نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته دکتری دانشگاه تربیت مدرس
2 عضو هیات علمی دانشگاه تربیت مدرس
3 هیات علمی دانشگاه مازندران
4 دانشیار رشته قارچ شناسی دانشگاه تربیت مدرس
چکیده
لیگنانها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی باارزش میباشند که در بسیاری از گیاهان از جمله خانواده کتان (Linaceae) وجود دارند. در تحقیق حاضر، اثر نسبتهای مختلف عصاره سلولی و محیط کشت قارچ Piriformospora indica بر تولید ترکیبات فنلی در ریشههای موئین کتان سفید (Linum album) مورد مطالعه قرار گرفت. مقدار لیگنانهای لاریسیرسینول، پینورسینول، پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در ریشههای موئین به وسیله HPLC اندازهگیری شد. همچنین، در راستای درک سازوکار تازنهای قارچی، فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین تحت تاثیر نسبت 1 درصد محیط کشت قارچی به ترتیب 9/248 میکروگرم و 69/59 میلیگرم بر گرم وزن خشک و لاریسیرسینول و پینورسینول در نسبتهای 1 و 5/0 درصد عصاره سلولی به ترتیب به میزان 68/144 و 68/72 میکروگرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد. همچنین بیشترین میزان فنل کل، فلاوونوئیدها و لیگنین تحت تاثیر نسبت 5 درصد و فلاونول در نسبت 1 درصد محیط کشت فارچی اندازهگیری شد که به ترتیب 3/3،6/4، 6/1 و 1/2 برابر نسبت به ریشههای شاهد افزایش یافتند. علاوه بر آن، فعالیت آنزیم PAL با افزایش عصاره سلولی و محیط کشت قارچی در ریشههای مویین افزایش یافت و بالاترین فعالیت آن در ریشههای موئین تیمار شده با عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به ترتیب در نسبتهای 1 و 5 درصد (v/v) مشاهده گردید. با توجه به نتایج بدست آمده، محیط کشت قارچی تاثیر بیشتری بر تولید ترکیبات فنلی بخصوص لیگنانها داشته است.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Comparative investigation on the effect of Piriformospora indica mycelium extract and culture medium on phenolic compounds in Linum album hairy roots
نویسندگان [English]
1 Tarbiat Modares University
2 Tarbiat Modares University
3 Mazandaran University
4 Tarbiat Modares University
چکیده [English]
Lignans are a large group of important phenolic compounds and synthesized by many plants such as Linaceae family. In this research, the effects of different concentrations of mycelium extract and culture medium of Piriformospora indica on the levels of phenolic compounds in L. album hairy roots were investigated. The amount of lariciresinol, pinoresinol, podophyllotoxin and 6-methoxy podophyllotoxin were also analyzed by HPLC. To study the fungal elicitors’ mechanism of action, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) enzyme activity was investigated. Results showed that maximum amounts of podophyllotoxin and 6-methoxy podophyllotoxin were at 1 % (v/v) of fungal medium, 248.9 µg/g and 59.59 mg/g DW, respectively and the highest amounts of lariciresinol and pinoresinol respectively were seen at 1 and 0.5 % (v/v) of mycelium extract, 144.68 and 72.68 µg/g DW. Maximum amounts of total phenol, flavonoid and lignin were analyzed at 5 % (v/v) and flavonol at 1 % (v/v) fungal culture treatments which were 3.3, 4.6, 1.6 and 2.1 -fold greater than those of control. The activity of PAL enzyme was induced by mycelium extract and fungal medium, reaching a peak at 1 % and 5 % (v/v), respectively. Consider to these results, fungal culture medium was more effective than mycelium extract for stimulation of phenolic compound production.
