نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته دکتری دانشگاه تربیت مدرس

2 عضو هیات علمی دانشگاه تربیت مدرس

3 هیات علمی دانشگاه مازندران

4 دانشیار رشته قارچ شناسی دانشگاه تربیت مدرس

چکیده

لیگنان‌ها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی باارزش می‌باشند که در بسیاری از گیاهان از جمله خانواده کتان (Linaceae) وجود دارند. در تحقیق حاضر، اثر نسبت‌های مختلف عصاره سلولی و محیط کشت قارچ Piriformospora indica بر تولید ترکیبات فنلی در ریشه‌های موئین کتان سفید (Linum album) مورد مطالعه قرار گرفت. مقدار لیگنان‌های لاریسی‌رسینول، پینورسینول، پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در ریشه‌های موئین به وسیله HPLC اندازه‌گیری شد. همچنین، در راستای درک سازوکار تازن‌های قارچی، فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا‌لیاز (PAL) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین تحت تاثیر نسبت 1 درصد محیط کشت قارچی به ترتیب 9/248 میکروگرم و 69/59 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک و لاریسی‌رسینول و پینورسینول در نسبت‌های 1 و 5/0 درصد عصاره سلولی به ترتیب به میزان 68/144 و 68/72 میکروگرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد. همچنین بیشترین میزان فنل کل، فلاوونوئید‌ها و لیگنین تحت تاثیر نسبت 5 درصد و فلاونول در نسبت 1 درصد محیط کشت فارچی اندازه‌گیری شد که به ترتیب 3/3،6/4، 6/1 و 1/2 برابر نسبت به ریشه‌های شاهد افزایش یافتند. علاوه بر آن، فعالیت آنزیم PAL‌ با افزایش عصاره سلولی و محیط کشت قارچی در ریشه‌های مویین افزایش یافت و بالاترین فعالیت آن در ریشه‌های موئین تیمار شده با عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به ترتیب در نسبت‌های 1 و 5 درصد (v/v) مشاهده گردید. با توجه به نتایج بدست آمده، محیط کشت قارچی تاثیر بیشتری بر تولید ترکیبات فنلی بخصوص لیگنان‌ها داشته است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Comparative investigation on the effect of Piriformospora indica mycelium extract and culture medium on phenolic compounds in Linum album hairy roots

نویسندگان [English]

  • Hannaneh Tashakori 1
  • Mohsen Sharifi 2
  • Najmeh Ahmadian 3
  • Naser Safaie 4
  • Mehrdad Behmanesh 2

1 Tarbiat Modares University

2 Tarbiat Modares University

3 Mazandaran University

4 Tarbiat Modares University

چکیده [English]

Lignans are a large group of important phenolic compounds and synthesized by many plants such as Linaceae family. In this research, the effects of different concentrations of mycelium extract and culture medium of Piriformospora indica on the levels of phenolic compounds in L. album hairy roots were investigated. The amount of lariciresinol, pinoresinol, podophyllotoxin and 6-methoxy podophyllotoxin were also analyzed by HPLC. To study the fungal elicitors’ mechanism of action, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) enzyme activity was investigated. Results showed that maximum amounts of podophyllotoxin and 6-methoxy podophyllotoxin were at 1 % (v/v) of fungal medium, 248.9 µg/g and 59.59 mg/g DW, respectively and the highest amounts of lariciresinol and pinoresinol respectively were seen at 1 and 0.5 % (v/v) of mycelium extract, 144.68 and 72.68 µg/g DW. Maximum amounts of total phenol, flavonoid and lignin were analyzed at 5 % (v/v) and flavonol at 1 % (v/v) fungal culture treatments which were 3.3, 4.6, 1.6 and 2.1 -fold greater than those of control. The activity of PAL enzyme was induced by mycelium extract and fungal medium, reaching a peak at 1 % and 5 % (v/v), respectively. Consider to these results, fungal culture medium was more effective than mycelium extract for stimulation of phenolic compound production.

کلیدواژه‌ها [English]

  • fungal culture
  • hairy root
  • lignan
  • Linum album
  • Piriformospora indica

بررسی مقایسه ای اثر عصاره سلولی و محیط کشت قارچ Piriformospora indicaبر تولید ترکیبات فنلی در ریشه­های موئین کتان سفید(Linum album)

حنانه تشکری میانرودی1، محسن شریفی1*، نجمه احمدیان چاشمیناصر صفایی3 و مهرداد بهمنش4

1 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

2 بابلسر، دانشگاه مازندران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

3 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه بیماری­های گیاهی

4 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 5/12/94                تاریخ پذیرش: 13/4/95

چکیده 

لیگنان­ها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی باارزش می­باشند که در بسیاری از گیاهان از جمله خانواده کتان (Linaceae)  وجود دارند. در تحقیق حاضر، اثر نسبت­های مختلف عصاره سلولی و محیط کشت قارچ Piriformospora indica بر تولید ترکیبات فنلی در ریشه­های موئین کتان سفید (Linum album) مورد مطالعه قرار گرفت. مقدار لیگنان­های لاریسی­رسینول، پینورسینول، پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در ریشه­های موئین به وسیله HPLC اندازه­گیری شد. همچنین، در راستای درک سازوکار تازن­های قارچی، فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا­لیاز (PAL)  مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین تحت تاثیر نسبت 1 درصد محیط کشت قارچی به ترتیب 9/248 میکروگرم و 69/59 میلی­گرم بر گرم وزن خشک و لاریسی­رسینول و پینورسینول در نسبت­های 1 و 5/0 درصد عصاره سلولی به ترتیب به میزان 68/144 و 68/72 میکروگرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد. همچنین بیشترین میزان فنل کل، فلاوونوئید­ها و لیگنین تحت تاثیر نسبت 5 درصد و فلاونول در نسبت 1 درصد محیط کشت فارچی اندازه­گیری شد که به ترتیب 3/3،6/4، 6/1 و 1/2 برابر نسبت به ریشه­های شاهد افزایش یافتند. علاوه بر آن، فعالیت آنزیم PAL‌ با افزایش عصاره سلولی و محیط کشت قارچی در ریشه­های مویین افزایش یافت و بالاترین فعالیت آن در ریشه­های موئین تیمار شده با عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به ترتیب در نسبت­های 1 و 5 درصد (v/v) مشاهده گردید. با توجه به نتایج بدست آمده، محیط کشت قارچی تاثیر بیشتری بر تولید ترکیبات فنلی بخصوص لیگنان­ها داشته است.

