بهبود تولید و مقاومت به اتانل در مخمر ساکارومایسس سرویزیه با راهبرد مهندسی تکاملی با استفاده از تنش 1-بوتانل

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترای سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی محقق موسسه تحقیقات و آموزش توسعه نیشکر و صنایع جانبی خوزستان

2 عضو هیات علمی سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران پژوهشکده زیست فناوری

3 عضو هیات علمی سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران

4 عضو هیات علمی دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوری‌های زیستی، گروه زیست‌فناوری

5 عضو هیات علمی دانشگاه قم،رئیس پژوهشکده سبز

6 محقق در آزمایشگاه زیست شناسی مولکولی ، هایدلبرگ

7 گروه بیوتکنولوژی درمانی اوماس

چکیده

در فرایند تولید بیواتانل، عوامل بسیار مهمی وجود دارد که کارایی تولید را تحت تاثیر قرار می‌دهد. تجمع اتانل در طول فرآیند تخمیر و اثر بازدارندگی بر رشد اجتناب‌ناپذیر است. افزایش تحمل به اتانل در سویه ساکارومایسس سرویزیه منجر به افزایش قدرت بقا و در نهایت افزایش تولید اتانل خواهد شد. رویکرد مهندسی تکاملی یک راهبرد مناسب برای بهبود صفت تحمل به اتانل در سویه ساکارومایسس سرویزیه است. سازوکار اثر سمیت الکل‌های کوتاه زنجیره بر مخمر مشابه است. در تحقیق حاضر، سویه آزمایشگاهی ساکارومایسس سرویزیه CEN PK 113-7D باراهبرد مهندسی تکاملی طی یک دوره کشت 144 روزه تحت تنش 1- بوتانل قرار گرفت و نرخ ویژه رشد (µ) سویه تکامل یافته از h-1 048/0بهh-1 084/0 ارتقا یافت. افزایش تحمل به تنش 1- بوتانل منجر به افزایش تحمل به اتانل و همچنین افزایش تولید اتانل در سویه تکامل یافته شد. میزان تولید اتانل از 50/68 گرم بر لیتردر سویه والد به 02/87 گرم بر لیتر در سویه تکامل یافته افزایش یافت. نتایج تعیین توالی کل ژنوم سویه‌‌های تکامل یافته و مقایسه آن با سویه والد تغییرات پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی ژن‌های درگیر در این صفت را آشکار نمود. تغییرات در ژن‌هایی مثل PGM2,MTH1, TCB1 YAP1801, UBP2, IAH1 CIA1, و FAB1 ایجاد شده بود که این ژن‌ها در ارتباط با انتقال مواد درون سلول و مسیرهای دخیل در ترکیب و ساختار غشاء سیتوپلاسمایی، ساختار دیواره سلولی، متابولیسم قند و لیپیدها بودند. در تحقیق حاضر، برای اولین بار اهمیت گروه جدیدی از ژن‌های دخیل در افزایش تحمل به اتانل گزارش شده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Improving ethanol production and tolerance in Saccharomyces cerevisiae through evolutionary engineering strategy using 1-butanol stress

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Sheikhi 1
  • Khosrow Rostami 2
  • Mehrdad Azin 3
  • Mohammad ali Asadollahi 4
  • Mansour Ebrahimi 5
  • Payam Ghiaci 6
  • Amir Feizi 7

1 Ph.D.student in Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran. Researcher at Sugarcane Training and Research Institute, Khuzestan, Iran

2 Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran

3 Faculty Member, Iranian Research Organization for Science and Technology

4 Department of Biotechnology, Faculty of Biological Science and Technology, University of Isfahan, Isfahan 81746-73441, Iran

5 Alghadir BLVD, University of Qom, IRAN

6 The European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany

7 OMass Therapeutics, Biotechnology, Oxford, England

چکیده [English]

There are crucial factors in the bioethanol production process that affect production efficiency. Accumulation of ethanol during the fermentation process and the inhibitory effect on growth are inevitable. Increasing ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae enhances survival and ultimately increases ethanol production. The evolutionary engineering approach is a promising strategy to improve the complex trait of ethanol tolerance in the Saccharomyces cerevisiae. The toxicity mechanism of short-chain alcohols on yeast are similar. In this study, the laboratory strain of Saccharomyces cerevisiae CEN PK113-7D was exposed to 1-butanol stress by evolutionary engineering strategy during a 144-days culture period, after which the specific growth rate (µ) of the evolved strain was boosted from 0.48 h-1 to 0.84 h-1. Increased stress tolerance of 1-butanol led to an increase in ethanol tolerance and also ethanol production in the evolved strain. Ethanol production improved from 68.50 g/L in the parent strain to 87.02 g/L in the evolved strain. The results of the whole genome sequencing of evolved strains and comparing it with the parent strain sequence revealed changes in the single nucleotide polymorphism (SNPs) of the genes involved in this trait. There were changes in genes such as PGM2, MTH1, TCB1, YAP1801, UBP2, FAB1, IAH1 and CIA1. These genes were related to intracellular transport and pathways involved in cytoplasmic membrane composition and structure, cell wall structure, glucose metabolism, and lipids metabolism. So, the significance of this set of genes in the enhancement of ethanol tolerance was reported for the first time.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ethanol tolerance"
  • Saccharomyces cerevisiae"
  • evolutionary engineering"
  • 1- butanol"
  • "
  • whole genome sequencing"

بهبود تولید و مقاومت به اتانل در مخمر ساکارومایسس سرویزیه با راهبرد مهندسی تکاملی با استفاده از تنش 1- بوتانل

فاطمه شیخی1و2، خسرو رستمی1، مهرداد آذین1*، محمدعلی اسداللهی3،منصور ابراهیمی4، پیام غیاثی5 و امیر فیضی6

1 ایران، تهران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی

2 ایران، اهواز، موسسه تحقیقات و آموزش توسعه نیشکر و صنایع جانبی خوزستان

3 ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوری­های زیستی، گروه زیست‌فناوری

4 ایران، قم، دانشگاه قم، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوانفورماتیک

5 آلمان، هایدلبرگ ، آزمایشگاه زیست شناسی مولکولی ، هایدلبرگ

6 انگلستان، اکسفورد، گروه بیوتکنولوژی درمانی اوماس

تاریخ دریافت: 25/08/1399          تاریخ پذیرش: 24/10/1399

چکیده

در فرایند تولید بیواتانل، عوامل بسیار مهمی وجود دارد که کارایی تولید را تحت تاثیر قرار می­دهد. تجمع اتانل در طول فرآیند تخمیر و اثر بازدارندگی بر رشد اجتناب­ناپذیر است. افزایش تحمل به اتانل در سویه ساکارومایسس سرویزیه منجر به افزایش قدرت بقا و در نهایت افزایش تولید اتانل خواهد شد. رویکرد مهندسی تکاملی یک راهبرد مناسب برای بهبود صفت پیچیده تحمل به اتانل در سویه ساکارومایسس سرویزیه است. سازوکار اثر سمیت الکل­های کوتاه زنجیره بر مخمر مشابه است. در تحقیق حاضر، سویه آزمایشگاهی ساکارومایسس سرویزیه CEN PK 113-7D باراهبرد مهندسی تکاملی طی یک دوره کشت 144 روزه  تحت تنش 1- بوتانل قرار گرفت و نرخ ویژه رشد (µ) سویه تکامل یافته از h-1 048/0بهh-1  084/0 ارتقا یافت. افزایش تحمل به تنش 1- بوتانل منجر به افزایش تحمل به اتانل و همچنین افزایش تولید اتانل در سویه تکامل یافته شد. میزان تولید اتانل از 50/68 گرم بر لیتردر سویه والد به 02/87 گرم بر لیتر در سویه تکامل یافته افزایش یافت. نتایج تعیین توالی کل ژنوم سویه‌­های تکامل یافته و مقایسه آن با سویه والد تغییرات پلی­مورفیسم تک نوکلئوتیدی ژن­های درگیر در این صفت را آشکار نمود. تغییرات در ژن­هایی مثل PGM2,MTH1, TCB1 YAP1801, UBP2, IAH1 CIA1, و FAB1  ایجاد شده بود که این ژن­ها در ارتباط با انتقال مواد درون سلول و مسیرهای دخیل در ترکیب و ساختار غشاء سیتوپلاسمایی، ساختار دیواره سلولی، متابولیسم قند، متابولیسم لیپیدها بودند. در تحقیق حاضر، برای اولین بار اهمیت گروه جدیدی از ژن­های دخیل در افزایش تحمل به اتانل گزارش شده است.

