بررسی اثر پروبیوتیکی Bifidobacterium bifidum بر روی رده سلولهای سرطانی CacoII 

حمیده محمودی اصل زاده^*،1، محمد رضا فاضلی²، اکرم عیدی¹، نسرین صمدی²، حسین جمالی فر²، لادن پارساسرشت¹

¹ تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

² تهران، دانشگاه تهران، دانشکده داروسازی، گروه کنترل دارو وغذا

تاریخ دریافت: 17/12/88             تاریخ پذیرش: 18/8/90 

چکیده

پروبیوتیکها مکمل خوراکی میکروبی زنده هستند . اثرات مفید مختلفی به پروبیوتیکها نسبت داده می شود. جالب ترین و بحث انگیزترین این اثرات در خصوص اثر پروبیوتیکها بر روی سرطان می باشد. در این تحقیق اثر پروبیوتیکی Bifidobacterium bifidum روی سلولهای سرطانی CacoII (رده سلولی سرطانی روده بزرگ) بررسی شد . برای این کار محیط کشت آبگوشتی MRS از باکتری Bifidobacterium bifidumآماده و از کشتهای 48،24 و 72 ساعت، دو سوپرناتانت تهیه شد به طوری که یکی از سوپرناتانت ها دارای pH اسیدی(4pH=) و یکی از آنها توسط NaOH  1N خنثی شد(7 pH=). غلظتهای 200،100 و 300 میکرولیتر/میلی لیتر از سوپرناتانت ها روی سلولهای سرطانی CacoII کشت شده در میکروپلیت 96 خانه ای اثر داده شد. نتایج به دست آمده نشان داد که در صد مهاری سوپرناتانت Bifidobacterium bifidum  روی سلولهای سرطانی ، 55 درصد تا 82 درصد بوده که مربوط به غلظت  100  میکرولیتر / میلی لیتر (24 ساعت) و 300 میکرولیتر/میلی لیتر (72 ساعت ) بوده است. اثر مهاری سوپرناتانت ها رابطه مستقیم با غلظت داشت و مستقل از اسیدی بودن سوپرناتانت ها بود .

واژه های کلیدی: پروبیوتیک، Bifidobacterium bifidum ، سرطان کولون،سلولهای CacoII

* نویسنده مسئول، تلفن: 22360802 ، پست الکترونیکی:  hamide.mahmudi2008@yahoo.com

مقدمه

سرطان روده بزرگ مسئله جدی سلامت است و عامل بیشترین  مرگ و میر سرطان در دنیاست.عوامل موثر در سرطان روده بزرگ عوامل ژنتیکی و عوامل محیطی است که رژیم غذایی نامناسب شامل چربی زیاد، فیبر کم ،کربوهیدرات کم از عوامل محیطی ایجاد کننده می باشد (6 و 9).

طیف وسیعی از گونه های باکتریایی در اغلب فعالیتهای فیزیولوژیکی و متابولیکی و عملکرد روده نقش دارند.پروبیوتیکها یک مکمل خوراکی میکروبی زنده هستند که به دلیل ایجاد تعادل میکروبی و تعادل غذایی در روده انسان مفید می باشند(3). گونه های باکتریایی که به عنوان پروبیوتیک  استفاده می شوند باکتریهای اسید لاکتیک اند که بیشتر از جنس لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتر می باشند. بیفیدو باکتر ها باکتریهای گرم مثبت، بی هوازی، غیر متحرک، فاقد قدرت اسپورزایی، کاتالاز منفی هستند که محیط زندگی عادی آنها ناحیه کولون لوله گوارش انسان و حیوان است و تعداد آنها به جز هنگام کهولت سن که کاهش می یابد، ثابت است. ولی عواملی مثل رژیم غذایی، آنتی بیوتیکها و استرس هم می تواند باعث تغییر در تعداد آنها شود (10). پروبیوتیکها مواد مختلفی تولید می کنند که هم برروی گرم مثبتها وهم روی گرم منفیها اثر می گذارند و شامل اسیدچرب با زنجیره کوتاه مثل استات، لاکتات، سوکسینات، بوتیرات،H₂O₂  و ترکیبات باکتریوسین می باشد. پروبیوتیکها با اتصال به جایگاههای اتصال موجود در سلولهای پوششی، رقابت با باکتریهای پاتوژن برای دریافت مواد مغذی، کاهش pH ، تولید باکتریوسین و  H₂O₂ از حضور این باکتریهای مضر در روده جلوگیری می کنند (12).

