نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 پژوهشکده بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران،ایران

2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک

3 عضو هیات علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

4 گروه زیست شناسی، دانشکده غلوم پایه، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران

چکیده

متحمل‌سازی گیاهان زراعی نسبت به علف‌کش گلایفوسیت از طریق دست‌ورزی‌های ژنتیکی یکی از کاراترین روش‌های موجود در مدیریت علف‌های هرز محسوب می‌شود. راه حل مطلوب برای توسعه گیاهان متحمل در سطح تجاری، به کارگیری ژن‌های عامل آنزیم های تجزیه کننده گلایفوسیت نظیر گلایفوسیت اکسیدورداکتاز در کنار EPSPS مقاوم به گلیفوسیت می‌باشد. ژن گلایفوسیت اکسیدورداکتاز اولین بار از باکتری Ochrobactrum antrophi سویه LBAA جدا گردیده که آنزیم آن، علف‌کش گلایفوسیت را به آمینومتیل فسفونیک اسید و گلی‌اکسالات تبدیل می‌کند. در تحقیق حاضر، برای مطالعه کارایی گلایفوسیت اکسیدورداکتاز، توالی ژن آن سنتز و در ناقل بیانی pET28a همسانه سازی گردید. پس از انتقال به باکتری اشرشیاکلی، بیان پروتئین هدف با روش SDS-PAGE مورد تائید قرار گرفت. آزمایشات بهینه سازی بیان ژن در باکتری نشان داد که شرایط بهینه شامل دمای 37 درجه سانتیگراد برای کشت، 4 ساعت پس از القا با IPTG یک میلی‌مولار در OD600=0.6 می‌باشد. در مرحله بعد، به منظور انجام آزمون زیستی باکتری‌های تراریخت، حد آستانه تحمل باکتری‌های شاهد در محیط حداقل فاقد فسفات با غلظت‌های مختلف گلایفوسیت انجام و با باکتری‌های نوترکیب مقایسه گردید. نتایج نشان داد که باکتری‌های شاهد غلظت بیشتر از 5/0 میلی‌مولار گلایفوسیت را نمی‌توانند تحمل کنند؛ در صورتی که باکتری‌های نوترکیب تا غلظت 1 میلی‌مولار زنده می‌مانند. این نتایج با انجام روش شمارش کلونی و پس از سه تکرار تایید گردید. بنابراین ژن گلایفوسیت اکسیدورداکتاز می‌تواند کاندید مناسبی در کنار سایر ژن‌های عامل مقاومت به گلایفوسیت جهت دست‌ورزی ژنتیکی گیاهان استراتژیک با هدف بدست آوردن سطوح بالاتر و پایدارتر مقاومت به این علف‌کش باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Increasing tolerance to glyphosate herbicide in Escherichia coli by expression of recombinant glyphosate oxidoreductase (gox) gene

نویسندگان [English]

  • Saeadeh Aghaei 1
  • Amir Mousavi 2
  • Ali Hatef Salmanian 3
  • Faranak hadi 4

1 1Plant Biotechnology Dept., National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran

2 Department of Plant Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran.

3 Department of Plant Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran.

4 Biology Department, Faculty of Science, Lorestan University, Khoramabad, Iran

چکیده [English]

Genetic manipulation of crop plants to obtain resistance to herbicide glyphosate is one of the most effective approaches for weed management. Application of the genes encoding glyphosate degrading enzymes such as glyphosate oxidoreductase (GOX) in combination with a glyphosate-tolerant EPSPS is the ultimate approach to provide commercial rates of glyphosate tolerance. The gox gene was first isolated from Ochrobactrum antrophi strain LBAA that catalyses the cleavage of glyphosate into aminomethylphosphonic acid and glyoxalate. In this study, the gox gene was synthesized and cloned in pET28a expression vector and transformed in E. coli. The expression of the target protein was confirmed by SDS-PAGE. The experiment for optimization of gene expression showed that the optimal condition was 37oC for bacterial culture, 4 hours of induction time using 1 mM IPTG in OD600=0.6. In the next step, in order to perform a bioassay on transformed bacteria, the threshold of tolerance of control bacteria in minimum phosphate-free medium with different concentrations of glyphosate was investigated and compared with recombinant bacteria. The result indicated that the wild type bacteria were not able to tolerate concentration of more than 0.5 mM glyphosate but the recombinant bacteria survived to a concentration of 1 mM. These results were confirmed by colony counting on selective media with three repetitions. Hence, glyphosate oxidoreductase gene could be a suitable candidate besides the other glyphosate resistance genes for genetic manipulation of strategic plants with the aim of obtaining higher and more sustainable levels of resistance to this herbicide.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Glyphosate
  • Gene expression
  • synthetic Glyphosate oxidoreductase gene

افزایش تحمل به علف کش گلایفوسیت در نتیجه بیان ژننوترکیب گلایفوسیت اکسیدورداکتاز (gox) در باکتری اشرشیا کولی

سعیده آقایی1، امیر موسوی1*، علی هاتف سلمانیان1 و فرانک هادی2

1 ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری کشاورزی

2 ایران، خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 7/8/96                  تاریخ پذیرش: 10/4/97

