اثر میدان‌های الکترومغناطیسی با فرکانس بسیار پایین‌ بر بیان ژن های miR-21   و
 miR-29 در رده‌های سلولی سرطان معده

الهام سیاسی^1*، الهه منیری¹ و سهیلا عبدی²

¹ ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک.

² ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد صفا دشت، گروه فیزیک

تاریخ دریافت: 19/01/1399          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

مطالعات بیوالکترومغناطیس و نقش تابش‌های میدان‌های الکترومغناطیس با فرکانس بسیار پایین از عوامل محیطی مهم در بروز و درمان سرطان ها می‌باشد. در این مطالعه تغییرات بیان miR-21 و miR-29 در رده سلولی سرطان معده تحت تأثیر تابش میدان‌های الکترومغناطیس با شدت‌های 25/0 و 5/2 میلی تسلا در دو نوع تابش پیوسته و ناپیوسته بررسی شد. رده سلولی سرطانی معده، تحت تابش میدان الکترومغناطیسی در دو شدت میدان 25/0 و 5/2 میلی تسلا و دو نوع تابش پیوسته و ناپیوسته قرار گرفتند و با یک گروه کنترل که تحت تابش قرار نداشت، مقایسه شدند. پس از استخراج RNA از سلول ها، سنتز cDNA انجام شد و با استفاده از روش Real Time PCR  تغییرات بیان دو microRNA بررسی و نتایج انالیز اماری شدند. بر اساس نتایج میزان بقای سلول ها در تابش میدان‌های الکترومغناطیسی نسبت به کنترل کاهش معنی‌داری نشان داد. افزایش میزان بیان miR-21 و miR-29  در هر دو میدان‌ الکترومغناطیسی با افزایش شدت میدان معنی دار بود. همچنین با افزایش بیان miR-21 و miR-29 در هر دو نوع تابش میزان زنده ماندن سلول‌ها کاهش معناداری نشان داد. نتایج مشخص نمود تابش میدان‌های الکترومغناطیس با فرکانس بسیار پایین در رده سلولی سرطان معده سبب افزایش بیان miR-21 و miR-29 شده که تایید تحقیقات بیشتر می تواند آن را بعنوان بیومارکر مولکولی برای سرطان معده مطرح نماید.

واژه های کلیدی: سرطان معده، تابش میدان‌های الکترومغناطیس، miR-21 , miR-29، رده سلولی سرطان معده.

* نویسنده مسئول، تلفن:   09124056746  ،  پست الکترونیکی: emi_biotech2006@yahoo.ca

مقدمه

آدنوکارسینوم معده (Gastric adenocarcinoma) یکی از مهم‌ترین علت مرگ‌ و میر ناشی از سرطان در جهان می‌باشد. بر اساس حالات مورفولوژی به دو نوع روده ای و نفوذی تقسیم بندی شده است و مطالعات نشان داده است که شیوع آن در مردان با فرم روده ای و در زنان با فرم نفوذی همراه است (12 و 36 و 44).  دلایل بیماری سرطان معده تاکنون به‌ طور روشن مشخص نشده است. با این‌وجود یک سری از فاکتورهای محیطی بعنوان عامل خطر برای ابتلا به این سرطان مورد بررسی قرارگرفته اند، از جمله: مواد غذایی، نیترات‌ها، غذاهای مانده به همراه سیگار، الکل، دیابت، سن و جنس، چاقی و بیماری های زمینه ای دستگاه گوارش همچون ابتلا به باکتری هلیکوباکتر پیلوری که یکی از شایع‌ترین پاتوژن‌های باکتریال در انسان است (1 و 18 و 26 و 36).  فاکتورهای ژنتیکی نیز در ابتلا به بیماری نقش دارند، همچون افراد دارای گروه خونی A، کم‌خونی، سابقه‌ی خانوادگی سرطان معده، افراد مبتلا به سرطان کولون و سندروم لی فرامنی و سندروم پوتزجگر (Peutz–Jeghers syndrome) و افرادی که دارای جهش و پلی مورفیسم در ژن  CDH1 می‌باشند (22 و 36 و 38). علاوه بر این موارد تغییرات دیواره معده و نقص در اسید معده، گاستریت آتروفی اتوایمون مزمن (تیپ A) که یک التهاب طولانی‌ مدت معده توسط حمله‌ی اشتباه سیستم ایمنی بدن برعلیه خود بدن است، انمی‌بدخیم پرنشیوز (Pernicious anemia) که نوعی کم‌خونی و کمبود ویتامین B12 می‌باشد، پولیپ های معده‌ای آدنوماتوز (Adenomatous) و التهابات شیارهای بزرگ معده از ریسک فاکتورهای سرطان معده می باشند (12 و 38).