فعالیتهای ضد سرطانی پروبیوتیکها از آزمایشات و مطالعات in vitro به دست می آید. در کارهای in vivo هم نشان داده شده که پروبیوتیکها در سرکوب زخمهای نئوپلاستیک اولیه و تومورهای سرطانی در مدلهای موش نقش دارند. اثرات ضد سرطانی پروبیوتیکها از طریق جلوگیری از تبدیل پروکارسینوژن به کارسینوژن، اتصال و غیر فعال کردن ترکیبات میتوژنی، کاهش رشد باکتریهای پروکارسینوژنز، کاهش جذب میتوژنها و افزایش عملکرد سیستم ایمنی می باشد(14). با توجه به تأثیر میکروفلور روده در کاهش توسعه سرطان روده، تولید انواع جدیدی از فراورده ها  که ضمن جلوگیری از ایجاد سرطان، باعث مهار سلولهای سرطانی شده و هیچ اثر مخربی بر روی سلولهای سالم نداشته باشد امری مهم به نظر می رسد. بدین جهت سعی بر این است که از پروبیوتیکها به این منظور استفاده شود. پروبیوتیکها از طریق تحریک سیستم ایمنی بدن، از بین بردن آنزیمهای مخرب و سرطان زا مثل اسید های صفراوی ثانویه و مواد موتاژنی که توسط باکتریهای روده ایجاد می شوند، می توانند در جلوگیری از سرطان کولون نقش مهمی را بازی کنند (15).

مواد و روشها

کشت باکتری: Bifidobacterium bifidum از آزمایشگاه تحقیقات پروبیوتیک دانشکده داروسازی دانشگاه تهران تهیه شد و مواد مورد استفاده برای کشت باکتری از شرکت  Merck آلمان بود. باکتری توسط آزمایشات بیوشیمیایی شامل بررسی مورفولوژی کلنی، رنگ آمیزی Gram، تست کاتالاز و تست تخمیر قندها  از نظر صحت جنس و گونه مورد بررسی قرار گرفت. برای تهیه سوپرناتانت،  Bifidobacterium bifidum با غلظت cfu/ml  10³×1/3 در 300 میلی لیتر محیط کشت مایع (DE Man ,Rogosa & Sharpe)MRS کشت داده شد و در شرایط بی هوازی (شرایط بی هوازی با جار بی هوازی تعبیه شد) در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. بعد از هر 24 ساعت (تا 72 ساعت)  pH محیط کشت و total count (به روش پورپلیت) محیط کشت حاوی  Bifidobacterium bifidum جداگانه اندازه گیری شد. در هر زمان 50 سی سی از محیط کشت حاوی Bifidobacterium bifidum در rpm 13000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ(ساخت Heraeus) شد و مایع رویی از فیلتر 22/0 میکرومتر گذرانده شد. بدین ترتیب سوپرناتانت های 24، 48 و 72 ساعت تهیه شد. هر کدام از سوپرناتانت ها به دو قسمت تقسیم شد بطوری که یکی از سوپرناتانت ها دارای pH نرمال (4=pH  ) و یکی از آنها با استفاده از NaOH 1N خنثی شد (7= pH). در نهایت 6 سوپرناتانت به دست آمد و از همه آنها ذخیره فریزری تهیه شد.

کشت سلول: سلولهای سرطانی CacoII (Human colonic adenocarcinoma cells)  از ذخیره سلولی آزمایشگاه پروبیوتیک دانشکده داروسازی دانشگاه تهران و مواد مورد استفاده برای کشت سلول از شرکت GIBCO آمریکا بود. یک اپندورف ذخیره فریزری سلول Caco2 به داخل فلاسک حاوی محیط کشت سلولی (Roswell Park Memorial Institute) RPMI غنی شده با 10 درصد  Fetal bovine serum (FBS)،  mM 2 L گلوتامین، Uml^-1 100 پنی سیلین و mgml^-1100 استرپتومایسین کشت داده شد. فلاسک حاوی سلول در داخل انکوباتور 37 درجه با 5 درصد CO₂ به مدت 72 ساعت انکوبه شد. بعد از 72 ساعت  برای ادامه رشد، سلولها پاساژ(Subculture) داده شدند. برای این کار  از تریپسین 1X برای جداسازی سلولها از دیواره فلاسک استفاده کرده و بعد از جداسازی با محیط RPMI رقیق شد. سوسپانسیون حاصل در rpm 15000 دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل از سانتریفیوژ در مقداری RPMI تعلیق شده و تعداد سلولها با استفاده از رنگ تریپان بلو و لام نئوبار در 1 میلی لیتر شمارش شد.

