نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

عضو هیات علمی مؤسسه تحقیقات خاک و آب کشور

چکیده

نیتروژن یکی از مهمترین و پرنیازترین عناصر برای رشد گیاهان است. نیتروژن در کشاورزی، معمولا از طریق کود شیمیایی در اختیار گیاه قرار می‌گیرد که باعث مشکلات زیست محیطی فراوانی می‌شود.. تثبیت زیستی نیتروژن از پدیده‌های طبیعی و استثنایی است که توسط گروهی از باکتری‌ها از جمله ریزوبیوم‌ها انجام می‌شود. باکتری اختصاصی همزیست تثبیت کننده نیتروژن باقلا Rhizobium leguminosarum bv. viciae می‌باشد. یکی از راه‌های مطمئن و ارزان برای تشخیص این باکتری آزمون آلودگی گیاه می‌باشد. در این پژوهش در موعد 50 درصد گلدهی نمونه‌برداری از گره‌های ریزوبیومی ریشه باقلا از استان‌های خوزستان، لرستان، گلستان، مازندران و گیلان انجام شد. در مجموع، تعداد 168 نمونه گره از این مناطق جمع‌آوری شد. پس از جداسازی باکتری‌ها از گره‌ها، آزمایشات مرفولوژیک و فیزیولوژیک مختلفی از جمله آزمون آلودگی گیاه و بررسی کارآیی تثبیت زیستی نیتروژن (S.E.) بر روی نمونه‌ها انجام شد. بر این اساس تعداد 101 جدایه، خالص‌سازی و شناسایی شدند. تعداد 42 جدایه بر اساس توان ایجاد گره در ریشه شناسایی و تأیید شدند. بر اساس نتایح کارایی تثبیت نیتروژن تعداد 19 جدایه انتخاب شدند. مقدار S.E. جدایه‌های انتخاب شده بین 5 تا 165 بود. از نظر مقاومت به آنتی بیوتیک‌ها دارای تنوع زیستی بودند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of some physiological characteristics of Rhizobium leguminosarum bv. viciae native to Iranian soils

چکیده [English]

Nitrogen is one the most important and most in need element for plants growth. In agriculture, the need of plants to nitrogen supplied through chemical fertilizers that causes many environmental problems. Biological nitrogen fixation is one of the exceptional natural phenomena that accomplished by some of bacteria including Rhizobia. Rhizobium leguminosarum bv. viciae is the specific symbiotic nitrogen fixer of fababean. Plant infection test is one of the inexpensive and reliable methods for detection of Rhizobium. In this research the sampling of Rhizobium root nodules of fababean in 50% flowering stage in fields of farmers from Khouzestan, Lorestan, Golestan, Mazandaran and Gilan provinces was accomplished. A total, 168 Rhizobium root nodules were collected from these areas. After isolation of bacteria from nodules, various morphological and physiological tests are performed on the isolates. Accordingly, 101 isolates were purified and detected. Plant infection test revealed that 42 isolates are able to form root nodules on fababean. The symbiotic effectiveness of selected isolates was 5-165. Thecae isolates showed diversity about antibiotic resistance.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Nitrogen
  • symbiotic
  • fixation

بررسی برخی خصوصیات فیزیولوژیک Rhizobium leguminosarum bv. viciae بومی ایران

هوشنگ خسروی

کرج، مؤسسه تحقیقات خاک و آب، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی

تاریخ دریافت:8/6/93                   تاریخ پذیرش: 17/7/94 

چکیده

نیتروژن یکی از مهم ترین و پرمصرف­ترین عناصر برای رشد گیاهان است. نیتروژن در کشاورزی، معمولاً از طریق کود شیمیایی در اختیار گیاه قرار می­گیرد که باعث مشکلات زیست محیطی فراوانی می­شود.. تثبیت زیستی نیتروژن از پدیده­های طبیعی و استثنایی است که توسط گروهی از باکتریها از جمله ریزوبیوم­ها انجام می­شود. باکتری اختصاصی همزیست تثبیت کننده نیتروژن باقلا Rhizobium leguminosarum bv. viciae می­باشد. یکی از راههای مطمئن و ارزان برای تشخیص این باکتری آزمون آلودگی گیاه می­باشد. در این پژوهش در موعد 50 درصد گلدهی، نمونه­برداری از گرههای ریزوبیومی ریشه باقلا از استانهای خوزستان، لرستان، گلستان، مازندران و گیلان انجام شد. در مجموع، تعداد 168 نمونه گره از این مناطق جمع­آوری شد. پس از جداسازی باکتریها از گرهها، آزمایشات مرفولوژیک و فیزیولوژیک مختلفی از جمله آزمون آلودگی گیاه و بررسی کارآیی تثبیت زیستی نیتروژن (S.E.) بر روی نمونه­ها انجام شد. بر این اساس تعداد 101 جدایه، خالص­سازی و شناسایی شدند. تعداد 42 جدایه بر اساس توان ایجاد گره در ریشه شناسایی و تأیید شدند. بر اساس نتایج کارآیی تثبیت نیتروژن تعداد 19 جدایه انتخاب شدند. مقدار S.E. جدایه­های انتخاب شده بین 5 تا 165 بود. جداهای انتخابی از نظر مقاومت به آنتی بیوتیکها دارای تنوع زیستی بودند.  نتیجه و حاصل اصلی این پژوهش دستیابی به چند سویه ریزوبیوم برتر بومی از نظر گره­بندی ریشه و کارآیی همزیستی برای ادامه پژوهشها در جهت معرفی مایه تلقیح ریزوبیوم برای گیاه باقلا بود.

واژه های کلیدی: نیتروژن، همزیستی، تثبیت. 

نویسنده مسئول، تلفن: 02636203502، آدرس پست الکترونیکی: hkhosravi@swri.ir

مقدمه

 

جمعیت جهان به طور تصاعدی در حال رشد و نیاز جامعه به غذا و از جمله پروتئین در حال افزایش است. بنابراین ارائه راهکارهای مبتنی بر توسعه پایدار و توجه به حفظ سلامت محیط زیست امری ضروری است. نیتروژن یکی از عناصر پر­نیاز و مهم برای رشد گیاهان است. با وجود اینکه بیش از 78 درصد ترکیب گازی جو زمین را نیتروژن مولکولی (N2) تشکیل می­دهد و برفراز هر هکتار زمین کشاورزی حدود 78000 تن از این گاز وجود دارد، اما این عنصر به شکل مولکولی برای گیاهان قابل جذب نیست. از طرف دیگر، نیتروژن، مهم ترین عامل محدود کننده تولید محصولات کشاورزی در جهان است (9). مصرف کودهای شیمیایی نیتروژنی یکی از راههای معمول برطرف کننده این محدودیت می­باشد که از یک سو مهم ترین نهاده کشاورزی مؤثر در افزایش تولید بوده و از سویی دیگر از پتانسیل آلوده­سازی بالایی برخوردار است. مصرف بی­رویه و غیر اصولی کودهای شیمیایی نیتروژنی باعث آلودگی نیتراتی آبهای سطحی و زیر زمینی و در نهایت موجب مسمومیت انسان، دام و آبزیان می­شوند. همچنین مشکل افزایش نیترات زدایی (دی نیتریفیکاسیون) و در نتیجه تولید بیشتر گازهای اکسید نیتروژنی و تخریب لایه حیاتی ازن را به همراه دارند. ظهور این قبیل مسائل مخرب و بسیاری مسائل دیگر ضرورت تجدیدنظر در روشهای افزایش تولید محصولات کشاورزی و لزوم فراهم­سازی شرایط برای استفاده بیشتر از فرآیندهای مفید طبیعی مانند تثبیت زیستی نیتروژن به جای کودهای شیمیایی نیتروژنی را ایجاب می­کند. تثبیت زیستی نیتروژن در انحصار انواع خاصی از موجودات پروکاریوت می‌باشد که توانائی تولید آنزیم نیتروژناز را دارند (9 و 23). ریزوبیوم اولین بار در سال 1888 از گره لگومها جداسازی وBacillus radicicola نامیده شد. ریزوبیوم همزیست با باقلا متعلق به سلسله باکتریها، شاخه پروتئوباکتر­ها، رده آلفاپروتئوباکتر­ها، راسته ریزوبیال، خانواده ریزوبیاسه، جنس ریزوبیوم، گونه لگومینوزاروم و بیووار ویسیا می­باشد (13). باکتری اختصاصی همزیست با باقلا Rhizobium leguminosarum bv. viciae می‌باشد. این باکتری، میله­ای شکل، هوازی، متحرک و دارای دو تا شش تاژه پیرامونی می­باشد. دمای بهینه برای رشد آن 30-25 درجه و pH بهینه برای رشد این باکتری شش تا هفت است. کلنیهای آن دایره­ای، محدب و برآمده، لعابی و نیمه مات هستند که پنج روز پس از رشد در محیط کشت (Yeast Manitol Agar)Y.M.A. قطر آنها به دو تا چهار میلی­متر می­رسد. باقلا به عنوان یکی از حبوبات عمده در بسیاری از کشورها از جمله چین، مصر،  سودان ، استرالیا و اتیوپی کشت و به صورت خشک یا سبز و تازه و یا کنسرو شده مصرف شده و بخشی از پروتئین جوامع را تأمین می­کند. مطابق آمار سازمان خوار و بار و کشاورزی جهانی، کشور چین با تولید 4/1 میلیون تن باقلا در سال 2012 در مقام اول می‌باشد (4). سطح زیر کشت باقلا در ایران در حدود 20000 هکتار و عملکرد متوسط باقلای خشک حدود دو تن در هکتار می­باشد. عمده سطح زیر کشت باقلا در استانهای خوزستان، لرستان،گلستان و مازندران می­باشد. سویه‌های برتر ریزوبیوم در گرههای فعال موجود در ریشه به شکل باکتروئید بوده و می‌توانند مقادیر قابل توجهی نیتروژن مولکولی هوا را تثبیت کنند. همزیستی باکتری فوق با گیاه باقلا علاوه بر تثبیت نیتروژن و در نتیجه کاهش مصرف کودهای شیمیایی نیتروژنی، سبب افزایش عملکرد نیز می­شود. مقدار تثبیت نیتروژن مولکولی با توجه به نوع سویه همزیست، جمعیت باکتریهای همزیست بومی، میزان کود مصرفی، رقم بذر و به طور کلی شرایط خاکی و اقلیمی بسیار متفاوت می‌باشد. مقدارتثبیت نیتروژن توسط ریزوبیوم باقلا متفاوت و حداکثر تا 30 درصد کل نیتروژن جذب شده گزارش شده است (17). همچنین گزارش شده که نیتروژن مشتق شده از اتمسفر توسط باقلا برای یک سویه ریزوبیوم بین 66 تا 74 درصد می­باشد (3).  در گزارش دیگری آمده است که باقلا 79 درصد نیتروژن مورد نیاز خود را از طریق تثبیت زیستی، 20 درصد از طریق خاک و فقط یک درصد آن را از طریق کود به دست می­آورد. (25).