واژه های کلیدی: تحمل به اتانل، ساکارومایسس سرویزیه، مهندسی تکاملی، 1-بوتانل، تعیین توالی کل ژنوم

* نویسنده مسئول، تلفن: 02156276636،  پست الکترونیکی: azin@irost.ir

مقدمه

 

در طی سال­های اخیر به دلیل رشد سریع قیمت سوخت­های فسیلی، کاهش سریع ذخایر سوخت و بالاخره بدلیل افزایش آلودگی محیط زیست توسط سوخت­های فسیلی و تغییر در آب و هوای جهانی، انرژی زیستی و برپایه منابع تجدیدپذیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است (30). برای کاهش مسائل آلودگی محیط زیست ناشی از استفاده بیش از حد از سوخت های فسیلی در دهه­های گذشته، تلاش­های عظیمی در جهت یافتن منابع سوخت پایدار و تجدیدپذیر شده است. سوخت­های زیستی میکروبی، سوخت­های مایع و گازی هستند که توسط میکروارگانیسم­ها تولید می­شوند (1). بیواتانل یک سوخت سازگار با محیط زیست و جایگزین مناسبی برای سوخت­های فسیلی است (20). اتانل عمدتاً از طریق فرآیند تخمیر با استفاده از مخمر ساکارومایسس سرویزیه تولید می­شود. بنابراین تخمیر اتانلی توسط ساکارومایسس سرویزیه به عنوان فرایند بیوتکنولوژی صنعتی بسیار مهم و به لحاظ اقتصادی سودآور به شمار می­آید. با توجه به ویژگی­های منحصر به فرد این میکروارگانیسم مانند توانایی تولید غلظت بالای اتانل از مواد تجدیدپذیر و تحمل غلظت بالای اتانل و سایر ترکیبات مهارکننده، مخمر ساکارومایسس سرویزیه از مدت­ها قبل به عنوان یک کارخانه سلولی در صنعت تخمیر استفاده می شود (31). با وجود این، تولید مقرون به صرفه اتانل و راندمان بالا جزء چالش­های اصلی این صنعت به شمار می‌رود (18). افزایش تولید اتانل در فرآیند صنعتی به عوامل مختلف بستگی دارد و مهمترین عامل، چگونگی عملکرد و قدرت بقاء مخمر در شرایط تخمیر می­باشد. در طول فرایند تولید اتانل، مخمر ساکارومایسس سرویزیه با تنش­های مختلف از جمله افزایش غلظت اتانل، درجه حرارت بالا و فشار اسمزی حاصل از غلظت بالای قند روبرو است (6). یکی از مشکلات عمده در ارتباط با تولید اتانل، سمیت این ماده برای رشد مخمر ساکارومایسس سرویزیه است که باعث مهار رشد شده و در نتیجه باعث کاهش مقدار اتانل و راندمان تولید در صنایع تخمیر می­شود (24). اتانل باعث مهار آنزیم­های مهم مسیر گلیکولیتیک و القاء تولید رادیکال آزاد اکسیژن در مخمر می­شود (11). اتانل، استحکام غشاهای سلولی را مختل می­کند، اندوسیتوز را مهار کرده، نیروی محرکه­ی پروتونی غشاهای داخلی میتوکندریایی را بلوکه می­کند و چندین آنزیم مهم مانند پروتئین کیناز A و الکل دهیدروژناز را غیرفعال می­سازد. همچنین این ترکیب موجب آسیب به DNAی میتوکندریایی و تجزیه­ی بیومولکول­ها می­شود و از جابه­جایی عناصر از غشاهای زیستی در سلول­ها جلوگیری می­کند. تجمع اتانل در محیط باعث مهار رشد سلول مخمر شده و بر روی سیستم انتقال درون سلولی آن تاثیر می‌گذارد و درنهایت باعث کاهش مقدار اتانل تولیدی می­شود (18). مهار متابولیسم، کاهش برداشت سوبسترا توسط مخمر، کاهش رشد، تغییر در ساختار غشاء و افزایش نفوذپذیری از جمله تغییرات دیگری است که اتانل در مخمر ایجاد می­کند و در نهایت مرگ سلول مخمر را به دنبال دارد (19). تا به امروزه تحقیقات بسیاری در جهت شناسایی عملکرد سامانه پاسخ به تنش اتانل در مخمر انجام گرفته، اما ساز و کار تحمل به اتانل در این مخمر به طور کامل شناسایی نشده است. تحمل به اتانل به شبکه پیچیده­ای بستگی دارد که در سطح ژنوم باهم واکنش متقابل دارند و تلاش­های پژوهشگران در جهت شناسایی ژن­های مرتبط با این صفت ادامه دارد (15). در تحقیقی که برای بررسی اساس مولکولی مقاومت مخمر ساکارومایسس سرویزیه در برابر تنش اتانل انجام شده است، بیش از700 ژن موثر بر مقاومت مخمر در برابر تنش ناشی از غلظت بالای اتانل شناسایی شده‌اند (38). با توجه به فقدان دانش لازم در مورد صفت تحمل به اتانل در ساکارومایسس سرویزیه، پیچیدگی­های مربوط به سازوکار این صفت و تنوع ژنتیکی بسیار بالا و همچنین محدودیت موجود در اعمال گسترده دستکاری ژن­ها که مانع عملکرد سلول می­شود، به راهکارهای موثرتری برای افزایش مقاومت مخمر به تنش‌های محیطی مانند تنش اتانل نیاز است. امروزه از رویکرد مهندسی تکاملی (Evolutionary engineering) به عنوان یک رویکرد علمی استفاده می‌شود که در آن با استفاده از اعمال فشار انتخابی، میکروارگانیسمی با فنوتیپ مورد نظر به‌دست می‌آید. پس از انجام مهندسی تکاملی و دستیابی به میکروارگانیسم با فنوتیپ دلخواه، با توالی­یابی آن می­توان تغییرات تک‌نوکلئوتیدی (SNP) ایجاد شده در آن را با میکروارگانیسم والد مقایسه کرد و سپس با بررسی ژن­های تغییریافته، نحوه‌ی عملکرد آن­ها در این ویژگی را بررسی کرد تا در مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گیرد. گسترش علوم بیوانفورماتیک، توسعه بیش از پیش توالی­یابی و تعیین توالی نسل جدید به عنوان تحولی اساسی در مسیر استخراج اطلاعات ژنتیکی از سامانه­های زیستی، جنبه های بی­حد و حصری ازاطلاعات کل  ژنوم، رونویسی و اپی­ژنوم گونه­ها را آشکار کرده است. این قابلیت بسیاری از موانع مهم در استخراج اطلاعات از ژنوم را برطرف کرده و باعث ایجاد مسیرهای نوینی در توسعه میکروارگانیسم های مهم مورد استفاده در فرایندهای زیستی شده است (7).

