بررسی محتوای فنول و فلاونوئید کل و فعالیت آنتی­اکسیدانی و آنتی­کولین­استرازی

نمونه­های بره موم جمع آوری شده از سه منطقه استان کرمان

شهناز فتحی هفشجانی¹، صفا لطفی^1*، الهام رضوان نژاد¹، مجتبی مرتضوی¹ و علی ریاحی مدوار²

¹ کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی.

² بجنورد، دانشگاه کوثر بجنورد، دانشکده علوم پایه، گروه سلولی و مولکولی.

تاریخ دریافت: 15/10/1399          تاریخ پذیرش: 05/11/1400

چکیده

بره­موم (پروپولیس)، یک ماده طبیعی رزینی با خواص زیستی متعدد است که توسط زنبور عسل تولید می­شود. در این مطالعه، عصاره اتانولی نمونه­های بره­موم جمع­آوری شده از سه منطقه استان کرمان (لاله زار، راین و سرآسیاب) مورد بررسی قرار گرفته است. محتوای فنل و فلاونوئید کل عصاره­ها بترتیب با روش فولین-سیوکالتو و آلومینیوم کلراید و فعالیت آنتی­اکسیدانی و آنتی­کولین­استرازی آنها با دو روش DPPH و المن مطالعه شد. نتایج به دست آمده نشان داد که محتوای فنل ( 97/165 میلی­گرم اکی­والان گالیک­اسید بر گرم عصاره) و فلاونوئید کل (26/72 میلی­گرم اکی­والان کوئرستین بر گرم عصاره) نمونه لاله­زار نسبت به دو نمونه سرآسیاب و راین بیش از دو برابر و توانایی این نمونه در مهار رادیکال آزاد DPPH (µg/ml 64/5 IC₅₀:)، نسبت به دو نمونه دیگر حدود هفت برابر است. بنابراین، یک ارتباط مستقیم بین فعالیت آنتی­اکسیدانی نمونه­ها و محتوای کل فنل و فلاونوئید آنها مشاهده شد. همچنین نتایج تست المن نشان داد که فعالیت آنتی­کولین­استرازی نمونه لاله­زار (µg/ml 37/14 IC₅₀:)  نسبت به دو نمونه راین و سرآسیاب به­ترتیب 8/4 و 4/5 برابر بیشتر است. بنابراین با توجه به نتایج بدست آمده، بره­موم لاله­زار پتانسیل بسیار خوبی برای مطالعات بیشتر دارد.

واژه های کلیدی: بره­موم (پروپولیس)، محتوای فنل کل، محتوای فلاونوئید کل، فعالیت آنتی­اکسیدانی، فعالیت آنتی­کولین­استرازی.

* نویسنده مسئول، تلفن: ۰۳۴۳۳۷۷۶۶۱۱  ، پست الکترونیکی: s.lotfi@kgut.ac.ir 

مقدمه

بره موم (پروپولیس) که عموما به عنوان چسب زنبور نیز شناخته می شود یک ماده طبیعی رزینی و به شدت چسبنده است که به وسیله زنبور عسل با مخلوط کردن موم و بزاق حاوی آنزیم های خاص با ترکیبات مشتق شده از گیاهان تولید می­شود (36، 37). بره موم که ترکیبی لیپوفیلیک است در دماهای مختلف، ویژگی های فیزیکی مختلفی را دارا می­باشد. در سرما این ماده سخت و شکننده و هنگام گرم شدن، نرم، قابل انعطاف و بسیار چسبنده می شود (21). نقطه ذوب بره­موم 60  تا 70  درجه سانتی گراد است، اما برای بعضی از نمونه­ها نقطه ذوب ممکن است به100 درجه سانتی گراد هم برسد. رنگ این ماده طبیعی معطر و خوشبو بسته به نوع ترکیبات تشکیل دهنده از سبز تا قرمز و قهوه ای تیره متغیر است (7، 22، 30). ترکیب شیمیایی بره موم نزدیک به رزین ها و ترکیبات موجود در منابع گیاهی است که برای تولید آن استفاده شده است. همراه با پیشرفت تحقیقات، ترکیبات متنوعی نظیر پلی فنول، آلدهیدهای فنلی، مونوترپن، اسیدهای آمینه، استروئیدها، کومارین­ها و چندین نوع ترکیب دیگر در ساختار بره موم یافت شده است(16، 30، 50). فعالیت زیستی بره­موم  به طور عمده به واسطه چند ماده نظیر فلاونوئیدها، ترپنها، اسیدهای کافئیک، فرولیک،کوماریک و استرها می­باشد(36، 37).