چکیده

متحمل‌سازی گیاهان زراعی نسبت به علف‌کش گلایفوسیت از طریق دست‌ورزیهای ژنتیکی یکی از کاراترین روشهای موجود در مدیریت علفهای هرز محسوب می‌شود. راه حل مطلوب برای توسعه گیاهان متحمل در سطح تجاری، به کارگیری ژنهای عامل آنزیمهای تجزیه کننده گلایفوسیت نظیر گلایفوسیت اکسیدورداکتاز در کنار EPSPS مقاوم به گلیفوسیت می باشد. ژن گلایفوسیت اکسیدورداکتاز اولین بار از باکتری Ochrobactrum antrophi سویه LBAA جدا گردیده که آنزیم آن، علف‌کش گلایفوسیت را به آمینومتیل فسفونیک اسید و گلی‌اکسالات تبدیل می‌کند. در تحقیق حاضر، برای مطالعه کارایی گلایفوسیت اکسیدورداکتاز، توالی ژن آن سنتز و در ناقل بیانی pET28a همسانه سازی گردید. پس از انتقال به باکتری اشرشیاکلی، بیان پروتئین هدف با روش SDS-PAGE مورد تأیید قرار گرفت. آزمایشات بهینه سازی بیان ژن در باکتری نشان داد که شرایط بهینه شامل دمای 37 درجه سانتی گراد برای کشت، 4 ساعت پس از القاء با IPTG یک میلی‌مولار در OD600=0.6 می باشد. در مرحله بعد، به منظور انجام آزمون زیستی باکتریهای تراریخت، حد آستانه تحمل باکتریهای شاهد در محیط حداقل فاقد فسفات با غلظتهای مختلف گلایفوسیت انجام و با باکتریهای نوترکیب مقایسه گردید. نتایج نشان داد که باکتریهای شاهد غلظت بیشتر از 5/0 میلی‌مولار گلایفوسیت را نمی‌توانند تحمل کنند؛ در صورتی که باکتریهای نوترکیب تا غلظت 1 میلی مولار زنده می‌مانند. این نتایج با انجام روش شمارش کلونی و پس از سه تکرار تأیید گردید. بنابراین ژن گلایفوسیت اکسیدورداکتاز می‌تواند کاندید مناسبی در کنار سایر ژنهای عامل مقاومت به گلایفوسیت جهت دست‌ورزی ژنتیکی گیاهان استراتژیک با هدف به دست آوردن سطوح بالاتر و پایدارتر مقاومت به این علف‌کش باشد.

واژه­هایکلیدی: گلایفوسیت، بیان ژن، ژن مصنوعی گلایفوسیت اکسیدورداکتاز

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144787336 ، پست الکترونیکی: m-amir@nigeb.ac.ir

مقدمه

 

در میان علف­کشهای وسیع الطیف مرسوم، گلایفوسیت بیشترین میزان استفاده را به خود اختصاص داده است (3 و 26). گلایفوسیت یکی از مهمترین کشفهای صدسال اخیر است که اهمیت آن در تولید غذای جهانی به اندازه اهمیت پنی سیلین در مبارزه با بیماریها می­باشد (15).

علف­کش گلایفوسیت با نفوذ به درون گیاه از طریق ممانعت از عملکرد آنزیم  EPSPSدر مسیر شیکیمات مانع تولید اسید آمینه­های حلقوی می­گردد. آنزیم  EPSPSتوسط ژنهای هسته­ای رمز می­گردد ولی ساخت اسید آمینه­های حلقوی در پلاستیدها (کلروپلاست) رخ می­دهد؛ به عبارت دیگر محصول این ژن پس از ساخته شدن به کلروپلاست منتقل می­شود (24). امروزه دو روش اساسی برای ایجاد گیاهان مقاوم به گلایفوسیت موفقیت آمیز بوده است که عبارتند از بیان EPSPS غیر حساس و یا جهش یافته و دوم سم­زدایی مولکول گلایفوسیت از طریق تغییر ساختار شیمیایی آن (9 و 15). با انتخاب طبیعی، جهشهای هدف دار و غربال­گری باکتریهای متحمل، آنزیمهای  EPSPSمقاوم زیادی شناسایی شدند (1، 3، 6، 8، 16، 19، 21، 22، 23، 25 و 27) همچنین با استفاده از روشهای غربال­گری مناسب، ریزسازواره­های مختلفی که قادرند این علف­کش را تجزیه و یا سم­زدایی کنند شناسایی و ژنهای مربوط به آنزیمهای مسئول جداسازی و برای ایجاد مقاومت در گیاهان مورد استفاده قرار گرفته اند. یکی از این آنزیمها، گلایفوسیت اکسیدو رداکتاز (GOX) می­باشد. ژن رمز کننده آنزیم GOX از باکتری خاک­زیantrophi  Achromobacter سویه LBAA شناسایی شده و در بانک ژن با شماره دسترسی GU214711.1 ثبت گردیده است. این باکتری قادر است گلایفوسیت را به عنوان تنها منبع فسفات استفاده کند، همچنین این باکتری AMPA (آمینومتیل فسفونیک اسید) و دیگر فسفوناتها را از طریق مسیرC-P  لیاز تجزیه می­کند. در واقع جهت به دست آوردن این توالی، یک کتابخانه ژنی از DNA ژنومی باکتری تهیه و برای یافتن ژنهای مسئول تحمل گلایفوسیت غربال شده است. در نتیجه یک ORF متشکل از 1290 جفت باز که رمز کننده آنزیمGOX  که یک فلاو پروتئین شامل FAD است و متشکل از 430 اسید آمینه می­باشد شناسایی شده است. مکانیسم تجزیه گلایفوسیت توسط این آنزیم شامل کاهش کوفاکتور FAD به وسیله اولین مولکول گلایفوسیت است و در نتیجه، یک مولکول AMPA با گلی اکسالات یک شیف باز تشکیل می­دهد که در آخر به ترکیبات تک کربنه هیدرولیز می­شود. فلاوین کاهش یافته دوباره به وسیله اکسیژن اکسید شده و یک حدواسط فلاوین اکسیژنه را به وجود می­آورد که این حدواسط، اکسیژناسیون مولکول دوم گلایفوسیت را کاتالیز و AMPA و گلی اکسالات را بدون تولید پراکسید هیدروژن تولید می­کند (15). آنزیمهای سم زدای دیگر گلایفوسیت، آنزیم گلیسین اکسیداز (GO) از باکتری Bacillus subtilis (13)، گلایفوسیت استیل ترانسفراز (GLYAT) از باکتری Bacillus licheniformis (5) آنزیمهای گلایفوسیت دکربوکسیلاز از منابع قارچهای خاک­زی (11) و آنزیمهای تجزیه کننده لیگنین (لیگنولیتیک) مانند لاکاز و منگنز پراکسیداز (MnP) (14) می باشند. در تحقیق حاضر، برای اولین بار به منظور ارزیابی توانایی آنزیم GOX به تنهایی در تجزیه گلایفوسیت، توالی آن به طور مصنوعی ساخته و در باکتری E.Coli بیان گردید؛ سپس میزان مقاومت باکتری تراریخت حاوی محصول ژن مورد نظر و باکتری شاهد فاقد این ژن نسبت به گلایفویسیت مقایسه شد.