واژه های کلیدی: ریشه موئین، کتان سفید، لیگنان،محیط کشت قارچ، Piriformospora indica 

* نویسنده مسئول، تلفن:82884479 ، پست الکترونیکی: msharifi@modares.ac.ir

مقدمه

 

لیگنان­ها شامل گروه بزرگی از متابولیت­های ثانوی گیاهی هستند که از دو واحد فنیل پروپانوئیدی مشتق شده­اند و به علت داشتن خاصیت ضد میکروبی و ضد ویروسی در درمان بسیاری از بیماری­ها اهمیت دارند (9). پودوفیلوتوکسین و مشتقات آن، یکی از مهم ترین انواع لیگنان­ها می­باشند که به عنوان ماده اولیه برای تولید برخـی از دارو­های ضد سرطانی مورد استفاده قرار می­گیرند. اگرچه در حال حاضر ترکیبات لیگنانی از گونه­های جنس در حال انقراض Podophyllumاستخراج می­شوند، اما در سال­های اخیر کتان سفید (Linum album) به عنوان گونه بومی ایران، به منبع جایگزینی برای این ترکیبات تبدیل شده است (12 و 31). مسیر بیوسنتزی این ترکیبات از مسیر فنیل پروپانوئیدی مشتق می شود. مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدی یک مسیر متابولیسمی مهم است و در بیوسنتز طیف وسیعی از متابولیت­های ثانوی گیاهی از جمله آنتوسیانین­ها، ترکیبات فنلی، فلاونوئید­ها، لیگنین­ها و لیگنان­ها نقش دارد (26). القاء مسیر فنیل پروپانوئیدی از ویژگی­های عمومی پاسخ­های دفاعی گیاهان به تنش­های پاتوژنی محسوب می­شود (6). با توجه به ایـن کـه سـنتز شیمیایی پودوفیلوتوکسین مقرون به صرفه نیست، تولید آن با کشت سلول و اندام و همچنین استفاده از روش­های بیوتکنولوژی راه جایگزین و سودمندی است (23). از آنجایی که کشت­های تعلیقی از نظر ژنتیکی پایدار نیستند، روش­های جدیدی برای بهبود تولید لیگنان­ها دنبال می­شود. کشت ریشه­های موئین با استفاده از تراریخته کردن ژنتیکی بافت گیاهی با Agrobacterium rhizogenesبه دست می­آید و مزایای فراوانی از جمله رشد سریع بدون استفاده از هورمون­های گیاهی، پایداری ژنتیکی و بیوشیمیایی و تولید زیادی از متابولیت­ها را دارد (13). از طرف  دیگر سنتز و تجمع متابولیت­های ثانوی درگیاهان پاسخی عمومی به تنش­های زیستی و غیر زیستی می­باشد، بنابراین، ترکیبات تازن با منشأ زیسـتی و یا غیرزیستی می­تواند یکی از راهکار­های موثر برای افزایش تولید متابولیت­های ثانوی از طریـق القـای سیسـتم دفـاعی در کشت­های درون شیشه باشد (24). در بین تازن­های زیستی، تازن­های قارچی منجر به افزایش چشمگیر تولید ترکیبات شیمیایی گیاهی در کشت بافت گیاه می­شوند (21). در مطالعات گذشته ما، تاثیر القایی عصاره سلولی و محیط کشت فیلتر شده Fusarium graminearum بر تولید و تجمع لیگنان­ها در کشت سلول کتان سفید نشان داده شد (10، 11و 27). در پژوهش حاضر، اثر غلظت­های مختلفی از عصاره سلولی و محیط کشت قارچ Piriformospora indica بر تولید برخی از لیگنان­های مهم بررسی می­شود و پــس از آن، میــزان ترکیباتی که مسیر بیوسنتزی مشترکی با لیگنان­ها دارنـد از جمله لیگنین و سایر ترکیبات فنلی مطالعه می­شود. همچنین تأثیر این تازن­ها بر فعالیـت آنـزیم فنیل آلانین آمونیا-لیاز (PAL) به عنوان اولین آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدها در ریشه­های موئین کتان سفید سنجش می­شود.

مواد و روشها

القای تولید ریشه­های موئین توسط آگروباکتریوم: بذر­های کتان سفید از منطقه سوهانک با مختصات جغرافیایی N ً19 48َ °35،  E 22ً  32ََ °51 جمع آوری شد. دانه­ها پس از شستشوی سطحی ابتدا به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 1 درصد، سپس 10 دقیقه در پراکسید هیدروژن 3/3 درصد و در مرحلۀ آخر یک دقیقه در الکل 70 درصد قرار گرفتند. پس از آن با آب مقطر سترون آبکشی شدند و در محیط پایه MS (Murashige and Skoog, 1962)کشت داده شدند (20). بذرها به مدت چهار هفته در دمای 25 درجه سانتی­گراد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند و از قطعات برگی گیاهچه­های حاصل برای ایجاد ریشه­های موئین استفاده شد (1). ریشه­های موئین با استفاده از Agrobactrium rhizogenes سویه LBA9402 تولید و تائید مولکولی آن­ها توسط بررسی بیان ژن­های دخیل در ایجاد ریشه موئین انجام شد (1). ریشه­ها به وزن 2 گرم، به منظور اعمال تیمار، در ارلن­های 100 میلی لیتری حاوی محیط پایه MS کشت و در شیکر انکوباتور با سرعت 100دور در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی­گراد در تاریکی قرار داده شدند (1).