در تحقیقی در آلبرتای کانادا مقدار تثبیت نیتروژن توسط باقلا 8/34 و 5/127 کیلوگرم نیتروژن در هکتار گزارش شد (18).

در شرایط اقلیمی و خاکی فرانسه و سوریه نیز همزیستی باقلا با یک سویه معین از ریزوبیوم به ترتیب 90 و 69 درصد از کل نیتروژن جذب شده توسط گیاه را از طریق تثبیت تأمین نمود (7).

تثبیت زیستی نیتروژن باقلا در مناطق مختلف کشاورزی جنوب بریتانیا مورد مطالعه و پتانسیل تثبیت نیتروژن، متفاوت و حداکثر تا 30 درصد کل نیتروژن جذب شده گزارش شده است (21).

تلقیح باقلا با ریزوبیوم، عملکرد و وزن صد دانه باقلا در سودان را به طور قابل توجهی افزایش داد.(12).

با توجه به اینکه رابطه همزیستی ریزوبیوم­ها با خانواده لگومها کاملاً اختصاصی بوده و هر لگوم قادر است فقط با یک گونه ریزوبیوم رابطه همزیستی تثبیت کنندگی نیتروژن داشته باشد بنابراین، بر اساس این خصوصیت آزمون آلودگی گیاه مهم ترین، مطمئن­ترین و ارزانترین روش برای شناسایی ریزوبیوم­ها تا سطح گونه و حتی بیووار معرفی شده است. آزمون کارآیی یا راندمان تثبیت نیتروژن  یا به اختصار، S.E. نیز از آزمونهای مهم برای انتخاب سویه­های برتر از نظر توان تثبیت نیتروژن مولکولی هوا محسوب می­شود.