کلیدواژهها [English]
بررسی مقایسه ای اثر عصاره سلولی و محیط کشت قارچ Piriformospora indicaبر تولید ترکیبات فنلی در ریشههای موئین کتان سفید(Linum album)
حنانه تشکری میانرودی1، محسن شریفی1*، نجمه احمدیان چاشمی2، ناصر صفایی3 و مهرداد بهمنش4
1 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی
2 بابلسر، دانشگاه مازندران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
3 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه بیماریهای گیاهی
4 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک
تاریخ دریافت: 5/12/94 تاریخ پذیرش: 13/4/95
چکیده
لیگنانها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی باارزش میباشند که در بسیاری از گیاهان از جمله خانواده کتان (Linaceae) وجود دارند. در تحقیق حاضر، اثر نسبتهای مختلف عصاره سلولی و محیط کشت قارچ Piriformospora indica بر تولید ترکیبات فنلی در ریشههای موئین کتان سفید (Linum album) مورد مطالعه قرار گرفت. مقدار لیگنانهای لاریسیرسینول، پینورسینول، پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در ریشههای موئین به وسیله HPLC اندازهگیری شد. همچنین، در راستای درک سازوکار تازنهای قارچی، فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین تحت تاثیر نسبت 1 درصد محیط کشت قارچی به ترتیب 9/248 میکروگرم و 69/59 میلیگرم بر گرم وزن خشک و لاریسیرسینول و پینورسینول در نسبتهای 1 و 5/0 درصد عصاره سلولی به ترتیب به میزان 68/144 و 68/72 میکروگرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد. همچنین بیشترین میزان فنل کل، فلاوونوئیدها و لیگنین تحت تاثیر نسبت 5 درصد و فلاونول در نسبت 1 درصد محیط کشت فارچی اندازهگیری شد که به ترتیب 3/3،6/4، 6/1 و 1/2 برابر نسبت به ریشههای شاهد افزایش یافتند. علاوه بر آن، فعالیت آنزیم PAL با افزایش عصاره سلولی و محیط کشت قارچی در ریشههای مویین افزایش یافت و بالاترین فعالیت آن در ریشههای موئین تیمار شده با عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به ترتیب در نسبتهای 1 و 5 درصد (v/v) مشاهده گردید. با توجه به نتایج بدست آمده، محیط کشت قارچی تاثیر بیشتری بر تولید ترکیبات فنلی بخصوص لیگنانها داشته است.
واژه های کلیدی: ریشه موئین، کتان سفید، لیگنان،محیط کشت قارچ، Piriformospora indica
* نویسنده مسئول، تلفن:82884479 ، پست الکترونیکی: msharifi@modares.ac.ir
مقدمه
لیگنانها شامل گروه بزرگی از متابولیتهای ثانوی گیاهی هستند که از دو واحد فنیل پروپانوئیدی مشتق شدهاند و به علت داشتن خاصیت ضد میکروبی و ضد ویروسی در درمان بسیاری از بیماریها اهمیت دارند (9). پودوفیلوتوکسین و مشتقات آن، یکی از مهم ترین انواع لیگنانها میباشند که به عنوان ماده اولیه برای تولید برخـی از داروهای ضد سرطانی مورد استفاده قرار میگیرند. اگرچه در حال حاضر ترکیبات لیگنانی از گونههای جنس در حال انقراض Podophyllumاستخراج میشوند، اما در سالهای اخیر کتان سفید (Linum album) به عنوان گونه بومی ایران، به منبع جایگزینی برای این ترکیبات تبدیل شده است (12 و 31). مسیر بیوسنتزی این ترکیبات از مسیر فنیل پروپانوئیدی مشتق می شود. مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدی یک مسیر متابولیسمی مهم است و در بیوسنتز طیف وسیعی از متابولیتهای ثانوی گیاهی از جمله آنتوسیانینها، ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها، لیگنینها و لیگنانها نقش دارد (26). القاء مسیر فنیل پروپانوئیدی از ویژگیهای عمومی پاسخهای دفاعی گیاهان به تنشهای پاتوژنی محسوب میشود (6). با توجه به ایـن کـه سـنتز شیمیایی پودوفیلوتوکسین مقرون به صرفه نیست، تولید آن با کشت سلول و اندام و همچنین استفاده از روشهای بیوتکنولوژی راه جایگزین و سودمندی است (23). از آنجایی که کشتهای تعلیقی از نظر ژنتیکی پایدار نیستند، روشهای جدیدی برای بهبود تولید لیگنانها دنبال میشود. کشت ریشههای موئین با استفاده از تراریخته کردن ژنتیکی بافت گیاهی با Agrobacterium rhizogenesبه دست میآید و مزایای فراوانی از جمله رشد سریع بدون استفاده از هورمونهای گیاهی، پایداری ژنتیکی و بیوشیمیایی و تولید زیادی از متابولیتها را دارد (13). از طرف دیگر سنتز و تجمع متابولیتهای ثانوی درگیاهان پاسخی عمومی به تنشهای زیستی و غیر زیستی میباشد، بنابراین، ترکیبات تازن با منشأ زیسـتی و یا غیرزیستی میتواند یکی از راهکارهای موثر برای افزایش تولید متابولیتهای ثانوی از طریـق القـای سیسـتم دفـاعی در کشتهای درون شیشه باشد (24). در بین تازنهای زیستی، تازنهای قارچی منجر به افزایش چشمگیر تولید ترکیبات شیمیایی گیاهی در کشت بافت گیاه میشوند (21). در مطالعات گذشته ما، تاثیر القایی عصاره سلولی و محیط کشت فیلتر شده Fusarium graminearum بر تولید و تجمع لیگنانها در کشت سلول کتان سفید نشان داده شد (10، 11و 27). در پژوهش حاضر، اثر غلظتهای مختلفی از عصاره سلولی و محیط کشت قارچ Piriformospora indica بر تولید برخی از لیگنانهای مهم بررسی میشود و پــس از آن، میــزان ترکیباتی که مسیر بیوسنتزی مشترکی با لیگنانها دارنـد از جمله لیگنین و سایر ترکیبات فنلی مطالعه میشود. همچنین تأثیر این تازنها بر فعالیـت آنـزیم فنیل آلانین آمونیا-لیاز (PAL) به عنوان اولین آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدها در ریشههای موئین کتان سفید سنجش میشود.