تهیه تیمارهای قارچی: به منظور تهیه تیمار­های عصاره سلولی و محیط کشت قارچی P. indica ابتدا این قارچ در محیط سترون شده PDB (Potato Dextrose Broth) (19)  کشت داده شد. سپس محیط کشت و زی توده قارچی در انتهای فاز لگاریتمی (روز هفتم پس از کشت) جمع آوری شد. ذی توده قارچی با عبور از کاغذ صافی جدا و جهت تهیه عصاره سلولی مورد استفاده قرار گرفت. محیط کشت آن با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه برای حذف ذرات اضافی سانتریفوژ و با استفاده از فیلتر­های میلی پور 2/0 میکرونی، سترون شد.

عصاره سلولی نیز با استفاده از زی توده قارچی، ‌بر اساس روشBaldi  و همکاران (2009) آماده شد (5). به طور خلاصه، 5/12 میلی گرم از میسیلیوم­ ها با آب مقطر سترون شسته و با استفاده از نیتروژن مایع ساییده شدند. سپس در آب مقطر حل و محلولی با غلظت 250 میلی گرم در لیتر به دست آمد. محلول حاصل به مدت نیم ساعت در دمای 100 درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از آن با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد،‌ محلول رویی به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتی گراد اتوکلاو شد و به عنوان تازن عصاره قارچی مورد استفاده قرار گرفت.

اعمال تیمار­های مورد نظر به کشت ریشه های موئین: مقدار 2 گرم از ریشه­های موئین به ارلن­های 100 میلی­لیتری محتوای 30 میلی­لیتر محیط MS مایع منتقل شدند و در شیکر انکوباتور با سرعت 110 دور در دقیقه و دمای 26 درجه سانتی‌گراد در تاریکی قرار گرفتند. سپس در روز دهم از کشت ریشه­ها (ابتدای فاز لگاریتمی رشد آن­ها) عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به طور جداگانه، ‌در چهار سطح 0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)، به محیط کشت ها اضافه شدند و اثر آنها پس از گذشت 5 روز از اعمال تیمار مورد بررسی قرار گرفت.

اندازه گیری رشد ریشه­های موئین: رشد ریشه­ها با اندازه­گیری وزن خشک آنان تعیین گردید. ریشه­ها توسط نایلون مش (42 میکرومتری) با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش از محیط کشت جدا شدند.ریشه­ها بلافاصله پس از جداسازی از محیط کشت وزن (وزن تر) و در ادامه به منظور تعیین وزن خشک، لیوفیلیز شدند.

استخراج و سنجش لیگنان­ها: 50 میلی گرم ریشه خشک شده با چهار میلی لیتر متانول 80 درصد کاملا ساییده و همگن شدند. مخلوط حاصل به مدت 15 دقیقه در حمام اولترا سونیک قرار گرفت و در ادامه حجم مساوی از آب و اتیل استات به آن افزوده شد و سانتریفوژ گردید. سپس فاز اتیل استات به تیوب جدید منتقل گردید و تبخیر شد. در انتها، رسوب خشک شده در یک میلی لیتر متانول حل و به مدت 10 دقیقه در13000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. برای بررسی محتوای لیگنان­ها از دستگاه HPLC (Agilent Technologies 1260 infinity, USA استفاده شد. برای بخش متحرک دستگاه که شامل استونیتریل و آب بود، از سیستم گرادیان مطابق جدول 1 استفاده شد. ستون مورد استفاده C18-ODS3 دارای طول 250 میلی متر و قطر 6/4 میلی متر بود. جذب این ترکیبات با استفاده از دتکتور UV در طول موج 280 نانومتر بررسی شد. حضور هر یک از لیگنان­های پودوفیلوتوکسین، لاریسی­رسینول، پینورسینول و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین به کمک کروماتوگرافی مایع و طیف سنجی جرمی (LC/MS) قبلاً تأیید شد (1و 11). مقدار لیگنان­ها بر اساس سطح زیر منحنی موجود از استاندارد هر یک از آنها محاسبه شد.

جدول1- مشخصات برنامه جریان و گرادیان دوره متحرک مورد استفاده در HPLCبرای سنجش مقادیر لیگنان­ها

آب

استونیتریل (%)

جریان

(میلی لیتر در دقیقه)

زمان (دقیقه)

60

40

8/0

0

33

67

8/0

10

60

40

8/0

17

60

40

8/0

21

تعیین محتوای فنل کل، فلاونوئید کل و فلاوونول کل: جهت تهیه عصاره متانولی، 5/0 گرم از ریشه­های منجمد شده در هشت میلی لیتر متانول80 درصد همگن و به مدت سه ساعت در حمام آب گرم، دمای70 درجه سانتی­گراد، قرار داده شدند. همگنای حاصل با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 15دقیقه سانتریفوژ شد. از عصاره متانولی بدست آمده جهت سنجش فنل کل، فلاوونوئید کل و فلاوونول کل استفاده گردید.