بره موم خام را نمی توان به طور مستقیم مورد استفاده قرار داد. ابتدا باید با یک حلال مناسب، مواد تشکیل­دهنده آن را به صورت محلول درآورد و بدین ترتیب عصاره بره موم را تهیه و از آن برای مصارف گوناگون استفاده نمود. روش های عصاره گیری ممکن است روی فعالیت آن تاثیر داشته باشد. به دلیل اینکه حلالهای مختلف، اجزای تشکیل دهنده مختلفی را حل کرده و استخراج می کنند از حلال های  اتانول، متانول، آب، هگزان، استون، دی کلرومتان و کلروفرم به عنوان عصاره گیر استفاده می شود (18، 32).

نوع حلال بسته به نوع استفاده­ای که از عصاره می­شود متفاوت خواهد بود. معمولا از اتانول برای تهیه عصاره بره موم استفاده می شود. عصاره الکلی بره موم مدت زمان بیشتری توانایی نگهداری خواص موجود در بره موم را دارد. بیشترین مواد تشکیل­دهنده فعال در محلول اتانول و پروپیل الکل مشاهده شده است و مواد تشکیل دهنده فعال کمتری در آب محلول هستند. این ماده طبیعی خارق العاده خواصی شامل اثر ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضد انگلی، آنتی­اکسیدانی، ضد التهابی و ضد پوسیدگی دندان دارد. همچنین به عنوان تقویت کننده سیستم ایمنی بدن، بهبود دهنده اختلالات دهان و لثه، بی حس کننده موضعی و کاهش دهنده فشار خون و قند خون و...کاربرد دارد (8، 38، 41).

شواهد قابل توجهی در مورد جنبه های مختلف شیمیایی و زیستی بره موم وجود دارد، اما کاربرد درمانی و استفاده از آن توسط صنعت داروسازی هنوز محدود است. این مسیله عمدتا به دلیل تغییر ترکیب شیمیایی آن با منشاء جغرافیایی است، زیرا زنبورها از گیاهان مختلف در اکوسیستم های مختلف استفاده می کنند. شناسایی ترکیبات اصلی در نمونه های بره موم ضروری است. گزارش از خواص زیستی بره موم باید شامل یک بررسی دقیق از ترکیب و منابع گیاه شناسی آن باشد (28، 43). در این تحقیق، میزان فنل و فلاونوئید کل و همچنین فعالیت آنتی­اکسیدانی و آنتی­کولین­استرازی عصاره های اتانولی نمونه­های بره­موم جمع­آوری شده از سه منطقه مختلف استان کرمان (لاله زار، راین و سرآسیاب) مورد مطالعه قرار گرفته است.

مواد و روشها

نئوستیگمین، آنزیم استیل کولین استراز مارماهی الکتریکی (نوع VI-S )، استیل تیوکولین یداید، معرف المن (DTNB)، آلبومین سرم گاوی (BSA)، 2،2-دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل(DPPH)، معرف فولین-سیوکالتو، گالیک اسید، کوئرستین و آلومینیوم کلراید از شرکت سیگما (Sigma) خریداری شدند. دی پتاسیم هیدروژن فسفات (K₂HPO₄)، پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH₂PO₄) و آسکوربیک اسید از شرکت مرک Merck)) خریداری گردیدند.