مواد و روشها
القای تولید ریشههای موئین توسط آگروباکتریوم: بذرهای کتان سفید از منطقه سوهانک با مختصات جغرافیایی N ً19 48َ °35، E 22ً 32ََ °51 جمع آوری شد. دانهها پس از شستشوی سطحی ابتدا به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 1 درصد، سپس 10 دقیقه در پراکسید هیدروژن 3/3 درصد و در مرحلۀ آخر یک دقیقه در الکل 70 درصد قرار گرفتند. پس از آن با آب مقطر سترون آبکشی شدند و در محیط پایه MS (Murashige and Skoog, 1962)کشت داده شدند (20). بذرها به مدت چهار هفته در دمای 25 درجه سانتیگراد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند و از قطعات برگی گیاهچههای حاصل برای ایجاد ریشههای موئین استفاده شد (1). ریشههای موئین با استفاده از Agrobactrium rhizogenes سویه LBA9402 تولید و تائید مولکولی آنها توسط بررسی بیان ژنهای دخیل در ایجاد ریشه موئین انجام شد (1). ریشهها به وزن 2 گرم، به منظور اعمال تیمار، در ارلنهای 100 میلی لیتری حاوی محیط پایه MS کشت و در شیکر انکوباتور با سرعت 100دور در دقیقه و دمای 25 درجه سانتیگراد در تاریکی قرار داده شدند (1).
تهیه تیمارهای قارچی: به منظور تهیه تیمارهای عصاره سلولی و محیط کشت قارچی P. indica ابتدا این قارچ در محیط سترون شده PDB (Potato Dextrose Broth) (19) کشت داده شد. سپس محیط کشت و زی توده قارچی در انتهای فاز لگاریتمی (روز هفتم پس از کشت) جمع آوری شد. ذی توده قارچی با عبور از کاغذ صافی جدا و جهت تهیه عصاره سلولی مورد استفاده قرار گرفت. محیط کشت آن با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه برای حذف ذرات اضافی سانتریفوژ و با استفاده از فیلترهای میلی پور 2/0 میکرونی، سترون شد.
عصاره سلولی نیز با استفاده از زی توده قارچی، بر اساس روشBaldi و همکاران (2009) آماده شد (5). به طور خلاصه، 5/12 میلی گرم از میسیلیوم ها با آب مقطر سترون شسته و با استفاده از نیتروژن مایع ساییده شدند. سپس در آب مقطر حل و محلولی با غلظت 250 میلی گرم در لیتر به دست آمد. محلول حاصل به مدت نیم ساعت در دمای 100 درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از آن با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد، محلول رویی به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتی گراد اتوکلاو شد و به عنوان تازن عصاره قارچی مورد استفاده قرار گرفت.
اعمال تیمارهای مورد نظر به کشت ریشه های موئین: مقدار 2 گرم از ریشههای موئین به ارلنهای 100 میلیلیتری محتوای 30 میلیلیتر محیط MS مایع منتقل شدند و در شیکر انکوباتور با سرعت 110 دور در دقیقه و دمای 26 درجه سانتیگراد در تاریکی قرار گرفتند. سپس در روز دهم از کشت ریشهها (ابتدای فاز لگاریتمی رشد آنها) عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به طور جداگانه، در چهار سطح 0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)، به محیط کشت ها اضافه شدند و اثر آنها پس از گذشت 5 روز از اعمال تیمار مورد بررسی قرار گرفت.
اندازه گیری رشد ریشههای موئین: رشد ریشهها با اندازهگیری وزن خشک آنان تعیین گردید. ریشهها توسط نایلون مش (42 میکرومتری) با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش از محیط کشت جدا شدند.ریشهها بلافاصله پس از جداسازی از محیط کشت وزن (وزن تر) و در ادامه به منظور تعیین وزن خشک، لیوفیلیز شدند.