سنجش فنل کل به روش فولین دنیسانجام شد (7). برای سنجش فنل سه میلی لیتر از عصاره متانولی موجود خشک، و رسوب حاصل در یک میلی لیتر آب بدون یون، حل شد. سپس به عصاره آبی، دو میلی لیتر معرف فولین دنیس اضافه شد. به مخلوط حاصل بعد از پنج دقیقه دو میلی لیتر محلول سدیم کربنات هفت درصد اضافه شد. حجم نهایی با آب بدون یون، به 5/12 میلی لیتر رسانده و جذب بعد از 10دقیقه در طول موج 700 نانومتر خوانده شد. منحنی جذب غلظت های مختلف گالیک اسید نیز به عنوان استاندارد مورد استفاده قرار گرفت.

به منظور سنجش محتوای فلاونول،‌ به یک میلی لیتر از عصاره متانولی یک میلی لیتر از محلول کلریدآلومینیوم دو درصد و سه میلی لیتر از محلول استات سدیم ا پنج درصد اضافه گردید. محتوای فلاوونول کل براساس منحنی استاندارد روتین و در طول موج 445 نانومتر اندازه گیری شد (2).

سنجش فلاونوئید کل نیز براساس منحنی استاندارد روتین در طول موج 415 نانومتر سنجیده شد. به این منظور، به یک میلی لیتر از عصاره متانولی، 250 میکرولیتر از محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد و 250 میکرولیتر استات پتاسیم یک مولار اضافه و جذب نمونه­ها در طول موج 415 نانومتر خوانده شد (2).

در تمام موارد، مقادیر فنل کل، فلاونوئید کل و فلاوونول کل برا اساس میلی گرم بر گرم وزن خشک محاسبه گردید.

سنجش و اندازه گیری لیگنین: محتوای لیگنین با استفاده از معرف استیل بروماید(Iiyama and Wallis, 1988)  تعیین گردید (15). به طور خلاصه 5/0 گرم از سلول­های  فریز شده در 12 میلی لیتر آب مقطر ساییده شد. بعد از سانتریفوژ به رسوب حاصل به نسبت چهار برابر نمونه، اتانول مطلق اضافه گردید بعد از سانتریفوژ به رسوب اتانول اضافه شد و دوباره سانتریفوژ گردید. سپس به مدت یک شب نمونه­ها درمخلوط متانول و کلروفروم قرار داده شدند و سپس به آنها استون اضافه گردید و در نهایت پودر خشک دیواره به دست آمد. پودرهای خشک شده به وسیله الک 250 میکرونی صاف شدند. به شش میلی گرم پودر خشک دیواره سلولی، 5/2 میلی لیتر استیل بروماید 25 درصد اضافه و نمونه­ها به مدت 30 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. پس از آن از حمام آب یخ به مدت 5 تا 10 دقیقه استفاده شد. سپس نمونه­ها به وسیله کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف شدند. در ادامه ، به بخش مایع، پنج میلی لیتر هیدروکسید سدیم دو نرمال و شش میلی لیتر اسید استیک گلایسیال اضافه گردید و در نهایت، جذب نمونه­ها در طول موج 280 نانومتر خوانده شد. مقدار لیگنین موجود بر اساس درصد آن در وزن خشک دیواره محاسبه شد.

تعیین فعالیت فنیل آلانین آمونیا-لیاز (PAL): به منظور استخراج عصاره پروتئینی، یک گرم از ریشه موئین کتان سفید در دو میلی لیتر بافر پتاسیم فسفات 1/0 مولار (8pH =)، دارای یک گرم پلی وینیل پیرولیدون کاملا سائیده شد تا به حالت همگن در آمد. غلظت پروتئین نمونه­ها به روش Bradford (1976) تعیین شد (8). برای سنجش فعالیت PAL، به 150میکرولیتر از عصاره پروتئین استخراج شده، 200 میکرولیتر محلول فنیل آلانین 1/0 مولار در بافر پتاسیم فسفات (8 = pH) و 650 میکرولیتر پتاسیم فسفات بافر 1/0 مولار (8 = pH) اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت یک ساعت در دمای 37 درجة سانتی­گراد قرار داده شد. سپس 50 میکرولیتر از  HCl(6 مولار) برای غیر فعال کردن آنزیم،‌ به مخلوط اضافه شد. شستشوی نمونه با پنج میلی لیتر از استات اتیل انجام شد. محلول استات اتیل در معرض جریان هوا تبخیر شد. رسوب حاصل در یک میلی لیتر از هیدروکسید سدیم (05/0 مولار) حل و جذب آن در طول موج 290 نانومتر خوانده شد.. فعالیت آنزیم PAL‌ به کمک استاندارد سینامیک اسید، بر حسب واحد آنزیمی میکرومول سینامیک اسید بر گرم پروتئین بر دقیقه تعیین شد (22).

تجزیه و تحلیل آماری: کلیه آزمایشها با حداقل سه تکرار مستقل انجام گرفت. آنالیز واریانس داده­ها و مقایسه میانگین ها با استفاده از نرم افزار SPSS (ویرایش 21) و آزمون دانکن جهت تعیین معنی دار بودن تفاوت ها در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

نتایج

اثر تازن­های قارچی بر رشد ریشه­های موئین: اثر نسبت­هایمختلف عصاره سلولی و محیط کشت قارچ بر رشد ریشه­های موئین با اندازه­گیری وزن خشک پس از گذشت 5 روز بررسی شد (شکل 1). نتایج نشان داد رشد ریشه­ها تحت تاثیر غلظت-های بیشتر هر دو تازن عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به طور معنی داری کاهش یافت. و این کاهش در ریشه­های تحت تیمار با محیط کشت قارچی بیشتر بوده است.

 

a

 

شکل 1- وزن خشک ریشه­های موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica  با نسبت­های مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده­ها حاصل 3 تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p≤) است.