تهیه عصاره اتانولی از نمونه های بره موم: نمونه های بره موم مورد استفاده دراین تحقیق، بصورت خام توسط زنبورداران از کندوهای زنبورعسل از سه منطقه مختلف استان کرمان (لاله زار، راین و سرآسیاب) جمع آوری شده است. در جدول 1، نام منطقه جمع آوری و رنگ بره­موم جمع آوری شده ذکر شده است.

جدول 1- منطقه جمع آوری و رنگ نمونه های بره موم مورد استفاده در این مطالعه.

نمونه های بره موم پس از گردآوری در محیطی تاریک و در دمای20 - درجة سانتی گراد در فریزر نگهداری شدند. برای تهیه عصاره­ اتانولی از این نمونه ها بدین ترتیب عمل شد. ابتدا بره موم خام توسط نیتروژن مایع به پودر تبدیل گردید. حدود 10 گرم از بره موم پودر شده در 100 میلی لیتر اتانول 80 درصد در ظروف تیره و در تاریکی خیسانده و به مدت 72 ساعت در شیکر انکوباتور قرار داده شد و سپس نمونه ها سانتریفیوژ گردید. مایع رویی صاف شده با استفاده از دستگاه روتاری در دمای 40 درجه سانتیگراد، تغلیظ و پس از تخلیه از مخزن دستگاه، جهت خشک شدن کامل، روی پلیت شیشه­ای پخش گردید و در آون تحت خلا در دمای 40 درجه سانتی گراد قرار داده شد. عصاره های اتانولی خشک شده از روی سطح پلیت جمع­آوری و در ظروف تیره تا زمان انجام مراحل بعدی در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

سنجش میزان فنل کل: برای اندازه گیری میزان  فنل کل از روش فولین-سیوکالتو (Folin-Ciocalteu) و از گالیک اسید به عنوان استاندارد کالیبراسیون استفاده شد (5). معرف فولین-سیوکالتو یک محلول زرد رنگ است که در محیطی که حاوی مقدار زیادی فنل باشد به رنگ آبی تیره تغییر رنگ می­دهد. در این روش اساس کار، احیای این معرف توسط ترکیبات فنولی در محیط قلیایی و ایجاد کمپلکس آبی رنگ می­باشد. نتایج به دست آمده از این تست، بر حسب میلی­گرم اکی­والان گالیک اسید در گرم عصاره (mg GAE/g extract) بیان می­شود (45). بدین منظور 100 میکرولیتر فولین-سیوکالتو 2/0 نرمال، 15 میکرولیتر عصاره بره­موم حل شده در اتانول 80 درصد ( غلظت نهایی: 50 میکروگرم بر میلی لیتر( و 585 میکرولیتر  آب مقطر باهم مخلوط شدند. بعد از یک دقیقه، 300 میکرولیتر کربنات سدیم 5/7 % به این مخلوط اضافه گردید و پس ‌از آنکه نمونه به مدت 30 دقیقه در محیط تاریک قرار داده شد، مقدار جذب آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول‌موج 735 نانومتر ثبت شد. برای هر نمونه سه تکرار در نظر گرفته شد. از مخلوط 600 میکرولیترآب مقطر، 100 میکرولیتر معرف فولین-سیوکالتو  2/0 نرمال و 300 میکرولیتر کربنات سدیم 5/7 % به‌عنوان نمونه شاهد این تست استفاده شد.