استخراج و سنجش لیگنانها: 50 میلی گرم ریشه خشک شده با چهار میلی لیتر متانول 80 درصد کاملا ساییده و همگن شدند. مخلوط حاصل به مدت 15 دقیقه در حمام اولترا سونیک قرار گرفت و در ادامه حجم مساوی از آب و اتیل استات به آن افزوده شد و سانتریفوژ گردید. سپس فاز اتیل استات به تیوب جدید منتقل گردید و تبخیر شد. در انتها، رسوب خشک شده در یک میلی لیتر متانول حل و به مدت 10 دقیقه در13000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. برای بررسی محتوای لیگنانها از دستگاه HPLC (Agilent Technologies 1260 infinity, USA استفاده شد. برای بخش متحرک دستگاه که شامل استونیتریل و آب بود، از سیستم گرادیان مطابق جدول 1 استفاده شد. ستون مورد استفاده C18-ODS3 دارای طول 250 میلی متر و قطر 6/4 میلی متر بود. جذب این ترکیبات با استفاده از دتکتور UV در طول موج 280 نانومتر بررسی شد. حضور هر یک از لیگنانهای پودوفیلوتوکسین، لاریسیرسینول، پینورسینول و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین به کمک کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی (LC/MS) قبلاً تأیید شد (1و 11). مقدار لیگنانها بر اساس سطح زیر منحنی موجود از استاندارد هر یک از آنها محاسبه شد.
جدول1- مشخصات برنامه جریان و گرادیان دوره متحرک مورد استفاده در HPLCبرای سنجش مقادیر لیگنانها
آب |
استونیتریل (%) |
جریان (میلی لیتر در دقیقه) |
زمان (دقیقه) |
60 |
40 |
8/0 |
0 |
33 |
67 |
8/0 |
10 |
60 |
40 |
8/0 |
17 |
60 |
40 |
8/0 |
21 |
تعیین محتوای فنل کل، فلاونوئید کل و فلاوونول کل: جهت تهیه عصاره متانولی، 5/0 گرم از ریشههای منجمد شده در هشت میلی لیتر متانول80 درصد همگن و به مدت سه ساعت در حمام آب گرم، دمای70 درجه سانتیگراد، قرار داده شدند. همگنای حاصل با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 15دقیقه سانتریفوژ شد. از عصاره متانولی بدست آمده جهت سنجش فنل کل، فلاوونوئید کل و فلاوونول کل استفاده گردید.
سنجش فنل کل به روش فولین دنیسانجام شد (7). برای سنجش فنل سه میلی لیتر از عصاره متانولی موجود خشک، و رسوب حاصل در یک میلی لیتر آب بدون یون، حل شد. سپس به عصاره آبی، دو میلی لیتر معرف فولین دنیس اضافه شد. به مخلوط حاصل بعد از پنج دقیقه دو میلی لیتر محلول سدیم کربنات هفت درصد اضافه شد. حجم نهایی با آب بدون یون، به 5/12 میلی لیتر رسانده و جذب بعد از 10دقیقه در طول موج 700 نانومتر خوانده شد. منحنی جذب غلظت های مختلف گالیک اسید نیز به عنوان استاندارد مورد استفاده قرار گرفت.
به منظور سنجش محتوای فلاونول، به یک میلی لیتر از عصاره متانولی یک میلی لیتر از محلول کلریدآلومینیوم دو درصد و سه میلی لیتر از محلول استات سدیم ا پنج درصد اضافه گردید. محتوای فلاوونول کل براساس منحنی استاندارد روتین و در طول موج 445 نانومتر اندازه گیری شد (2).
سنجش فلاونوئید کل نیز براساس منحنی استاندارد روتین در طول موج 415 نانومتر سنجیده شد. به این منظور، به یک میلی لیتر از عصاره متانولی، 250 میکرولیتر از محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد و 250 میکرولیتر استات پتاسیم یک مولار اضافه و جذب نمونهها در طول موج 415 نانومتر خوانده شد (2).
در تمام موارد، مقادیر فنل کل، فلاونوئید کل و فلاوونول کل برا اساس میلی گرم بر گرم وزن خشک محاسبه گردید.