هدف از انجام این پژوهش، بررسی و مطالعه سویه­های ریزوبیوم بومی همزیست با باقلا در مناطق عمده مختلف زیر کشت این محصول بود. هدف نهایی در پژوهشهای تکمیلی که شامل تحقیقات مزرعه­ای در مناطق مختلف ایران است، دستیابی به سویه­های برتر به منظور ارائه مایه تلقیح و کود زیستی نیتروژنی مناسب برای کشت باقلا در ایران است.

مواد و روشها

به منظور تهیه کلکسیونی متنوع از باکتری R. leguminosarum bv.viciae همزیست با باقلا از مزارع کشاورزان در استانهای گلستان، مازندران، خوزستان و لرستان به علت سطح زیر کشت قابل توجه و استان گیلان به علت کشتهای پراکنده متعدد، در موقع 50 درصد گل­دهی گیاه، نمونه­برداری انجام شد. برای نمونه­برداری، چند بوته باقلا که از نظر ظاهری دارای رشد بهتری بودند انتخاب و به وسیله بیل به شعاع حدود 15 سانتیمتر اطراف ریشه از خاک خارج شدند. پس از شستن ریشه‌ها و تمیز کردن آنها، گرهها به آرامی از ریشه جدا و پس از شستشوی کامل با آب، با دستمال کاغذی خشک و در ظروف حاوی سیلیکاژل قرار داده شدند. نمونه‌ها به آزمایشگاه بخش تحقیقات بیولوژی مؤسسه تحقیقات خاک و آب منتقل شدند. ابتدا گرهها به مدت 10 ثانیه در الکل 96 درجه و سپس به مدت دو دقیقه در کلرید جیوه 1/0 درصد قرار داده و استریل سطحی شدند. سپس گرهها با آب مقطر استریل حدود شش بار کاملاً شستشو داده شدند. گرهها با پنس استریل به درون لوله‌های درپوش­دار حاوی یک  میلی­لیتر آب مقطر استریل منتقل و به وسیله میله شیشه‌ای استریل به طور کامل له شدند. با استفاده از حلقه لوپ، مقداری از سوسپانسیون حاصل  بر روی پلیت حاوی محیط کشت Y.M.A انتقال داده شد. این محیط کشت حاوی دی­پتاسیم هیدروژن فسفات 5/0، سولفات منیزیم 1/0، کلرید سدیم 1/0،  مانیتول 10، عصاره مخمر 5/0، و آگار 15 گرم در یک لیتر آب مقطر و یک میلی­لیتر کنگورد 5/2 درصد بود. pH محیط روی هفت تنظیم شد. پس از پخش سوسپانسیون به وسیله حلقه، پلیتهای تلقیح شده در انکوباتور و دمای 28 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. با توجه به نوع سویه باکتری، بین 24 تا 72  ساعت کلنیها ظاهر شدند. از کلنیهای مشخص و تیپیک یک حلقه داخل لوله‌های اسلنت حاوی Y.M.A با سه درصد آهک کشت شدند. این اسلنتها جهت ادامه پژوهشهای مربوطه در دمای چهار درجه سانتی گراد و در یخچال نگهداری شدند. آزمونهای بررسی اشکال میکروسکوپی و کلنی باکتریها، آزمون تحرک و آزمایش گرم انجام شدند. برای بررسی مقاومت به آنتی­بیوتیک جدایه­ها از پنج آنتی­بیوتیک استرپتومایسین، اسپکتینومایسین، کانامایسین، ریفامپیسین و نالیدیکسیک اسید استفاده شد. حلال سه آنتی بیوتیک اول، آب مقطر، حلال ریفامپیسین، اتانول 95 درصد و حلال نالیدیکسیک اسید، سود یک نرمال بود. از هرآنتی بیوتیک، پنج سطح 10؛ 20، 30، 40 و 50 میلی­گرم در لیتر محیط کشت استفاده شد (6). برای تجزیه آماری داده­های آنتی­بیوتیک از برنامه Minitab استفاده شد. برای نگهداری و حفاظت از نمونه­های باکتری در دراز مدت با استفاده از روش لیوفیلیزاسیون یا فریز درایینگ سه تکرار آمپول لیوفیلیزه تهیه شد (6 و 20).