 در تحقیقات انجام شده تاکنون در زمینه بهبود صفت مقاومت به تنش اتانل با رویکرد مهندسی تکاملی، از غلظت اتانل به‌عنوان فشارانتخابی استفاده شده است(18،11،10). با توجه به دمای جوش پایین اتانل و تبخیر آن درحین کشت­های مدت­دار، احتمال تکثیر و گسترش جمعیت­های کاذب مخمر نسبت به صفت مقاومت به اتانل وجود دارد. از طرفی در تحقیقات اخیر نشان داده شده است که سازوکار سمیت الکل­های کوتاه زنجیره بر مخمرها، به‌ویژه سویه مخمر ساکارومایسس سرویزیه، مشابه می­باشد (40،22). با توجه به این که 1-بوتانل یک الکل کوتاه زنجیره با ساختار مشابه اتانل ولی دارای نقطه جوش بالاتر است، در مطالعه حاضر از 1- بوتانل برای ایجاد فشارانتخابی در آزمایش­های تکامل تطبیقی استفاده شد و سپس میزان تحمل به اتانل و تولید اتانل سویه تکامل یافته با سویه والد مقایسه شد. در ادامه، ژنوم سویه منتخب تکامل یافته استخراج و توالی کل ژنوم آن تعیین شد. بدین ترتیب، تغییرات تک‌نوکلئوتیدی ایجاد شده در سویه­های تکامل یافته با میکروارگانیسم مادر مقایسه و ژن­های جدیدی که در ارتباط با این صفت دستخوش تغییر شده بودند، معرفی شدند.

مواد و روشها

محیط‌های کشت و شرایط کشت مخمرها: سویه آزمایشگاهی هاپلوئید ساکارومایسس سرویزیه CEN.PK 113.7D به عنوان سویه والد برای آزمایش­های تکامل تطبیقی استفاده شد. سویه والد در محیط کشت YPD (مرک) رشد داده شد. این محیط حاوی ترکیبات (20 گرم در لیتر گلوکز، 20 گرم در لیتر پپتون و 10 گرم در لیتر عصاره مخمر) بود. برای ساخت محیط جامد، 2درصد وزنی آگار (مرک) به سایر مواد افزوده شد و در نهایت محیط‌ها در دمای 121 درجه سانتیگراد و به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو استریل شدند. این سویه با 6 تکرار طی 48 مرحله متوالی در میکروپلیت کشت داده شد و سویه­های تکامل یافته با توجه به  بهبود نرخ ویژه رشد به دست آمدند. غلظت 1- بوتانل به تدریج در طول کشت­های متوالی افزایش یافت بطوریکه غلظت1- بوتانل از 8/1درصد (حجم در حجم) شروع و نهایتا تا غلظت 2 درصد (حجم در حجم) افزایش یافت و قبل از هر کشت در حضور 1- بوتانل به‌عنوان فشار انتخابی، سلول­ها در محیط تازه YPD به مدت 30 دقیقه برای آزمایش­های تکامل تطبیقی بازیابی شدند (22).

بررسی تحمل سویه­های صنعتی مخمر به اتانل: برای بررسی میزان تحمل به اتانل و ویژگی‌های رشد سویه CEN.PK 113-7D قبل از شروع آزمایش­های تکامل تطبیقی، این سویه در معرض غلظت­های مختلف اتانل از 0 تا 11 درصد (حجم در حجم) قرار گرفت و سرعت رشد ویژه آن مشخص شد. همچنین نرخ رشد ویژه این سویه در غلظت 5/0 تا 2 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل نیز تعیین شد.

آزمایش­های تکامل تطبیقی: محیط کشت ملاس با رقیق کردن ملاس نیشکر در آب مقطر تا بریکس 18 تهیه شد. پس از تهیه رقت، به منظور حذف ناخالصی های جامد، محیط کشت آماده شده در rpm 5000 به مدت 25 دقیقه، در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. پس از افزودن 2 گرم در لیتر سولفات آمونیوم و 2 گرم در لیتر اوره (مرک)، pH محیط توسط اسید سولفوریک روی 5/4 تنظیم و سپس در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه اتوکلاو شد (1).

برای شروع آزمایش­های تکامل تطبیقی، با توجه به میزان نرخ ویژه رشد سویه والد، از غلظت اولیه 8/1 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل استفاده شد که به‌طور مستقیم و بدون استریل کردن به محیط کشت اضافه شد. هر میکروپلیت با فویل غشایی کاملاً محکم پوشیده شد تا از تبخیر الکل جلوگیری شود. میکروپلیت­ها در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور rpm70 گرماگذاری شد. برای جلوگیری از اثر تبخیر محیط از بیرونی­ترین ردیف­های میکروپلیت استفاده نشد.

خوگیری سویه­ها با اندازه‌گیری میزان کدورت در OD600 و محاسبه نرخ ویژه رشد تمام سویه­ها حین انجام آزمایش­های تکامل تطبیقی پایش شد. به منظور نگهداری تمامی رده‌های سلول تکامل یافته، قبل از هر بار تکرار کشت، 2/0 میلی لیتر از کشت قبلی به 2/0 میلی لیتر از محلول گلیسرول 40٪ در محیط کشت YPD تازه (حجم در حجم) اضافه و در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شد (22). نرخ ویژه رشد مخمر در طول تکرار کشت در محیط حاوی غلظت مذکور الکل کاهش و افزایش یافت و درنهایت پس از 64 روز نرخ ویژه جمعیت­ها ثابت شد و کاهش نیافت. در این زمان، میزان غلظت 1- بوتانل از 8/1 درصد (حجم در حجم)  به 2درصد در کشت­ها افزایش یافت.

بررسی تولید کمی اتانل توسط مخمر: از میکروپلیت­های با عمق 5 سانتی‌متر برای کشت سویه­های منتخب برای اندازه‌گیری میزان اتانل تولید شده استفاده شد، به‌طوری که حجم نهایی محیط کشت 2میلی لیتر شد. غلظت قند در این مرحله 20 گرم در لیتر بود که در مرحله هوازی که برای تکثیر سویه‌ها استفاده شد، سویه‌ها بر روی محیط کشت  YPDدر دمای 30 درجه سانتیگراد و دور rpm 250 در شیکر انکوباتور به مدت 8 ساعت گرماگذاری شدند. از یک محفظه شیشه­ای (Gas tight box) با قابلیت تنظیم و حفظ فشار گاز داخل محفظه از طریق یک خروجی گاز استفاده شد. این محفظه دارای یک ورودی برای گاز نیتروژن و یک خروجی برای هوا و اکسیژن بود و برای فراهم کردن شرایط کشت بی‌هوازی مورد استفاده قرار گرفت (شکل 1). پس از 8 ساعت هوادهی، غلظت گلوکز محیط کشت به 200 گرم در لیتر رسانده شد. کشت در شرایط بی‌هوازی در دمای 30 درجه سانتیگراد با دور همزن  rpm70 برای تولید اتانل به مدت 36 ساعت ادامه یافت. تمام آزمایش­ها در سه تکرار انجام شد.

استخراج ژنوم و تعیین توالی کل ژنوم: تغییرات ژنومی در سویه­های تکامل یافته توسط تعیین توالی کل ژنوم (WGS) مشخص شد. کلون‌های تکامل یافته از نمونه‌های جمعیتی منتخب مربوطه برروی پلیت YPD انتخاب شدند. سه کلونی از هر جمعیت منتخب بعد از آزمایش­های تکاملی، به‌طور تصادفی برروی پلیت YPD انتخاب و به طور مجزا در محیط مایع YPD رشد داده شدند. بعد از تعیین میزان تولید و مقاومت این کلون­ها، DNA کلون‌های تایید شده با استفاده از کیت Qiagen® استخراج شد. غلظت DNA نهایی با استفاده از ((Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer Qubit با دقت بسیار بالا اندازه­گیری شد و کیفیت وکمیت ژنوم استخراج شده تایید گردید. نمونه­های ژنوم خالص شده با استفاده از پلتفرم ایلومینا (Illumina) NextSeq 500، با کیت NextSeq Mid Output v2 توالی­یابی شدند. هر قطعه توالی خوانده شده (read) از 150 جفت باز تشکیل شده بود که با پوشش x100 تعیین توالی شدند.