سنجش و اندازه گیری لیگنین: محتوای لیگنین با استفاده از معرف استیل بروماید(Iiyama and Wallis, 1988) تعیین گردید (15). به طور خلاصه 5/0 گرم از سلولهای فریز شده در 12 میلی لیتر آب مقطر ساییده شد. بعد از سانتریفوژ به رسوب حاصل به نسبت چهار برابر نمونه، اتانول مطلق اضافه گردید بعد از سانتریفوژ به رسوب اتانول اضافه شد و دوباره سانتریفوژ گردید. سپس به مدت یک شب نمونهها درمخلوط متانول و کلروفروم قرار داده شدند و سپس به آنها استون اضافه گردید و در نهایت پودر خشک دیواره به دست آمد. پودرهای خشک شده به وسیله الک 250 میکرونی صاف شدند. به شش میلی گرم پودر خشک دیواره سلولی، 5/2 میلی لیتر استیل بروماید 25 درصد اضافه و نمونهها به مدت 30 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. پس از آن از حمام آب یخ به مدت 5 تا 10 دقیقه استفاده شد. سپس نمونهها به وسیله کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف شدند. در ادامه ، به بخش مایع، پنج میلی لیتر هیدروکسید سدیم دو نرمال و شش میلی لیتر اسید استیک گلایسیال اضافه گردید و در نهایت، جذب نمونهها در طول موج 280 نانومتر خوانده شد. مقدار لیگنین موجود بر اساس درصد آن در وزن خشک دیواره محاسبه شد.
تعیین فعالیت فنیل آلانین آمونیا-لیاز (PAL): به منظور استخراج عصاره پروتئینی، یک گرم از ریشه موئین کتان سفید در دو میلی لیتر بافر پتاسیم فسفات 1/0 مولار (8pH =)، دارای یک گرم پلی وینیل پیرولیدون کاملا سائیده شد تا به حالت همگن در آمد. غلظت پروتئین نمونهها به روش Bradford (1976) تعیین شد (8). برای سنجش فعالیت PAL، به 150میکرولیتر از عصاره پروتئین استخراج شده، 200 میکرولیتر محلول فنیل آلانین 1/0 مولار در بافر پتاسیم فسفات (8 = pH) و 650 میکرولیتر پتاسیم فسفات بافر 1/0 مولار (8 = pH) اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت یک ساعت در دمای 37 درجة سانتیگراد قرار داده شد. سپس 50 میکرولیتر از HCl(6 مولار) برای غیر فعال کردن آنزیم، به مخلوط اضافه شد. شستشوی نمونه با پنج میلی لیتر از استات اتیل انجام شد. محلول استات اتیل در معرض جریان هوا تبخیر شد. رسوب حاصل در یک میلی لیتر از هیدروکسید سدیم (05/0 مولار) حل و جذب آن در طول موج 290 نانومتر خوانده شد.. فعالیت آنزیم PAL به کمک استاندارد سینامیک اسید، بر حسب واحد آنزیمی میکرومول سینامیک اسید بر گرم پروتئین بر دقیقه تعیین شد (22).
تجزیه و تحلیل آماری: کلیه آزمایشها با حداقل سه تکرار مستقل انجام گرفت. آنالیز واریانس دادهها و مقایسه میانگین ها با استفاده از نرم افزار SPSS (ویرایش 21) و آزمون دانکن جهت تعیین معنی دار بودن تفاوت ها در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج
اثر تازنهای قارچی بر رشد ریشههای موئین: اثر نسبتهایمختلف عصاره سلولی و محیط کشت قارچ بر رشد ریشههای موئین با اندازهگیری وزن خشک پس از گذشت 5 روز بررسی شد (شکل 1). نتایج نشان داد رشد ریشهها تحت تاثیر غلظت-های بیشتر هر دو تازن عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به طور معنی داری کاهش یافت. و این کاهش در ریشههای تحت تیمار با محیط کشت قارچی بیشتر بوده است.
|
شکل 1- وزن خشک ریشههای موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica با نسبتهای مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). دادهها حاصل 3 تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p≤) است.
اثر تازنهای قارچی بر میزان لیگنانها: نتایج بررسی لیگنانها در سطوح مختلف تیمارها نشان داد که بیشترین مقدار تولید پودوفیلوتوکسین، لاریسی رسینول، و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در نسبت 1 درصد هر دو تازن بدست آمد (شکل 2،3 و 5) و بیشترین مقدار پینورسینول در نسبت 5/0 درصد عصاره قارچی و نسبت 1 درصد محیط کشت قارچی اندازه گیری شد (شکل4). در بین تازنهای قارچی مورد بررسی، بیشترین مقدار تولید پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین مربوط به ریشههای تیمار شده با نسبت 1 درصد محیط کشت قارچی، به ترتیب به میزان 2/2 و 7/1 برابر نسبت به نمونههای شاهد بود در حالیکه عصاره سلولی باعث القا بیشترین میزان لاریسی رزینول و پینورزینول به ترتیب به میزان 1/2 و 7/1 برابر نمونههای شاهد شد.
|
شکل 2- محتوای پودوفیلوتوکسین در ریشههای موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica با نسبتهای مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p ≤) است.
|
|
شکل 3- محتوای لاریسی رسینول در ریشههای موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica با نسبت های مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p≤) است.
