن بتااکتین نیز به عنوان استاندارد داخلی و ژن خانه دار (House keeping) مورد آزمایش RT-PCRقرار گرفت.  دمای annealingبرای این مرحله از آزمایش 53 درجه سانتی گراد و طول قطعه مورد نظر، 174bp می باشد.

نتایج

نتایج حاصل از این مطالعه در چند بخش قابل ارائه است:

نتایج آنالیز بررسی مارکرهای ژنتیکی بر روی بیماران SCCE: در مجموع، این بیماران شامل 29 نفر مرد (66 درصد) و 15 نفر زن (34 درصد) در طیف سنی 37 تا 87 سال با میانگین  سنی (88/13±84/60) بودند در حالی که هیچیک، نسبت خویشاوندی با یکدیگر نداشتند و اکثر آنها بالاتر از 45 سال داشتند(1/81 درصد). اکثر بیماران نژاد آذری (5/70 درصد) و 5/29 درصد بیماران نژاد غیر آذری (کرد، لر، فارس) داشتند. اعتیاد سیگار و سایر مخدرها، در 41% بیماران دیده شد. از نظر تاریخچه خانوادگی نیز، هیچیک از افراد فامیل این بیماران مبتلا به سرطان مری یا سایر سرطانها نبودند (جدول 1). نتایج آزمایشات پاتولوژی نیز نشان داد 9 درصد بیماران از نظر تمایزی،  grade II و 6/63 درصد در مرحله T3 بودند. از نقطه نظر تهاجم لنفی، 8/47 درصد مرحله N1 را نشان دادند و فقط 16/9 درصد ایشان متاستاز داشتند (جدول 1).

 

 

جدول 3-1- اطلاعات فردی، دموگرافی، و پاتولوژی بیماران ESCC

Total (n=44) %

 

Total (n=44) %

 

 

31(70.5)

13(29.5)

Race

   Azeri

   Non-Azeri

 

60.84±13.88

 

Age (mean±SD), years 

 

29(66)

15(34)

Sex

    Male

   Female

 

8(18.2)

36(81.8)

Age

   <45

   >45 

 

12(27.24)

4(9.16)

28(63.6)

Metastasis

   M0

   M1

   MX

 

13(29.5)

21(47.8)

10(22.7)

Lymph node invasion

   N0

   N1

   NX 

 

 

15(34)

21(47.8)

8(18.2)

Tumor Necrosis Present

   Yes

   No

   Unknown

 

1(2.27)

10(22.7)

28(63.6)

1(2.27)

4(9.16)

Tumor T stage

   T1

   T2

   T3

   T4

   Unknown 

 

16(36.36)

24(54.47)

4(9.16)

Perineural Invasion

   Yes

   No

   Unknown

 

15(34)

27(61.3)

2(4.7)

BMI>25

   Yes

   No

   Unknown 

 

10(22.7)

26(59)

5(11.3)

3(7)

Grade Differentiation

   I

   II

   III

   Unknown

 

 

15(34)

26(59)

3(7)

Air born occupational  exposures

   Yes

   No

   Unknown 

 

19(43)

25(57)

Tumor size (Cm)

   <4.9

   >5 

 

18(41)

26(59) 

Smoking 

   Yes

   No 

 

 

تجزیه و تحلیل آماری ارتباط مثبتی بین متیلاسیون ژنهای p16، p14، p15، و برخی فاکتورهای دموگرافی و پاتولوژی بیماران مبتلایان SCCE، نشان داد که ارتیاط مثبت بین متیلاسیون CDKN2A/p16 و فاکتورهای ذرات آلاینده شغلی (P=0.0082) و چاقی (P=0.00142) BMI دیده شد. بین متیلاسیون پروموتر ژن CDKN2A/p14 و ذرات آلاینده هوا(P=0.02)، درجه تمایزی تومور (grade I نسبت به grade II) (P=0.005) و متاستاز (P=0.003)  ارتباط مثبت دیده شد. بین متیلاسیون پروموتر ژن p15 و فاکتورهای چاقی  (P=0.025)، Lymph node invasions  (P=0.04) ، Tumor Necrosis Present  (P=0.04)، و Perineural Invasion  (P=0.0036)  ارتباط معنادار مثبت مشاهده شد.  