سنجش میزان فلاونوئید کل: اندازه گیری فلاونوئیدها با استفاده از روش رنگ سنجی آلومینیوم کلرید انجام شد (10). این ترکیب قادر به اندازه گیری ترکیباتی از جمله فلاونون و فلاونول در نمونه مورد نظر است. آلومینیوم کلرید با ترکیب شدن با گروه کتون و هیدروکسیل فلاونون و فلاونول یک ترکیب پایدار ایجاد می کند. هر چه رنگ ایجاد شده به زرد متمایل­تر باشد، فلاونوئید موجود در نمونه بیشتر است. در این تست، از کوئرستین به عنوان استاندارد کالیبراسیون استفاده و نتایج  بر اساس میلی­گرم اکی­والان کوئرستین در گرم عصاره (mg QE/g extract) گزارش شد (49، 2). برای انجام این آزمایش، 500 میکرولیتر عصاره بره موم حل شده در اتانول 75 درصد به  500 میکرولیتر آلومینیوم کلرید 2% موجود در کووت اضافه گردید (غلظت نهایی عصاره بره موم: 50 میکروگرم برمیلی لیتر)، سپس کووت حاوی محلول فوق در تاریکی به مدت 15 دقیقه انکوبه شد. بعد از این مدت، جذب آن در طول موج 435 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. از محلول حاوی 500 میکرولیتر آلومینیوم کلرید 2% و 500 میکرولیتر آب مقطر به عنوان محلول شاهد استفاده گردید. برای هر نمونه سه تکرار در نظر گرفته شد.

ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی: استفاده از روش (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH به منظور بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های گیاهی و به طور کلی آنتی‌اکسیدانی‌های طبیعی، یکی از پرکاربردترین روش‌ها می باشد (7). DPPH یک رادیکال آزاد هیدروفیل و پایدار به رنگ بنفش است که دارای حداکثر جذب در طول موج 517-515 نانومتر می­باشد و در اثر احیا شدن به رنگ زرد کمرنگ و یا بیرنگ در می­آید. هرچه یک نمونه دارای فعالیت آنتی­اکسیدانی بالا­تری باشد شدت کاهش رنگ بیشتر خواهد بود (31).

برای انجام این آزمایش، برای هر نمونه از بره­موم از شش غلظت مختلف عصاره حل شده در متانول استفاده شد و برای هر غلظت، آزمون­ سه بار تکرار گردید. ابتدا 750 میکرولیتر از محلول DPPH (4/0میلی مولار) به 250 میکرولیتر عصاره بره­موم موجود در کووت اضافه شد. سپس محلول فوق به مدت 30 دقیقه در جای تاریک انکوبه گردید. بعد از انکوبه کردن، جذب محلول در طول موج 517 نانومتر تعیین شد. از محلول حاوی یک میلی لیتر متانول به عنوان محلول شاهد و از محلول شامل 750 میکرولیتر   DPPH و 250 میکرولیتر متانول به عنوان نمونه کنترل استفاده شد. در این آزمایش، از اسید آسکوربیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

به منظور محاسبه فعالیت آنتی­اکسیدانی نمونه­ها، با استفاده از فرمول پایین، درصد مهار رادیکال آزاد DPPH برای هر غلظت از عصاره بره­موم و همچنین اسید آسکوربیک محاسبه شد و در نهایت با رسم نمودار دوز-پاسخ، شاخص IC₅₀ )غلظتــی از نمونه کــه در آن 50% رادیـکال DPPH مهـار مـی­شـود( برای هر نمونه به دست آورده شد.

100× [A_{control –} A_{sample ) /}A_{control  (}]=  (%) Inhibition of DPPH

جذب کنترل A_control:

جذب نمونه A_sample:

سنجش فعالیت آنتی­کولین­استرازی: در این مطالعه جهت بررسی فعالیت آنتی­کولین­استرازی عصاره اتانولی نمونه های بره موم، از روش المن استفاده شد (6). فعالیت آنزیم استیل­کولین­استراز (AChE) در عدم حضور و حضور 6 غلظت مختلف از هر عصاره مورد مطالعه قرار گرفت و برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد. همه تست های آنزیمی با حجم کلی µl200 و در پلیت های 96 خانه انجام شدند. نتایج به دست آمده از این مطالعه به صورت غلظتی از عصاره که توانایی مهار فعالیت آنزیمی به میزان 50 درصد را دارد (IC₅₀) بیان شد. از مهارکننده شناخته شده آنزیم استیل­کولین­استراز، نئوستیگمین، به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات پتاسیم 1/0 مولار (pH= 8)، آنزیم (AChE) با غلظت نهایی 1/0 واحد بر میلی لیتر و DTNB با غلظت نهایی 5/0 میلی­مولار بود. نمونه های بره موم به مدت 10 دقیقه با مخلوط واکنش در دمای 25 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. سپس سوبسترا (استیل تیوکولین یدید) با غلظت نهایی 1 میلی مولار به مخلوط واکنش افزوده و جذب نمونه­ها بعد از 10 دقیقه در 405 نانومتر با دستگاه میکروپلیت ریدر (Elx808 BioTek Instruments) خوانده شد. یک نمونه حاوی همه اجزای واکنش به استثنای آنزیم به عنوان نمونه شاهد در نظر گرفته شد. در نهایت درصد مهار فعالیت آنزیم در هر غلظت از عصاره بره موم محاسبه شد. سپس تغییرات درصد مهار فعالیت آنزیمی نسبت به لگاریتم غلظت (نمودار دوز-پاسخ) برای هر عصاره ترسیم و مقدار IC₅₀ با استفاده از این نمودار تعیین شد.

نتایج

محتوای فنل و فلاونوئید کل: در شکل 1، محتوای فنل و فلاونوئید کل عصاره های اتانولی بره موم جمع آوری شده از سه منطقه مختلف کرمان، به صورت نمودار ستونی نمایش داده شده است. این نتایج به ترتیب بر حسب میلی­گرم اکی­والان گالیک اسید در گرم عصاره (mg GAE/g extract) و میلی­گرم اکی­والان کوئرستین در گرم عصاره (mg QE/g extract) گزارش شده است. همانطور که به خوبی در شکل مشخص است بیشترین محتوای فنل کل مربوط به نمونه لاله زار  mg GAE/g extract) (165.96 و کمترین مقدار مربوط به نمونه راین  mg GAE/g extract) (70.25 می­باشد. این دو نمونه همچنین به ترتیب از بیشترین mg QE/g extract)  (72.26و کمترین mg QE/g extract) (29.92 محتوای فلاونوئیدی کل برخوردار می‍باشند.

شکل1- میزان فنول و فلاونوئید کل عصاره اتانولی نمونه های بره موم.

شکل2- نتایج بدست آمده از بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره اتانولی نمونه های بره موم با آزمون DPPH.

محتوای فنل و فلاونوئید کل نمونه سرآسیاب که در رتبه دوم قرار دارد به میزان کمی از نمونه راین بالاتر است. 

فعالیت آنتی اکسیدانی: همانطور که قبلا اشاره شد به منظور سنجش فعالیت آنتی­اکسیدانی نمونه­های بره­موم از روش DPPH و از آسکوربیک­اسید به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. نتایج به دست آمده از این تست، به صورت غلظتی از عصاره که توانایی مهار رادیکال آزاد DPPH را به میزان 50% دارد (IC₅₀) گزارش گردید. شکل 2، مقادیر IC₅₀ به دست آمده برای سه نمونه بره­موم و همچنین آسکوربیک اسید را با یکدیگر مقایسه نموده است. همانطور که به خوبی در شکل دیده می­شود توانایی نمونه لاله­زار (IC₅₀: 5.64 µg/ml) در مهار رادیکال آزاد DPPH  نسبت به آسکوربیک اسید (IC₅₀: 3.89 µg/ml) تقریبا یک و نیم برابر کمتر و نسبت به دو نمونه بره­موم دیگر حدود هفت برابر بیشتر است. ظرفیت آنتی­اکسیدانی نمونه سرآسیاب (IC₅₀: 39.97 µg/ml)  در مقایسه با نمونه راین (IC₅₀: 44.47 µg/ml) به میزان کمی بالاتر است.