در سال های اخیر تحقیقات فراوانی در زمینه microRNAها و نقش آن‌ها در فرآیندهای طبیعی سلولی و مولکولی موجودات زنده صورت گرفته است (3 و 41). دلایلی متعددی وجود دارند که ثابت می‌کند miRNA می‌تواند بیومارکرهای مناسبی در تشخیص و پیش اگهی سرطان‌ها باشند، زیرا microRNAها نقش مهمی در تنظیم فرآیندهای حیاتی نظیر، کنترل چرخه ی سلولی، تکثیر سلول، مهاجرت، تمایز، آپوپتوز، التهاب و متاستاز دارند و تغییرات انها می تواند در پیشبرد یا مهار سلول های سرطان دخالت داشته باشد  (5 و 6 و 23 و 28).  حضور miRNAها در گردش خون می‌تواند به علت مرگ و لیز سلول‌ها باشد و یا توسط سلول‌های توموری به محیط خونی آزاد ­شوند. بنابراین، حضور انها در گردش خون نه تنها مارکر مولکولی برای تشخیص سرطان معده هستند، بلکه با تنظیم ژن‌های هدف مختلف در مسیرهای سیگنالینگ می توانند در تکثیر، تومور زایی و متاستاز سرطان معده نقش داشته باشند ( 39 و 46). دسته ای از microRNAها در سرطان معده با تنظیم مثبت دارای افزایش بیان شده و نقش انکوژنیک دارند و دسته دیگر با تنظیم منفی دچار کاهش بیان می شوند و سرکوبگر تومر هستند (14 و 37 و 40 و 42 و 45).  در این بین، miR-21 یکی از با سابقه ترین microRNAها با نقش بیومارکر مولکولی در امر تشخیص سرطان معده می‌باشد (  4  و 17 و 30 و 40 و 47 و 50 ). این مولکول، یک microRNA چند منظوره می‌باشد که در سرطان‌های مختلف از جمله روده، پستان، پانکراس و پروستات و همین طور سرطان معده شاهد تغییرات تنظیمی و اغلب به‌صورت افزایش بیان می‌باشد ( 2 و 6 و 11 و 31 ).  ژن هدف miR-21، تومور ساپرسورهایی از جمله ژن PTEN و پروتئین PDCD4 می‌باشد. در نتیجه با مهار این دو تومور ساپرسور توسط  miR-21  تکثیر و مهاجرت سلول‌های سرطانی معده افزایش یافته و آپوپتوز سلول‌های سرطانی معده مهار می‌ گردد ( 17 و 30 و 49).  یکی دیگر از microRNAها در تشخیص سرطان معده، miR-29 است که در سرطان های مختلف نقش انکوژنی یا تومورساپرسوری دارد و بر اساس تحقیقات در رده سلولی سرطان معده میزان بیان آن کاهش می یابد (13 و 16 و 23 و 40 ).  MiR-29 از طریق هدف قرار دادن ژن CCND2 و ژن‌های متالوپروتئیناز 2 نقش تومور ساپرسوری داشته و با کاهش بیان این microRNA بیان این دو ژن هدف کاهش می یابد، در نتیجه سبب افزایش مهاجرت و متاستاز در سلول‌های سرطانی می گردد (16 و 34 و 48). 

مطالعات نشان داده است تابش میدان‌های الکترومغناطیس می‌تواند با تأثیر بر غشای سلول و تغییر در کانال های غشای سلولی از جمله کانال کلسیم، تغییرات قابل توجهی در پتاسیل الکتریکی غشا ایجاد نماید و واکنش های سلولی را در پی داشته باشد.  تأثیر بر مسیرهای پیام رسانی سلولی از طریق تغییرات یون کلسیم از دیگر مکانیسم های اعمال اثر میدان‌های الکترومغناطیس می‌باشد. همچنین میدان الکترومغناطیس می‌تواند با تأثیر بر فاکتورهای رونویسی و یا تغییر در هر یک از فاکتورها یا سایر عوامل مؤثر مثل آنزیم های دخیل در روند رونویسی، منجر به تغییر بیان ژن‌ها ‌گردد.  همچنین تابش میدان الکترومغناطیس با فرکانس بسیار پایین، درصورتی ‌که ناپایداری مولکول‌ها کاهش یابد می‌تواند با ایجاد تغییرات در سطح اسپین های اتم های مولکول ها و تغییر آن‌ها منجر به ایجاد رادیکال‌های آزاد مختلف در سلول‌ها با نقش اکسیداتیو استرس گردد. تولید رادیکال های آزاد تحت تابش میدان‌های الکترومغناطیس با فرکانس بسیار پایین می‌تواند منجر به تغییر در چرخه های موثر در تمایز و اپپتوز، ترمیم DNA و تغییر بیان مولکولی microRNA ها گردد (8 و 9 و 15 و 33).  با توجه به مطالب فوق و بنابر مطالعات انجام شده در این خصوص، میدان های الکترومغناطیسی با تاثیر بر عملکرد microRNA ها می توانند به ‌عنوان بیومارکرهای تشخیصی در سرطان ها مطرح باشند (7 و 19 و 20 و 24 و 27 و 32 و 43).  بنابراین هدف از این تحقیق بررسی تغییرات سطح بیان miR-21 و miR-29 در رده سلولی سزطان معده که تحت تابش میدان‌های مغناطیسی با فرکانس بسیار پایین قرار گرفته اند، بود تا بتواند بعنوان روش تشخیصی، پیش اگهی و درمانی برای بیماران مبتلا به سرطان معده مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روشها

نمونه ها – این تحقیق به روش بنیادی کاربردی و در بازه زمانی سال های 1397-1398، درمحل انستیتو کنسر بیمارستان امام خمینی تهران انجام شد. با توجه به اهداف پژوهشی در 5 گروه شامل یک گروه کنترل که تحت تابش میدان الکترومغناطیس نبوده است و 4 گروه  ازمایش که تحت تابش با دو شدت میدان (25/0 و 5/2 میلی تسلا) و دو نوع تابش پیوسته و نا پیوسته قرارگرفتند.، انجام شد. برای گروه های مورد ازمون از رده سلولی سرطان معده استفاده شد.