نتایج حاصل از تستهای آزمایشگاهی: نتایج نشان داد که کیفیت و کمیت DNA و RNA استخراج  شده از بافتها دارای وضعیت خوبی هستند. میانگین غلظت DNA هر نمونه بین ng/ul330 تا 150 و نسبت 260l به 280l نیز بین 8/1 تا 2 بود و DNAها عاری از هر گونه آلودگی بودند.

نتایج حاصل از آزمایش MSPCR با پرایمرهای اختصاصی TPEF  نشان داد که کلیه DNAهای تیمار شده دارای کیفیت خوبی بوده و عمل modification به خوبی انجام شده است. این آزمایش جهت اطمینان از مناسب بودن واکنش تیمار با سدیم بی سولفیت،  از ژن  TPEF به عنوان کنترل تیمار و MSPCR  استفاده شد(شکل 2)

 

 

 

شکل2- آزمایش MSPCR با پرایمرهای ژن p14 بر روی ژل 5/1% آگارز. از چپ به راست(طول قطعه تکثیر شده با جفت پرایمر متیله، bp122 و با چفت پرایمر غیر متیله، bp132می باشد.)، چاهک 1: سایز مارکر bp123،  Invitrogen. چاهک 2: کنترل منفی برای حالت متیله، چاهک 3: حالت متیله برای نمونه توموری یکی از بیماران، چاهک 4: کنترل مثبت، چاهک 5: کنترل مثبت برای حالت غیر متیله، چاهک 6: حالت غیر متیله برای نمونه توموری یکی از بیماران. چاهک 7: حالت غیر متیله یکی از نمونه های نرمال بافتی ،چاهک 8: کنترل منفی برای حالت غیر متیله.

 


نتایج حاصل از آزمایش MSPCR برای ژن p14، نشان داد که فقط 4  نمونه از 44 عدد DNA  بیماران، متیله است و تمامی نمونه های غیر توموری (بخش سالم هم جوار تومورها) غیر متیله می باشد (شکل2(. بدین ترتیب 9 درصد نمونه ها برای پروموتور ژن p14  متیله می باشند.

نتایج حاصل از آزمایش MSPCR برای ژن p15 نیز نشان داد که 18 نمونه از  DNA  بیماران متیله (41 درصد) و 26 عدد از نمونه های توموری بیماران و تمامی نمونه های غیر توموری (بخش سالم هم جوار تومورها) غیر متیله می باشند (شکل3). همچنین نتایج آزمایش MSPCR برای ژن p16 نیز نشان داد که 12 عدد از 44 عدد نمونه DNA  بیماران متیله بود (27 درصد) در حالی که تمامی نمونه های غیر توموری (بخش سالم هم جوار تومورها) غیر متیله هستند )شکل 3).

فراوانی وجود متیلاسیون همزمان در ژنهای p15+p16 و p14+p15 به ترتیب 6/13 و 5/4 درصد بود در حالی که فراوانی متیلاسیون در ژنهای p14+p16، 9 درصد مشاهده شد (P=0.0036)بدین معنا که در تمامی بیمارانی که برای ژن p14 متیله بود، متیلاسیون p16 هم مشاهده شد اما در بیشتر بیمارانی کهp15  متیله بود، ژنهای p14 و یا p16 متیلاسیون نشان نمی داد.

از طرف دیگر آزمایشهای RT-PCR برای بررسی بیان نمونه هایی که برای این ژنها متیله بودند، نشان از ارتباط معکوس بین میزان متیلاسیون و بیان این ژنها در بافتها داشت. در واقع مطابق نتایج، اولاً برای ژن بتااکتین در همه نمونه های نرمال و توموری بیان مشاهده شد. دوماً بیان RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی برای تک تک ژنهای سرکوبگر توموری (p14, p15 و p16)، متناسب با حالت متیله یا غیر متیله بودن این ژنها بود. به عبارت دیگر، برای نمونه های توموری که از نظر هر یک از ژنهای سرکوبگر تومور متیله بود، بیانی مشاهده نشد در حالی که نمونه های توموری غیر متیله برای این ژنها، بیان داشتند. همچنین تمامی بافتهای نرمال برای تک تک این ژنها بیان نشان دادند زیرا هیچیک از آنها متیله نبودند.   

