نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

2 دانشگاه شهید باهنر کرمان

3 کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

چکیده

سلولازها یکی از مهم‌ترین آنزیم‌های صنعتی برای اکثر فرآیندهای تبدیل زیستی هستند. در این مطالعه باسیلوس آرئوس به عنوان بهترین باکتری‌ ترموفیل تجزیه‌کننده سلولز از چشمه آب‌گرم گروه در کرمان جداسازی و شناسایی شد. این باکتری بر اساس تست‌های میکروبی- بیوشیمیایی و توالی‌یابی ژن rRNA S16 به عنوان باسیلوس آرئوس شناخته شد. شرایط تولید آنزیم سلولاز توسط این باکتری در تخمیر حالت جامد مورد بررسی قرار گرفت. pH، رطوبت، عصاره‌مخمر و MgSO4 به عنوان عوامل قابل توجه در فعالیت اندوگلوکاناز، اگزوگوکاناز و Fpase به وسیله طراحی پلاکت- برمن مشخص شدند. روش سطح- پاسخ (RSM‌( و طرح ترکیبی مرکزی ((CCD با 4 عامل و 5 سطح جهت بهینه‌سازی تولید آنزیم مورد استفاده قرار گرفت که نتایج محدوده بهینه pH، MgSO4، رطوبت و عصاره‌مخمر را به ترتیب 2/6، %29/0، %‌4/61، %65/1 نشان داد. در حالت بهینه بیش‌ترین مقدار تولیدCMCase،(U/ml) 1203/561 به دست آمد. pH و دمای بهینه آنزیم در هیدرولیز کاه گندم به ترتیب 7 و60 درجه سانتی‌گراد به دست آمد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Statistical optimization of Cellulase production by Bacillus aerius AV10 in solid-state fermentation of cellulosic wastes and it,s partial characterization

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Azadian 1
  • Arastoo Badoei-Dalfard 2
  • Zahra Karami 3

چکیده [English]

Cellulases are important industrial enzymes for the most bioconversion processes. In this study, Bacillus aerius isolated and identification as the best thermophilic cellulose degrading bacterium from Gorooh hot spring and was identified as Bacillus aerius AV10 based on 16S rRNA sequence homology and microbial-‌biochemical tests. Cultivation conditions of cellulase production by Bacillus aerius AV10 in solid-state fermentation (SSF) were investigated. The moisture content, yeast extract, MgSO4 and initial culture pH were identified by Plackett-Burman design (PBD) as the significant factors for endoglucanase, exoglucanase and filter paper (FPA) activities. Response surface Methodology and central composite design by 5-level and 4-factor were used for the optimization of enzyme. The optimal ranges of moisture content, yeast extract, MgSO4 and initial culture pH were 61.4%, 1.65%, 0.29% and 6.2, respectively. Under the optimized conditions, maximum CMCase production was 561.12 U/ml. The optimal pH and temperature of the enzyme for wheat straw hydrolysis were determined to be 7.0 and 60 °C.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Plackett-Burman design
  • Thermophilic
  • Solid-state fermentation
  • Wheat straw

بهینه سازی آماری تولید سلولاز به وسیله باسیلوس آرئوس سویه AV10 با روش تخمیر حالت جامد ضایعات سلولزی و تعیین خصوصیت نسبی آن

فاطمه آزادیانخرنجانی­1و2، ارسطو بدویی دلفارد1٭ و زهرا کرمی1

1کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

2 کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، انجمن پژوهشگران جوان

تاریخ دریافت: 14/12/94              تاریخ پذیرش: 8/8/95

چکیده

سلولازها یکی از مهم­ترین آنزیمهای صنعتی برای اکثر فرآیندهای تبدیل زیستی هستند. در این مطالعهباسیلوس آرئوس به عنوان بهترین باکتری­ ترموفیل تجزیه­کننده سلولز از چشمه آبگرم گروه در کرمان جداسازی و شناسایی شد. این باکتری بر اساس تستهای میکروبی- بیوشیمیایی و توالی­یابی ژن  rRNA S16 به عنوان باسیلوس آرئوس شناخته شد. شرایط تولید آنزیم سلولاز توسط این باکتری در تخمیر حالت جامد مورد بررسی قرار گرفت. pH، رطوبت، عصاره­مخمر و MgSO4 به عنوان عوامل قابل توجه در فعالیت اندوگلوکاناز، اگزوگوکاناز و Fpase به وسیله طراحی پلاکت- برمن مشخص شدند. روش سطح- پاسخ (RSM­( و طرح ترکیبی مرکزی ((CCD با 4 عامل و 5 سطح جهت بهینه­سازی تولید آنزیم مورد استفاده قرار گرفت که نتایج محدوده بهینه pH، MgSO4، رطوبت و عصاره­مخمر را به ترتیب 2/6، 29/0، 4/61، 65/1 درصد نشان داد. در حالت بهینه بیشترین مقدار تولید CMCase،(U/ml)  1203/561 به دست آمد. pH و دمای بهینه آنزیم در هیدرولیز کاه گندم به ترتیب 7 و60 درجه سانتی­گراد به دست آمد.