میدان الکترومغناطیسی و تنظیم سیستم تابش میدان الکترومغناطیس- سیستم مورداستفاده برای القای میدان مغناطیسی شامل استوانه ای از جنس P.V.C به قطر 12 سانتی متر و طول 30 سانتی متر بود که بر روی آن 1200 دور سیم مسی به قطر 1 میلی متر در 4 ردیف پیچیده شده بود. برای تولید میدان‌های مغناطیسی پیوسته از منبع تغذیه DC (سنجش، ساخت ایران) استفاده شد و برای ایجاد میدان‌های الکترومغناطیسی نا پیوسته از منبع تغذیه AC، (delta، ساخت چین) استفاده شد. میدان‌های مغناطیسی داخل سیم لوله به وسیله تسلا متردیجیتالی ( Holladay three-D sensor ، ساخت امریکا) اندازه گیری شد. در میدان 5/2 میلی تسلا افزایش شدت جریان باعث افزایش دما در داخل سیم لوله می شد. از آن جایی که سلول‌ها در دمای بالاتر 39 درجه سانتی گراد آسیب می‌بینند‌، برای کنترل دمای داخل سیم لوله علاوه بر این که سیم لوله به داخل انکوباتور 37 درجه سانتی گراد منتقل شد، یک هواکش کوچک در پایین آن قرار گرفت. همچنین پایه چوبی به ارتفاع 15 سانتی متر برای سیم لوله طراحی شد تا با سطوح فلزی انکوباتو تماس نداشته باشد و در فضای مرکزی انکوباتور به‌ صورت ثابت قرار گیرد.

تهیه رده‌های سلولی سرطان معده- رده سلولی سرطان معده (AGS) با مشخصه (IBRC-C10071)، از مرکز ذخایر ژنتیک ایران، تهیه گردید. برای کشت سلول‌های سرطان معده، از محیط کشت حاوی ترکیبات : DMEM high glucose 85 درصد (از شرکت (biowest ، پنی سیلین و استرپتومایسین به میزان 1 درصد (تهیه شده از شرکت amgiS)، اسیدهای امینه غیر ضروری به میزان 1 درصد (تهیه شده از شرکت Gibco)، L-گلوتامین به میزان 1 درصد (تهیه شده از شرکت Gibco)، سرم استریل گاوی FBS به میزان 10 درصد (تهیه شده از شرکت Gibco) و تریپسین همراه با EDTA به میزان 25 درصد (تهیه شده از شرکت Invitrogen) استفاده گردید. سپس به‌صورت وابسته به بستر (Anchorage dependent)  یا چسبنده (Adherent) و بر طبق دستورالعمل های موجود در منابع معتبر کشت سلولی در زیر هود کلاس  II و با رعایت نکات استریل انجام شد. به‌منظور نگهداری سلول‌ها در حین کشت سلولی و افزایش تعداد آن‌ها از انکوباتور 97 درجه سانتی گراد با رطوبت 32 درصد و غلظت 5 درصد گاز CO2 استفاده شد.

انتقال فلاسک های حاوی رده سلولی به سیستم میدان الکترومغناطیس داخل انکوباتور جهت پرتودهی- بعد از کشت و پاساژ سلولی، فلاسک ها در روز سوم، زمانی که هر فلاسک حدود یک میلیون سلول داشت برای پرتودهی میدان مغناطیسی به انکوباتور، منتقل شدند. یک نگه دارنده فلاسک در قسمت میانی سیم لوله از جنس فوم که مانعی برای جریان میدان و سلول‌ها در معرض میدان الکترومغناطیسی نباشد، طراحی و ساخته شد. رده های سلولی در پنج گروه که شامل یک گروه کنترل، که داخل انکوباتوری مجزا به ‌صورت شرایط عادی و تحت تابش میدان الکترومغناطیس نبود و  4 گروه‌ ازمایش که شامل 4 عدد فلاسک بودند که تحت تابش میدان الکترومفناطیس حاصل از سیم لوله داخل انکوباتور با مشخصه های متفاوت از نظر شدت میدان و نوع جریان تابش، در بازه زمانی 18 ساعت قرار گرفتند. شرایط قرار گیری سلول‌ها در معرض میدان های الکترومغناطیسی در جدول 1 آورده شده است.