 

 

 

شکل3- آزمایش MSPCR با پرایمرهای ژن p15 بر روی ژل 5/1% آگارز. از چپ به راست(طول قطعه تکثیر شده با جفت پرایمر متیله، bp 148 و با چفت پرایمر غیر متیله، bp154 می باشد.). چاهک 1: سایز مارکر bp123، Invitrogen. چاهک2: کنترل منفی برای حالت متیله نمونه های توموری، چاهک 3: حالت متیله برای یکی از نمونه های توموری بیماران. چاهک 4: کنترل مثبت برای حالت متیله، چاهک 5:کنترل منفی برای حالت غیر متیله، چاهک 6: کنترل مثبت برای حالت غیر متیله، چاهک 7: حالت غیر متیله برای نمونه توموری یکی از بیماران. چاهک 8: حالت غیر متیله یکی از نمونه های نرمال بافتی. نمونه های کنترل مثبت جهت انجام این آزمایشها خریداری شده از شرکت New England Biolab است.

 


بحث

سرطان مری از جمله بیماریهای بسیار کُشنده است و ایران که در منطقه کمربند مرکزی آسیایی سرطان مری قرار دارد، کشوری است که با5/165 نفر در هر 100 هزار نفر بالاترین میزان وقوع  این سرطان را در جهان دارا است (4). به طور کلی در جهان شایع ترین نوع سرطان مری از نظر هیستولوژیک، نوع ESCC بوده اما در 15 سال اخیر وقوع آدنوکارسینومای مری درکشور های غربی و آمریکا رو به افزایش و در عوض میزان ESCC رو به کاهش است یا در حالت ثابت قرار دارد (19). در ایران، اغلب بیماران سرطانی مربوط به شمال و شمال شرقی می باشند و مطابق تحقیق منتشر شده توسط انستیتو سرطان ایران، شیوع سرطان مری (عمدتاً نوع ESCC) در استان گلستان، شهرستان گنبد کاووس،  31 درصد (اولین سرطان شایع)، مازندران 9/12 درصد (دومین سرطان شایع) و در استان گیلان 7/8 درصد (چهارمین سرطان شایع) بود و در کل در ایران شیوع آدنوکارسینومای مری به فراوانی کشورهای غربی نمی باشد. نسبت مبتلایان به این سرطان از نظر جنسیتی، 92/0: 1 زن به مرد گزارش می باشد.

در این مطالعه مشاهده شد که درصد متیلاسیون برای ژنهای P14  وP15 و P16 از میان 44 بیمار ایرانی مبتلا به سرطان بافت سنگفرشی مری، به ترتیب 41 ، 9 و 27 درصد می باشد. از مقایسه نتایج این تحقیق با مطالعات انجام شده توسط سایر محققین به این نتیجه می توان رسید که کاهش بیان ژنهای  p14و p15 در سرطان مری با افزایش تهاجم و متاستاز در ارتباط است، فقدان یا کاهش بیان ؤن­های  p14و p15 به عنوان یک نتیجه ژنتیکی، در مرحله تهاجم و متاستاز چندین تومور مختلف انسانی مشاهده شده است. از نتایج این تحقیق، عدم وجود متیلاسیون پروموتر ژنهای مورد بررسی در بافتهای سالم مری است (P<0.05). این یافته نشان دهنده این است که مکانیسم متیلاسیون، فقط به تومور اختصاص دارد و مؤید نتایج سایر محققینی است که نشان دادند ارتباطی مثبت بین متیلاسیون CDKN2A و نقش آن به عنوان یک بیومارکر با ریسک فاکتورهای سرطان مری وجود دارد. به عنوان مثال Igaki در 1994، حدف هموزیگوس p16 را در 13/12 رده سلولی سرطان مری  و 9/2 رده سلولی سرطان معده مطالعه کرد (10) و نشان داد حذف ژن p16 باعث موتانتهای ژن سیکلین D1 و  p53 می شود که به طور مستقل در این رده های سلولی اتفاق می افتد. در واقع تغییرات ژن p16 در بیشتر سرطانهای مری نقش دارند و نقش حیاتی را در توسعه این نوع سرطانهای بدخیم بازی می کنند (15 و 16).

Serrano در 2000، با آنالیز گاسترینوما از 44 بیمار دارای موتاسیون CDKN2A،  نتایج آزمایش را با رفتار بیولوژیک توموری، الگوی رشد تومور و قدرت تهاجمی آن مرتبط دانست (22). او با گزارش 52 درصدی هایپر متیلاسیون ناحیه 5'-CpG پروموتر CDKN2A در گاسترینوما، نشان داد حضور یا فقدان متیلاسیون ژن  CDKN2A ارتباطی با علائم کلینیکی این سرطان، رفتار بیولوژیک، حضور یا فقدان فاکتورهای شناخته شده (مانند سایز و موقعیت تومور، متاستاز غده لنفی، و متاستاز کبدی)، یا الگوی رشد این سرطان ندارد. اما متیلاسیون این ژن احتمالا" مرکزی  برای پروسه پاتوژنز مولکولی این تومورهاست.