واژه های کلیدی: طرح پلاکت-برمن، ترموفیل،  تخمیر حالت جامد، کاه گندم

* نویسنده مسئول، تلفن: 03433222032، پست الکترونیکی:  badoei@uk.ac.ir

مقدمه

 

سلولازها یکی از مهم­ترین آنزیمهای صنعتی هستند که شامل سه نوع مختلف­ سلوبیوهیدرولازها ­(EC:3.2.1.91)، اندوگلوکانازها یا CMCase (EC:3.2.1.4) و بتا­گلوکوزیدازها (EC:3.2.1.21) می­باشند (22). اندوگلوکانازها به طور تصادفی باندهای  β(1-4) را در مولکول سلولز هیدرولیز می­کنند. برای اندازه­گیری فعالیت این آنزیم از سوبسترای کربوکسی­متیل­سلولز استفاده می­شود، به همین دلیل به آن CMCase نیز گفته می­شود. اگزوسلوبیوهیدرولازها در بیشتر موارد یک واحد سلوبیوز را آزاد می­کنند که جهت اندازه­گیری آن از­Avicel  به عنوان سوبسترا استفاده می­شود و در آخر سلوبیوز به وسیله بتاگلوکوزیداز به گلوکز تبدیل می­شود. همچنین فعالیت هر سه آنزیم به طور همزمان با استفاده از کاغذ صافی اندازه­گیری می­شود که به این روش FPase می­گویند (10، 23 و 30). سلولازها مهم­ترین آنزیمهای تجاری هستند که در صنعت غذا، نساجی، پالپ و کاغذ­سازی، تخمیر الکلی، غلات، داروسازی، صنایع آبجوسازی و مالت سازی استفاده می­شوند (27). یک مانع مهم در کاربرد سلولازها هزینه بالای تولید آن است که بیشتر از 50 درصد از هزینه­های کلی هیدرولیز را شامل می­شود و استفاده تجاری از این آنزیمها را محدود می­کند (38). تخمیر حالت جامد رشد میکروارگانیسم­ها روی ذرات جامد در غیاب یا کمبود آب تعریف می­شود و برای تولید محصولات مختلف از جمله آنزیمها استفاده می­شود (7، 29). محتوای آب در تخمیر حالت جامد بین 80-40 درصد متفاوت است. محتوای آب در تخمیر غوطه­وری بیش از 95 درصد است ­(33). اگرچه معایبی در تخمیر حالت جامد وجود دارد، مانند کشت طولانی و دشوار بودن شناسایی پارامترهای تخمیری، اما تخمیر حالت جامد فرآیندی بسیار جذاب و جایگزین است. چون با استفاده از ضایعات کشاورزی و غذایی به عنوان سوبسترا هزینه­های فرآیند پایین می آید (6). بهینه­سازی شرایط تخمیر مشکل اصلی در توسعه فرآیند است. برخی از پارامترها که با توجه به تأثیر اقتصادی آنها بر فرآیند باید بهینه­سازی شوند شامل شرایط محیط کشت مثل (رطوبت، pH، دما و زمان کشت) و ترکیبات محیط کشت (به ویژه منابع کربنی و نیتروژنی) می­باشد. روش بهینه­سازی سطح- پاسخ امروزه در دنیا کاربرد فراوانی دارد. این روش در واقع مجموعه­ای از روشهای تجربی، ریاضی و استنتاج آماری است که به طور فزآینده­ای برای بهینه­سازی در روند مطالعات فناوری زیستی به کار برده می­شود (39). این روش می تواند چند عامل را در چند سطح همزمان با در نظر گرفتن اثرات متقابل آنها بررسی کند و ناحیه­ای که نتایج در محدوده آن قرار دارند را به شکل یک سطح سه­بعدی نشان دهد. در این مطالعه تولید آنزیم سلولاز توسط سویه Bacillus aerius با استفاده از ضایعات کشاورزی در فاز تخمیری حالت جامد مورد مطالعه قرار گرفت و تأثیر سطوح مختلف pH، رطوبت، عصاره مخمر وMgSO4  به عنوان فاکتورهای مؤثر بر روی تولید آنزیم با روش طراحی آزمایش به شیوه سطح-پاسخ ­مورد آزمایش قرار گرفت.

مواد و روشها

نمونه­برداری و جداسازی باکتریهای مولد سلولاز: در این پژوهش برای جداسازی باکتریهای ترموفیل مولد آنزیم سلولاز از چشمه آبگرم گروه در شهرستان جیرفت در استان کرمان با مختصات جغرافیای 57 درجه و 56 دقیقه طول شرقی و 29 درجه و 5 دقیقه عرض شمالی با دمای 72 درجه سانتی­گراد نمونه برداری صورت گرفت. بعد از تهیه محیط کشت حاوی CMC به عنوان منبع کربن از نمونه چشمه آبگرم به محیطهای مایع تلقیح شد و به مدت یک هفته در انکوباتور شیکردار در دمای 50 درجه سانتی­گراد و دور  rpm150 قرار گرفتند. ترکیبات محیط کشت در یک لیتر آب مقطر به شرح زیر است (16):

MgSO4 0.05 carboxymethylcellulose, 0. 5; yeast extract, 0.05; NaNO3, 0. 1, 1; K2HPO4, 0. 1;

پلیتها در دمای 50 ­درجه سانتی­گراد به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. به وجود آمدن هاله شفاف در اطراف کلنیها در محیط حاوی  CMCآگار نشانگر تولید آنزیم سلولاز است که سبب هیدرولیز کربوکسی متیل سلولز موجود در محیط شده و یک هاله شفاف ایجاد می­نماید. برای تشخیص باکتریهای ایجادکننده هاله، پلیتها به مدت 20 دقیقه در حضور معرف کنگو­رد 5/0 درصد قرار گرفته و پس از آن با  NaClیک مولار رنگبری شدند. باکتریهای ایجاد کننده هاله انتخاب و برای خالص­سازی به محیطهای جدید منتقل شدند (9).