جدول 1- شرایط قرار گیری سلول‌ها در معرض میدان الکترومغناطیسی 25/0 و 5/2 میلی تسلا

سنجش بقای سلولی به روش MTT Assay - پس از پرتوگیری هر گروه، میزان زنده ماندن سلول‌های آن گروه با روش MTT Assay اندازه گیری شد. این روش، یک روش رنگ سنجی برای بررسی تکثیر و بقای سلول‌ها است که بر اساس فعالیت میتوکندری های سلول زنده می‌باشد. فعالیت میتوکندریایی در سلول‌های زنده به‌صورت پایدار است و بنابراین افزایش یا کاهش تعداد سلول‌های زنده به‌صورت خطی با فعالیت میتوکندری درارتباط می‌باشد. رنگ تترازولیموم MTT در سلول‌های فعال (به لحاظ متابولیکی)، إحیا می‌شود. دهیدروژنازهای میتوکندریایی در سلول‌های زنده، حلقۀ تترازولیوم را شکسته و با تولید NADH و NADPH منجربه تشکیل رسوب نامحلول ارغوانی رنگ به نام فورمازان می­شوند. این رسوب می­تواند توسط ایزوپروپانول یا دی متیل سولفواکسید حل شود. از سوی دیگر، سلول‌های مرده، چنین توانایی را نداشته و بنابراین سیگنالی را نشان نمی‌دهند. در این روش، تشکیل رنگ به‌عنوان نشانگر سلول‌های زنده است. شدت رنگ تولید شده، با استفاده از پلیت های 96 خانه ایی که حاوی 100 میکرولیتر از هر یک از 4 گروه محیط های ازمایش در معرض تابش میدان ها و گروه کنترل بدون تابش، به همراه 10 میکرو لیتر رنگ MTT، می باشند با دستگاه microplate reader، و طول موج 540 تا 630 نانومتر اندازه­ گیری شد که به‌طور مستقیم با تعداد سلول‌های زنده متناسب بود.

استخراج RNA- پس از تریپسینه نمودن، سلول ها از کف فلاسک در تمام گروه های مورد ازمون، جدا شدند و با روش تریزول (محلول تریزول تهیه شده از شرکت Invitrogen) ، استخراج RNA انجام شد.

سنجش غلظت، خلوص و کیفیت RNA- برای تعیین غلظت و سنجش خلوص RNA هر نمونه، از دستگاه نانودراپ استفاده شد و  جهت سنجش کیفیت RNA استخراج شده، میزا ن 3 میکرولیتر از نمونه بر روی ژل آگارز با غلظت 5/1 درصد بارگذاری شد. با مشاهده باندهای RNA های ریبوزومی s 18 و 28 s, کیفیت و صحت استخراج RNA تائید شد.

تکثیر microRNA و انجام واکنش  Real Time PCR برای بررسی بیان miR-21 و miR-29 - تکثیر miR-21   و miR-29 و سنتز cDNA با استفاده از کیت تکثیر microRNA پارس ژنوم ساخت ایران و انجام واکنش Reverse Transcription PCR (RT-PCR) صورت گرفت. سپس سنجش بیان دو microRNA مورد مطالعه، با واکنش
Real Time PCR در نمونه‌های سلولی شامل 4 گروه آزمایشی تحت تابش با مشخصات شدت تابش 25/0 و 5/2 میلی تسلا و در دو نوع تابش پیوسته و نا پیوسته و یک گروه فلاسک کنترل که تحت هیچ گونه تابشی قرار نداشتند و ژن رفرنس داخلی U6  با دو بار تکرار انجام شد. مواد و توالی پرایمرهای مورد استفاده برای واکنش Real Time PCR در جول 2 آورده شده است. برنامه دستگاه ترمو سایکلر عبارت بود از : 95 درجه سانتی گراد 5 دقیقه، 95 درجه سانتی گراد 20 ثانیه، 60 درجه سانتی گراد 40 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد 10 ثانیه، که واکنش در تعداد 40 چرخه تکرار شد و دمای Melt curve از 66 تا 95 درجه سانتی گراد بود.

جدول 2- مواد و پرایمرهای مورد استفاده جهت انجام واکنش Real time PCR

آنالیز اماری - نتایج بدست آمده طی واکنش Real Time PCR، با محاسبه ∆CT و سپس ∆∆CT، و درنهایت محاسبه عدد FC= 2^-∆∆CT و میانگین محاسبه شده دو تکرار از هر فلاسک،  مورد آنالیز آماری، با استفاده از برنامه SPSS، قرار گرفت. آزمون Independent-samples t-test ، جهت بررسی داده ها و تعیین میزان معنی‌داری آن‌ها استفاده شد. تمامی داده های حاصل در این بررسی با 2 بار تکرار و در سطح معنی‌داری 05/0< p در نظر گرفته شدند.

نتایج

نتایج بقای سلولی با MTT Assay - نتایج تست MTT Assay  که نشان دهنده ی بقا و زنده ماندن سلول‌ها بود، در شکل 1 آورده شده است. بر اساس نتایج، میزان بقای سلولی در میدان‌های الکترومغناطیسی 25/0 و 5/2 میلی تسلا، نسبت به کنترل کاهش معنی‌داری نشان داد
(p value <0.05).  این کاهش زنده ماندن هم در شرایط تابش پیوسته و هم در شرایط تابش ناپیوسته وابسته به ‌شدت میدان مغناطیسی مشاهده شد و در گروه تابش ناپیوسته میزان بقا به میزان بیشتر کاهش یافت.