شکل 4- محتوای پینورزینول در ریشههای موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica با نسبتهای مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/ 0≥ p) است.
شکل 5- محتوای 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در ریشههای موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica با نسبت های مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میلههای عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p ≤) است.
اثر تازنهای قارچی بر محتوای فنل کل، فلاونوئید کل و فلاوونول کل: نتایج آنالیز واریانس میزان فنل کل نشان داد که رابطه مستقیمی بین تولید ترکیبات فنلی با افزایش نسبت تازنها در محیط کشت ریشه وجود دارد به طوری که با افزایش نسبت تازنهای قارچی، محتوای فنل کل در ریشه های موئین افزایش یافت (جدول 2و 3). بیشترین مقدار فنل کل در ریشههای تیمار شده با محیط کشت قارچی، حدود 07/1 میلی گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد که 3/3 برابرمقدار اندازه گیری شده در نمونههای شاهد بود (جدول3). مقدار فلاوونول کل نیز در ریشههای تیمار شده در هر دو تازن با افزایش غلظت، نسبت به شاهد افزایش معنی داری را نشان داد (جدول 2 و3) و در ریشههای تیمار شده با نسبت 5 درصد عصاره سلولی قارچ بیشترین میزان فلاونول، در حدود013/0 میلی گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد (جدول2). در حالیکه در ریشههای تیمار شده با محیط کشتقارچی بشترین میزان فلاوونولها به میزان 0167/0 میلی گرم بر گرم وزن خشک در نسبت 1 درصد اندازه گیری شد که در بین مقادیر فلاوونول کل دو تیمار قارچی، بیشترین مقدار را به خود اختصاص داد (جدول 3).
جدول2- محتوای فنل کل، فلاونوئید کل، فلاونول کل و لیگنین در ریشههای موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی قارچ P. indica در نسبتهای مختلف (0، 5/0 ، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p≤) است.
متابولیت نسبت عصاره سلولی قارچ |
فنل کل (mg/g DW) |
فلاونوئید کل (mg/g DW) |
فلاونول کل (mg/g DW) |
لیگنین (% cell wall DW) |
0 |
c014/0± 32/0 |
c00025/0± 0068/0 |
bc 0005/0 ± 0079/0 |
d3/0± 73/11 |
5/0 |
bc008/0± 33/0 |
c0002/0± 007/0 |
b00027/0 ± 0096/0 |
c36/0± 8/13 |
1 |
b023/0± 36/0 |
a0017/0± 016/0 |
a 0018/0 ± 012/0 |
b4/0± 63/14 |
5 |
a048/0± 73/0 |
b0013/0± 009/0 |
a 001/0 ± 013/0 |
a5/0± 63/16 |
جدول3- محتوای فنل کل، فلاونوئید کل، فلاونول کل و لیگنین در ریشههای موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با محیط کشت قارچ P. indica در نسبتهای مختلف (0، 5/0 ، 1 و 5 درصد (v/v)). دادهها حاصل 3 تکرار، میلههای عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p≤) است.
متابولیت نسبت محیط کشت قارچ |
فنل کل (mg/g DW) |
فلاونوئید کل (mg/g DW) |
فلاونول کل (mg/g DW) |
لیگنین (% cell wall DW) |
0 |
cd014/0± 32/0 |
cd0002/0± 0068/0 |
c 0005/0 ± 0079/0 |
d3/0± 73/11 |
5/0 |
c049/0± 43/0 |
c0005/0± 0074/0 |
c0011/0 ± 0081/0 |
c35/0± 26/14 |
1 |
ab051/0± 84/0 |
b0026/0± 0114/0 |
a 0033/0 ± 0167/0 |
b45/0± 43/16 |
5 |
a185/0± 07/1 |
a0038/0± 0318/0 |
b 0007/0 ± 0124/0 |
a35/0± 43/19 |
آنالیز واریانس محتوای فلاونوئید کل نشان داد که مقدار این ترکیبات نیز در ریشههای تیمار شده با هر دو تازن قارچی همانند ترکیبات فنلی دیگر افزایش معنی داری نسبت به شاهد یافت. اگرچه بیشترین مقدار فلاونوئید کل در ریشههای تیمار شده با نسبت 5 درصد محیط کشت سلولی، حدود 0318/0 میلی گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد (جدول3)، اما نسبت 1 درصد عصاره سلولی نیز افزایش معنی داری در مقدار این ترکیب در ریشهها در حدود 016/0 میلی گرم بر گرم وزن خشک نشان داد (جدول2). با توجه به نتایج بدست آمده، بنظر میرسد تازن محیط کشت قارچی تاثیر بیشتری را بر مقادیر ترکیبات فنلی نسبت به محیط کشت سلولی قارچ داشته است.