شناسایی مولکولی: به منظور شناسایی مولکولی، ابتدا باکتری  AV10 در محیط ­CMC ­ آگار کشت داده شد. پس از رشد باکتریها جهت استخراج DNA ژنومی از روش فنل کلروفرم استفاده شد (24، 31). پس از انجام PCR  و مشاهده نتایج بر روی ژل آگارز محصول واکنش PCR برای تعیین توالی و شناسایی مورد استفاده قرار گرفت. توالی DNA با استفاده از توالی یاب DNA توسط شرکت بیونیر (کره جنوبی) تعیین شد. سپس درخت فیلوژنی توالی سویه­ها با توالی حاصل از جستجو در پایگاه اطلاعاتی بانک ژنی به کمک نرم افزار مگا 4 با روش Neighbour joining رسم شد (36).

 

 

شکل 1- درخت فیلوژنی سویه باسیلوس آرئوس AV10 با استفاده از نرم افزار Mega4


تخمیر حالت جامد در تولید سلولاز: از سبوس گندم، سبوس برنج، کاه گندم، یونجه، ضایعات ذرت، به عنوان منبع کربنی (10 درصد) استفاده شد که بعد از جمع آوری به طریق مکانیکی خرد شدند و به محیط کشت اضافه شدند. تخمیر حالت جامد در ارلنهای 250 میلی لیتری انجام شد  (5). هر کدام از این ارلنها حاوی 10 گرم سوبسترا بودند که شامل:

  10.00 g, (NH4)2SO4 0.30 g, KH2PO4 0.06 g, MgSO4·7H2O 0.03 gسوبسترا می­باشد. پس از تلقیح از کشت شبانه باکتری مذکور در دمای 50 درجه سانتی­گراد به مدت 6  روز گرمخانه­گذاری شدند.

استخراجآنزیم: به منظور استخراج آنزیم پس از اتمام مدت زمان مورد­نظرگرمخانه­گذاری، ارلن حاوی سوبسترای تخمیر شده را توزین نموده و پس از کسر عدد به دست آمده از وزن خالی، وزن توده تخمیر شده به دست آمد. برای استخراج نمودن آنزیم 5 برابر وزن توده تخمیر شده به ارلن آب مقطر اضافه کرده و به مدت یک ساعت در دور rpm 130  مخلوط شد .­پس از خاتمه این مدت به مدت 15 دقیقه محتوای ارلن را با دور g  10000 سانتریفیوژ نموده و مایع موجود در ظروف سانتریفیوژ برای اندازه­گیری میزان فعالیت سلولاز در یخچال نگهداری شد (28).

سنجش آنزیمی: در سنجش آنزیمی اندوگلوکانازها (کربوکسی متیل سلولاز ،(CMCase   مخلوط واکنش محتوی­ml  ­5/0 محلول سوبسترا  می باشد که در بافر فسفات سدیم 50 میلی مولار با 7pH  آماده شده است و­ml  ­5/0 محلول آنزیم که در دمای 50 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. بعد از انکوباسیون واکنش با اضافه­کردن  ml1 محلول دی نیتروسالیسیلیک اسید (DNS) متوقف شد. این نمونه­ها به مدت 10 دقیقه در حمام آبگرم جوشانده می­شوند و سپس در دمای اتاق خنک شدند­ (26). فعالیت سلولاز کل ((Fpase با روش Ghose تعیین شد ­(8). فعالیت اگزوگلوکاناز با استفاده از Avicel به عنوان سوبسترا تعیین شد. مخلوط واکنش محتوی ml  ­5/0 آنزیم و­ml  ­5/0 محلول سوبستراست که در بافر سدیم فسفات 50 میلی­مولار آماده شد (26). یک واحد فعالیت آنزیمی عبارت است از مقدار آنزیمی که یک میکرومول گلوکز را در یک دقیقه تحت شرایط استاندارد واکنش آزاد می­نماید.

بهینه سازی شرایط تولید آنزیم (طرح آزمایش پلاکت برمن): طرح آزمایش پلاکت برمن برای 8  متغیر با استفاده از نرم افزار مینی تب (1و16) انجام شد. این 8 متغیر با توجه به تحقیقات انجام شده در این زمینه شامل رطوبت، pH، MgSO4­، KH2PO4­، عصاره مخمر، سبوس برنج، کاه گندم، و ضایعات ذرت می­باشد (39). هر یک از این عوامل در دو سطح بالا (1+) و پایین (1-) مورد آزمایش قرار گرفتند. در مجموع 12 آزمایش طراحی شد و فعالیت سلولازی اندازه­گیری شد که در جدول 1 نشان داده شده است. بر اساس نتایج حاصل از طراحی پلاکت برمن pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر به عنوان متغیر انتخاب شدند.

جدول 1- سطوح متغیرهای مورد آزمایش در طرح پلاکت-برمن

Variables

(%)

Low level

(-1)

High level

(+1)

(A) Wheat straw

5

10

(B) Corn stover

5

10

(C) Rice bran

5

10

(D) KH2PO4

0.04

0.08

(E) Yeast extract

0.5

2.5

(F) MgSO4

0.1

0.04

(G) Moisture content

40

80

(H) pH

5

7

بهینهسازیمتغیرهایانتخابشدهتوسط روشسطح- پاسخ:  ارزیابی و بهینه سازی شرایط کشت با استفاده از روش سطح- پاسخ  (RSM) صورت گرفت. 4 عامل و 5 سطح مرکزی شامل 30  آزمایش در مورد باسیلوس آرئوس مورد بررسی قرار گرفت. متغیرهای طراحی شده pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر بودند. متغیرها و سطوح آنها در جدول 7 آورده شده است. داده­های به دست آمده در این طرح با استفاده از نرم افزار مینی تب مدل 1/16 مدل­سازی شده و شکلهای سه­بعدی (منحنیهای سطح-پاسخ) جهت بررسی رابطه میان پاسخ و متغیرهای مستقل رسم شد. جهت تعیین نقطه بهینه از روش بهینه­یابی عددی نرم­افزار مذکور استفاده گردید. تابع پاسخ (Y) شامل تولید آنزیم با استفاده از مدل چند جمله ای درجه دوم زیر به دست آمد.