مواد و روشها

سویه­هایباکتری،ناقلها و محیط کشت: در این تحقیق از باکتریE. coliسویه هایDH5a و BL21 (DE3) (Invitrogen) و ناقل همسانه سازی pUC57 ((Fermentas و ناقل بیانی باکتریایی pET-28a (Novagen) استفاده گردید. از محیط حداقلM9  وLB  Luria-Bertani)) برای کشت باکتریها استفاده شد

ساخت سازه بیانی pET-synth-gox: توالی ژن gox در حدود 1296 جفت باز (GU214711.1 EMBL Bank:) جستجو و انتخاب شد. این توالیبا استفاده از نرم افزار بیوانفورماتیک DNAsis MAX (Hitachi Software)، بانک اطلاعاتی و نرم افزارهای مختلف دیگر شامل: Codon Database (http://www.kazusa.or.jp/codon) و همچنینSwissprot Reverse Translation Online tool (http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html) و (NJ, USA) Gen-Script متناسب با میزبان باکتریایی بهینه شد. در این آنالیز، حضور جایگاههای برشی برای آنزیمهای BamHI وSacIکه جهت همسانه سازی ژن درون ناقلهای بیانی مدنظر بودند، درون توالی هدف بررسی و حذف شد. بدین ترتیب، برای همسانه سازی ژن در باکتری و زیرهمسانه سازیهای مورد نظر آتی، در انتهای´5، جایگاه برش برای آنزیمBamHI و در انتهای´3 آن، جایگاه برش برای آنزیم SacI تعبیه شد.

پس از سنتز ژن gox (synth-gox) توسط شرکت(China)  Shine Gene و تعیین توالی و اطمینان از صحت سنتز ژن مصنوعی، ترادف مورد نظر به طول 1314 جفت باز در بانک ژنی ثبت گردیده شد .(Genbank:HQ110097.1) این توالی که درون پلاسمید pUC57همسانه سازی (pUC-synth-gox) شده بود، به صورت لیوفیلیزه و به میزان 2-4 میکروگرم دریافت گردید. پلاسمید pUC-synth-gox به روش استاندارد شوک حرارتی به سلول مستعد DH5α E. coli انتقال یافت (18). رسوب باکتریهای تراریخت بر روی پلیتهای حاوی آمپی سیلین (غلظت 80 میکروگرم در میلی­لیتر) کشت و در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد به مدت 18 ساعت جهت ظهور کلونیهای نوترکیب نگهداری گردید. جهت تکثیر ژن هدف از پلاسمید نوترکیب، از روش PCR با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم Expand (Roche) در کنار آنزیم Taq پلیمراز استفاده به عمل آمد. به این منظور، آغازگرهای20-mer NGT1 (5´-GGATCCATGTCGGAGAATCA-3´) و  18-mer NG2 (5´-GAGCTCGGAGGCAGGACC-3´)  طراحی و توسط شرکت Bioneer کره جنوبی ساخته شدند. شرایط واکنش زنجیره های پلیمراز شامل واسرشت سازی اولیه در 94 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه سپس 35 چرخه شامل واسرشت سازی در 94 درجه سانتی گراد، اتصال در 57 درجه و تکثیر در 72 درجه هر کدام به مدت 1 دقیقه و تکثیر نهایی در 72 درجه به مدت 10 دقیقه بود. محصول واکنش در روی ژل 1 درصد آگارز الکتروفورز گردید. در عین حال، قطعه ژن هدف با روش تعیین ترادف مورد تأیید مجدد قرار گرفت. سپس، کلونیهای باکتریایی حاوی پلاسمید مورد نظر در حضور گلیسرول 20 درصد در فریزر 70- درجه سانتی گراد و به روش استاندارد نگهداری شدند.