کشت سلول در میکروپلیت 96 خانه ای و بررسی اثر سوپرناتانت باکتری روی کشت سلولی CacoII: در 3 میکروپلیت 96 خانه ای، در داخل هر خانه از میکروپلیت ها 100 میکرولیتر از محیط کشت سلولی که حاوی 8000 سلول بود ریخته شد. در یکی از میکروپلیت ها از هر 6 سوپرناتانت به دست آمده  100 میکرولیتر/میلی لیتر در دومی 200 میکرولیتر/میلی لیتر و درسومی 300 میکرولیتر/میلی لیتر و از هر کدام 3 تکرار به خانه ها اضافه شد. و در یک ردیف از هر میکروپلیت  که شاهد مثبت در نظر گرفته شد سلولهایCacoII  با همان میزان ذکر شده به همراه محیط کشت  RPMI تلقیح شدند و به عنوان شاهد منفی به یک ردیف از میکروپلیت ها محیط کشت RPMI  تلقیح شد. بعد از 72 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه با 5 درصد CO₂ میکروپلیت ها با کریستال ویوله رنگ آمیزی و تثبیت شدند و سلولهای مرده با شستشو حذف شدند. میزان جذب نوری سلولهای رنگ شده CacoII  در طول موج  nm 570 به وسیله دستگاه Elisa reader(anthos 2020) اندازه گیری شد و سپس با استفاده از محاسبات ریاضی و جذب نوری سلولهای شاهد در صد سلولهای زنده محاسبه شد.

آنالیز آماری: اعداد به دست آمده از دستگاه Elisa reader با استفاده از نرم افزار آماری ANOVA تجزیه تحلیل شد و اختلاف معنی دار(0001/0 < ارزش P)، بین سه فاکتور زمان، غلظت و pH  به دست آمد.

نتایج

در شناسایی باکتری از نظر صحت جنس و گونه، کلنیهای باکتری، گرد، محدب، سفید و پر و بعد ار رنگ آمیزی Gram در زیر میکروسکوپ  باکتریهای گرم مثبت، به صورت میله ای، میله خمیدۀ، میله تجمعی یا میله ای Y شکل و به رنگ آبی دیده شد. تست کاتالاز منفی بود و در نهایت نتایج تست تخمیر قندها و مقایسه با جدول برگی برابر با Bifidobacterium bifidum بود (1).

در بررسی کشت باکتری Bifidobacterium bifidum مشخص شد که با افزایش زمان، کاهش pH روی می دهد که خود می تواند عاملی در کاهش رشد باکتری باشد به طوری که در زمان 0، pH 5/6  و تعداد باکتریهای زنده10³×1/3  ، در 24 ساعت pH به حدود 5/4 رسیده و تعداد باکتریهای زنده 10⁸×7/5، در 48 ساعت pH به 4 رسیده و تعداد باکتریها به 10⁹×8/3 ودر 72 ساعت pH به زیر 4 رسید و عملاً هیچ رشدی از 48 تا 72 ساعت صورت نگرفت و حتی برخی از باکتریها هم از بین رفته و تعداد باقیمانده به10⁸×1/4 رسیده است (شکل 1).

در بررسی اثر پروبیوتیکی سوپرناتانت ها ی 24، 48 و 72 ساعت Bifidobacterium bifidum با دو pH 4 و 7 در سه غلظت 100، 200 و 300 میکرولیتر/میلی لیتر روی سلولهای سرطانی  CacoIIاعداد به دست آمده پس از بررسی در نرم افزار آماری ANOVA تجزیه و تحلیل شد و انحراف معیار 75/0 و R² نیز 9950/0 به دست آمد (جدول1). نتایج به دست آمده نشان داد که این سوپرناتانت ها توانایی مهار رشد سلولهای سرطانی را داشتند .