11.465+1205.78x1+89.8733x2+358.383x3+585.625x4-242.142x1x1-0.710354x2x2-31.9229x3x3-4622.29x4x4-1.47750x1x2-52.1250x1x3+51x1x4+0.24875x2x3-5.725x2x4


جدول 7- طرح آزمایش و نتایج حاصل از روش سطح- پاسخ

Run

(X1)

yeast extract (%)

(X2)

Moisture content (%)

(X3) Initial

culture pH

(X4) MgSO4.7H2O (%)

Endoglucanase

activity (U/ml)

1

1

1

1

-1

288.1

2

-1

1

-1

-1

417.9

3

-1

-1

-1

-1

334.8

4

0

0

0

0

547.3

5

0

0

0

0

547.3

6

1

1

1

1

363.7

7

-1

-1

1

1

338.3

8

1

-1

-1

-1

412.9

9

-1

1

-1

1

334.3

10

1

1

-1

-1

467.2

11

1

-1

1

1

331.8

12

0

0

0

0

547.3

13

1

1

-1

1

422.9

14

0

0

0

0

547.3

15

-1

1

1

-1

288.6

16

-1

-1

1

-1

224.9

17

-1

-1

-1

1

278.1

18

1

-1

-1

1

412.9

19

1

-1

1

-1

219.9

20

-1

1

1

1

417.9

21

0

0

-2

0

467.7

22

0

0

2

0

333.3

23

2

0

0

0

338.3

24

0

0

0

2

422.9

25

0

2

0

0

278.6

26

0

0

0

0

547.3

27

0

-2

0

0

209.5

28

-2

0

0

0

233.8

29

0

0

-2

-2

263.7

30

0

0

0

0

547.3

 


اثر pH و دما روی فعالیت و پایداری آنزیم سلولاز: در بررسی فعالیت دمایی آنزیم سلولاز­، به 500 میکرولیتر سوبسترا (CMC 1 درصد) که در بافر سدیم فسفات 50 میلی­مولار آماده شده است، 500 میکرولیتر آنزیم اضافه شده و در محدوده دمایی 90-30 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه گرماگذاری شدند. در بررسی پایداری دمایی آنزیم سلولاز، 500 میکرولیتر آنزیم را به مدت 30 دقیقه در دماهای مورد بررسی قرار داده وقتی همه لوله­ها در دمای تعیین شده قرار گرفتند به همه آنها به طور همزمان 500 میکرولیتر سوبسترا افزوده و فعالیت باقی­مانده آنزیمی اندازه­گیری شد (16). میزان فعالیت و پایداری آنزیم سلولاز در محدوده 12- 3 pH مشابه با آنچه در بالا ذکر شد مورد بررسی قرار گرفت. بافرهای به کار رفته برای تهیه pH مختلف عبارت بودند از استات سدیم:
 5، 4) pH ­جرم­مولکولی  =04/82) سدیم فسفات:6، 7،­  pH (جرم­مولکولی= ­18/174) تریس باز: 8، 9، 10 pH (جرم­مولکولی  =04/121)

نتایج و بحث

شناسایی مولکولی: بعد از تعیین توالی، برای محصول واکنش زنجیره­ای پلیمر­از سویه در مقایسه با سایر ژنهای­ ­16S rRNA، موجود در مرکز ملی بیوتکنولوژی درخت فیلوژنتیکی رسم گردید. رسم درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم افزارمگا 4 با روش Neighbour joining انجام شد (شکل1). این سویه با جنس و گونه باسیلوس آرئوس همسانی بیش از 98 درصد دارد. در مطالعات پیشین انواع متنوعی از جنسها برای تولید سلولاز از جمله باسیلوس سوبتیلیس (18)، مارینوباکتر (32) و پنی سیلیوم (12) گزارش شد.

تعیین بهترین منبع کربن در تولید آنزیم: همان­طور که در جدول 2 دیده می­شود، از بین ضایعات کشاورزی مورد مطالعه محیط حاوی کاه گندم بیشترین تولید آنزیم را نشان داد که در مرحله بعدی به عنوان سوبسترا مورد استفاده قرار گرفت. با توجه کشت انبوه گندم در کشور و فراوانی این محصول فرعی کشاورزی در کشور، استفاده از آن به عنوان یک سوبسترا ارزان و در دسترس برای تولید آنزیم سلولاز بسیار قابل­توجه می­باشد. لی و همکاران دریافتند که سبوس برنج بهترین منبع کربن برای رشد سلول و تولید سلولاز به وسیله باسیلوس سوبتیلیس A-5 است­ (20). جو و همکاران، مایند و همکاران گزارش کردند که پوسته برنج و سبوس برنج بهترین زیست­توده کشاورزی برای تولید CMCase به وسیله باسیلوس آمیلولیکوفاسیئنسDL3  (13) و باسیلوس sp ­(25) است.