شکل 1- بررسی زنده ماندن گروه های ازمون تحت تابش یوسته و ناپیوسته (a- تابش پیوسته و b- تابش ناپیوسته)

نتایج میزان بیان miR-21 و miR-29 با روش Real Time PCR- نتایج اندازه گیری میزان تغییرات بیان miR-21 و miR-29 در رده سلولی سرطان معده پس از تابش دهی در میدان‌های الکترومغناطیسی 25/0 و 5/2 میلی تسلا، بصورت پیوسته و ناپیوسته به مدت 18 ساعت در جدول 3 و شکل 2 نشان داده شده است. بر اساس نتایج بدست آمده، میزان بیان miR-21 و miR-29 در هر دو میدان‌ الکترومغناطیسی ( 25/0 و 5/2 میلی تسلا ) افزایش داشت و با ‌افزایش شدت میدان میزان بیان این دو microRNA اقزایش یافت و این افزایش بیان برای miR-21 و miR-29 در میدان الکترومغناطیسی 5/2 میلی تسلا معنی‌دار بود
(p value <0.05).

جدول 3- تغییرات بیان miR-21 و miR-29 تحت تابش میدان‌های الکترو مغناطیسی 25/0 و 5/2 میلی تسلا، بصورت پیوسته و نا پیوسته

شکل 2- تغییرات بیان miR-21 و  miR-29تحت تابش پیوسته و ناپیوسته میدان‌های الکترو مغناطیسی

(a - شدت 25/0 میلی تسلا و b - شدت 5/2 میلی تسلا)

نتایج همبستگی میزان بیان miR-21 و miR-29 - همبستگی بین تغییرات بیان miR-21 و miR-29 در رده سلولی سرطان معده تحت تابش میدان‌های الکترومغناطیسی 25/0 و 5/2 میلی تسلا، در شکل 3 نشان داده شده است. این نتایج مشخص نمود بین تغییرات بیان miR-21 و miR-29 همبستگی مثبت وجود دارد. یعنی با افزایش بیان هر کدام میزان بیان دیگری نیز افزایش می یابد (R=0.807, p value <0.001).

شکل 3-  همبستگی بین بیان miR-21 و miR-29 در رده سلولی  سرطان معده تحت تابش میدان‌های الکترومغناطیسی

ارتباط بین تغییرات بیان   miR-21 و miR-29 و میزان بقا سلولی - ارتباط بین تغییرات بیان miR-21 و miR-29 و میزان بقای سلولی در رده سلولی سرطان معده تحت تابش میدان‌های الکترومغناطیسی در شکل های 4 و 5  آورده شده است.  بر اساس انالیز اماری میزان بقای سلولی با افزایش بیان miR-21 نسبت معکوس دارد و با افزایش بیان این microRNA چه در شرایط تابش پیوسته (R= -0.918, p value <0.001 ) و چه در شرایط تابش ناپیوسته

 (R= -0.889, p value <0.001)میزان زنده مانی سلول‌ها کاهش یافته است. زنده مانی سلول‌ها با افزایش بیان miR-29 نیز نسبت عکس دارد و با افزایش بیان این microRNA در شرایط تابش پیوسته (R= -0.828, p value <0.001) و هم در شرایط تابش ناپیوسته  (R= -0.800, p value <0.001)  میزان بقای سلولی کاهش نشان داده است.

شکل 4-  همبستگی بین تغییرات بیان miR-21 و miR-29 و میزان بقای سلولی در سلول‌های سرطان معده تحت تابش میدان‌های الکترومغناطیسی به‌صورت پیوسته.

شکل 5-  همبستگی بین تغییرات بیان miR-21 و miR-29 و میزان بقای سلولی در سلول‌های سرطان معده تحت تابش میدان‌های الکترومغناطیسی به‌صورت ناپیوسته.

بحث

سرطان معده ‌یکی از انواع سرطان‌های ناهمگون و با نرخ مرگ میر بالا و نیز از نظر نرخ بقا پایین می‌باشد بطوریکه پنجمین سرطان شایع در دنیا و سومین سرطان عامل مرگ انسانی است (1 و 36 و 43). سرطان معده با دو علت ژنتیک و محیط به‌ عنوان یک بیماری چند عاملی تعریف می‌گردد. این بیماری از دیدگاه پاتوفیزیولوژی مولکولی از دو جنبه ژنتیک و اپی ژنتیک بررسی می‌گردد (1 و 22 و 26 و 36 و 38).  تغییراتی نظیر متیلاسیون، استیلاسیون و داستیلاسیون هیستون ها و یا نقش microRNA، ازجمله تغییرات مهم اپی ژنتیک می‌باشد. در فرایند های مهمی در سلول‌ها microRNA ها نقش دارند و می‌توانند به‌عنوان انکو microRNA یا تومورساپرسور microRNA در سرطان ایفای نقش نمایند (2 و 37  و 39 و 46). بنابراین تحقیقات اخیر نشان داده است از این کوچک مولکول‌های زیستی می‌توان به‌عنوان نوعی بیو مارکرهای مهم در فرایند تشخیص، پیش اگهی و یا درمان انواع بیماری ها از جمله سرطان استفاده نمود (16 و 28 و 31 و 40 ).  از آنجایی که تشخیص زود هنگام سرطان معده توسط تکنیک‌های رایج بسیار پایین است بنابراین نیاز به روش‌های کارآمدتری نسبت به روش‌های موجود نیاز است. درسال های اخیر نقش عوامل محیطی و تاثیرات آن بر عوامل ژنتیکی سرطان به خوبی شناخته ‌شده است، از جمله سبک زندگی افراد، نوع تغذیه، مواد شیمیایی و یا اشعه های مضر و سایر عوامل محیطی که با اثر بر فاکتورهای ژنتیک و اپی ژنتیکی می‌تواند نقش موثری در بروز سرطان ایفا نماید (22 و 26 و 38).  نقش تابش میدان‌های الکترومغناطیس که به ‌صورت امواج مختلف و با شکل های گوناگون انسان ها را در زندگی روزمره تحت تاثیر قرار داده است، اهمیت این موضوع را بر سلامتی و حوزه بیولوژی بیش از پیش با اهمیت نموده است (7 و 9 و 27 و 33 و 43).  با توجه به نقش miR-21 و miR-29 که بترتیب جز microRNA های ایجاد کننده سرطان و مهارکننده و یا تومور انکوژن و ساپرسورژن توموری هستند و اهمیت اثرات تابش میدان‌های الکترومغناطیس بعنوان عامل محیطی مهم بر روی انواع سرطان بویژه سرطان معده، هدف از این تحقیق را که بررسی اثر میدان های مغناطیسی با فرکانس  5/2 و 25/0 میلی تسلا بر بیان miR-21 و miR-29 در رده سلولی سرطان معده بود، مشخص نمود و نتایج حاصل از آن نشان داد که بیان هر دو microRNA در اثر این میدان های مغناطیسی افزایش یافته و این افزایش بیان در میدان 5/2 میلی تسلا نسبت به 25/0 میلی تسلا بطور معنی دار بیشتر بود (p<0.05).