اثر تازن­های قارچی بر میزان لیگنان­ها: نتایج بررسی لیگنان­ها در سطوح مختلف تیمار­ها نشان داد که بیشترین مقدار تولید پودوفیلوتوکسین، لاریسی رسینول، و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در نسبت 1 درصد هر دو تازن بدست آمد (شکل 2،3 و 5) و بیشترین مقدار پینورسینول در نسبت 5/0 درصد عصاره قارچی و نسبت 1 درصد محیط کشت قارچی اندازه گیری شد (شکل4). در بین تازن­های قارچی مورد بررسی، بیشترین مقدار تولید پودوفیلوتوکسین و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین مربوط به ریشه­های تیمار شده با نسبت 1 درصد محیط کشت قارچی،‌ به ترتیب به میزان 2/2 و 7/1 برابر نسبت به نمونه­های شاهد بود در حالیکه عصاره سلولی باعث القا بیشترین میزان لاریسی رزینول و پینورزینول به ترتیب به میزان 1/2 و 7/1 برابر نمونه­های شاهد شد.

 

 

a

 

شکل 2- محتوای پودوفیلوتوکسین در ریشه­های موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica  با نسبت­های مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p ≤) است.

 

b

 

 

a

 

شکل 3- محتوای لاریسی رسینول در ریشه­های موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica  با نسبت های مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل  تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p≤) است.

 

شکل 4- محتوای پینورزینول در ریشه­های موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica  با نسبت­های مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/ 0≥ p) است.

 

شکل 5- محتوای 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در ریشه­های موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica  با نسبت های مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میله­های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p ≤) است.

اثر تازن­های قارچی بر محتوای فنل کل، فلاونوئید کل و فلاوونول کل: نتایج آنالیز واریانس میزان فنل کل نشان داد که رابطه مستقیمی بین تولید ترکیبات فنلی با افزایش نسبت تازن­ها در محیط کشت ریشه وجود دارد به طوری که با افزایش نسبت تازن­های قارچی، محتوای فنل کل در ریشه های موئین افزایش یافت (جدول 2و 3). بیشترین مقدار فنل کل در ریشه­های تیمار شده با محیط کشت قارچی،‌ حدود 07/1 میلی گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد که 3/3 برابرمقدار اندازه گیری شده در نمونه­های شاهد بود (جدول3). مقدار فلاوونول کل نیز در ریشه­های تیمار شده در هر دو تازن با افزایش غلظت، نسبت به شاهد افزایش معنی داری را نشان داد (جدول 2 و3) و در ریشه­های تیمار شده با نسبت 5 درصد عصاره سلولی قارچ بیشترین میزان فلاونول، در حدود013/0 میلی گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد (جدول2). در حالیکه در ریشه­های تیمار شده با محیط کشتقارچی بشترین میزان فلاوونول­ها به میزان 0167/0 میلی گرم بر گرم وزن خشک در نسبت 1 درصد اندازه گیری شد که در بین مقادیر فلاوونول کل دو تیمار قارچی، بیشترین مقدار را به خود اختصاص داد (جدول 3).

 

 

جدول2- محتوای فنل کل، فلاونوئید کل، فلاونول کل و لیگنین در ریشه­های موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی قارچ P. indica  در نسبت­های مختلف (0، 5/0 ، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میله های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p≤) است.

              متابولیت

نسبت عصاره سلولی قارچ

فنل کل

 (mg/g DW)

فلاونوئید کل

(mg/g DW)

فلاونول کل

 (mg/g DW)

لیگنین

 (% cell wall DW)

0

 c014/0± 32/0

 c00025/0± 0068/0

bc 0005/0 ± 0079/0

 d3/0± 73/11

5/0

 bc008/0± 33/0

 c0002/0± 007/0

  b00027/0 ± 0096/0

 c36/0± 8/13

1

 b023/0± 36/0

 a0017/0± 016/0

 a  0018/0 ± 012/0

 b4/0± 63/14

5

 a048/0± 73/0

 b0013/0± 009/0

 a  001/0 ± 013/0

 a5/0± 63/16

 

جدول3- محتوای فنل کل، فلاونوئید کل، فلاونول کل و لیگنین در ریشه­های موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با محیط کشت قارچ P. indica  در نسبت­های مختلف (0، 5/0 ، 1 و 5 درصد (v/v)). داده­ها حاصل 3 تکرار، میله­های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0 p≤) است.

            متابولیت

نسبت محیط کشت قارچ

فنل کل

 (mg/g DW)

فلاونوئید کل

(mg/g DW)

فلاونول کل

 (mg/g DW)

لیگنین

 (% cell wall DW)

0

 cd014/0± 32/0

 cd0002/0± 0068/0

c 0005/0 ± 0079/0

 d3/0± 73/11

5/0

 c049/0± 43/0

 c0005/0± 0074/0

  c0011/0 ± 0081/0

 c35/0± 26/14

1

 ab051/0± 84/0

 b0026/0± 0114/0

 a  0033/0 ± 0167/0

 b45/0± 43/16

5

 a185/0± 07/1

 a0038/0± 0318/0

 b  0007/0 ± 0124/0

 a35/0± 43/19

 

آنالیز واریانس محتوای فلاونوئید کل نشان داد که مقدار این ترکیبات نیز در ریشه­های تیمار شده با هر دو تازن قارچی همانند ترکیبات فنلی دیگر افزایش معنی داری نسبت به شاهد یافت. اگرچه بیشترین مقدار فلاونوئید کل در ریشه­های تیمار شده با نسبت 5 درصد محیط کشت سلولی، حدود 0318/0 میلی گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد (جدول3)، اما نسبت 1 درصد عصاره سلولی نیز افزایش معنی داری در مقدار این ترکیب در ریشه­ها در حدود 016/0 میلی گرم بر گرم وزن خشک نشان داد (جدول2). با توجه به نتایج بدست آمده، بنظر میرسد تازن محیط کشت قارچی تاثیر بیشتری را بر مقادیر ترکیبات فنلی نسبت به محیط کشت سلولی قارچ داشته است.