جدول 2- اثر منابع کربنی در تولید آنزیم

Substrate

Activity (%)

Dry cell mass (mg.ml-1)

Alfalfa straw

57 ± 0.9

66

Corn stover

79 ± 0.8

80

Wheat straw

100 ± 1.2

34

Rice bran

80 ± 1.2

37

Wheat bran

53 ± 1.1

34

طرح آزمایش پلاکت برمن: بر اساس داده­های موجود در جدول 3 تنوع گسترده­ای در فعالیت آنزیم سلولاز در 12 آزمایش طراحی شده وجود دارد. این متغیرها اهمیت بهینه­سازی پارامترهای تخمیری برای رسیدن به تولید بالاتر را نشان می­دهند. همان­طور که در جدول 4، 5 و 6 مشاهده می­کنید این فاکتورها شامل­ pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر می­باشند که با P values کمتر از 05/0 اثرات مثبت قابل توجهی بر فعالیت هر سه نوع سلولاز نشان می­دهند. بهینه­سازی ترکیبات محیط کشت (سبوس برنج، عصاره مخمر، سولفات منیزیم و پتاسیم فسفات) با استفاده از پلاکت برمن و طرح ترکیبی مرکزی از باسیلوس کربنیفیلوس CAS1 گزارش شده است (1). بازده CMCase تولید شده در این مطالعه بسیار بیشتر از CMCase تولید شده به وسیله سایر باکتریهاست. گزارشهای قبلی نشان داده­اند که رطوبت و دما اثر قابل توجهی روی فعالیت آنزیم تریکودرما­رسیATCC 26921 و آسپرژیلوس اوریزا ATCC 12892 داشته است (4). علاوه بر این رطوبت و دما به عنوان پارامتر مؤثر به وسیله تریکودرما رسی­  MCG77گزارش شده است (19).

 

جدول 3- طرح آزمایش پلاکت-برمن برای 8 متغیر و نتایج فعالیت سلولازها در تخمیر حالت جامد

Run

A

B

C

D

E

F

G

H

Endoglucanase

activity (U/ml)

FPA (U/ml)

Exoglucanase

activity (U/ml)

1

-1

1

-1

-1

-1

1

1

1

126.4

51.7

76.6

2

-1

1

1

-1

1

-1

-1

-1

49.8

5.0

24.9

3

-1

-1

1

1

1

-1

1

1

101.5

26.9

51.7

4

-1

-1

-1

1

1

1

-1

1

204.0

124.4

149.3

5

1

1

-1

1

-1

-1

-1

1

223.9

120.0

149.3

6

1

-1

1

1

-1

1

-1

-1

194.0

119.4

144.3

7

-1

1

1

1

-1

1

1

-1

104.5

29.9

54.7

8

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

84.6

10.0

34.8

9

1

-1

1

-1

-1

-1

1

1

139.3

114.4

139.3

10

1

-1

-1

-1

1

1

1

-1

117.9

43.3

68.2

11

1

1

1

-1

1

1

-1

1

217.9

143.3

168.2

12

1

1

-1

1

1

-1

1

-1

84.6

14.4

39.3

جدول 4- طرح آزمایش پلاکت-برمن برای فعالیت اندوگلوکاناز

Term

Effect

Coef

SE Coef

T

P

Constant 

 

137.35

3.084

44.54

0.000

(A) W.S

-16.17

-8.08

3.084

-2.62

0.079

(B) C.S

-5.72

-2.86

3.084

-0.93

0.422

(C) R.B

-5.72

-2.86

3.084

-0.93

0.422

(D) KH2PO4

29.44

14.72

3.084

4.77

0.017

(E) Yeast extract

51.16

25.58

3.084

8.30

0.004

(F) MgSO4

46.85

23.42

3.084

7.6

0.005

(G) Moisture content

-50.00

-25

3.084

-8.11

0.004

(H) pH

62.94

31.47

3.084

10.21

0.002

جدول 5- طرح آزمایش پلاکت-برمن برای فعالیت اگزوگلوکاناز

Term

Effect

Coef

SE Coef

T

P

Constant 

 

66.88

5.513

12.13

0.001

(A) W.S

-14.69

-7.35

5.513

-1.33

0.275

(B) C.S

-12.34

-6.7

5.513

-1.12

0.345

(C) R.B

12.5

6.25

5.513

1.13

0.339

(D) KH2PO4

11.21

5.61

5.513

1.02

0.384

(E) Yeast extract

51.18

25.59

5.513

4.64

0.019

(F) MgSO4

36.88

18.44

5.513

3.34

0.044

(G) Moisture content

-40.23

-20.12

5.513

-3.65

0.036

(H) pH

59.80

29.90

5.513

5.42

0.012

جدول 6- طرح آزمایش پلاکت-برمن در تعیین فعالیت Fpase

Term

Effect

Coef

SE Coef

T

P

Constant 

 

91.71

5.307

17.28

0.000

(A) W.S

-16.25

-8.13

5.307

-1.53

0.223

(B) C.S

-12.44

-6.22

5.307

-1.17

0.326

(C) R.B

10.95

5.47

5.307

1.03

0.378

(D) KH2PO4

12.77

6.38

5.307

1.2

0.315

(E) Yeast extract

52.74

26.37

5.307

4.97

0.016

(F) MgSO4            

36.98

18.49

5.307

3.48

0.04

(G) Moisture content

-40.13

-20.07

5.307

-3.78

0.032

(H) pH

61.36

30.68

5.307

5.78

0.01

 


بهینهسازیمتغیرهایانتخابشدهتوسطروشسطح- پاسخ: بر اساس نتایج حاصل از طراحی پلاکت برمن (جدول های 2، 3، 4 و 5) pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر به عنوان متغیرهای تأثیرگذار در فعالیت آنزیم انتخاب شدند. روش سطح- پاسخ برای بهینه­سازی متغیرهای انتخاب شده انجام شد. شرایط بهینه برای تولید آنزیم با استفاده از pH، رطوبت، عصاره مخمر و MgSO4 بر روی پارامتر تولید آنزیم با استفاده از تکنیک بهینه­سازی عددی نرم افزار مینی­تب انجام شد. در حالت بهینه بیشترین مقدار تولید آنزیم 1203/561 به دست آمد. مقادیر متغیرهای مستقل در شرایط بهینه تولید آنزیم برای رطوبت، عصاره مخمر و MgSO4 و pH به ترتیب 4141/61، 6515/1، 2980/0 و 2929/6  (unit/ml) به دست آمد.