اختلافات معنادار بین سوپرناتانت های 24، 48، 72 ساعته و بین غلظت 100، 200 و 300 میکرولیتر بر میلی لیتر بود به طوری که سوپرناتانت 72 ساعته نسبت به 48 ساعته و آن هم نسبت به 24 ساعته اثر مهاری بیشتری داشت. غلظت 100 میکرولیتری/میلی لیتر، سوپرناتانت 24 ساعته 55 درصد و سوپرناتانت 48 ساعته حدود 59 درصد و سوپرناتانت 72 ساعته تا 61 درصد رشد سلولهای سرطانی CacoII را مهار کرد. در غلظت 200 میکرولیتری/میلی لیتر، سوپرناتانت 24 ساعته حدود 66 درصد، سوپرناتانت 48 ساعت حدود 70 در صد و سوپرناتانت 72 ساعته تا 72 درصد از  سلولهای سرطانی CacoII را توانست مهار کند. در غلظت 300 میکرولیتری/میلی لیتر، سوپرناتانت 24 ساعته 76 درصد، سوپرناتانت 48  ساعته حدود 79 درصد و سوپرناتانت 72 ساعته توانست تا 82 درصد رشد سلولهای سرطانی CacoII را مهار کند. در بین غلظتهای 100، 200 و 300 میکرولیتر/میلی لیتر ،غلظت 300 میکرولیتر/میلی لیتر بیشتر از 200 میکرولیتر /میلی لیتر و آن هم بیشتر از 100 میکرولیتر/میلی لیتر بر روی رشد سلولهای سرطانی اثر کرد به طوری که بیشترین اثر مربوط به غلظت 300 میکرولیتر/میلی لیتر بود که 82 درصد رشد سلولهای سرطانی را مهار کرد(شکل 2) ولی بین4= pH و 7= pH اختلاف معنی داری وجود نداشت و سوپرناتانت اسیدی اثر مهاری مشابه با سوپرناتانت خنثی داشت.

شکل 1 - تغییرات pH و total count در مدت زمان 72 ساعت از کشت باکتری Bifidobacterium bifidum در محیط آبگوشت MRS در دمای 37 درجه سانتی گراد (اعداد گزارش شده میانگین 3 نمونه اندازه گیری شده است).

جدول 1-  محاسبات آماری در تعیین اختلاف معنی دار بین سه فاکتور زمان ، غلظت و pH به وسیله نرم افزار آماری ANOVA

شکل2- اثر سوپرناتانت های 24، 48، 72 ساعته بیفیدوباکتریوم بیفیدوم و غلظتهای متفاوت 100، 200 و 300 میکرولیتری/میلی لیتر روی رشد سلولهای سرطانی CacoII( p<0.0001 معنا دار در نظر گرفته شده است و  C'',C',C,B'',B',B ,A'',A',Aبا هم تفاوت معنادار دارند)