اثر تازن­های قارچی بر میزان لیگنین: نتایج بررسی میزان لیگنین در ریشه­های کتانسفیدنشان داد که پس از گذشت 5 روز از اعمال تازن­های قارچی محتوای لیگنین کل در هر دو تیمار به طور معنی داری با افزایش غلظت تازن­ها نسبت به شاهد افزایش یافت، به طوری که میزان لیگنین کل در ریشه­های تیمار شده با نسبت 5 درصد دو تیمار عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به ترتیب به مقدار 63/16 و 43/19 میلی گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد (جدول 2و 3).

اثر تازن­های قارچی بر فعالیت آنزیم PAL: بررسی نتایج فعالیت آنزیم PAL نشان داد تازن­های قارچی در سطوح مختلف باعث افزایش معنی داری در فعالیت این آنزیم در ریشه­های موئین شدند. بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در ریشه­های تیمار شده با نسبت 1 درصد عصاره سلولی و و نسبت 5 درصد محیط کشت قارچی به ترتیب 5/1 و 8/1 برابر بیشتر از ریشه­های شاهد اندازه­گیری شد نتایج مشخص کرد که میزان فعالیت آنزیم PAL تحت تاثیر محیط کشت قارچی بیشترین تغییرات را داشته است (شکل 6).

 

شکل 6- فعالیت آنزیم  فنیل آمونیالیاز (PAL) در ریشه­های موئین کتان سفید، 5 روز پس از تیمار با عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P. indica  با نسبت­های مختلف (0، 5/0، 1 و 5 درصد (v/v)). داده ها حاصل 3 تکرار، میله­های عمودی معرف انحراف استاندارد و حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح (05/0p≤) است.

بحث و نتیجه گیری

در تحقیق حاضر، اثر عصاره سلولی و محیط کشت قارچ P.indicaبر رشد و تولید ترکیبات فنلی در ریشه­های موئین کتان سفید بررسی شد. نتایج نشان داد که عصاره سلولی و محیط کشت قارچ در سطوح بیشتر ، منجر به کاهش رشد ریشه­های موئین می­شود. مطالعات متعدد نشان می­دهد تازن­های قارچی باعث مهار رشد سلول­های گیاهی می­شوند (4 و 18). کاهش رشد سلول تحت تاثیر تازن­های قارچی به­دلیل کاهش متابولیسم اولیه و آغاز متابولیسم ثانوی می باشد (29). در کتان زراعی (L. usitatissimum) نیز تحت تازن­های قارچی بعد از 5 روز زنده مانی به میزان 50- 30 درصد نسبت به سلول­های شاهد کاهش نشان داده است (14). مطالعات گذشته نشان داده است که سطح تازن اهمیت زیادی در فرآیند تحریک دارد و عامل مؤثری بر شدت پاسخ است (21). به طور مثال گزارش­ها نشان می دهد که غلظت زیاد تازن قارچی Rhizopus stolinofer (50 میلی گرم در لیتر) در کشت سلول Tobacco baccataمنجر به بیشترین میزان مرگ سلول ها و کمترین مقدار تاکسول شد، در حالی که غلظت کم آن (25 میلی گرم در لیتر) منجر به تولید بیشترین مقدار تاکسول و کمترین میزان مرگ و میر سلول­ها شده است (17). در این تحقیق نسبت 1 درصد (v/v) عصاره سلولی و محیط کشت قارچی بیشترین تاثیر افزایشی را بر مقدار پودوفیلوتوکسین و لاریسی رسینول و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در ریشه­های موئین نشان داد و این در صورتی است که در این غلظت میزان رشد ریشه­ها نسبت به نمونه شاهد کاهش معنی داری داشته است. همچنین محیط کشت قارچی در نسبت 1 درصد (v/v) نسبت به عصاره سلولی قارج تاثیر بیشتری بر افزایش تولید لیگنان­ها نشان داد. در سال­های اخیر نیز گزارش­هایی وجود دارد مبنی بر اینکه نسبت 1 درصد عصاره قارچی و محیط کشت قارچ F. graminearum بیشترین تاثیر افزایشی را بر میزان پودوفیلوتوکسین در سلول­های کتان سفید داشته است (11 و 27). Hano و همکاران نیز گزارش کردند نسبت 3 درصد (v/v) عصاره سلولی قارج­های Botrytis cinerea، Phoma exigua و F. oxysporum به طور متمایزی باعث القای تولید ترکیبات مونولیگنولی در سلول­های کتان زراعی می­شوند (14). همچنین Baldi  و همکاران (2010) و Kumar و همکاران (2012) در مطالعه جدا، تاثیر غلظت­های مختلف محیط کشت فیلتر شده قارچP. indica  بر سلول­های ترانسفورم شده کتان سفید بررسی کردند و نشان دادند که به ترتیب نسبت­های 1 و 3 درصد محیط کشت بیشترین تاثیر را بر تولید لیگنان­ها دارد (4 و 18). مقداری از تازن قارچی که ریشه­ها در معرض آن قرار می­گیرند می تواند نقش مهمی در تولید بیشتر لیگنان­ها داشته باشد. کاهش لیگنان­ها در ریشه­های تیمار شده با نسبت 5 درصد عصاره سلولی و محیط کشت قارچی بعد از گذشت 5 روز در مقایسه با ریشه­های شاهد، ممکن است به دلیل تبدیل این ترکیبات به ترکیبات فنلی دیگر از جمله فنولیک اسید­ها و لیگنین­ها باشد (28). تازن­های حاصل از ترکیبات قارچی بسیار پیچیده هستند و شامل پروتئین­ها، اولیگو ساکاریدها، گلیکو پروتئین­ها، پپتید ها، کیتین و کیتوزان می­باشد (25). به نظر می­رسد این ترکیبات نقش القا کننده­ایی درتولید و تجمع متابولیت­های ثانوی داشته باشند. اثرات خاص تازن­های قارچی در ارتباط با بر همکنش ویژه قارچ با سلول گیاهی و همچنین مسیر ترارسانی علامت مربوطه و به دنبال آن پاسخ­های دفاعی سلول گیاهی متناسب با هر قارچ متفاوت می­باشد (16). شناسایی ترکیبات فعال عصاره سلولی و محیط کشت قارچی به درک مکانیسم برهمکنش تازن­های قارچی با سلول های گیاهی و به دنبال آن پاسخ­های دفاعی گیاه کمک خواهد کرد.