به منظور زیرهمسانه سازی ژن هدف در ناقل بیانی pET-28a، در ابتدا توالی تکثیر یافته از طریق PCR در ناقل pTZ57 R/T همسانه سازی و تأیید کار از طریق کلونی PCR  و نیز هضم ناقلین مثبت با آنزیمهای BamHI و SacI انجام گرفت. توالی هدف در نهایت از طریق جایگاههای برشی مذکورهضم و در ناقل بیانی pET-28a مستقر و از طریق روش شوک حرارتی به باکتری میزبان E. coliسویه BL21(DE3) منتقل گردید (18). با انجامکلونی PCRبه کمکآغازگرهای اختصاصی ژن (NG1 و NG2) وسپس استخراج ناقلین نوترکیب احتمالی وانجامواکنش هضم به کمک آنزیمهای BamHI وSacI، صحت همسانه سازی تأیید شد. در نهایت، سازه مورد نظر جهت توالی یابی به شرکت ژن فناوران ارسال شد.

القای بیان پروتئین نوترکیب: به منظور بیان ژن هدف در پلاسمید pET-28a، بررسی بر روی چند کلونی نوترکیب انجام گرفت که در این شرایط کلونیهایی با توانایی تولید پروتئین بیشتر انتخاب ­شدند برای این منظور، چند کلونی در محیطهای LB مایع حاوی μg/ml50 کانامایسین به مدت 15 ساعت در شیکر انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد و سرعت rpm150 کشت داده شدند. سپس مقدار 50 میکرولیتر از هر کشت به طور جداگانه به 5 میلی لیتر محیط LB 4/1 دارای μg/ml50 کانامایسین اضافه شدند؛ پس از رسیدن کدورت رشد باکتری در طول موج 600 نانومتر به 6/0، IPTG با غلظت نهایی یک میلی‌مولار در شرایط استریل اضافه شده و به مدت 5 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و سرعت rpm150 در شیکر انکوباتور نگهداری شدند. یک لوله شاهد نیز بدون افزودن IPTG طبق شرایط فوق تهیه شد. پس از اتمام زمان فوق، مقدار 5/1 میلی لیتر از هرکدام از لوله­های کشت مورد آزمایش و شاهد مربوط به هر کلونی درون ویالهای 5/1 میلی لیتری ریخته شد و به کمک سانتریفیوژ در سرعت rpm5000 به مدت 5 دقیقه سلولها رسوب داده شدند. سلولهای جمع شده مستقیماً با Sample Buffer با رقت2.5X  مخلوط و پس از جوشانیدن به مدت 5 دقیقه در ژلاکریل آمید دناتوره 12 درصد (SDS- PAGE) الکتروفورز شدند (4).

جهت بهینه سازی بیان ژن مورد نظر، فاکتورهایی نظیر میزان OD600 در زمان القاء، غلظت ماده القاگر IPTG، زمان القاء و دمای رشد باکتریهای نوترکیب مورد بررسی قرار گرفتند و الگوی پروتئینهای حاصل از بیان ژن در شرایط متفاوت به کمک SDS-PAGE آنالیز و مقایسه شدند.

روش زیست سنجی برای تعیین حداقل غلظت گلایفوسیت برای مهار باکتری E. coli:میزان 10 میکرولیتر از کشتهای شبانه باکتری  E. coli BL21-DE3در محیط LB به پلیتهای محیط کشت جامد حداقل (M9) حاوی غلظتهای 0، 05/0، 1/0، 5/0، 1 و 5/1 از گلایفوسیت، اضافه و کشت خطی انجام گردید. سپس به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی گراد انکوبه و در روز بعد، رشد یا عدم رشد کلونیها بررسی شد. در این روش، از محیط کشت حداقل استفاده گردید که فاقد هر گونه اسید آمینه برای مصرف باکتریهاست. بدین ترتیب درصورت رشد باکتریها بر روی محیط می توان گفت که باکتری توانسته است با غلبه بر مهار کننده (ماده گلایفوسیت) و استفاده از آنزیمهای موجود در مسیر بیوشیمیایی شیکیمات، اسید آمینه های ضروری و متابولیتهای ثانویه را برای خود بسازد و در غیر این صورت آنزیم نسبت به مهار کننده حساس خواهد بود.

تهیه رقتهای متوالی از غلظتهای متفاوت گلایفوسیت به منظور شمارش کلونی: باکتریها به مدت 6 ساعت در محیط  LB4/1 به همراه آنتی بیوتیک کانامایسین در گرمخانه 37 درجه سانتی گراد با دور 200 rpm کشت داده شدند. پس از رسیدن OD600به حدود 5/0، سلولها با IPTG 1 میلی مولار القاء شده و بعد از گذشت 4 ساعت، از محیطهای فوق رقتهای متوالی 102 ،103، 104، 105 و 106 تهیه گردید و پس از یافتن بهترین رقت، از هر کدام از رقتها با سه تکرار، 100میکرولیتر بر روی محیط جامد M9 حاوی همان مقادیر0، 05/0، 1/0، 5/0، 1 و 5/1 میلی‌مولار از گلایفوسیت کشت داده شدند. پلیتهای مذکور به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار گرفته و بعد از گذشت مدت زمان گفته شده، شمارش کلونی از پلیتهای فوق انجام گرفت.