اثر تازنهای قارچی بر میزان لیگنین: نتایج بررسی میزان لیگنین در ریشههای کتانسفیدنشان داد که پس از گذشت 5 روز از اعمال تازنهای قارچی محتوای لیگنین کل در هر دو تیمار به طور معنی داری با افزایش غلظت تازنها نسبت به شاهد افزایش یافت، به طوری که میزان لیگنین کل در ریشههای تیمار شده با نسبت 5 درصد دو تیمار عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به ترتیب به مقدار 63/16 و 43/19 میلی گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد (جدول 2و 3).
اثر تازنهای قارچی بر فعالیت آنزیم PAL: بررسی نتایج فعالیت آنزیم PAL نشان داد تازنهای قارچی در سطوح مختلف باعث افزایش معنی داری در فعالیت این آنزیم در ریشههای موئین شدند. بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در ریشههای تیمار شده با نسبت 1 درصد عصاره سلولی و و نسبت 5 درصد محیط کشت قارچی به ترتیب 5/1 و 8/1 برابر بیشتر از ریشههای شاهد اندازهگیری شد نتایج مشخص کرد که میزان فعالیت آنزیم PAL تحت تاثیر محیط کشت قارچی بیشترین تغییرات را داشته است (شکل 6).
شکل 6- فعالیت آنزیم فنیل آمونیالیاز (PAL) در ریشههای موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica با نسبتهای مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میلههای عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0p≤) است.
بحث و نتیجه گیری
در تحقیق حاضر، اثر عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P.indicaبر رشد و تولید ترکیبات فنلی در ریشههای موئین کتان سفید بررسی شد. نتایج نشان داد که عصاره سلولی و محیط کشت قارچ در سطوح بیشتر ، منجر به کاهش رشد ریشههای موئین میشود. مطالعات متعدد نشان میدهد تازنهای قارچی باعث مهار رشد سلولهای گیاهی میشوند (4 و 18). کاهش رشد سلول تحت تاثیر تازنهای قارچی بهدلیل کاهش متابولیسم اولیه و آغاز متابولیسم ثانوی می باشد (29). در کتان زراعی (L. usitatissimum) نیز تحت تازنهای قارچی بعد از 5 روز زنده مانی به میزان 50- 30 درصد نسبت به سلولهای شاهد کاهش نشان داده است (14). مطالعات گذشته نشان داده است که سطح تازن اهمیت زیادی در فرآیند تحریک دارد و عامل مؤثری بر شدت پاسخ است (21). به طور مثال گزارشها نشان می دهد که غلظت زیاد تازن قارچی Rhizopus stolinofer (50 میلی گرم در لیتر) در کشت سلول Tobacco baccataمنجر به بیشترین میزان مرگ سلول ها و کمترین مقدار تاکسول شد، در حالی که غلظت کم آن (25 میلی گرم در لیتر) منجر به تولید بیشترین مقدار تاکسول و کمترین میزان مرگ و میر سلولها شده است (17). در این تحقیق نسبت 1 درصد (v/v) عصاره سلولی و محیط کشت قارچی بیشترین تاثیر افزایشی را بر مقدار پودوفیلوتوکسین و لاریسی رسینول و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در ریشههای موئین نشان داد و این در صورتی است که در این غلظت میزان رشد ریشهها نسبت به نمونه شاهد کاهش معنی داری داشته است. همچنین محیط کشت قارچی در نسبت 1 درصد (v/v) نسبت به عصاره سلولی قارج تاثیر بیشتری بر افزایش تولید لیگنانها نشان داد. در سالهای اخیر نیز گزارشهایی وجود دارد مبنی بر اینکه نسبت 1 درصد عصاره قارچی و محیط کشت قارچ F. graminearum بیشترین تاثیر افزایشی را بر میزان پودوفیلوتوکسین در سلولهای کتان سفید داشته است (11 و 27). Hano و همکاران نیز گزارش کردند نسبت 3 درصد (v/v) عصاره سلولی قارجهای Botrytis cinerea، Phoma exigua و F. oxysporum به طور متمایزی باعث القای تولید ترکیبات مونولیگنولی در سلولهای کتان زراعی میشوند (14). همچنین Baldi و همکاران (2010) و Kumar و همکاران (2012) در مطالعه جدا، تاثیر غلظتهای مختلف محیط کشت فیلتر شده قارچP. indica بر سلولهای ترانسفورم شده کتان سفید بررسی کردند و نشان دادند که به ترتیب نسبتهای 1 و 3 درصد محیط کشت بیشترین تاثیر را بر تولید لیگنانها دارد (4 و 18). مقداری از تازن قارچی که ریشهها در معرض آن قرار میگیرند می تواند نقش مهمی در تولید بیشتر لیگنانها داشته باشد. کاهش لیگنانها در ریشههای تیمار شده با نسبت 5 درصد عصاره سلولی و محیط کشت قارچی بعد از گذشت 5 روز در مقایسه با ریشههای شاهد، ممکن است به دلیل تبدیل این ترکیبات به ترکیبات فنلی دیگر از جمله فنولیک اسیدها و لیگنینها باشد (28). تازنهای حاصل از ترکیبات قارچی بسیار پیچیده هستند و شامل پروتئینها، اولیگو ساکاریدها، گلیکو پروتئینها، پپتید ها، کیتین و کیتوزان میباشد (25). به نظر میرسد این ترکیبات نقش القا کنندهایی درتولید و تجمع متابولیتهای ثانوی داشته باشند. اثرات خاص تازنهای قارچی در ارتباط با بر همکنش ویژه قارچ با سلول گیاهی و همچنین مسیر ترارسانی علامت مربوطه و به دنبال آن پاسخهای دفاعی سلول گیاهی متناسب با هر قارچ متفاوت میباشد (16). شناسایی ترکیبات فعال عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به درک مکانیسم برهمکنش تازنهای قارچی با سلول های گیاهی و به دنبال آن پاسخهای دفاعی گیاه کمک خواهد کرد.