یکی از روندهای تنظیمی ژن‌ها اثرات تنظیم گر microRNAها می‌باشد. توانایی تمایز microRNAها برای کنترل ژن‌های مختلف و مسیرهای سیگنالینگ مختلف به ‌طور همزمان این microRNAها را کاندید مهمی برای هدف تشخیص زود هنگام و درمان بیماری ها بخصوص درزمینۀ سرطان نموده است (14 و 40 و 46).   MiR-21 و miR-29 چندین ژن دخیل در بیماری زایی سرطان را هدف یابی می‍کنند (11 و 16 و 31 و 34). MiR-21 ، microRNA شناخته‌شده ای است که مطالعات بسیار زیادی در مورد آن صورت گرفته است و ثابت شده که در سرطان های مختلف نقش اساسی را ایفا می‌کند. این microRNA. دارای نقش انکوژنی بوده و با اثر تنظیمی بر ژن‌های مهم در مسرهای سیگنالینگ، سلول را به سمت سرطانی شدن پیش می برد (10 و 11 و 17 و 30 و 40 ).  در مطالعه ژانگ و همکارانش در سال 2008 مشخص شد بیان miR-21 در بافت توموری معده افزایش می یابد و  با حذف آن کاهش قابل توجهی در تکثیر، مهاجرت و تهاجم سلول‌های سرطانی و افزایش آپاپتوز مشاهده شد (47).  زنگ و همکارانش افزایش بیان miR-21  را در سلول‌های توموری بیماران سرطان معده نشان دادند. همچنین مشخص نمودند بین افزایش بیان با مرحله‌ی بیماری، متاستاز و اندازه تومور ارتباط معناداری وجود دارد (50).  بر اساس مطالعه‌ای که بر روی 37 بیمار سرطان معده توسط چان و همکارانش در سال 2008 صورت گرفت miR-21  در 92 % بیماران افزایش بیان داشت (4). در مطالعه‌ای که روان و همکارانش بر روی 40 فرد بیمار مبتلا به سرطان معده و 40 فرد سالم انجام دادند افزایش بیان miR-21  و ارتباط معنادار آن با این سرطان و مراحل آن گزارش شد (28). از سوی دیگر مطالعات بسیاری نشان می دهد که miR-29 نقش اساسی در مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با پیشرفت سرطان ها از جمله سرطان معده دارد و نتایج این تحقیقات نشان داده است کاهش بیان این microRNA بطور طور معناداری بر روند این مسیرهای تمایزی و ایجاد سرطان معده تاثیر دارد ( 13 و 16 و 34 و 40 و 48). به دلیل اهمیت ویژه‌ی این microRNA  در مسیر های پیشرفت سرطان مطالعات مختلفی بر روی آن صورت گرفته است. با توجه به مطالعه‌ای که در ارتباط با miR-29 با سرطان پروستات صورت گرفته است کاهش بیان miR-29 در رده‌ی سلولی سرطان پروستات نشان داده شده است (23).  همچنین در مطالعه ایی که به روش سیستماتیک برای ارزیابی وضعیت miR-29 در سرطان پستان صورت گرفته است، این microRNA مهارگر تومور گزارش شده است (6)  باتوجه به اهمیت نقش  miR-29در سرطان های دستگاه گوارش بویژه سرطان کبد مطالعات متعددی انجام شده است و نتایج انها نشان داده که miR-29 دارای یک عملکرد سرکوبگر تومور می‌باشد و این microRNA در سرکوب مهاجرت، تهاجم و رشد سلول‌های سرطانی نقش بسزایی ایفا می‌کند (2 و 10 و 25 و 35). همچنین در مطالعه استیل و همکارانش در سال 2010 نشان داده شده است، بیان miR-29 در سلول های رده سرطان پروستات، با نقش تنظیمی که در هدف گیری مولکول های اغازگر متاستاز و انتی اپپتوزی دارد، می تواند در تهاجم و تکثیر سلولی دخالت داشته باشد. بنابراین می توان از این microRNA بعنوان فاکتور موثر در درمان سرطان پروستات همراه با روش های شیمی درمانی استفاده نمود (34).