بهینه­سازیسطوحپاسخچندگانه: یکی از اهداف عمده تحقیقات سلولازی کاهش هزینه­های تولید آنزیم به وسیله بهینه­سازی پارامترهای فرآیند است. این روش یک روش ریاضی طراحی آزمایشها، ساخت مدلها­، تعیین تأثیر چندین عامل و جستجوی شرایط بهینه برای پاسخهای مورد نیاز است .بر طبق مطالعات پیشین، بهینه­سازی ترکیبات محیط کشت برای محاسبه اثر بر همکنش گزیلوز، عصاره گوشت، سدیم کلراید، pH و دما در تولید سلولاز به وسیله باسیلوسVITRKHB  مورد مطالعه قرار گرفته است (34). نمودارهای سه بعدی پاسخ وقتی دو تا از متغیرها در سطح مرکزی ثابت و دو تای دیگر تغییر می­کند در شکل 2 نشان داده شده است.

 

شکل 2- اثر دما و pH بر فعالیت و پایداری آنزیم سلولاز

این نمودارها نشان می­دهند که pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر تولید آنزیم را تحت تأثیر قرار می­دهند. نمودارهای سه بعدی حاصله در این آزمایش از نوع نمودارهای حداکثر است و می­تواند میزان حداکثر پاسخ را در محدوده انتخابی نشان دهد.

رابطه متغیرها در تولید آنزیم:  در شکل 2-الف نمودار سه بعدی مرتبط به دو عامل MgSO4 و رطوبت نشان داده شده است. با افزایش محتوای رطوبت تا 60 درصد و MgSO4 تا 29/0 میزان تولید CMCase افزایش می­یابد. در تحقیقی که توسط لطیفیان ارائه شده است، نتایج نشان می­دهد که بیشترین فعالیت سلولاز عمدتاً در بیشترین سطح محتوای رطوبتی (70 درصد) می­باشد (19) که این نتایج بسیار به نتایج گزارش شده توسط سلولازهای قارچی شباهت دارد (11، 14 و 28). در شکل 2-ب نمودار سه بعدی مربوط به دو عامل عصاره مخمر و MgSO4 نشان داده شده است. با افزایش میزان عصاره مخمر و MgSO4 میزان تولید CMCase در نقطه مرکزی به حداکثر میزان خود می­رسد. در شکل 2-ج نمودار سه بعدی مربوط به دو عامل pH و رطوبت نشان داده شده است. با افزایش میزان رطوبت تا 60 درصد و تأثیر گذاری کمتر pH میزان تولید CMCase در نقطه مرکزی افزایش قابل توجهی نشان داده است. سانی و همکاران با استفاده از کاه برنج به عنوان سوبسترا و محتوای رطوبتی 75 درصد به بیشترین میزان تولید اندوگلوکاناز (2/240) با استفاده از قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس رسیدند (35). در شکل 2-د نمودار سه بعدی مربوط به دو عامل pH و MgSO4 نشان داده شده است با کاهش میزان pH و افزایش غلظت MgSO4 میزان تولید  CMCaseدر نقطه مرکزی به حداکثر مقدار خود می­رسد. در تحقیقی که توسط کانگ و همکارانش با استفاده از کاه برنج به عنوان سوبستر ارائه شد، بیشترین میزان تولید CMCase (129 درصد) عمدتاً در محتوای رطوبتی 65 درصد و 7 pH مشاهده شد (15). ضریب تعیین کلی 98/­97  نشان می­دهد که مدل رگرسیونی واکنش را به خوبی توصیف می­کند و می­تواند تغییرات کلی را در درون محدوده مقادیر مورد مطالعه توضیح دهد. هر چه قدر این مقدار به یک نزدیک­تر باشد، مدل بهتر پاسخ را پیش­بینی می­کند. مقایسه تولید آنزیم سلولاز در شرایط بهینه شده با بالاترین میزان تولید شده (1203/561) نشان می­دهد که با بهینه سازی به روش سطح- پاسخ میزان تولید آنزیم 2/8 افزایش می­یابد.

اثر pH و دما روی فعالیت و پایداری آنزیم سلولاز: همان­طور که در شکل 3- الف نشان داده شده است بهینه فعالیت و پایداری آنزیمی در دمای 60 درجه سانتی­گراد، برای هیدرولیز کاه گندم مشاهده شد. به طوری که از دمای 30 تا 60 درجه سانتی­گراد روند افزایش فعالیت آنزیم مشاهده شد. آنزیم سلولاز در دمای 70 درجه سانتی­گراد 40 درصد کاهش فعالیت داشت. روند کاهش فعالیت آنزیم در دماهای بالاتر ادامه داشت به طوری که در دمای 80 درجه سانتی گراد 46 درصد فعالیت بهینه آنزیمی مشاهده شد. این دمای بهینه بیشتر از CMCase تولید شده به وسیله باسیلوس sp بود (37) و مشابه سلولاز تولید شده به وسیله باسیلوس مگاتریوم بود­ (17). در مطالعه­ای بر روی سلولاز خالص­سازی شده از باسیلوس پومیلوسEB3 (3) وباسیلوس L1(21) ماکزیمم فعالیت آنزیم در دمای 60 درجه سانتی­گراد مشاهده شد. همان­طور که در شکل 3-ب نشان داده شده است بیشترین فعالیت و پایداری آنزیم در­ 7­pH   مشاهده شد در 9 pH فعالیت آنزیم به میزان قابل توجهی کاهش یافت و در ­بازه 12-9 تقریبا 30 درصد از فعالیت بهینه آنزیم مشاهده شد. این pH بهینه پایین­تر از CMCase گزارش شده از باسیلوس هالودورانس است (2). ­در بررسی سلولاز جدا شده از باکتری باسیلوس پومیلوسEB3 مشخص شد که فعالیت بهینه آنزیم در 6 pH  بوده است (­3) و در باسیلوس آمیلولیکوفاسیئنس  DL3 در 7 pH مشاهده شد (11).