ترکیباتی فنلی دیگری نیز از مسیر فنیل پروپانوئیدها در پاسخ به تازنهای زیستی تولید میشوند (3). در این مطالعه میزان فنل کل، فلاونول و فلاونوئیدها تحت تاثیر نسبتهای مختلف عصاره سلولی و محیط کشت قارچی در مقایسه با شاهد روندی افزایشی داشت. این افزایش تایید کننده پاسخهای دفاعی ریشههای کتانسفیدنسبت به حضور تازن می باشد. لیگنین یکی دیگر از ترکیباتی است که نقش دفاعی دارد و گیاه در پاسخ به استرسهای محیطی میزان آن را افزایش میدهد (25). افزایش لیگنین و سایر ترکیبات فنلی تحت تاثیر تازنهای قارچی در کشت سلول کتان زراعی و محیط کشت فیلتر شده قارچ بر گیاه کتان سفید نیز گزارش شده است (4 و 14). نتایج بررسی ما نیز نشان داد که مقدار لیگنین در پاسخ به تازنهای قارچی افزایش یافت.
به منظور درک رابطه بین تازنهای قارچی و افزایش ترکیبات فنلی، فعالیت آنزیمPAL به عنوان اولین آنزیم تنظیم کننده کلیدی مسیر فنیل پروپانوئیدی بررسی شد. آنزیم PAL که آغاز کننده نخستین مرحله از مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدها می باشد، پل ارتباطی بین متابولیتهای اولیه و برخی از متابولیتهای ثانوی میباشد. افزایش فعالیت PAL و دیگر آنزیمهای مسیر فنیل پروپانوئیدی که منجر به افزایش ترکیبات فنلی میشود، از نخستین پاسخهای گیاهان در شرایط تنش و در پاسخ به تازنهای قارچی میباشد (30). در مطالعه حاضر نیز افزایش میزان فعالیت این آنزیم تحت تاثیر تازنهای قارچی مشاهده گردید. با توجه به نتایج بدست آمده، بهنظر میرسد نسبت 1 درصد هر یک از تازنهای قارچی را میتوان به عنوان غلظت منتخب جهت افزایش تولید لیگنانها بهخصوص پودوفیلوتوکسین، لاریسی رزینول و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین انتخاب نمود.
بطور کلی نتایج نشان داد که محیط کشت قارچی نسبت به عصاره سلولی قارچی تاثیر بیشتری بر مقدار تولید ترکیبات مسیر فنیل پروپانوئیدی بخوص لیگنانها داشته است و این تاثیر القایی ممکن است به دلیل حضور برخی از متابولیتهای آزاد شده و خارج سلولی در محیط کشت قارچی در طی دوره رشدی آن باشد (4 و 18). احتمال میرود تنوع در پاسخ ریشههای موئین کتان سفید نسبت به تازنهای مختلف زیستی بدلیل نوع برهمکنش آنها در اطراف جایگاه پاسخ با اجزا مختلف تازن باشد (4). بنابراین مطالعات بیشتری برای درک بهتری از مکانیسم عمل تازن و ارتباط میان مسیرهای متابولیسمی گیاه، بخصوص بررسی فعالیت و بیان ژن آنزیمهای درگیر در بیوسنتز ترکیبات لیگنانی و فنلی مورد نیاز است.