 

 

 

شکل1- محفظه شیشه­ای با قابلیت تنظیم فشار برای کشت بی‌هوازی سو‌یه‌ها و تولید اتانل

 

 

کیفیت توالی خوانده شده در 80٪ قرائت از تمام موارد با نمره کیفیت Q30 تضمین شد. از برنامه Trimmomatic-0.32 برای پیرایش توالی آداپتور با پارامترهای پیش فرض برای دادههای تعیین توالی در همه نمونه‌ها استفاده شد (9). هر نمونه حاوی بیش از 10 میلیون توالی خوانده قابل نقشه­برداری بود. هر نمونه با 4 تکرار تکنیکال برای هر کلون تکامل یافته نسبت به ژنوم مرجع CEN.PK113-7D (http://cenpk.tudelft.nl) نقشه‌برداری و با استفاده از پایپلاین GATK مطابقت داده شد. تجدید چینش INDEL، حذف تکراری SNP در همه نمونه‌ها به طور همزمان با استفاده از پارامترهای استاندارد فیلترینگ انجام شد (16،36). برای مرتبسازی و فهرست‌بندی فایل­های تراز از SAMtools استفاده شد (26).

آنالیز دستگاهی: برای تعیین غلظت اتانل و گلوکز باقیمانده در محیط کشت، نمونه‌ها با کروماتوگرافی مایع با فشار بالا (HPLC) (Ultimate 3000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) آنالیز شدند. از ستون تعویض یونی Aminex HPX-87H Product no: 1250140, Bio-Rad, Hercules, California, USA)) به عنوان فاز ثابت و از اسید سولفوریک 1 میلی­مولار به عنوان فاز متحرک استفاده شد. ترکیبات با استفاده از یک آشکارساز RI شناسایی شدند (32). از آب میلیکیو (MilliQ water) استریل برای رقیق‌سازی نمونه­ها استفاده شد. از هر نمونه 20 میکرولیتر در ستون با دمای 30 درجه سانتیگراد و با سرعت جریان فاز متحرک 6/0 میلی لیتر در دقیقه تزریق شد. نمونه‌های استاندارد با رقیق کردن محلول‌های گلوکز و اتانل به غلظت‌هایی که دامنه حساسیت تشخیص ستون را پوشش می‌داد، تهیه شدند. حجم نهایی نمونه‌های جمع‌آوری شده در ویالهایHPLC  5/0 میلی لیتر بود.

واکنش زنجیره­ای پلیمراز (Polymerase chain reaction (PCR)): جهت تایید SNP های حاصل از تفسیر تعیین توالی کل ژنوم در سویه­های تکامل یافته از روش (واکنش زنجیرهای پلیمراز) PCR برای تکثیر قطعات حاوی جهش­ها استفاده شد و در دستگاه ترموسایکلرBIORAD  مدل BR582 با سیکل ارائه شده در جدول 1 قرار داده شد.

جدول 1- چرخه دمایی مورد نیاز برای واکنش زنجیره ایی پلیمراز

زمان (ثانیه)

دما (سانتی گراد)

مرحله

30

98

واسرشتگی اولیه

10

98

واسرشتگی

60

متغیر براساس آغازگر

اتصال

30-15s/kb

72

تکثیر

تکرار مرحله 4-2 (30 بار)

10

72

تکثیر

 

4

توقف واکنش

 

برای مبنای آغازگرها برای هر جهش دمای اتصال تعییین شد. تمام واکنشهای زنجیره ای پلیمراز با استفاده از با Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix (شماره محصول: F565S ،Thermo Scientific ، Waltham ، ماساچوست ، ایالات متحده آمریکا) با حجم 50 میکرولیتر طبق جدول 2 در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. آغازگرهای استفاده شده در کل این پروژه را می توان در جدول 3 مشاهده کرد..

نتایج

بررسی رشد سویه و تعیین تحمل به الکل: میزان رشد سویه ساکارومایسس سرویزیه CEN.PK 113-7D، قبل از شروع آزمایش­های تکامل تطبیقی ارزیابی شد.

جدول 2 -ترکیبات واکنش زنجیرهای پلیمراز

غلظت نهایی

حجم (میکرولیتر)

غلظت

ترکیب

1X

25

2X

مستر میکس آنزیم فیوژن

2X Master Mix

(Phusion U)

5/0 میکرومول

1

10 پیکو مول

پرایمر Forward

5/0 میکرومول

1

10 پیکو مول

پرایمر Reverse

250-10 نانوگرم

1

 

ژنوم

%3

5/1

 

DMSO 100%

 

5/20

 

آب مقطر استریل

 

سویه در معرض غلظت­های مختلف اتانل از 0 تا 11 درصد (حجم در حجم) قرار گرفت و نرخ رشد ویژه سویه در هر یک از غلظت­های یاد شده نیز تعیین شد (شکل 2). همچنین نرخ رشد ویژه سویه مذکور در غلظت 0 تا 2 درصد 1- بوتانل نیز تعیین شد (شکل 3). در این مطالعه، سویه مخمر تا 2 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل سازگار شد. سویه­ها تحت فشار انتخابی 1- بوتانل، تا 144 روز متوالی کشت شدند. انتقال سویه به یک محیط تازه حاوی غلظت 1- بوتانل بالاتر زمانی انجام شد که سرعت رشد در غلظت قبلی برای چندین نسل ثابت باقی مانده بود. پس از 48 دوره کشت در طی 144 روز، برخی از رده‌های سلولی مورد آزمایش قادر به رشد در غلظت 2٪ (حجم در حجم) 1- بوتانل بودند، در حالی که سویه والد قادر به رشد در این غلظت نبود.

حداکثر نرخ ویژه رشد به تدریج در طول آزمایش­های تکامل تطبیقی افزایش یافت. اگرچه، در برخی مراحل کاهش نرخ رشد نیز مشاهده شد، اما پس از 48 دوره کشت متوالی تحت تنش 1- بوتانل، حداکثر نرخ ویژه رشد یک سویه از h-1 048/0بهh-1 084/0 ارتقا یافت (شکل 4).

 

جدول3-  فهرست آغازگرهای استفاده شده برای تایید جهش‌های تک‌نوکلئوتیدی

نام

توالی آغازگر ˊ3 →ˊ5

 

نوکلئوتید

Tm (ᵒC)

DAN4

 

Forward TCTACAACCTCCACCACT

18

3/58

Reverse GGAAGTGGTTGCTTTACTGA

۲۰

59

ISC1

Forward GAAAATCAAACCCACCCTT

19

2/57

Reverse TCATCATCATCCCCGGTA

18

3/58

CIA1

 
 

Forward ATGGCGTCTATCAATCTGAT

20

7/57

Reverse GCTGCTTTTTCTAGAGACCA

20

8/58

UBP2

 
 

Forward GCCGAACGAAGATAATGAA

20

6/56

Reverse TGGAGGGACGTATTCAGTA

19

2/58

IAH1

Forward AGATGGCAAAGATCAGTA

18

2/54

Reverse CCATCATCTAGCACATCTCT

20

6/57

FAB1

Forward ACAATAGCTCTGCAACA

17

7/54

Reverse ATCGCTAGTATATCGGGATTC

21

7/57

TUB3

 
 

Forward GGAACACGCAGACTGTA

17

2/57

Reverse AGAACTCCTCAGCGTAAGA

19

7/58

MTH1

 
 

Forward AGCAGACCCATCCAACAT

18

8/59

Reverse GGTAAACTTGTGCCTGACA

19

8/58

PGM2

Forward GCCGCTTCTCACATCAT

17

1/58

Reverse CGTACTTTGCCCAGAATT

18

8/56

 RTK1

 
 

Forward GGAGTATGCGCCATATGA

18

5/57

Reverse TCTTTATTCCCGTGTTGCT

18

2/58

   SHE4

 
 

Forward GAATGATCCAATCGATAGCT

20

2/56

Reverse TCGACCACTGCTTTATCAA

18

8/57

YAP1801

 
 

Forward CCGTTCGCATTGCACAA

17

9/59

Reverse GAGGTTGTTAGCATATTGGT

20

6/56

   SEC12

 
 

Forward GAAGTTCGTGACAGCTAGT

19

9/57

Reverse CCAATTCACCCTTCATGT

17

56

 

 

 

شکل 2- منحنی نرخ ویژه رشد سویه ساکارومایسس سرویزیه در غلظت‌های مختلف اتانل، هر داده میانگین 3تکرار می‌باشد.