ب

ج

د

ج

الف

شکل 3-الف( نمودار سه بعدی اثر متقابل محتوای رطوبتی و غلظت­های مختلف  MgSO4بر میزان تولید CMCase. شکل 3-­ب( نمودار سه بعدی اثر متقابل عصاره مخمر و MgSO4 بر میزان تولید  CMCaseشکل 3-ج( نمودار سه بعدی اثر متقابل MgSO4 و pH بر میزان تولید CMCase شکل 3- د نمودار سه بعدی اثر متقابل محتوای رطوبت و pH بر میزان تولید CMCase. در شرایطی که دو متغیر در نقطه مرکزی ثابت نگه داشته شدند

د

 


نتیجه­گیری کلی

استفاده از  ضایعات کشاورزی برای تولید آنزیم سلولاز در فاز تخمیری حالت جامد امروزه توجه زیادی را به خود جلب کرده است که نشان می­دهد این مواد حاوی ترکیبات با ارزشی است و می­تواند به تولید مواد با ارزش افزوده بیانجامد. در طی این تحقیق یک سویه بومی که دارای فعالیت سلولازی مناسب می­باشد از چشمه آبگرم جداسازی گردیده و بعد از تعیین توالی ژن ­rRNA S16 باسیلوس آرئوس­AV10­  نامگذاری گردید. نتایج حاصل از این تحقیق بیانگر کارآیی مفید روش سطح-­پاسخ در بهینه­سازی شرایط تولید آنزیم سلولاز گرما دوست می­باشد. از میان شرایطی که برای تولید آنزیم اعمال شد pH (2/6 درصد)، MgSO4(29/0 درصد)، رطوبت (4/61 درصد) و عصاره مخمر (65/1 درصد) نسبت به سایر فاکتورها تأثیر زیادی بر تولید آنزیم داشته به طوری­که میزان تولید تا 2/8 برابر افزایش پیدا کرد. سوبسترای مورد استفاده در این مطالعه کاه گندم می­باشد که با توجه به هزینه بالای تولید آنزیم اقتصادی بودن فرآیند تولید را توجیه می­کند.


 

جدول 8- نتایج جدول آنالیز واریانس ((ANOVA مدل سطح-پاسخ معادله درجه دوم

Source

df

SS

MS

F

P

Model

14

344764

246226

48/04

0.000

Linear

4

69693

17423

33/99

0.000

Square

4

238979

59745

116/56

0.000

Intraction

6

36092

6015

11/74

0.000

Residual error

14

7176

513

-

-

Lack of fit

10

7176

718

-

-

Pure error

4

0

0

-

-

TOTAL

29

355445

45

-

-

جدول 9- نتایج جدول آنالیز واریانس ((ANOVA مدل سطح-پاسخ معادله درجه دوم

 

Response

Optimal

High

Low

Variables

561.1203

CMCase maximum

1.6515

2.5

0.5

Yeast extract

 

 

61.4141

80

40

Moisture

 

 

6.2929

9

5

pH

 

 

0.2980

0.5

0.1

MgSO4

1-Annamalai N, Rajeswari MV, Balasubramanian T. (­2014) Enzymatic saccharification of pretreated rice straw by cellulase produced from Bacillus carboniphilus CAS 3 utilizing lignocellulosic wastes through statistical optimization. Biomass Bioenerg. 68: 151–160.

2-Annamalai N, Rajeswari MV, Elayaraja S, Balasubramanian T. (2013) Thermostable, haloalkaline cellulase from Bacillus halodurans CAS 1 by conversion of lignocellulosic wastes. Carbohy. Polym. 94: 409–415.

3-Ariffin H, Abdullah N, Umi-Kalsom MS, Shirai Y, Hassan MA. (2006) Production and characterization of cellulase by Bacillus pumilus EB3. Eng technol. 3: 47-53.

4-Brijwani K, Oberoi HS, Vadlani PV. (2010) Production of a cellulolytic enzyme system in mixed-culture solid-state fermentation of soybean hulls supplemented with wheat bran. Process Biochem. 45(1):120–128

5-Asha-Poorna C, Prema P. (2007) Production of cellulase-free endoxylanase from novel alkalophilic thermotolerent Bacillus pumilus by solid-state fermentation and its application in wastepaper recycling. Bioresour. Technol. 98:485–490.

6-Cen PL, Xia LM. (­1999) Production of cellulase by solid-state fermentation. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 68–92.

7-El-Bakry M, Abraham J, Cerda A, Barrena R, Ponsá S, Gea T, Sánchez T. (­2015) From wastes to high value added products: novel aspects of SSF in the production of enzymes. Crit. Review. Environ. Sci. Technol. 45 (18): 1999–2042.

8-Ghose TK. (1987) Measurement of cellulose activities. Pure Appl. Chem. 59(2):257–268

9-Hart TD, Leij DF, Kinsey G, Kelley J, Lynch JM. (2002) Strategies for the isolation of cellulolytic fungi for composting of wheat straw. World J. Microbiol. Biotechnol. 18: 471–480.

10-Ibrahim ASS, El-Diwany AI. (2007) Isolation and identification of new cellulases. Astrralian Aust. J. basic appl. sci. 1: 473-478.

11-Jecu L. (2000) Solid state fermentation of agricultural wastes for endoglucanase production. Ind. Crop. Prod. 11: 1- 5.

12-Jeya M, Joo AR, Lee KM, Sim WI. Oh DK, Kim YS. (2010) Characterization of endo-b-1,4-glucanase from a novel strain of Penicillium pinophilum KMJ601. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:1005–1014.