در مطالعات متعدد اخیر نقش و تاثیرات شدت میدان‌های الکترومغناطیسی با فرکانس پایین بر روی بافت ها و ارگان‌های بدن نشان داده شده است. این تاثیرات، ارتباط میدان های مغناطیسی را با افزایش سنتز DNA، کاهش در باز جذب استخوان و نگهداری تراکم استخوان، سنتز پروتئین، اتصالات سلولی، کمپلکس ارتباط داخل سلولی و تحریک و ترمیم اعصاب مطرح نموده اند. همچنین نشان داده شده است که در بررسی‌های سلولی و مولکولی یا در سطوح حیوانی، تابش میدان‌های الکترومغناطیسی با فرکانس بسیار پایین، منجر به ایجاد سرطان یا تشدید آن شده و یا بدون تأثیرات خاص بوده و گاهی اثر درمانی، داشته است (7  و 9 و 21 و 27 و 29 و 33 و 43). در این زمینه می توان به مطالعات زیر اشاره نمود. صدوقی در سال 2013 به بررسی اثرات میدان مغناطیسی با فرکانس پایین بر رده سلولی سرطان کولون پرداخت. نتایج تحقیق او مشخص نمود درصد زنده ماندن سلول های سرطانی در مجاورت میدان با شدت 200 و 400 گاوس نسبت به گروه شاهد بطور معناداری کاهش یافته است و مشخص نمود که تابش با این میدان های مغناطیسی می تواند اثر مهاری بر رشد و تکثیر رده سلولی سرطان کولون داشته باشد و سبب کشته شدن این سلول ها گردد (29). لیو و همکاران در دو مطالعه مختلف در سال های 2015 و 2016 مشخص نمودند میدان های مغناطیسی با فرکانس پایین بر عملکرد تولید مثل مردان تاثیرگذار است. آنان بیان microRNA هایی را که بر روی مسیرهای تنظیمی تشکیل سلول جنسی موش مذکر و رده سلولی GC-2 موثر بودند، را پس از تابش با میدان های مغناطیسی بررسی نمودند و تاثیرات اپی ژنتیکی این اثرات را مورد مطالعه قرار دادند. انالیز تفاوت پروفایل بیان microRNA های مورد مطالعه مشخص نمود که تابش میدان های مغناطیسی می تواند در تنظیم چرخه های سلولی و بیان mRNA و پروتئین های سیکلین D2 مرتبط با ان، میانکنش سیتوکینین ها و رسپتورهای آن و مسیر سیکنالینگ P53 اثرگذار باشد. در نتیجه این میدان ها را می توان بعنوان بیومارکری با پتانسیل بالا که در مسیرهای سیگنالینگ موثر در فعالیت های بیولوژیکی هستند، مطرح نمود (19 و 20). نتایج تحقیق پاسی و همکاران در سال 2016 مشخص نمود که میدان های مغناطیسی با فرکانس پایین می تواند اثر درمانی برای بیماران سرطانی داشته باشد و با نقش اپی ژنتیکی بر بیان ژن های موثر در سرطان اثربخش است. آنان نشان دادند میدان های مغناطیسی با شدت 2 میلی تسلا می تواند نقش اتوفازی در سلول های گلیوبلاستوما ایفا نماید و بر بیان ژن های microRNA هایی که در پیشرفت تومر در سلول های انسان موثر هستند، تاثیر گذارند. همچنین پژوهش آنان اثر میدان های مغناطیسی را در اثربخشی داروی ضد سرطان و نقش اپی ژنتیکی این میدان ها بر فاکتورهای رونویسی ژن های موثر در تشکیل تومر و جهش در ژن های دخیل در روند ترمیم DNA را، گزارش نمود (24). مطالعه سلوا مورگان و همکاران در سال 2017 مشخص نموده است که تابش میدان های الکترومغناطیسی با فرکانس پایین سبب افزایش سلول های مغز استخوان می گردد که تاثیر پذیر از بیان ژن هایی است که بر تنظیم چرخه های سلولی، ساختار سلول و گیرنده های آن و مسیرهای تنظیم کننده کینازها موثر هستند. در نتیجه بیان داشتند که میدان مغناطیسی بربیان ژن های تولید کننده استئوبلاست های اولیه و مسیر سیگنالینگ فاکتور رشد بتا و بیان  microRNAهایی همچون miR-21  اثربخش است که این تغییرات بیان ژنی می تواند با تمایز سلول های استئوبلاست و در نتیجه متابولیسم استخوان مرتبط باشد (32). رن و همکاران در سال 2017 نشان دادند میدان های مغناطیسی با فرکانس پایین بر سرطان ریه اثربخش است. آنان در مدل موش سرطانی که در معرض تابش میدان مغناطیسی 4/0 تسلا در مدت 35 روز قرار گرفته بود، مشخص نمودند میزان رشد سلول های سرطانی با مهار متابولیسم آهن کاهش یافته است که مهار آهن اثر مهاری در چرخه تکثیر سلولی داشته است و با پایداری پروتئین P53 و افزایش بیان miR-34 توانسته است بر مسیر سیگنالینگ E2F1/E2F3 اثر گذار باشد و در نتیجه سبب مهار سرطان ریه در موش تومری گردد (27).  همچنین زو و همکارانش در سال 2017 مطالعه ایی در همین راستا در مدل سرطان ریه در موش انجام دادند. نتایج تحقیق آنان نشان داد تابش میدان های مغناطیسی با فرکانس پایین می‍تواند از رشد تومر در موش جلوگیری نموده و سبب مرگ اتوفاژی سلول های سرطانی گردد که این فعال شدن اتوفاژی با افزایش بیان miR-486 در ارتباط بوده است. این افزایش بیان miR-486 می تواند سبب مهار مسیر سیگنالینگ AKT/mTOR و مهار سرطان ریه در موش ها گردد. در نتیجه پژوهش آنان، کاربرد کلینیکی این میدان های مغناطیسی با فرکانس پایین، بر علیه تومورها و درمان سرطان ها گزارش شد (43). اردال و همکاران نیز که در سال 2018 بر روی تاثیر میدان های مغناطیسی با فرکانس پایین بر بیان microRNAها تحقیقی را انجام داده بودند، گزارش نمودند که تابش با میدان های مغناطیسی با فرکانس 1 میلی تسلا به مدت 60 روز در موش های ازمایشگاهی می تواند بر بیان microRNA هایی همچون miR-29 که مرتبط با بیماری های نورولوژیکی انسان (مانند آلزایمر و پارکینسون) می باشند تاثیر گذار باشد. آنان نشان دادند بیان اکثر microRNA های مورد مطالعه در نمونه خون حیوانات در مقایسه با نمونه مغز آنان کاهش معنادار داشته است. در نتیجه عنوان نمودند این تفاوت سطح بیان ایجاد شده در اثر تابش با میدان های مغناطیسی می تواند راهگشایی برای دستیابی به علل ایجاد و درمان بیماری های نورولوژیکی انسان باشد (7).