 

 

 

شکل 3- منحنی نرخ ویژه رشد سویه ساکارومایسس سرویزیه در غلظت‌های مختلف 1-بوتانل، هر داده میانگین 3تکرار می‌باشد.

 

 

شکل4- تغییرات نرخ ویژه رشد سویه ساکارومایسس سرویزیه طی آزمایش­های تکامل تطبیقی در شرایط تنش 1- بوتانل. غلظت بوتانل تا روز شصت و چهارم برابر با 1.8% (حجم در حجم) بود و سپس به 2% افزایش داده شد.

 

به منظور مشابه سازی با شرایط صنعتی برای انتخاب سویه­های برتر به لحاظ مقاومت به الکل، از محیط کشت ملاس استفاده شد. معیار انتخاب سویه­های برتر، توان تکثیر بالاتر طی کشت­های پی در پی تحت تنش الکل و محاسبه زمان نسل بود. میزان نرخ ویژه رشد سویه منتخب در محیط کشت ملاس از h-1 048/0به  h-1 06/0 ارتقا یافته بود.

تعیین میزان تولید اتانل سویه­های منتخب: برای بررسی تأثیر افزایش مقاومت به 1- بوتانل سویه­های تکامل یافته منتخب بر افزایش تولید اتانل آنها، میزان تولید اتانل و مصرف گلوکز هر سویه تکامل یافته مشخص شد (شکل 5). برای مشخص شدن تاثیر افزایش مقاومت به اتانل بر میزان تولید اتانل، از غلظت گلوکز 200 گرم بر لیتر محیط کشت استفاده شد. در محیط YPD حاوی 200 گرم در لیتر گلوکز، تغییرات جمعیت سلول سویه­های تکامل یافته با والدین متناظر آنها تفاوت معنی‌داری وجود داشت.

میزان تولید اتانل و مصرف گلوکز برای دو سویه تکامل یافته افزایش یافت. تولید اتانل سویه تکامل یافتهE1 منتخب که در محیط کشت YPD در غلظت 2 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل تکامل یافته بود به 76/1±02/87 گرم در لیتر و میزان مصرف گلوکز 34/163 گرم در لیتر و برای سویه E2 که در محیط کشت ملاس در غلظت 2 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل تکامل یافته بود به 37/3±1/78 گرم در لیتر و میزان مصرف گلوکز 34/159 گرم در لیتر ارتقا یافته بود و این در حالی است که میزان تولید اتانل سویه والد تحت شرایط مذکور46/2±5/68 گرم بر لیتر و میزان مصرف گلوکز 0/145 گرم بر لیتر بود. این داده­ها نشان می­دهد که افزایش تحمل مخمر در برابر 1- بوتانل منجر به افزایش تحمل به اتانل (شکل 6) و سرعت مصرف قند شده که نهایتاً میزان تولید اتانل نیز در این دوسویه تکامل یافته افزایش یافت.

نتایج حاصل از تفسیر توالی یابی کل ژنوم: برای رمزگشایی از مسیرهای جهش یافته در هنگام سازگاری با 1-بوتانل، ژنوم سویه‌های منتخب تکامل یافته در طول آزمایش، مجدداً توالی‌یابی و شناسایی شد، 68 جهش در مناطق رمزگذار ژن، از جمله 38 جهش missense، 78 جهش خاموش و 6 حذف در ژنوم اتفاق افتاده بود. برخی جهش ­ها درمنطقه رمزگذار ژن غالب ژن­های شناسایی شده، در ارتباط با انتقال مواد درون سلول و مسیرهای دخیل در ترکیب و ساختار غشاء سلولی، ساختار دیواره سلولی، متابولیسم قند و متابولیسم لیپید بودند با استفاده از واکنش زنجیره­ایی پلیمراز تایید شدند (جدول 1).

 

 

شکل5- میزان تولید اتانل سویه­های تکامل یافته و گلوکز باقیمانده در محیط کشت در مقایسه با سویه والد. P سویه والد، E1 سویه تکامل یافته در محیط کشت ملاس و E2 سویه تکامل یافته در محیط کشت YPD

 

 

شکل6- تغییرات نرخ ویژه رشد دوسویه تکامل یافته در طی آزمایش­های تکامل تطبیقی در غلظت 9% حجم در حجم اتانل

 

 

دراین مطالعه، جهش­های تک‌نوکلوتیدی در مناطق غیر رمزگذار ژن حذف شدند. تعداد جهش­های یافت شده در سویه تکامل یافته در محیط کشت YPD نسبت به سویه‌­ی تکامل یافته در محیط کشت ملاس بیشتر بود. برخی از SNPهای سویه­های تکامل یافته با طراحی آغازگرها و انجام PCR تأیید شدند (جدول 4).

 

 

 

جدول 4- فهرست SNPs تایید شده حاصل از توالی‌یابی کل ژنوم و ژن‌های مرتبط

 

ژن

اسید آمینه تغییر یافته

شماره کروموزوم

شرح کار پروتئین

 

YAP1801

Gln575His

کروموزوم 9

پروتئین متصل شونده به کلاترین در فرایند اندوسیتوز و دخیل سازماندهی اسکلت سلولی 

 

CIA1

Arg63Phe

کروموزوم4

از پروتئین‌های کلاستر سولفور- اهن سیتوزلی دخیل دربیوسنتز متیونین، دخیل در سازماندهی زیرواحد بزرگ ریبوزم 

 

RTK1

Pro585Thr

کروموزوم4

پروتئین مورد نیاز برای بیوژنز ریبوزوم

 

TCB1

Asp96Asn

کروموزوم15

از پروتئین‌های دخیل در سازمان‌دهی غشای شبکه اندوپلاسمی و تنظیم دفسفوریله شدن فسفاتیدیل اینوزیتول

 

SHE4

Lys25Asn

کروموزوم15

پروتئین متصل شونده به میوزین و دخیل در سازمان‌دهی میوزین و اکتین، انتقال سلولی

 

IAH1

Lys163Asn

کروموزوم15

آنزیم هیدرولیز کنده ایزوآمیل استات استراز

 

DAN4

Glu181Lys

کروموزوم 10

مانوپروتئین دیواره سلولی، بیان ژن در شرایط بی‌هوازی

 
 

UBP2

Asp342Ala

کروموزوم15

آنزیم پروتئاز یوبی‌کیتیون وابسته به تیول دخیل در تنظیم دساتوره‌کردن لیپیدهای غشاء میتوکندری

 

PGM2

Met226Ilu

کروموزوم13

آنزیم فسفوگلوموتاز

 
 

TUB3

Ala338Val

کروموزوم13

پروتئین آلفا توبولین، نقش در تقسیم سلولی

 

MTH1

Cys329Trp

کروموزوم4

پروتئین داخل غشایی، دخیل در انتقال گلوکز و انتقال سیگنال

 

SEC12

Lys25Asn

کروموزوم14

پروتئین مورد نیاز برای تشکیل وزیکول COP11 برای انتقال از شبکه اندوپلاسمی به شبکه گلژی

 

FAB1

Asn582Ser

کروموزوم6

پروتئین فسفاتیدیل اینوزیتول 3فسفوکیناز، نقش در هموستازی سلول

 

 

 

نتایج تعیین توالی کل ژنوم منجربه آشکارسازی تغییرات تک‌نوکلوتیدی در ژنوم سویه­های منتخب شد. اغلب SNPها برای بار نخست در این مقاله در رابطه با این صفت گزارش می­شوند. این SNPها در ژن­هایی, TCB1, YAP1801, UBP2, FAB1,DAN4 ,SEC12, رخ داده‌اند که این ژن­ها مرتبط با سازماندهی غشاء سیتوپلاسمی و غشاء اندامک­های داخل سلولی و دیواره سلولی و متابولیسم لیپدها هستند. جهش­های روی داده در ژن‌های TUB3 و SHE4 در ارتباط با اسکلت سلولی و دینامیک درون سلولی ، ژن آنزیم فسفوگلوموتاز PGM2 و MTH1 دخیل در متابولیسم گلوکز، ژن آنزیم ایزوآمیل استات استراز IAH1 و CIA1 رمزگذار پروتینی که در همانندسازی و تعمیر ژنوم نقش داشته و از طرفی در حفظ و نگهداری تلومر موثر است.