13-Jo KI, Lee YJ, Kim BK, Lee BH, Jung CH, Nam SW. (2008) Pilot-scale production of carboxymethylcellulase from rice hull by Bacillus amyloliquefaciens DL-3. Biotechnol. Bioprocess. Bioen. 13: 182-88.

14-Kalogeris E, Iniotak F, Topakas E, Christakopoulos P, Kekos D, Macris BJ. (2003) Performance of intermittent agitation rotating drum type bioreactor for solid-state fermentation of wheat straw. Bioresour. Technol. 86: 207-213.

15-Kang SW, Park YS, Lee JS, Hong SI, Kim SW. (2004) Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass. Bioresour. Technol. 91(2):153–156.

16-Kasana RC, Salwan R, Dhar H, Dutt S, Gulati A. (2008) A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on Agar plates using gram’s iodine. Curr. Microbiol. 55: 503–507.

17-Kim H, Pack MY. (­1988) Endo-b-1, 4-glucanase encoded by Bacillus subtilis gene cloned in Bacillus megaterium. Enz. Microb. Technol. 10: 347–351.

18-Kim BK, Lee BH, Lee YJ, Jin IH, Chung CH, Lee JW. (2009) Purification and characterization of carboxymethylcellulase isolated from a marine bacterium, Bacillus subtilis subsp. subtilis A-53. Enz. Microb. Technol. 44: 411-416.

19-Latifian M, Esfahani ZH, Barzegar M. (2007) Evaluation of culture conditions for cellulase production by two Trichoderma reesei mutants under solid-state fermentation conditions. Bioresour. Technol. 98(18):3634–3637

20-Lee BH, Kim BK, Lee Y­J, Chung CH, Lee JW. (2010) Industrial scale of optimization for the production of carboxymethylcellulase from rice bran by a marine bacterium, Bacillus subtilis subsp. subtilis A-53. Enz. Microb. Technol. 46: 38-42.

21- Li X, Yu HY. (2012) Purification and characterization of an organic-solvent-tolerant cellulase from a halotolerant isolate, Bacillus sp. L1. J Ind Microbiol Biotechnol. 39:­1117-124.

22-Li XH, Yang HJ, Roy B, Park EY, Jiang LJ, Wang D, Miao YG. (2010) Enhanced cellulase production of the Trichoderma viride mutated by microwave and ultraviolet. Microbiol Res. 165(3):190–198.

23-Lin Y, Tanaka S. (2006). Ethanol fermentation from biomass resources: Current state and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

24-Marmur JA. (1961) Procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 3 (2): 208-218.

25-Mayende L, Wilhelmi BS, Pletschke BI. (2006) Cellulases (CMCases) and polyphenol oxidases from thermophilic Bacillus sp. isolated from compost. Soil. Biol. Biochem. 38: 2963-966.

26-Miller GL, Blum R, Glennon W, Burto AL. (1960) Measurement of carboxymethyl cellulase activity. Anal Biochem.1: 127-32.

27-Oksanen T, Pere J, Paavilainen L, Buchert J, Viikari L. (2000) Treatment of recycled Kraft pulps with Trichoderma reesei hemicellulases and cellulases. J. Biotechnol. 78(1):39–48.

28-Panagiotou, G., Kekos, D., Macris, B. J. and christakopoulos, P. (2003). Production of cellulolytic and xylanolytic enzymes by Fusarium oxysporum grown on corn stover in solid state fermentation. Ind. Crop. Prod.18: 37-45.

29-Pandey A, Soccol CR, Nigam P, Brand D, Mohan R, Roussos S. (­2000) Biotechnological potential of coffee pulp and coffee husk for bioprocesses. Biochem. Eng. J. 6: 153–162.

30-Percival-­Zhang YH, Himmel ME, Mielenz JR. (2006) Outlook for cellulose improvement: Screening and selection strategies. Biotechnol. Adv. 24: 452–481.

31-Sambrook J, MacCallum P, Russell D. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual. Bioscience and Medicine. 2:16-9.

32-Shanmughapriya S, Seghal-Kiran G, Selvin J, Thomas TA  Rani C. (2010) Optimization, purification, and characterization of extracellular mesophilic alkaline cellulase from sponge associated Marinobacter sp. MSI032. Appl. Biochem. Biotechnol. 162: 625-640.

33-Shuler ML, Kargi F. (­2002) Bioprocess Engineering: Basic principle, second ed. Prentice Hall PTR, USA.

34-Singh, K, Richa K, Bose H, Karthik L, Kumar G, Rao KVB. (2014) Statistical media optimization and cellulase production from marine Bacillus VITRKHB. 3 Biotech 4: 591–598.

35-Soni R, Nazir A, Chadha BS. (2010) Optimization of cellulase production by a versatile Aspergillus fumigatus fresenius strain (AMA) capable of efficient deinking and enzymatic hydrolysis of Solka floc and bagasse. Ind. Crop. Prod. 31(2):277-283.

36-Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. (2007) MEGA4: molecular evolutionary. Genetics analysis (MEGA) software version 4.0, Mol. Biol. Evol. 24 (8): 1596-1599.

37-Vijayaraghavan P, Vincent SGP. (­2012) Purification and characterization of carboxymethyl cellulase from a Bacillus sp. isolated from a paddy field. Polish J. Microbiol. 61 (1): 51–55.

38-Xia WS, Liu P, Liu J­. (2008) Advance in chitosan hydrolysis by nonspecific cellulases. Bioresour. Technol. 99 (15):6751–6762.

39-Zhang H, Sang Q, Zhang W. (2012) Statistical optimization of cellulases production by Aspergillus niger HQ-1 in solid-state fermentation and partial enzymatic characterization of cellulases on hydrolyzing chitosan. Ann Microbiol. 62:629–645.