ترکیباتی فنلی دیگری نیز از مسیر فنیل پروپانوئیدها در پاسخ به تازن­های زیستی تولید می­شوند (3). در این مطالعه میزان فنل کل، فلاونول و فلاونوئید­ها تحت تاثیر نسبت­های مختلف عصاره سلولی و محیط کشت قارچی در مقایسه با شاهد روندی افزایشی داشت. این افزایش تایید کننده پاسخ­های دفاعی ریشه­های کتانسفیدنسبت به حضور تازن می باشد. لیگنین یکی دیگر از ترکیباتی است که نقش دفاعی دارد و گیاه در پاسخ به استرس­های محیطی میزان آن را افزایش می­دهد (25). افزایش لیگنین و سایر ترکیبات فنلی تحت تاثیر تازن­های قارچی در کشت سلول کتان زراعی و محیط کشت فیلتر شده قارچ بر گیاه کتان سفید نیز گزارش شده است (4 و 14). نتایج بررسی ما نیز نشان داد که مقدار لیگنین در پاسخ به تازن­های قارچی افزایش یافت.

به منظور درک رابطه بین تازن­های قارچی و افزایش ترکیبات فنلی، فعالیت آنزیمPAL  به عنوان اولین آنزیم تنظیم کننده کلیدی مسیر فنیل پروپانوئیدی بررسی شد. آنزیم PAL که آغاز کننده نخستین مرحله از مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدها می باشد، پل ارتباطی بین متابولیت­های اولیه و برخی از متابولیت­های ثانوی می­باشد. افزایش فعالیت PAL و دیگر آنزیم­های مسیر فنیل پروپانوئیدی که منجر به افزایش ترکیبات فنلی می­شود، از نخستین پاسخ­های گیاهان در شرایط تنش و در پاسخ به تازن­های قارچی می­باشد (30). در مطالعه حاضر نیز افزایش میزان فعالیت این آنزیم تحت تاثیر تازن­های قارچی مشاهده گردید. با توجه به نتایج بدست آمده، به­نظر می­رسد نسبت 1 درصد هر یک از تازن­های قارچی را می‍توان به عنوان غلظت منتخب جهت افزایش تولید لیگنان­ها به­خصوص پودوفیلوتوکسین، لاریسی رزینول و 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین انتخاب نمود.

بطور کلی نتایج نشان داد که محیط کشت قارچی نسبت به عصاره سلولی قارچی تاثیر بیشتری بر مقدار تولید ترکیبات مسیر فنیل پروپانوئیدی بخوص لیگنان­ها داشته است و این تاثیر القایی ممکن است به دلیل حضور برخی از متابولیت­های آزاد شده و خارج سلولی در محیط کشت قارچی در طی دوره رشدی آن باشد (4 و 18). احتمال می­رود تنوع در پاسخ ریشه­های موئین کتان سفید نسبت به تازن­های مختلف زیستی بدلیل نوع برهمکنش آنها در اطراف جایگاه پاسخ با اجزا مختلف تازن باشد (4). بنابراین مطالعات بیشتری برای درک بهتری از مکانیسم عمل تازن و ارتباط میان مسیر­های متابولیسمی گیاه، بخصوص بررسی فعالیت و بیان ژن آنزیم­های درگیر در بیوسنتز ترکیبات لیگنانی و فنلی مورد نیاز است.

1-      Ahmadian, C.N., Sharifi, M., Yousefzadi, M., Behmanesh, M., Rezadoost, H., Cardillo, A. and Palazon, J., 2013, Analysis of 6-methoxy podophyllotoxin and podophyllotoxin in hairy root cultures of Linum album Kotschy ex Boiss. Med Chem Res, 22: 745-752.

2-      Akkol, E.K., Göge,r F., Kosar, M. and Baser, H.C., 2008, Phenolic composition and biological activities of Salvia halophile and Salvia virgata from Turkey. Food Chem, 108: 942-949.

3-      Bais, H. P., Park, S. W., Weir, T. L., Callaway, R.M. and Vivanco, J.M., 2004, How plants communicate using the underground information superhighway. Trends Plant Sci, 9: 26-32.

4-      Baldi, A., Farkya, S., Jain, A., Gupta, N., Mehra, R., Datta, V., Srivastava, A.K. and Bisaria, V.S., 2010, Enhanced production of podophyllotoxins by co-culture of transformed Linum album cells with plant growth-promoting fungi. Pure Appl Chem, 82(1): 227-241.

5-      Baldi, A., Srivastava, K. and Bisari, V.S., 2009, Fungal elicitors for enhanced production of secondary metabolites in plant cell suspension cultures. Soil Biol, 18: 373-380.

6-      Barz, W. and Mackenbrock, U., 1994, Constitutive and elicitation induced metabolism of isoflavones and pterocarpans in chickpea (Cicer arientinum) cell-suspension cultures. Plant Cell Tissue Org Cult, 38: 199-211.