بحث

امروزه تولید بیواتانل از چشم­انداز کاملاً منحصر به ­فردی در جهان برخوردار است و همچنان به­ عنوان یک محصول راهبردی محسوب می­شود و امنیت انرژی را تضمین می کند (2،3). افزایش تولید اتانل در فرآیند صنعتی به عوامل مختلف بستگی دارد و مهمترین عامل، چگونگی عملکرد و قدرت بقاء مخمر در شرایط تخمیر می­باشد. تجمع اتانل در طول فرآیند تخمیر در واکنش­گاه اجتناب­ناپذیر است و اثر بازدارندگی آن برروی رشد ثابت شده است (17). یک رویکرد موفق برای بهبود تحمل تنش ساکارومایسس سرویزیه، بهبود مقاومت این سویه از طریق سازگاری فیزیولوژیکی با الکل هاست (5) و انتخاب سویه‌ مقاومی که ناشی از جهش ایجاد شده در اثر فشار انتخابی باشد، می­تواند باعث افزایش طول عمر مخمر در شرایط تنش­زا شده و درنهایت راندمان تولید را بالا برد (10،1). در تحقیقات گذشته اثر سمیت مشابه الکل­های کوتاه زنجیره بر روی ساکارومایسس سرویزیه ثابت شده است. براساس این پژوهش‌ها، سویه‌هایی که طی آزمایش­های تکامل تطبیقی در برابر بوتانل بهبود یافته‌اند، در برابر اتانل نیز مقاومت بالاتری از خود نشان می‌دهند (40،22). در این تحقیق نیز از ترکیب 1- بوتانل که سمیت نسبتاً بالاتری نسبت به سایر انواع بوتانل و همچنین اتانل دارد (22)، به عنوان فشار انتخابی استفاده شد. نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد افزایش تحمل به این ترکیب منجر به افزایش تحمل به اتانل نیز می­شود و علاوه بر این، سویه­های منتخب قادر به مصرف گلوکز بیشتر و تولید اتانل بالاتری شدند. 

در تحقیق حاضر، افزایش نرخ رشد ویژه به عنوان پارامتر انتخابی برای جداسازی سویه­های با تحمل بالاتر به الکل انتخاب شد. جمعیت طی مراحل مکرر رشد مداوم تحت غلظت بالای الکل با تنش موجود خوگرفته و رشد در حضور تنش پایدار، منجر به تکثیر جمعیت برتر در این شرایط شد. برای بررسی تاثیر افزایش تحمل به الکل بر افزایش تولید اتانل، از غلظت 200 گرم بر لیتر گلوکز استفاده شد. نتایج نشان داد دو سویه تکامل یافته منتخب که براساس افزایش نرخ رشد ویژه تحت تنش انتخاب شده بودند نسبت به سویه والد میزان اتانل بالاتری در شرایط یکسان تولید کردند. به نظر می‌رسد، تحمل این سویه­ها نسبت به اتانل بهبود یافته و قادر به استفاده از گلوکز بیشتری نسبت به سویه والد بوده و به رشد خود دراین شرایط ادامه دادند و درنهایت میزان اتانل بیشتری نسبت به سویه والد تولید کردند.

در ارتباط با صفت تحمل به اتانل، ژن­های متعددی دخیل هستند که طیف وسیعی از مسیرهای متابولیسمی مانند بیوسنتز پروتئین، مسیر انتقال مواد به داخل سلول، چرخه رشد سلولی و رشد، متابولیسم اسیدهای چرب ، سازمان­یابی دیواره سلول و غشاء را دربرمی‌گیرند. هرکدام از این ژن­ها، در گروه­های عملکردی مختلف طبقه‌بندی شده­اند. با وجود این، سازوکار تحمل به اتانل به‌طور کامل شناخته نشده است. تعداد زیادی از این ژن­ها دارای عملکرد چندگانه بوده و باهم میانکش دارند. پیچیدگی شبکه پاسخ مخمر طوری است که مسیرها به‌طور مداوم برنامه­ریزی می­شوند و این، تعیین سازوکار تحمل اتانل را مشکل کرده است. با وجود این، تلاش محققین برای شناسایی ژن­های موثر براین صفت همچنان ادامه دارد.

موریا و همکاران در تحقیقی اهمیت بیان ژن MTH1 برای تنظیم بیان ژن HIX1 در مسیرانتقال هگزوزها به داخل سلول مخمر را بیان کردند (27). در واقع ژن MTH1 پروتئینی را رمزگذاری می­کند که تنظیم کننده منفی مسیر انتقال سیگنال حسگر گلوکز بوده و میزان ورود و خروج گلوکز را به داخل سلول از طریق میانکش با پروتئین دو ژن SNF3 و RGT2 تنظیم می­کند (25). با توجه به افزایش میزان مصرف گلوکز سویه­های تکامل یافته، به نظر می‌رسد که جهش در این ژن حائز اهمیت است. آنزیم فسفوگلوکوموتاز حاصل از ژن PGM2، مسئول تبدیل گلوکز 1-فسفات به گلوکز6-فسفات است و این ترکیب ماده اولیه مسیر گلیکولیز و مسیرپنتوزفسفات بوده و یکی از آنزیم­های کلیدی در متابولیسم گلوکز به شمار می رود. از طرفی متابولیسم گلوکز به‌طور تنگاتنگی در مسیر تولید تر­هالوز تاثیرگذار است. کربوهیدرات­هایی مثل تر­هالوز، مواد سازگار کننده‌ای هستند که می­توانند در هنگام ورود نمک­های اضافی از دهیدراته شدن برگشت­ناپذیر سلول­های مخمر جلوگیری کنند. مخمرها قادرند در شرایط تنش محیطی تا %15 وزن خشک سلول تر­هالوز در خود جمع کنند. تجمع تر­هالوز تحت شرایط تنش اتانل هم مشاهده شده است و سلول­هایی که قادر به تجمع تر­هالوز نباشند، رشدشان در شرایط تنش اتانل کاهش و با تاخیر انجام می­گیرد (28). بعد از رهایی از تنش اتانل، ژن­های تجزیه­کننده تر­هالوز نیز فعال شده و بیان آنها بالا می­رود. تجمع تر­هالوز با افزایش بیان ژن­های مسئول سنتز تر­هالوز مثل TPS2، TSL1، PGM2، UGP1 همراه است. تر­هالوز باعث کاهش نفوذپذیری غشاء سلولی می­شود و این کار می­تواند از طریق شکل­گیری پروتئین­ها باشد. در شرایط عادی، تر هالوز در سلول تجمع نمی­یابد و برخلاف شرایط تنش اتانل، به سرعت تجزیه می­شود؛ اما در شرایط تنش دما و اتانل این ترکیب در سلول تجمع یافته و باعث حفظ تمامیت سلول مخمر در این شرایط می­شود. هرو و همکاران تاثیر آنزیم فسفوگلوکوموتاز برتولید ترهالوز طی تنش اتانل را گزارش کردند (23).

افزایش سنتز پروتئین در سلول حین مواجهه مخمر با تنش اتانل در مطالعات قبلی اثبات شده است (11). پروتئین سیتوزولیک و هسته­ای آهن-­گوگردی حاصل از بیان ژن CIA1 عملکرد بسیار مهمی در پردازش rRNA و بیوژنز ریبوزوم در سلول‌های یوکاریوت دارد. این پروتئین برای مخمر ساکارومایسس سرویزیه حیاتی بوده و در شروع ترجمه نقش بنیادی دارد. سلول­های یوکاریوتی سازوکارهای مقابله­ای زیادی از جمله تنظیم ترجمه و بیان ژن­های آنتی اکسیدانی محافظ را ایجاد کرده­اند، و از طریق تقویت سیستم پروتئین‌سازی، پروتئین‌های مورد نیاز برای مقابله با شرایط تنش‌زا را سنتز می­کنند. این پروتئین در بیوژنز ریبوزوم موثر بوده و باعث افزایش سنتز پروتئین در پاسخ به تنش شده و با افزایش همانندسازی DNA، باعث افزایش نرخ رشد می­شود (37).