جهت تأیید نهایی باکتریهای مورد نظر، آزمون آلودگی گیاه بر روی آنها صورت گرفت. برای این منظور از سیستم ظروف لئونارد حاوی ماسه شسته و استریل و در سه تکرار استفاده شد. یک عدد بذر باقلای استریل سطحی شده در هر ظرف کشت شد. باکتریهای مورد نظر در محیط مایع Y.M.B. تکثیر و سپس یک میلی­لیتر از سوسپانسیون باکتری مورد نظر با جمعیت 8 10 سلول در هر میلی­لیتر بر روی هر بذر باقلا تلقیح شد. در طول دوره رشد، محلول غذایی عناصر کم مصرف و پر مصرف (بدون نیتروژن) از طریق سیستم ظرف لئونارد تأمین شد. دمای اتاقک رشد بین 20 تا 30 درجه سانتی گراد تنظیم شد. سه تکرار نیز به صورت شاهد بدون تلقیح در نظر گرفته شدند. پس از چهار هفته، ریشه­ها از نظر تشکیل گره مورد بررسی قرار گرفتند (6، 11 و 20). برای محاسبه درجه گره­بندی از جدول یک استفاده شد (8).

جدول 1- روش درجه گره­بندی برای لگومها (8)

توزیع و تعداد گره­­های موثر

درجه گره­بندی

در سایر قسمت­های ریشه

در ناحیه تاج ریشه*

0

0

0

0

5>

1

0

10-5

2

0

10<

3

5>

10<

4

10<

10<

5

*تاج ریشه عبارت است از 5 سانتیمتر بالایی ابتدای ریشه

آزمون بررسی کارآیی تثبیت نیتروژن به صورت گلخانه­ای انجام شد. برای این منظور از گلدانهای حاوی دو کیلوگرم ماسه استریل استفاده شد. تیمارها شامل تیمارهای تلقیحی، تیمار نیتروژنی و تیمار شاهد بدون تلقیح در سه تکرار بودند. پس از رشد، یک میلی­لیتر از سوسپانسیون باکتری مورد نظر با جمعیت 8 10 سلول در هر میلی­لیتر بر روی هر بذر باقلا تلقیح شد. در طول دوره رشد، محلول غذایی عناصر کم مصرف و پر مصرف (بدون نیتروژن) تأمین شد. تیمار نیتروژنی به مقدار 125 میلی­گرم در کیلوگرم به شکل نیترات پتاسیم و به صورت تقسیط در پنج مرحله و هر مرحله 25 میلی­گرم در کیلوگرم به ترتیب در 4، 6، 7، 8 و 9 هفتگی استفاده شد. دمای گلخانه بین 20 تا 30 درجه سانتی گراد تنظیم شد. در انتهای 10 هفتگی، اندام هوایی از محل طوقه جداسازی و در داخل پاکتهای کاغذی به مدت سه روز در آون با دمای 72 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. سپس وزن خشک اندام هوایی اندازه­گیری شد (6 و20). وزن خشک اندام هوایی شاخص مناسبی برای محاسبه کارآیی تثبیت نیتروژن (S.E.) است. برای به دست آوردن S.E از فرمول زیر استفاده شد (20):

 

در این فرمول I: وزن خشک اندام هوایی مربوط به تیمار تلقیح شده، C: وزن خشک اندام هوایی مربوط به تیمار شاهد بدون تلقیح و N: وزن خشک اندام هوایی مربوط به تیمار نیتروژنی است. در ارزیابی کارآیی همزیستی، 50>:S.E. نسبتاً مؤثر (ضعیف)، 75-50=S.E.: مؤثر (متوسط) و 100-75=S.E.: کارآیی خوب و 100<S.E.: کارآیی خیلی خوب و به عنوان سویه برتر طبقه­بندی می­شوند. 

نتایج و بحث

در مجموع 168 نمونه گره ریزوبیوم باقلا از مناطق مختلف ایران جمع آوری شد. تعداد و محل جداسازی باکتریها در جدول دو ارائه شده است. تعداد 150 جدایه باکتری از گرهها جداسازی شدند. 101 جدایه دارای مشخصات میکروسکوپی و مرفولوژیک ریزوبیوم بودند. کلیه جدایه­های انتخابی در این مرحله، گرم منفی، میله­ای، هوازی، متحرک و کلنیهای آنها دایره­ای، محدب، برآمده، لعابی، نیمه مات، فاقد توان جذب کنگورد با قطر کلنی دو تا چهار میلی­متر پس از پنج روز بودند. این موارد مطابق با مشخصات ذکر شده در منابع (13) برای ریزوبیوم بود (داده­ها نشان داده نشده است). بر اساس آزمون آلودگی گیاه، تعداد 42 جدایه شناسایی و تأیید شدند.