فعالیت آنتی­کولین­استرازی: همانطور که در بخش مواد و روش ها اشاره شد فعالیت آنتی­کولین­­استرازی نمونه­های ­بره­موم با استفاده از روش المن بررسی و نتایج نهایی برای هر نمونه به صورت IC₅₀ گزارش گردید. در این مطالعه، از نئوستیگمین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. نتایج به دست آمده از این بخش در جدول 2 نمایش داده شده است.

جدول2- نتایج بدست آمده از بررسی فعالیت آنتی­کولین­استرازی عصاره اتانولی نمونه های بره­موم. در این تست، از نئوستیگمین به عنوان کنترل مثبت استفاده شده است.

جدول3- مقایسه نتایج بدست آمده از بررسی محتوای فنل و فلاونوئید کل و فعالیت آنتی اکسیدانی (DPPH) و آنتی کولین استرازی (المن) عصاره­های اتانولی نمونه­های بره موم مورد استفاده در این مطالعه.

مقایسه IC₅₀  نئوستیگمین (22.62 ng/ml) با مقادیر IC₅₀ عصاره­های سه نمونه بره­موم نشان می­دهد که هر سه نمونه توانایی مهار آنزیم استیل­کولین­استراز را دارا می­باشند. فعالیت آنتی­کولین­استرازی نمونه لاله­زار (IC₅₀: 14.37 µg/ml) با اختلاف بسیار زیادی نسبت به دو نمونه بره­موم دیگر بالاتر می باشد. مقایسه IC₅₀ دو نمونه راین (69.53 µg/ml) و سرآسیاب (77.73 µg/ml) نشان می­دهد که فعالیت آنتی­کولین­استرازی نمونه راین تا حدی از نمونه سرآسیاب بالاتر است.

بحث و نتیجه گیری

در این کار تحقیقاتی، عصاره اتانولی نمونه های بره­موم زنبور عسل جمع­آوری شده از سه منطقه مختلف کرمان (لاله ­زار، راین و سرآسیاب) مورد مطالعه قرار گرفته است. علاوه بر سنجش محتوای فنل و فلاونوئید کل عصاره ها، فعالیت آنتی­اکسیدانی و آنتی کولین استرازی آنها نیز به ترتیب با استفاده از روش DPPH و المن بررسی شده است. نتایج کلی به دست آمده از این مطالعه (محتوای فنل و فلاونوئید کل و مقادیر IC₅₀  به دست آمده از دو تست DPPH و المن)  در جدول 3 ارایه شده است.

بره موم حاوی طیف گسترده­ای از ترکیبات فنلی، به طور عمده فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک و استرهای آنها است (7، 30، 39). خواص بیولوژیکی متعدد بره موم با محتوای فنلی و فلاونوئیدی آن مرتبط است. محتوای فلاونوئیدی بره موم به نوع گیاهان مناطق مختلف که توسط زنبورهای عسل جمع آوری شده اند، نسبت داده می شود  (9، 17، 43). برای فلاونوئیدها خواص بیولوژیکی متنوعی از جمله آنتی­اکسیدانی، ضد میکروبی، ضدالتهابی، محافظت­کننده کبدی، ضد سرطانی ثبت شده است (2،1، 35). آنتی اکسیدان ها، رادیکال های آزاد مانند سوپراکسید، هیدروکسیل و پراکسیل را از بین می­برند و نقش مهمی در جلوگیری از بیماری­ها و اختلالات القا شونده توسط رادیکال­های آزاد نظیر پیری، بیماری­های قلبی-عروقی، آرتریت روماتوئید، سرطان، دیابت و بیماری­های تحلیل­برنده اعصاب (بیماری آلزایمر و پارکینسون) و التهاب دارند (47، 48). ویژگی­های آنتی­اکسیدانی بره­موم به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته است و با استفاده از روش های DPPH، ABTS⁺، FRAP و ORAC به اثبات رسیده است (27). فلاونوئیدها از جمله ترکیبات آنتی اکسیدانی قدرتمند موجود در انواع بره­موم هستند که توانایی از بین بردن رادیکال­های آزاد را دارا می باشند (14).