تنش اکسایشی یک چالش برای شرایط هموستاز سلولی است و تنش الکل یکی از عواملی است که می­تواند منجر به ایجاد این شرایط اکسایشی در سلول مخمر شود. محصول ژن UBP2 یکی از تنظیم­کننده­های اصلی مسیر غیراشباع‌کردن اسیدهای چرب در میتوکندری است که اثر آنتاگونیستی بر فعالیت پروتئین ژن RSP5 داشته و منجر به سنتز اسیدچرب اولئیک، یک اسید چرب غیراشباع، می­شود. غشاء سلولی تحت تاثیر الکل­ها تغییر ساختار داده و وارد فرآیند پاسخ می­شود. افزایش دو اسید چرب غیراشباع اسید پالمتولئیک و اسید اولئیک در غشاء ساکارومایسس سرویزیه باعث افزایش سیالیت غشاء و تحمل تنش اتانل می­شود (30). این دو اسید چرب به‌ویژه اسید اولئیک در گونه­های مقاوم به اتانل دیده شده­اند (13،12).

نوع اجزای تشکیل دهنده غشاء سیتوپلاسمی سلول شامل پروتئین­ها و لیپیدها با تنظیم فرآیندهای اگوسیتوز و اندوسیتوز، کنترل بسیاری از فرآیندهای سلولی ضروری مانند جذب مواد مغذی و انتقال سیگنال با واسطه گیرنده را برعهده دارند. ژن YAP1801 پروتئینی را رمزگذاری می­کند که به پروتئین کلاترین متصل شده و در انتقال وزیکول به ارگانل مناسب نقش به‌سزایی دارد. این پروتئین همچنین در سازمان‌دهی اسکلت سلولی نقش دارد (39). شبکه اندوپلاسمی یک اندامک بسیار مهم در سلول‌های یوکاریوت به‌شمار می­رود که نقش اساسی در سنتز لیپید­ها، ترشح پروتئین­ها و انتقال سینگال کلسیم دارد. پروتئین حاصل از ژن TCB1 که در شبکه اندوپلاسمی سنتز و ترشح شده، یکی از پروتئین­هایی است که شبکه اندوپلاسمی را به غشاء پلاسمایی متصل می کند، در انتقال کلسیم و انتقال آن به داخل سلول و سازماندهی شبکه اندوپلاسمی تاثیرگذار است (35).

ژن DAN4 سنتز مانوپروتئین دیواره سلولی در مخمر را رمزگذاری می­کند که در شرایط بی‌هوازی بیان می شود. به نظر می‌رسد که الیگوساکاریدهای کوچک مرتبط با مانوپروتئین­ها نیز به ثبات دیواره سلول کمک می­کنند. این پدیده را می­توان با وجود پیوندهای قوی که بین ساکاریدهای مرتبط با این پروتئین­ها وجود دارد، توضیح داد. وجود این نوع مانوپروتئین­ها در ثبات دیواره سلولی بسیار موثر است (4).

فسفاتیدیل اینوزیتول 4, 5 بیس فسفات در غشاء سیتوپلاسمی مخمر قرارداشته و دارای دو نقش ساختاری و سیگنالی است. درحفظ تمامیت سلول و هموستازی سلول از طریق دینامیک غشاء نقش داشته و همچنین در سازمان‌دهی رشته‌های اکتین اسکلت سلولی تاثیرگذار است. ژنFAB1  یک پروتئین 257 کیلو دالتونی را رمزگذاری می­کند که حاوی یک دامنه غنی از سیستئین در انتهای NH2 می‌باشد. Fab1p به عنوان یک فسفاتیدیل اینوزیتول 4-فسفات کیناز عضوی از یک خانواده آنزیمی شناخته می­شود که با فسفریله کردن فسفولیپیدها و ایجاد پیامبرهای ثانویه در مسیرهای مختلف انتقال پیام از جمله تکثیر، تمایز، کنترل سیکل سلولی تاثیرگذار است (14.33). پروتئین پوششی (COPII) نیز یکی از پروتئین­های مهم در جوانه‌زدن و ساختار دیواره سلولی مخمر ساکارومایسس سرویزیه بوده و از طریق وزیکول­ها، حمل و نقل پروتئین صادراتی را از شبکه آندوپلاسمی به شبکه گلژی منتقل می‌کند. ژن SEC12 پروتئینی را رمزگذاری می­کند که اولین مرحله تشکیل وزیکول COPII، شامل تبدیل Sar1p-GDP به Sar1p-GTP توسط عامل تبادل نوکلئوتید گوانین (GEF) Sec12p را به انجام می ‌رساند (21 (. به نظر می‌رسد این ژن در تکثیر و رشد مخمر تاثیرگذار باشد. در ساکارومایسس سرویزیه، TUB3 یکی از ژن­هایی است که پروتئین آلفاتوبولین را رمزگذاری می­کند. میکروتوبول­ها عناصر اسکلتی محافظت شده­ای هستند که در فرایندهای هسته­ای مانند تفکیک کروموزوم در میتوز و میوز، جهت دوک همانندسازی و مهاجرت هسته­ای در طی میتوز و جفت­گیری تاثیرگذار هستند. بد و همکاران گزارش کرده‌اند که محصول این ژن با افزایش دینامیک میکروتوبول­ها بر جوانه‌زدن و تکثیر مخمر تاثیرگذار است (8). پروتئین ژن SHE4 عضوی از خانواده پروتئین‌هایی است که برای اندوسیتوز و قطب‌بندی اسکلت سلولی اکتین در ساکارومایسس سرویزیه مورد نیاز است.  She4p تنظیم تعامل بین موتور Myo3/5p و F-actin را برعهده دارد و به نظر می­رسد که برای عملکرد پروتئین میوزین حضور She4p ضروری است (34). ژن­های درگیر در جوانه زدن و دینامک سلولی به‌دلیل این که منجر به تطابق درون سلولی مخمر با شرایط محیطی و توان ادامه بقا می شوند، حائز اهمیت هستند.

با توجه به نتایج به‌دست آمده در این پژوهش، استفاده از 1- بوتانل به‌عنوان فشار انتخابی جایگزین اتانل، منجر به بهبود تحمل به اتانل در سویه تکامل یافته شده است و دو سویه منتخب نسبت به اتانل مقاوم‌تر شده­اند. می‌توان از SNPهای تایید شده در این تحقیق، برای مهندسی معکوس و بررسی اثر آن در سویه وحشی در مطالعات بعدی استفاده نمود.

سپاسگزاری

ازحمایت مادی و معنوی موسسه تحقیقات و آموزش توسعه نیشکر و صنایع جانبی خوزستان و همچنین مرکز the Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability  دانشگاه صنعتی دانمارک که قسمتی از این طرح در آنجا انجام شد، تشکر وقدردانی می گردد.

  • درویشی ف، ابوالحسنی مقدمی ن ،1397، جداسازی سویه صنعتی ساکارومایسس سرویزیه با قابلیت تحمل بالا به اتانل از کارخانه های الکل سازی ایران. پژوهشهای سلولی و مولکولی، 31 ،592-582.
  • فرامرزی س، انزابی ی،جعفریزاده مالمیری ه.(1399). اثر تغییرات مقدار ملاس و سلنیوم بر رشد مخمر ساکارومایسس سروزیه و میزان بیو‌اتانول تولیدی. پژوهشهای سلولی و مولکولی، 4، 639-626
  • ممبینی دهکردی. م .(1387). بهینه‌سازی تولید بیواتانل در مخمر ساکارومایسس سرویزیه از طریق مهندسی متابولیک. پایان­نامه دکتری رشته میکروبیولوژی. دانشگاه اصفهان. صفحه 5-2.