نتایج و بحث

همسانه سازی ژن synt -goxدرناقل بیانی: در مرحله نخست، پس از استخراج ناقل پلاسمیدی pUC-synth-gox از باکتری میزبان، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن هدف (NG1 و NG2) و الگو قرار دادن ناقل مذکور ، قطعه synth-gox (حدود bp 1314) از طریق PCR تکثیر گردید (شکل 1). قطعه  bp1314 نهایتاً جهت وارد شدن به جایگاه همسانه­سازی حامل pET28a، با آنزیمهای  BamHI و SacI برش و آماده گردید.

bp1314

 

    3        2        1       M

شکل 1- الگوی الکتروفورزی محصول PCR حاصل از تکثیر ژن Syth-gox در ناقل pUC57 نوترکیب با استفاده از آغازگرهای اختصاصی NG1 و NG2. M، نشانگر وزن مولکولی 1kb (Fermentas)؛ 1، قطعه تکثیر شده (1314bp) توسط آنزیم Expand؛ 2، قطعه تکثیر شده (1314bp) توسط آنزیم Taq polymerase؛ 3، کنترل منفی شامل مواد واکنش PCR بدون پلاسمید pUC57+Synth gox

پس از قرارگیری synth-goxدر جایگاه همسانه­سازی سازه مورد نظر، با کشت باکتریهای تراریخت در محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین و سپس انجام کلونیPCR و واکنش هضم آنزیمی، کلونیهای حاوی pET-synth-gox بررسی و گزینش شدند (شکل 2). همسانه های مثبت نهایتاً از طریق توالی یابی تأیید گردیدند.

 

الف

 

ب

 

اسکلت پلاسمید

 bp1314

 

 

 

 

 

 

 

 

 

لا

 

 

 

bp1314

 

 M         1

 

C-   M  C+     1    2    3     4    5    6

 


 

شکل2- تأیید صحت همسانه­سازی قطعه ژن هدف (Synth-gox) در ناقل pET28a. الف: نتایج حاصل از Colony PCR؛ M، نشانگر وزن مولکولی1Kb  (Fermentas)؛ +C، کنترل مثبت (پلاسمید pUC57+Synth gox). C- کنترل منفی محلول واکنش PCR بدون الگو؛ 2، 3، 4 و 5 کلونیهای دارنده  Synth goxو 1 و 6 کلونیهای فاقد حامل نوترکیب. ب: واکنش هضم آنزیمی توسط آنزیمهای برشی (BamHI–SacI). M ، نشانگر وزن مولکولی1Kb  (Fermentas)؛ 1، قطعه bp 1314 (Synth gox) و اسکلت حامل pET28a.


بهینه سازی شرایط بیان ژن نوترکیب در باکتری E. coli: براساس پیش بینی وزن مولکولی پروتئین GOX و محاسبه بخشهایHis-Tag  اضافه شده، قطعه مشاهده شده در ژل اکریل آمید با وزن تخمین زده شده  KD51 تشخیص داده شد (شکل 3). به منظور بهینه سازی و تعیین بهترین شرایط القاء باکتریهای واجد pET-synth-gox ، فاکتورهای مهم دخیل در این رابطه از جمله میزان OD600 در زمان القاء، غلظت ماده القاگر IPTG، زمان القاء و دمای رشد باکتریهای نوترکیب بررسی شد. بدین منظور باکتریها در چهار مرحله از کشت با میزان OD600 برابر با 1، 8/0، 6/0 و 4/0 با IPTG 1 میلی مولار القاء شدند. الکتروفورز محصولات پروتئینی حاصل بر روی ژل اکریل آمید 12 درصد نشان داد که بهترین نتیجه مربوط به 6/0 OD600= می باشد (شکل 3 الف).

همچنین باکتریهای نوترکیب به طور جداگانه با غلظتهای متفاوت 6/0، 8/0 و 1 میلی مولار از IPTG القاء شدند. نتایج نشان داد که اختلاف چندانی بین غلظتهای 8/0 و 1 میلی مولار از IPTG وجود ندارد ( شکل 3 ب). برای تعیین بهترین زمان القاء، باکتریهای نوترکیب حاویpET-synth-gox  در سه مرحله (قبل از القاء، 2 و 4 ساعت بعد از القاء) با غلظت 1 میلی مولار IPTG، با باکتریهای E. coli BL21 DE3 حاوی pET28a بدون  synth gox مقایسهشدند و نتایج نشان داد چهار ساعت بعد از القاء بهترین شرایط بیان پروتئین مربوط به ژن synth-gox می­باشد (شکل 3 ج). باکتریهای حاوی pET-synth-gox در سه دما (37، 33 و 28 درجه سانتی گراد) و در غلظت 1 میلی مولار  IPTG با باکتریهای E. coli BL21 DE3 حاوی pET28a بدون ژن هدف مقایسهشدند و نتایج الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریل آمید 12 درصد (شکل 3 د) نشان داد که بهترین دما برای بیان پروتئین GOX، 37 درجه سانتی گراد می­باشد. مقایسه نتایج حاصل از بهینه کردن شرایط بیان در این تحقیق با دیگر کارهای مشابه که از سیستم pET معرفی شده توسط شرکت Novagen، استفاده کرده بودند، نشان می­دهد که دمای بهینه رشد برای باکتری میزبان پلاسمید pET، 37 درجه سانتی گراد می­باشد. در ارتباط با دانسیته سلولی مناسب جهت انجام عمل القاء، 1 تا 4/0 =­ OD600 توسط شرکت Novagen سفارش شده است. همچنین، در بررسی بیان ژنهای epsps جهش یافته در میزبان E. coli در راستای ایجاد مقاومت به گلایفوسیت، 4/0 =­ OD600 برای رسیدن به بالاترین میزان بیان گزارش گردیده است (17). در بررسی مذکور، حداقل میزان بهینه استفاده از القاگر IPTG، 2/0 میلی مولار گزارش شده است. در ارتباط با بهترین زمان نمونه برداری پس از القاء به منظور بررسی میزان بیان نیز، زمانهای 4 تا 5 ساعت پس از القاء توصیه شده است که با نتایج به دست آمده در تحقیق حاضر مطابقت دارند.