7-      Boonyuen, C., Wangkarn, S., Suntornwat, O. and Chaisuksant, R., 2009, Antioxidant capacity and phenolic content of Mimusops elengi fruit extract. Kasetsart Journal: Natural Science, 43: 21-27.

8-      Bradford, M.M., 1976, A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248-254.

9-      Canel, C., Moraes, R.M., Dayan, F.E. and Ferreira, D., 2000, Molecules of interest: podophyllotoxin. Phytochemistry, 54: 115-20.

10-   Esmaeilzadeh, S., Sharifi, M., Ahmadian, C.N., Murata, J. and Satake, H., 2014, Significant enhancement of lignan accumulation in hairy root cultures of Linum album using biotic elicitors. Acta Physiol Plant, 36: 3325-3331.

11-   Esmaeilzadeh, S., Sharifi, M., Safaei, N., Murata, J., Araki, R., Yamagaki, T. and Satake, H., 2011, Increased lignan biosynthesis in the suspension cultures of Linum album by fungal extracts. Plant Biotechnol Rep, 5:367-373.

12-   Fuss, E., 2003, Lignans in plant cell and organ cultures: an overview. Phytochem Rev, 2: 307-320.

13-   Georgiev, M.I., Pavlov, A.T. and Bley, T., 2007, Hairy root type plant in vitro systems as sources of bioactive substances. Appl Microbiol Biotechnol, 74: 1175-85.

14-   Hano, C., Addi, M., Bensaddek, D., Cronier, S. and Laine, E., 2006, Differential accumulation of monolignol-drived compounds in elicited flax (Linum usitatissimum) cell suspension cultures. Planta, 223: 975-989.

15-   Iiyama, K. and Wallis, A., 1988, An improved acetyl bromide procedure for determining lignin in woods and wood pulps. Wood Sci Technol, 22: 271-280.

16-   Imre, E., Somssich, I.E. and Hahlbrok, K., 1998, Pathogen defence in plant-a paradigm of biological complexity. Trends Plant Sci, 3: 86–90.

17-   Khosroshahi, A., Valizadeh, M., Ghasempour, M. Naghdibadi , H., Dadpour, M.R. and Omidi, Y., 2005, Improved Taxol production by combination of inducing factors in suspension cell culture of Taxus baccata. Cell Biology International, 30: 262-269.

18-   Kumar, V., Rajauria, G., Sahai, V. and Bisaria, V.S., 2012, Culture filtrate of root endophytic fungus Piriformospora indica promotes the growth and lignan production of Linum album hairy root cultures. Process Biochem, 47: 901-907.

19-   Lichtenzveig, J., Anderson, J., Thomas, G., Oliver, R., and Singh, K., 2006, Inoculation and growth with soil borne pathogenic fungi. M. truncatula handbook. 1-10.

20-   Murashige, T. and Skoog, F., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassay of tobacco tissue culture. Physiol Plant, 15:473-497.

21-   Namdeo, A., Patil, S. and Fulzele, D.P., 2002, Influence of fungal elicitors on production of ajmalicine by cell cultures of Catharanthus roseus. Biotechnol Prog, 18: 159-62.

22-   Ochoa-Alejo, N. and Gomez-Peralta, J.E., 1993, Activity of enzymes involved in capsaicin biosynthesis in callus tissue and fruits of chili pepper (Capsicum annuum L.). Journal of Plant Physiology, 141: 147–152.

23-   Sahu, R., Gangopadhyay, M. and Dewanjee, S., 2013, Elicitor-induced rosmarinic acid accumulation and secondary metabolism enzyme activities in Solenostemon scutellarioides. Acta Physiol Plant, 35(5): 1473-1481.

24-   Savitha, B.C., Thimmaraju, R. and Bhagyalakshmi, N., 2006, Different biotic and abiotic elicitors influence betalain production inhairy root cultures of Beta vulgaris in shake-flask and bioreactor. Process Biochemistry, 41: 50–60.

25-   Schmitt, O., 2006, Wood and tree fungi: Biology damage protection and use. Springer-Verlag,Berlin, 2-52

26-   Sreelakshmi, Y. and Sharma, R., 2008, Differential regulation of phenylalanine ammonia lyase activity and protein level by light in tomato seedlings. Plant Physiol Biochem, 46:444-451.

27-   Tahsili, J., Sharifi, M., Safaie, N., Esmaeilzadeh-Bahabadi, S. and Behmanesh, M., 2014, Induction of lignans and phenolic compounds in cell culture of Linum album by culture filtrate of Fusarium graminearum. J Plant Interact, 9(1): 412-417.

28-   Tokunaga, N., Sakakibara, N., Umezawa, T., Ito, Y., Fukud, H. and Sato, Y., 2005, Involvement of extracellular dilignols in lignification during tracheary element differentiation of isolated Zinnia mesophyll cells. Plant and Cell Physiology, 46: 224-232.

29-   Wang, C.G. and Wu, J.Y., 2001, Enhancement of taxol production and excretion in Taxus chinensis cell culture by fungal elicitation and medium renewal. Applied Microbiology and Biotechnology, 55: 404–410.

30-   Wen, P.F., Chen, J.Y., Wan, S.B., Kong, W.F., Zhang, P. and Wang, W., 2008, Salicylic acid activates phenylalanine ammonia-lyase in grape berry in response to high temperature stress. Journal of Plant Growth Regultor, 55:1–10.

31-   Yousefzadi, M., Sharifi, M., Behmanesh, M., Ghasempour, A., Moyano, E. and Palazon, J., 2012, The effect of light on gene expression and podophyllotoxin biosynthesis in Linum album cell culture. Plant Physiol Biochem, 56: 41-46