در مطالعه حاضر، محتوای فنل و فلاونوئید کل عصاره اتانولی سه نمونه بره موم لاله زار، راین و سرآسیاب کرمان به ترتیب با روش فولین-سیوکالتو و آلومینیوم کلراید و فعالیت آنتی­اکسیدانی آنها با تست DPPH مورد مطالعه قرار گرفت. مقایسه نتایج به دست آمده از آزمون DPPH (شکل 2) با محتوای فنل و فلاونوئید کل سه نمونه  بره­موم (شکل 1) نشانگر آن است که بین محتوای فنل و فلاونوئید کل و فعالیت آنتی­اکسیدانی نمونه­ها رابطه مستقیم وجود دارد. به طوریکه نمونه لاله­زار که نسبت به دو نمونه سرآسیاب و راین، توانایی بسیار بالاتری در مهار رادیکال آزاد DPPH از خود نشان می دهد (حدود هفت برابر) و IC₅₀ آن به میزان کمی از کنترل مثبت (آسکوربیک اسید) بالاتر است محتوای فنل و فلاونوئید کل آن نیز نسبت به این دو نمونه بیش از دو برابر می باشد. این نتایج با نتایج به دست آمده از مطالعات انجام شده بر روی نمونه های بره­موم آرژانتین (23)، یونان و قبرس (24)، ژاپن (19) و لهستان (44) مطابقت دارد.

بیماری آلزایمر (Alzheimer's disease: AD) که یک نوع بیماری پیشرونده تحلیل برنده اعصاب است رایج­ترین دلیل بروز زوال عقل در افراد بالای 65 سال محسوب می­ شود. AD به طور تدریجی منجر به زوال حافظه و شناخت و در نهایت مرگ می شود (33، 46). بر اساس فرضیه کولینرژیک پاتوژنز AD، دلیل بروز این بیماری به کاهش سطح استیل کولین، یک نوروترانسمیتر درگیر در دو فرایند حافظه و یادگیری، در هیپوکامپ و کورتکس مغز نسبت داده می شود (12، 20). اگرچه تا به امروز هیچ نوع درمان قطعی برای AD شناخته نشده است اما تجویز مهارکننده های آنزیم استیل­کولین­استراز (AChE) به منظور بهبود علایم فرم خفیف و یا حدواسط این بیماری، از استراتژی های درمانی اصلی محسوب می­شود. هرچند استفاده از مهارکننده های AChE، اولین بار برای درمان بیماری آلزایمر مطرح شد اما با گذشت زمان، این داروها برای درمان انواع دیگری از زوال عقل و اختلالات سیستم عصبی مرکزی نظیر اختلال شناختی خفیف، زوال عقل با اجسام لوی، بیماری پارکینسون، سندرم داون، بیماری کورساکوف و زوال عقل عروقی نیز مورد استفاده قرار گرفتند (11، 29). 

مطالعات فراوانی در سراسر جهان به منظور تشخیص و جداسازی مهارکننده های AChE با منشا طبیعی در جریان است. خانواده آماریلیداسه از جمله گیاهانی هستند که فعالیت آنتی­کولین­استرازی آنها به خوبی شناخته شده است. گونه­های  گالانتوس این خانواده، منبع اولیه آلکالوئید گالانتامین می باشند. گالانتامین یکی از مهارکننده های AChE تایید شده توسط FDA می­باشد که هم اکنون به منظور بهبود علایم فرم های خفیف و حدواسط  AD تجویز می شود (15، 34، 40). مطالعاتی که بر روی چندین نمونه بره موم جمع آوری شده از مناطق مختلف کره جنوبی (3)، ترکیه (4) و مراکش (13) انجام شده است نشاندهنده فعالیت آنتی­کولین­استرازی نمونه­های بره­موم می باشد (42).