 

M        1            2         34      5      6

 1     2    3    4     5      6             M

51 KD

51 KD

1             2          3           4          M

51KD

ج

د

الف

ب

51KD

M           1            2         34     5

 


                   

 

51KD

د

               

شکل 3- بهینه سازی شرایط القای باکتریهای نوترکیب حاوی pET-Synt- gox. الف) تعیین OD600مناسب جهت القاء بیان. 1: OD600 =1، 2: OD600 = 0.8 ، 3: بدون القاء باIPTG ، 4: OD600 = 0.6 . 5: OD600 = 0.4. ب) استفاده از غلظتهای متفاوت IPTG. 1: باکتری تراریخت قبل از القاء، 2: بعد از القاء باIPTG 6/0 میلی مولار، 3: بعد از القاء باIPTG 8/0 میلی مولار، 4: بعد از القاء باIPTG 1 میلی مولار. ج) نتایج حاصل از القاء در زمانهای متفاوت در باکتریهای نوترکیب حاوی pET-Synt- goxو باکتریهای شاهد. 1: باکتریهای نوترکیب چهار ساعت بعد از القاء، 2: باکتریهای نوترکیب دو ساعت بعد از القاء، 3: باکتریهای نوترکیب قبل از القاء. 4: باکتریشاهد چهارساعت بعد از القاء، 5: باکتری شاهد دو ساعت بعد از القاء، 6: باکتری شاهد قبل از القاء. د) نتیجه حاصل از القاء در دماهای متفاوت 1: القاء باکتری شاهد در دمای 28 درجه سانتی گراد. 2: القاء باکتری نوترکیب در دمای 28 درجه سانتی گراد. 3: القاء باکتری شاهد در دمای 33 درجه سانتی گراد. 4: القایباکتری نوترکیب در دمای 33 درجه سانتی گراد، 5: القای باکتری شاهد در دمای 37 درجه سانتی گراد، 6: القای باکتری نوترکیب در دمای 37 درجه سانتی گراد. M: نشانگر وزن پروتئینی #SM0661 (Fermentas). پروتئین هدف در عکسها با فلش مشخص گردیده است.


نتایج بررسی فعالیت زیستی آنزیم Synth-GOX در مجاورت مهار کننده (گلایفوسیت): به منظور تعیین حداقل غلظت لازم از گلایفوسیت برای مهار باکتری E. coli BL21 DE3، غلظتهای 0، 05/0، 1/0، 5/0، 1 و 5/1 میلی مولار از گلایفوسیت در محیط کشت جامد حداقل M9 اعمال شد. باکتری فوق بر روی این محیطها کشت داده شد. نتایج نشان داد که رشد باکتری در غلظت 5/0 میلی مولار از گلایفوسیت متوقف شد (شکل 4).

 

 

شکل 4- بررسی حد آستانه غلظت گلایفوسیت برای مهار رشد باکتریهای BL21DE3  E. coliدر نمونه هایی ازمحیط کشت حداقل M9 حاوی غلظتهای مختلف گلایفوسیت. 1: پلیت فاقد گلایفوسیت، 2: پلیت حاوی 05/0 میلی مولار گلایفوسیت، 3: پلیت حاوی 1/0 میلی مولار گلایفوسیت، 4: پلیت حاوی 5/0 میلی­مولار گلایفوسیت، 5: پلیت حاوی 1 میلی مولار گلایفوسیت، 6: پلیت حاوی 5/1 میلی مولار گلایفوسیت.

 

الف

 

ب

 

همچنین به منظور تأیید عملکرد آنزیم GOX در تجزیه گلایفوسیت، فرآیند القاء باکتری نوترکیب حاوی ژن مورد نظر (pET-synth gox)وباکتریشاهددر محیط حداقل مایع M9 و در حضور 1 میلی مولار IPTG با سه بار تکرار انجام شد. نتایج نشان داد در هر سه تکرار، باکتری شاهد پس از گذشت 9 ساعت در غلظت 1 میلی مولار گلایفوسیت قادر به رشد نمی­باشد، در حالی که باکتریهای بیان کننده آنزیم GOX توانایی رشد در این غلظت از گلایفوسیت را به خوبی داشتند (شکل 5).

 

 

شکل 5- تأیید عملکرد پروتئین نوترکیب با مقایسه رشد باکتری بیان کننده آنزیم GOX (الف) و باکتری شاهد فاقد ژن هدف (ب) در مجاورت 1 میلی مولار از مهار کننده گلایفوسیت پس از گذشت 9 ساعت.

به منظور بررسی مقاومت باکتری تراریخت حاوی pET-synth-gox و باکتری شاهد در مجاورت گلایفوسیت، رقتهای متوالی از محیط کشتهای حاوی باکتریهای تراریخت که در مجاورت غلظتهای متفاوت گلایفوسیت بودند تهیه شد. مشاهدات نشان داد که رقت 106 بهترین رقت برای به دست آوردن کلونیهای تک به منظور شمارش کلونی می­باشد.

نتایج حاصل از شمارش کلونی باکتریهای نوترکیبو باکتری شاهد در نمودار­ شکل 6 نمایش داده شده است که حاکی از مقاومت برتر کلونیهای نوترکیب نسبت به کلونیهای بدون ژن هدف جهت رشد در غلظتهای 01/0 و 5/0 میلی مولار از گلایفوسیت و نیز برتریت مطلق این کلونیها در غلظت 0/1 میلی مولار از این علف­کش می‍باشد.