بحث 

در این تحقیق اثر پروبیوتیکی Bifidobacterium bifidum روی سلولهای سرطانی CacoII مورد بررسی قرار گرفت و نتایج به دست آمده نشان داد که سوپرناتانت Bifidobacterium bifidum توانایی مهار رشد سلولهای سرطانی کولون را دارد. مطالعات اپیدمیولوژی انجام شده در فنلاند توسط Malhotra در سال 1977 بیان کرد که علی رغم مصرف چربی بالا، سرطان کولون کمتر از کشورهای دیگر وجود دارد و آن به دلیل مصرف زیاد شیر، ماست و دیگر فراورده های لبنی است (11). در مطالعات in vitro  در سال 1995 توسط Laurent Baricault ، تأثیر شیر تخمیر شده با4 نوع باکتری مختلف پروبیوتیکی به طور جداگانه روی سلولهای سرطانی HT29 (سلولهای سرطانی رکتوم) بررسی شد و  مشاهده شد که Bifidobacterium و L. helaventicus بیشترین تأثیر را روی مهار رشد سلولهای سرطانی داشته و تا 50 درصد رشد سلولهای سرطانی را مهار کردند. همچنین نشان داده شد که دی پپتیدیل پپتیداز، یک مارکر حساس و مؤثر در تمایز HT29 نقش دارد و 3 آنزیم دیگر مؤثر سوکراز،N آمینوپپتیداز و آلکالین فسفاتاز به طور محسوسی افزایش پیدا کرد. او پیشنهاد کرد که تولیدات این باکتریها می تواند روی رشد و تمایز سلولها تأثیر داشته باشد (7). طی مطالعه ای توسط Biffi در سال 1997 روی اثر مهاری 5 گونه مختلف از باکتریهای اسید لاکتیک روی سلولهای سرطانی سینه (MCF7) ، مشاهده شد که هر 5 گونه باکتری Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei  روی رشد سلولهای سرطانی اثر مهاری داشته و بیشترین اثر مربوط به Lactobacillus acidophilus و Bifidobacterium infantis بود که تا 85 در صد رشد سلولهای سرطانی را مهار کرد. همچنین نشان داد  که وجود خود باکتریها به طور زنده تأثیری نداشته و دلیل این عمل را به تولید ترکیبات ضد توموری و ضد توسعه سرطانی توسط این باکتریها نسبت داد (2). طی بررسی در سال 2008 توسط Yunakim ، سوپرناتانت B. spmo212 ، تکثیر سلولهای سرطانی روده انسان HT-29,SW480,CacoII را مهار کرد (18). در سال 2009 Elise L. Ma نشان داد که ترکیبات تولیدی توسط  Bacillus polyfermenticus رشد سلولهای سرطانی HT29 و سلولهای سرطانی CacoII  را به ترتیب  56-35 درصد و 95 تا 99 درصد مهار کرد. او نشان داد  که افزایش بیان پروتئینهای ErbB2 و ErbB3 در سلولهای سرطانی کولون تحت اثر متابولیتهای این باکتری کاهش یافتند و نتیجه گرفت  که متابولیتهای باکتری نسخه برداری از این فاکتور ها را کاهش می دهند (5). همچنین در این تحقیق نشان داده شد که خنثی کردن سوپرناتانت تفاوت معناداری در اثر مهاری آن نداشت. می توان گفت که حالت اسیدی سوپرناتانت عامل اصلی مهار رشد سلولی نبوده است و احتمالاً  ترکیبات غیر اسیدی در این مهار نقش داشتند. در طی مطالعه ای ، Zoran D.etal در سال 1997 نشان داد که بوتیرات تولیدشده توسط باکتریهای اسید لاکتیک در کولون نقش ضد کارسینوژنژی داشته و می تواند آپوپتوز و تمایز سلولهای کولونی را تنظیم کند (19). در سال 2008، توسط Do Kyony Lee مهار رشد سلولهای توموری به وسیله بوتانول استخراجی از B. adolescentis را نشان داد  و در این مطالعه غلظت 20 میکرولیتری از بوتانول تا 70 درصد توانست سلولهای سرطانی CacoII را از بین ببرد (8). به طور کلی می توان گفت مکانیسمهای مؤثر در مهار رشد سلولهای سرطانی CacoII توسط ترکیبات Bifidobacterium bifidum کاملاً مشخص نیست ولی با توجه به مطالعاتی که قبلاً در موارد مشابه انجام شده می توان گفت که این باکتریها ترکیبات ضد توموری و ضد سرطانی تولید می کنند که می توانند در رشد و تمایز سلولهای سرطانی نقش داشته و از رشد آنها جلوگیری کند . با توجه به نتایج به دست آمده  مشاهده شد که سوپرناتانت 72 بیشترین اثر را داشت که این می تواند به دلیل مقدار بیشتر متابولیتهای تولید شده در سوپرناتانت باشد (4). در سال 2006 ،Vander Meulen  بیان کرد که با افزایش در تعداد باکتریها مقدار مواد تولیدی آنها نیز افزایش می یابد و در فاز ثابت مقدار این متابولیتها ثابت است (16). برخی از قطعات سلولی می تواند اثر ضد توموری داشته باشد. در سال 1995 ، Sekine اثر ضد توموری گلیکوپروتئین های جدا شده از B. infantis را مشاهده کرد (13). همچنین You در سال 2004 نشان داد که سلول و عصاره سیتوپلاسمی BGN4   Bifidobacterium bifidum ایزوله شده از مدفوع انسانی می تواند اثر مهاری روی سلولهای سرطانی داشته باشد و همین طور قطعات پلی ساکاریدی جدا شده از BGN4 Bifidobacterium bifidum روی رشد سلولهای سرطانی در in vitro  نقش مهاری داشت (17).

نتایج این تحقیق نشان داد که اثر مهاری وابسته به غلظت بود و غلظت 30 میکرولیتری تا 80 در صد از رشد سلولهای توموری را مهار کرد . تأثیر غلظت تولیدات باکتری تاکنون گزارش نشده و تنها در سال 2008، Do Kyony Lee منع رشد سلولهای توموری را به وسیله بوتانول استخراجی از B. adolescentis نشان داد. در این مطالعه نیز غلظت 200 میکرولیتر/میلی لیتر از بوتانول توانست 70 درصد سلولهای سرطانی CacoII را از بین ببرد (8).