در مجموع بر اساس یافته های تحقیق حاضر (به ویژه بالا بودن سطح متیلاسیونp15 در نمونه های سرطانی) به نظر می‌رسد در جریان تغییرات (اپی)ژنتیکی ناحیه 9p21 که به ESCC ختم می‌گردند، ژن p15 می تواند یکی از ژنهای هدف باشد و تعیین نقش آن در کارسینوژنز ESCC به عنوان یک ژن سرکوبگر تومور نیازمند مطالعات جامع تری می‌باشد.

ارتباط مثبت بین متیلاسیون ژنهای  CDKN2A/p16 ، p14 ، p27 و  ذرات آلاینده شغلی بیماران مبتلا به SCCE در مقایسه با بیماران مبتلا به SCCE که در معرض ذرات آلاینده شغلی نبودند، می تواند نشان دهنده نقش تنظیمی این ژن مهار کننده سرطان در چرخه سلولی در بیماران SCCE باشد. مطالعات سایر محققین نیز نقش ذرات آلاینده را به عنوان فاکتوری مهم در اتیولوژی سرطان مری، نشان داده است (12 و 23). با توجه به نتایج حاصله از این بررسی، می توان پیشنهاد داد که افزایش خطر توسعه سرطان مری، ممکن است به دلیل افزایش فراوانی متیلاسیون لکوسهای CDKN2A/p16 ، p14 ، در این دسته از کارگران باشد. اگرچه بایستی احتمال درگیر بودن سایر ژنها و نقش آنها (در نتیجه رخدادهای ژنتیکی مانند متیلاسیون) را نیز مورد توجه قرار داد.

ارتباط با اهمیتی بین متیلاسیون CDKN2A/p16 و p15 و فاکتور چاقی در SCCE گویای ریسک بالای SCCE در بیماران چاق (BMI>25) است. از طرف دیگر چاقی به عنوان یکی از ریسک فاکتورهای سرطان مری در مردان و به ویژه آدنوکارسینومای مری گزارش شده است (8). از آنجا که نمونه های مورد نظر در این آزمایش، همگی SCCE است و تاکنون گزارش مشابهی در مقالات دیده نشده است، می توان ادعا کرد که این یافته، اولین یافته ای است که نشان دهنده ارتباط BMI با متیلاسیون CDKN2A/p16 و p15 در SCCE می باشد (17). گزارشهای موجود مبنی بر اختصاصیت افزایش BMI به عنوان ریسک فاکتور در سرطانهای کولون، پروستات، مثانه، اندومتریال، و سینه می باشد (2 و 6)، برخی مطالعات انجام شده بر روی گاستریک کاردیا، ادعا دارد که افزایش BMI در ایجاد این سرطان نقشی ندارد. Hampel و همکارانش، ارتباط بین BMI و آدنوکارسینومای مری را نشان دادند (8). ایشان با محاسبه odds ratios مساوی  (95% CI 1.15-2.0)  52/1 برای افزایش وزن و  (1.85-4.16) 78/2 برای چاقی، نشان دادند که ارتباط معناداری بین فاکتورهای چاقی و افزایش وزن با آدنوکارسینومای سرطان مری وجود دارد.

از مقایسه نتایج این پروژه با سایر مطالعات مشابه در جهان، مشاهده می شود که وضعیت متیلاسیون ژنهای p15، p14، p16 در جمعیت ایرانی مورد بررسی ‌در محدوده گزارشات قبلی از شمال چین قرار دارد. بنابراین می‌توان چنین نتیجه گرفت که احتمالاً مکانیسمهای مولکولی و عوامل اتیولوژیک مشابهی می توانند در بروز سرطان ESCC در این دو جمعیت (ایران و چین ) نقش داشته باشند.

تشکر و قدردانی:

نویسندگان بر خود لازم می دانند از مسئولان و پرسنل محترم بیمارستان امام خمینی و تومور بانک ایران که در تهیه نمونه های مورد نظر برای این تحقیق، همکاری و مساعدت خوبی داشتند قدردانی نمایند.