در طی بررسیهای زیستی باکتریهای تراریخت شده با synth-gox، نتایج نشان داد که باکتریهای نوترکیب حاوی synth-goxتا غلظت 1 میلی مولار زنده مانند در صورتی که این باکتریهای غیر تراریخت غلظت بیشتر از 5/0 میلی مولار گلایفوسیت را نمی­توانند تحمل کنند. این نتایج با انجام روش شمارش کلونی و پس از سه تکرار اثبات شدند.

 

Glyphosat Concentration (mM)

 

شکل 6- نمودار ستونی درصد بقای باکتریهای بیان کننده پروتئین GOX و باکتریهای شاهد در برابر غلظتهای متفاوت مهار کننده گلایفوسیت.

 

در عین حال، با مقاسیه میزان مقاومت ایجاد شده در باکتریهای نوترکیب بیان کننده آنزیم گلایفوسیت اکسیدورداکتاز با باکتریهای بیان کننده آنزیم 5-انول پیروویل شیکیمات 3-فسفات سنتاز (EPSPS) (17)، می توان به این نتیجه رسید که سطح مقاومت بروز یافته پایین تر می باشد. این امر می تواند ناشی از مکانیسمهای اعمال شده توسط این دو آنزیم بوده باشد، به طوری که سم زدایی از علف­کش سهم کمتری را نسبت به کاهش اتصال علف‌کش به آنزیم هدف در ایجاد تحمل به آن ایفاء می نماید. البته این حقیقت نمی تواند از اهمیت سودمندی آنزیم GOX درطی پروژه­های دست ورزی ژنتیکی گیاهان استراتژیک بکاهد، چرا که به کارگیری همزمان دو آنزیم مذکور همواره می تواند باعث افزایش و پایداری سطوح مقاومت بروز یافته به علف کش گلایفوسیت در محصولات هدف شود. برای مثال در رخدادهای تجاری مقاوم به گلایفوسیت کلزا شامل GT200 و GT73 (2)، از ژن تجزیه کننده گلایفوسیت اکسیدورداکتاز (gox) که توسط شرکت Monsanto از باکتری خاک­زیOchrobactrum antrophi سویه LBAA جداسازی شده، در کنار ژن epspsمربوط به اگروباکتری سویه CP4 استفاده شده است (7). در ایران مطالعه ای توسط هادی و همکاران (2012) به منظور ارزیابی عملکرد ژن تجزیه کننده گلایفوسیت به تنهایی در ایجاد مقاومت و همچنین اثرات احتمالی آن در گیاه صورت گرفته است (10). در این تحقیق، توالی ژن gox موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI، به صورت مصنوعی تهیه و سپس برای تراریختی گیاه کلزا به کار رفته است. نتایج تحمل گیاهان تراریخت شده با ژن gox مصنوعی نسبت به گلایفوسیت در حد 5/1 میلی مولار گزارش شده است که در مقایسه با گیاهانی که با دریافت ژنهای epsps مقاوم، متحمل شدند پایین تر است (10). برای مثال کهریزی و همکاران میزان مقاومت به گلایفوسیت را برای گیاه کلزای تراریخت با ژن epsps مقاوم دارای جهش دوگانه (Ala183Thr وGly96Ala ) در حدود 10 میلی­مولار گزارش نموده اند (12). البته این موضوع با در نظر گرفتن نقش کمکی آنزیم GOX در کنار آنزیم EPSPS که نقش کلیدی تری را در مهار گلایفوسیت دارد، طبیعی و قابل قبول می تواند باشد. همچنین تجریشی و همکاران در (1388) پس از بررسی پایداری و توارث ژن epsps جهش یافته در نسل اول گیاهان کلزای تراریخت، گزارش کردند که بیان این ژن قادر است اثرات گلایفوسیت را در گیاه تراریخت تا حدودی کاهش دهد (20). لذا، به نظر می رسد به کارگیری ژن gox در کنار ژن جهش یافته epsps بتواند برای ایجاد گیاهان تراریخت تجاری متحمل به گلایفوسیت به کار رود.

قدردانی

نویسندگان از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری بابت تأمین اعتبار مالی این پروژه (طرح مأموریت محور ۴۰۷-م) کمال تشکر و سپاسگزاری را دارا می باشند.

1- Barry, G., Kishore, G., Padgette, S. 1992. DNA encoding class II 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase for producing plants and bacteria tolerant to glyphosate herbicides. World Patent WO. 9(204,449): Q03321.

2- Barry, G.F., Kishore, G.M. 1995. Glyphosate tolerance crop plants, US Patent 5463175.

3-  Baylis, A.D. 2000. Why glyphosate is a global herbicide: strengths, weaknesses and prospects. Pest management science. 56(4): 299–308.

4-  Bollag, D.M., Rozycki, M.D., Edelstein, S.J. 1996. Protein Methods (New York: Wiley-Liss)

5-  Castle, L.A., Siehl, D.L., Gorton, R., Patten, P.A., Chen, Y.H., Bertain, S., Cho, H.J., Duck, N., Wong, J., Liu, D., Lassner, M.W. 2004. Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene. Science. 304 (5674): 1151-4.

6- Du, W., Wallis, N.G., Mazzulla, M.J., Chalker, A.F., Zhang, L., Liu, W.S., Kallender, H., Payne, D.J. 2000.Characterization of Streptococcus pneumoniae 5‐enolpyruvylshikimate 3‐phosphate synthase and its activation by univalent cations. FEBS Journal. 267(1): 222-227.