 

  • Abramova N, Sertil O, Mehta S. Lowry C.V. 2001. Reciprocal regulation of anaerobic and aerobic cell wall mannoprotein gene expression in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol.183 (9):2881-7
  • Attfield, P.V. 1997. Stress tolerance: the key to effective strains of industrial baker’s yeast. Nat. Biotechnol. 15, 1351–1357.
  • Bai FW, Chen LJ, Zhang Z, Anderson WA, Moo-Young M. 2004. Continuous ethanol production and evaluation of yeast cell lysis and viability loss under very high gravity medium conditions. J. Biotechnol. 110:287–293.
  • Behjati S, Tarpey PS. 2013. What is next generation sequencing? Archives of Disease in Childhood - Education and Practice 0: 1–3.
  • Bode CJ, Gupta J. ML, Suprenant K A, Himes R H. 2003. The two alpha-tubulin isotypes in budding yeast have opposing effects on microtubule dynamics in vitro. EMBO Rep. 4 (1):94-9.
  • Bolger Anthony m, Lohas Marc, Usadel Bjoern. 2014. Trimmomatic: A flexible trimmer for illumina sequence data. Bioinformatics 1:30(15):2114-20.
  • Cakar ZP, Seker UOS, Tamerler C, Sonderegger M, Sauer U. 2005. Evolutionary engineering of multiple-stress resistant Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 5:569–578.
  • Cakar, ZP., Turanli-Y, Alkim C., Yilmaz, U. 2012. Evolutionary engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved industrially important properties. FEMS Yeast Res. 12. 171–182.
  • Cavellini L, Meurisse J, Findinier J, Zoi E, Naima B.T, Allan M. Weissman M, Cohen M. 2017. An ubiquitin-dependent balance between mitofusin turnover and fatty acids desaturation regulates mitochondrial fusion. Nat. Commun. 8:15832.
  • ChenY, FeldmanE, Deng C, Brown J.B, De Giacomo A.F, Gaw A.F, Shi G, Le Q.T ,Brown JM, , Koong A.C. 2005. Identification of Mitogen-Activated Protein Kinase Signaling Pathways That Confer Resistance to Endoplasmic Reticulum Stress in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cancer Res. 3(12):669-77
  • Cooke F.T, Dove S.K, McEwen R.K, Painter G, B. Holmes A, Hall, R.H. Michell M.N, Parker P. J. 1998. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in cerevisiae. Curr Biol.8 (22):1219-22.
  • Davis L. Stephanie A, Griffith D.A, Choi B, Cate J, Tullman E.D. 2018. Evolutionary engineering improves for medium-chain alcohols in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol biofuels 11:
  • Depristo M.A, Banks E, Poplin R, V Garimella, et al. 2011. A framework for variation discovery and genotyping using next generation DNA sequence data. Nat. Genet.43, 491-498.
  • Ding J, Huang X, Zhang H, Zhao N, Yang D, Zhang K. 2009. Tolerance and stress response to ethanol in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:253–263.
  • Dinh TN, Nagahisa K, Hirasawa T, Furusawa C, Shimizu H. 2008. Adaptation of Saccharomyces cerevisiae cells to high ethanol concentration and changes in fatty acid composition of membrane and cell size. PloS One 3: 2623.
  • Dragosits M, Mattanovich D. 2013. Adaptive laboratory evolution – Principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Fact. 12: 64.
  • Dutta A. 2018. Cointegration and nonlinear causality among ethanol-related prices: evidence from Brazil. GCB Bioenergy. 10:335-342.
  • Fath S. Mancias JD, Xiping Bi, Goldberg J. 2007. Structure and organization of coat proteins in the COPII cage. Cell. 129(7):1325-36.
  • Ghiaci P, Norbeck J, Larsson C. 2013. Physiological adaptations of Saccharomyces cerevisiae evolved for improved butanol tolerance. Biotechnol. Biofuels. 6:101.
  • Herve A, Ansanay-Galeote S, Dequin BB. 2001. Global gene expression during short-term ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 498 .98-103.
  • Jia K, Zhang Y, Li Y. 2010. Systematic engineering of microorganisms to Improve alcohol tolerance. Engineering Life. Sciences. 10(2010): 422-429.
  • Lafuente MJ, Gancedo C, Jauniaux JC, Gancedo 2002. Mth1 receives the signal given by the glucose sensors Snf3 and Rgt2 in Saccharomyces cerevisiae. Mo. Microbiol.35 (1), 161-172.
  • Li H, Durbin 2009. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 25(14): 1754–1760.
  • Moriya H, Johnston M. 2003. Glucose sensing and signaling in Saccharomyces cerevisiae through the Rgt2 glucose sensor and casein kinase I. 1572–1577. PNAS .101. 6.
  • Mulet JM, Alejandro S, Carlos R. 2004. The trehalose pathway and intracellular glucose phosphates as modulators of potassium transport and general cation homeostasis in yeast. Yeast. 21: 569–582.
  • Roozbehani B, Imani MS, Mirdrikvand M, Cheshmeh RA. 2012. Modeling Direct Ethylene Hydration over Zirconium Tungsten Catalyst: Fundamental of Ethanol Production Using the Biggest Global Ethylene Feeding Pipeline in Iran. EER. 2: 28-36.
  • Silva GM, Daniel F, Christine V. 2015. K63 polyubiquitination is a new modulator of the oxidative stress response. Nat Struct Mol Biol. 22(2): 116–123.
  • Somda MK, Savadogo A, Ouattara CAT, Outtara AS, Traora AS. 2011a. Improvement of bioethanol production using amylase properties from Bacllus licheniformis and yeasts strains fermentation for biomass valorization. Asian J. Biotechnol., 3:254-261.
  • Stanley D, Fraser S, Chambers P.J, Grant P.R, Stanley A .2010. Generation and characterization of stable ethanol-tolerant mutants of Saccharomyces cerevisiae. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 37:139–149.
  • Strahl T, Thorner J .2007. Synthesis and function of membrane phosphoinositides in budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta.1771 (3):353-404.
  • Toi H, Fujimura-Kamada K, Irie K, Takai Y, Todo S, Tanaka 2003. She4p/Dim1p interacts with the motor domain of unconventional myosins in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell.14 (6):2237-49.
  • Toulmay A, Prinz WA. 2012. A conserved membrane-binding domain targets proteins to organelle contact sites. J Cell Sci. 125:49-58
  • Van der AGA, Carneiro MO, Hartl C, et al. 2018. From Fast Q data to high confidence variant calls: the genome analysis toolkit best practices pipeline. Curr protoc Bioinformatics.15.3.
  • Vasundara S, Daili JAN, Holger W, Judita M, Antonio JP, Hartmut M, Roland L. 2007. Structure of the Yeast WD40 Domain Protein Cia1, a Component Acting Late in Iron-Sulfur Protein Biogenesis. Cell press. Struct. 15, 1246–1257.
  • Wallace-Salinas V. Gorwa-Grauslund MF. 2013. Adaptive evolution of an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae for combined tolerance to inhibitors and temperature. Biotechnol.Biofuels. 6:151.
  • Wendland B, Emr SD .1998. Pan1p, yeast eps15, functions as a multivalent adaptor that coordinates protein-protein interactions essential for endocytosis. J Cell Biol.141 (1):71-84.
  • Zverlov VV, Berezina O, Velikodvorskaya GA, Schwarz WH. 2006. Bacterial acetone and butanol production by industrial fermentation in the Soviet Union: use of hydrolyzed agricultural waste for biorefinery. Appl Microbiol Biotechnol. 71:587–597.
دوره 35، شماره 3
مهر 1401
صفحه 379-392
  • تاریخ دریافت: 25 آبان 1399
  • تاریخ بازنگری: 07 دی 1399
  • تاریخ پذیرش: 24 دی 1399