  1. Allen JW, Edeards MJ. 1997. SCCE: a review and update. Surgerical Oncology, 6:193-200.
  2. Bergstrom A, Pisani P, Tenet V, Wolk A. 2001. Overweight as an avoidable cause of cancer in Europe. Int J Cancer, 91:421-430.
  3. Bird A. 2002. DNA methylation patterns and epigenetics memory. Genes Dev, 16(6-21).
  4. Day NE, Munoz N. 1982Cancer Epidemiology and Prevention Schottenfled, S & Fravmeni, J F Saunders, Philadelphia:596.
  5. Eads CA, Laird PW. 2000. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nuc Acids Res, 28:E32.
  6. Gates E J, Hirschfield L, Matthews R P, Yap O W. 2006. Body mass index as a prognostic factor in endometrioid adenocarcinoma of the endometrium. J Natl Med Assoc, 98:1814-1822.
  7. Ghavamzadeh A, Mousavi A, Jahani M, Rastegarpanah M. 2001. Esophageal cancer in Iran. Seminars in On cology, 28(2):153-157.
  8. Hampel H, Abraham N S, El-Serag H B. 2005. Meta-analysis: obesity and the risk for gastroesophageal reflux disease and its complications. Ann Intern Med, 143:199-211.
  9. Herman JC. 2003. Baylin SB: Gene silensing in cancer in association with promoter hypermethylation. N Engl J Med, 349:2042-2054.
  10. Igaki H, Sasaki H, Kishi T, Sakamoto H, et al. 1994. Highly frequent homozygous deletion of the p16 gene in esophageal cancer cell lines. Biochem Biophys Res Commun, 203(1090-1095).
  11. Ivanchuk SM, Mondal S, Dirks PB, Rutka JT. 2001. The INK4A/ARF locus: role in cell cycle control and apoptosis and implications for glioma growth. J Neurooncol, 219-229.
  12. Jansson C, Plato N, Johansson A L, Nyren O, Lagergren J. 2006. Airborne occupational exposures and risk of oesophageal and cardia adenocarcinoma. 63:107-112.
  13. Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. 1994. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 264:436-440
  14. Kamb A, Shattuck-Eidens D, Eeles R, Liu Q, Gruis NA, et al. 1994. Analysis of the p16 gene (CDKN2) as a candidate for the chromosome 9p melanoma susceptibility locus. Nature Genet, 26:23-28.
  15. Liu L, Lassam NJ, Slingerland JM, Bailey D, et al. 1995. Germline p16(INK4A) mutation and protein dysfunction in a family with inherited melanoma. Oncogene, 11:405-412.
  16. Liu Q, Yan Y, McClure M, Nakagawa H, et al. 1995. MTS-1 (CDKN2) tumor suppressor gene deletions are a frequent event in esophagus squamous cancer and pancreatic adenocarcinoma cell lines. Oncogene, 10:619-622.
  17. Mohammad Ganji S, Miotto E, Callegari E, Sayehmiri K, et al. 2010. Associations of risk factors obesity and occupational airborne exposures with CDKN2A/p16 aberrant DNA methylation in esophageal cancer patients. Diseases of the Esophagus.
  18. Ng H.H. 1999. A. Bird: DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 9:158-163.
  19. Pera M. 2001. Recent changes in the epidemiology of esophageal cancer. Surgerical Oncology, 10:81-90.
  20. Quelle DE, Ashmun RA, Hannon GJ, et al. 1995.Cloning and characterization of murine p16(INK4a) and p15(INK4b) genes. Oncogene, 11:635-645.
  21. Quelle DE, Zindy F, Ashmun RA, Sherr CJ. 1995. Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest. Cell, 83:993-1000.
  22. Serrano J, Goebel SU, Peghini PL, et al. 2000. Alterations in the p16INK4a/CDKN2A tumor suppressor gene in gastrinomas. J Clin Endocr Metab, 85:4146-4156.
  23. Thuret A, Geoffroy-Perez B, Luce D. 2007. Goldberg M: A 26-year cohort mortality study of French construction workers aged 20-64 years. J Occup Environ Med:546-556.
  24. Zolota V, Tsamandas AC, Aroukatos P, Panagiotopoulos V, et al. 2008. Expression of cell cycle inhibitors p21, p27, p14 and p16 in gliomas. Correlation with classic prognostic factors and patients’ outcome. Neuropathology, 28:35–42.