7- Duke, S.O., Powles, S.B. 2008. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest Managment Science. 64: 319-25.

8- Fitzgibbon, J., Braymer, H. 1990. Cloning of a gene from Pseudomonas sp. strain PG2982 conferring increased glyphosate resistance. Applied and environmental microbiology. 56(11): 3382-3388.

9- Green, J.M., 2014. Current state of herbicides in herbicide‐resistant crops. pest management science.70(9): 1351-1357

10- Hadi, F., Mousavi, A., Salmanian, A.H, Akbari Noghabi, K., Khajeh, K. 2012. Glyphosate Tolerance in Transgenic Canola by a Modified Glyphosate Oxidoreductase (gox) Gene. Progress in Biological Science. 2(1):50-58

11- Hammer, P.E., Hinson, T.K., Duck, N.B., Kozie, M.G. 2005. Protein and DNA sequences of fungal TPP-binding decarboxylases encoded by GDC-1 and GDC-2 genes and their uses in conferring glyphosate resistance in transgenic plants, US Patent 204 436

12- Kahrizi, D., Salmanian, A.H., Afshari, A., Moieni, A., Mousavi, A. 2007. Simultaneous substitution of Gly96 to Ala and Ala183 to Thr in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene of E. coli (k12) and transformation of rapeseed (Brassica napus L. ) in order to make tolerance to glyphosate. Plant Cell Report. 26(1): 95-104.

13- Nishiya, Y., Imanaka, T. 1988. Purification and characterization of a novel glycine oxidase from Bacillus subtilis. FEBS Letter. 438(3): 263-6.

14-  Pizzul, L., Castillo Mdel, P., Stenström, J. 2009. Degradation of glyphosate and other pesticides by ligninolytic enzymes. Biodegradation. 20: 751-9.

15- Pollegioni, L., Schonbrunn, E., Siehl, D. 2011. Molecular basis of glyphosate resistance-different approaches through protein engineering. FebsJournal. 278(16):2753-66.

16- Priestman, M.A., Funke T., Singh, I.M., Crupper, S.S., Schönbrunn, E. 2005. 5‐Enolpyruvylshikimate‐3‐phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letter. 579(3): 728-732.

17- Salmanian, A.H., Zakikhan, K., Afshari, A., Moshashaie, M., Jafari, M., Mousavi, A. 2006. Site-directed mutagenesis, expression and biological activity of E. coli 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene. Iranian Journal of Biotechnology. 4 (4): 224-229.

18-  Sambrook, J., Russell, D. 2004. editors. Molecular cloning A Laboratory Manual, Third edition.

19- Sun, Y.C., Chen, Y.C., Tian, Z.X., Li, F.M.,Wang, X.Y., Zhang, J., Xiao, Z.L., Lin, M., Gilmartin, N., Dowling, D.N. 2005. Novel AroA with high tolerance to glyphosate, encoded by a gene of Pseudomonas putida 4G-1 isolated from an extremely polluted environment in China. Applied and environmental microbiology. 71(8): 4771-4776.

20- Tajrishi, M.M., Salmanian, A.H., Mousavi, A., Kahrizi, D. 2009. Investigation on Inheritance of Glyphosate tolerance in T1 Generation of Transgenic Rapeseed (Brassica napus L.) with the mutated bacterial EPSPS gene. Iranian Journal of Biology. 22(2):282-292.

21- Tian, Y.S., Xiong, A.S., Xu J., Zhao, W., Gao, F., Fu, X.Y., Xu, H., Zheng, J.L., Peng, R.H., Yao, Q.H. 2010. Isolation from Ochrobactrum anthropi of a novel class II 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase with high tolerance to glyphosate. Applied and environmental microbiology. 76(17): 6001-6005.

22- Tian, Y.S., Xu, J., Han, J., Zhao, W., Fu, X.Y., Peng, R.H., Yao, Q.H. 2013. Complementary screening, identification and application of a novel class II 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Bacillus cereus. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 29(3): 549-557.

23- Tian, Y.S., Xu, J., Xiong, A.S., Zhao, W., Gao, F., Fu, X.Y., Peng, R.H., Yao, Q.H. 2012. Functional characterization of Class II 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Halothermothrix orenii H168 in Escherichia coli and transgenic Arabidopsis. Applied and environmental microbiology. 93(1): 241-250.

24- Vaughn, K.C., Duke, S.O. 1991. Biochemical Basis of Herbicide Resistance. In: Ebing, W., Börner, H., Martin, D., Sjut, V., Stan, H.J., Stetter, J. (eds) Herbicide Resistance—Brassinosteroids, Gibberellins, Plant Growth Regulators. Chemistry of Plant Protection, vol 7. Springer, Berlin, Heidelberg.

25- Wang, L., Peng, R., Tian, Y., Han, J., Zhao, W., Wang, B., Liu, M., Yao, Q. 2014. Characterization of a class II 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase with high tolerance to glyphosate from Sinorhizobium fredii. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 30(11): 2967-2973.

26- Yu, Q., Cairns, A., Powles, S. 2007. Glyphosate, paraquat and ACCase multiple herbicide resistance evolved in a Lolium rigidum biotype. Planta 225(2): 499-513.

27- Zhang, Y., Yi, L., Lin, Y., Zhang, L., Shao, Z., Liu, Z. 2014. Characterization and site-directed mutagenesis of a novel class II 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase from the deep-sea bacterium Alcanivorax sp. L27. Enzyme and Microbial Technology. 63: 64-70.