در پایان، بنابر گزارشات موجود در خصوص ارتباطmiR-21  و  miR-29با سرطان های مختلف، مشخص است که این microRNA ها می توانند نقش بسزایی در تومورزایی ایفا نمایند و بر این اساس پژوهش حاضر در راستای تحقیقات دانشمندان گذشته که به بررسی اثر میدان های مغناطیسی بر روی بیان این microRNA ها در سایر سلول های سرطانی (غیر از سرطان معده) پرداخته بودند، به منظور ارزیابی اثر میدان‌های مغناطیسی بر بیان این دو microRNA (miR-21  و  miR-29 ) برای اول بار در رده سلولی سرطان معده، صورت پذیرفت. نتایج این تحقیق افزایش بیان دو  microRNA مورد مطالعه را در اثر میدان های مغناطیسی 25/0 و 5/2 میلی تسلا نشان داد و مشخص شد  که این افزایش بیان با افزایش شدت میدان ارتباط معنادار دارد.  بنابراین ادامه مطالعات در این حوزه پژوهشی و تایید نتایج حاصل از تحقیق حاضر، می تواند راهکاری در کنار سایر روش های تشخیصی و درمانی به ویژه همراه با داروهای شیمی درمانی برای بهبود سرطان معده در کشور ارایه نماید. البته برای براورد این مهم نیاز به پژوهش های بیشتر و با انواع نمونه های ازمایشگاهی گسترده تر، جهت تعیین دقیق تأثیرات تابش میدان‌های الکترومغناطیسی با فرکانس بسیار پایین‌ بر روی بیان microRNA ها (بخصوص miR-21  و  miR-29) می باشد تا بتوان از تایید نتایج این تحقیقات بطور کلینیکی استفاده کاربردی نمود.

نتیجه گیری

از آنجایی که بیشتر سرطان‌ها در افراد مسن بروز می کند  و کشور ایران جمعیت به نسبت جوانی دارد، انتظار می‌رود که در آینده ی نزدیک میزان بروز مرگ ‌و میر با این بیماری در کشور به‌ سرعت افزایش یابد؛ بنابراین با توجه به اهمیت مبارزه با این بیماری وجود برنامه کنترل سرطان در کشور ضرورت دارد و با توجه به ضرورت موضوع، روش های تشخیص زود هنگام و پیش آگهی بخصوص برای سرطان معده که دومین سرطان شایع در کشور ما می‌باشد، مورد کلینیکی مهمی است. از انجایی که تنوع بیان ژن‌ها و تنظیم کننده های آنان مانند microRNA ها می‌تواند نقش مهمی در بروز سرطان معده داشته باشد، امید است ادامه تحقیقات در راستای نتایج این مطالعه که افزایش بیانmiR-21  و  miR-29 را در رده سلولی سرطان معده و ارتباط آن با میدان های مغناطیسی با فرکانس پایین، را نشان داده است، انجام پذیرد تا بتواند راهگشایی برای دستیابی به بیومارکرهای مناسب جهت تشخیص و درمان سرطان ها بویژه سرطان معده در جمعیت کشور ایران گردد.

تشکر و قدردانی

از کلیه اعضای محترم هیئت علمی و پرسنل گرامی انستیتو کنسر بیمارستان امام خمینی تهران که در اجرای این پروژه تحقیقاتی همکاری های فراوانی را مبذول فرموده اند کمال سپاسگزاری می نماید.