در این مطالعه، فعالیت آنتی­کولین­استرازی عصاره اتانولی سه نمونه بره­موم با روش المن مورد بررسی قرار گرفت. از نئوستیگمین که مهارکننده شناخته شده  و توانمند AChE می باشد به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. همانطور که در جدول 2 مشاهده می شود IC₅₀ نئوستیگمین در مقیاس نانوگرم و مقادیر IC₅₀ هر سه عصاره در مقیاس میکروگرم می باشد. با توجه به اینکه نئوستیگمین یک ترکیب خالص با توانایی بسیار بالا در مهار AChE می باشد، اما عصاره های بره موم از مجموع چندین ترکیب مختلف تشکیل شده اند که فقط تعداد معدودی از آنها توانایی آنتی­کولین­استرازی دارند این اختلاف مشاهده شده بین مقادیر IC₅₀ نئوستیگمین و نمونه های بره­موم کاملا منطقی و طبیعی است. از بین سه نمونه بره موم، نمونه لاله­زار توانایی بسیار بالاتری در مهار AChE از خود نشان می دهد به طوریکه فعالیت آنتی کولین استرازی آن نسبت به دو نمونه راین و سرآسیاب به ترتیب 8/4 و 4/5 برابر بیشتر است. محتوای فنل و فلاونوئید کل این نمونه نیز نسبت به دو نمونه دیگر تفاوت قابل ملاحظه ای نشان می دهد. نتایج به دست آمده از این مطالعه با نتایج کارهای تحقیقاتی انجام شده بر روی نمونه های بره موم ترکیه (4) و مراکش (13) مطابقت دارد. اما مطالعه انجام شده بر روی چندین نمونه بره موم کره­جنوبی، هیچ نوع ارتباطی را بین فعالیت آنتی­کولین­استرازی و محتوای فنل و فلاونوئید کل نمونه ها نشان نمی دهد (48).

با توجه اینکه مقالاتی مبنی بر فعالیت آنتی­کولین­استرازی فلاونوئیدها وجود دارد (25، 26) ممکن است بخشی و یا تمام فعالیت آنتی کولین استرازی مشاهده شده برای نمونه لاله زار و (دو نمونه دیگر) مربوط به فلاونوئیدها باشد. البته پاسخ دقیق به این سوال، نیازمند مطالعات بسیار گسترده تر در این زمینه می باشد. بدین منظور باید اجزای تشکیل دهنده هر عصاره به طور دقیق شناسایی و فعالیت آنتی­کولین­استرازی هر یک از این اجزا تعیین شود.

به طور کلی، نتایج به دست آمده از این کار تحقیقاتی (جدول 3) نشان دهنده آن است که نمونه لاله زار نسبت به دو نمونه راین و سرآسیاب، از محتوای فنل و فلاونوئید کل، فعالیت آنتی­اکسیدانی و آنتی­کولین­استرازی بسیار بالاتری برخوردار است. این در حالی است که محتوای فنل و فلاونوئید کل نمونه سرآسیاب و همچنین فعالیت آنتی اکسیدانی آن به میزان کمی از نمونه راین بالاتر است، اما فعالیت آنتی­کولین­استرازی آن نسبت به این نمونه تا حدی پایین تر می­باشد. بنابراین باتوجه نتایج به دست آمده به نظر می رسد نمونه بره موم منطقه لاله­زار کرمان، پتانسیل بسیار خوبی برای بررسی و مطالعات بیشتر دارد. به ویژه شناسایی دقیق و جداسازی ترکیبات آنتی­کولین­استرازی این نمونه، به منظور معرفی و طراحی داروهای جدید برای آلزایمر از اهمیت خاصی برخوردار است.

تشکر و قدردانی

مقاله حاضر بخشی از پایان نامه دوره کارشناسی ارشد مصوب دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان می باشـد که بدین وسیله نویسندگان از حمایتهای آن دانشگاه تشکر می نمایند.