همان طوری که جدول دو نشان می­دهد تعداد جدایه خالص شده معمولاً کمتر از تعداد گره جمع­آوری شده می­باشد. یکی از دلایل این مسئله این می­تواند باشد که در برخی از گرهها ممکن است باکتری در حین انتقال از مزرعه تا آزمایشگاه توان رشد خود را از دست بدهد و یا اینکه در هنگام استریل نمودن گره، مواد استریل کننده به داخل گره نفوذ و موجب از بین رفتن باکتری شود.

 

جدول 2- تعداد نمونه و جدایه­های خالص شده به تفکیک استان

تعداد جدایه انتخاب شده

 بر اساس آزمون آلودگی گیاه*

تعداد جدایه تأیید شده بر اساس

 خصوصیات اندازه­گیری شده

 

تعدادجدایه باکتری

خالص شده

تعداد نمونه گره

جمع­آوری شده

استان

16

16

27

28

گلستان

8

25

42

48

مازندران

6

15

25

34

گیلان

6

7

16

18

لرستان

6

38

40

40

خوزستان

42

101

150

168

    جمع           

* جدایه­های با درجه گره­بندی کمتر از یک ارائه نشده­اند.

 

در یک بررسی در چین از 54 جدایه جداسازی شده از گرههای ریزوبیومی باقلا از مناطق مختلف، 48 جدایه توان تشکیل گره در ریشه باقلا را داشتند. در این گزارش آمده است شش جدایه برای ادامه کار برای تولید مایه تلقیح انتخاب شد (24).

در جدول دو همچنین همه جدایه­های خالص شده به عنوان ریزوبیوم مورد تأیید قرار نگرفتند. از دلایل این مسئله ممکن است به علت وجود سایر باکتریها غیر از ریزوبیوم در داخل گره یا سایر آلودگیهای در سطح گره باشد. گزارش شده است از گرههای استریل سطحی شده جداسازی شده از ریشه یونجه باکتریهای اندوفیت غیر ریزوبیومی هم جداسازی شده است (22).

در جدول سه نتایج مقاومت و حساسیت سویه­های مختلف به مقادیر مختلف آنتی­بیوتیکها ارائه شده است. دندوگرام ترسیم شده جدایه­های مختلف بر اساس نتایج مقاومت به آنتی­بیوتیک نیز در شکل یک ارائه شده است. بر این اساس بیش از 90 درصد باکتریها دارای تشابهی بیشتر از50 درصد بودند. کل سویه­های انتخابی در 14 گروه، تقسیم بندی شدند. نتایج نشان داد که جدایه­ها از نظر حساسیت و یا مقاومت به آنتی­بیوتیکها و سطوح مختلف آن دارای تنوع (Diversity) می­باشند. روش مقاومت به غلظتهای کم آنتی­بیوتیک یکی از روشهای بررسی وضعیت تاکسونومیک و تنوع ژنتیکی سویه­های مختلف باکتریها می­باشد. امروزه برای مطالعه تنوع ژنتیکی و وضعیت تاکسونومیک باکتریها، بررسی ژن 16S rRNA روشی مرسوم و معتبر محسوب شده و توسط پژوهشگران مورد استفاده قرار می­گیرد. در این رابطه در پژوهشی باکتریهای سودوموناس بومی خاکهای ایران توسط این روش بررسی شدند (2). همچنین در بررسی دیگری تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست دریاچه اینچه برون توسط مطالعه ژن 16S rRNA انجام شد (1). علی رغم رایج بودن روشهای مولکولی با این حال در مواردی روش بررسی حساسیت و مقاومت به آنتی بیوتیک در مورد ریزوبیوم­ها نیز استفاده می­شود. در یک بررسی مقاومت به آنتی بیوتیک سویه­های ریزوبیوم جداسازی شده از گره ریزوبیومی باقلا نشان داد اکثریت جدایه­ها به استرپتومایسین حساس و تقریبا همه جدایه­ها به غلظتهای مختلف نالیدیسیک اسید مقاوم بودند و این در حالی بود که فقط یک سویه به استرپتومایسین مقاوم بود )16).

 

 

جدول 3 - نتایج مقاومت به آنتی­بیوتیک جدایه­های مختلف*

نوع آنتی­بیوتیک

Spectinomycin

Nalidixic acid

Rifampicin

Kanamycin

Streptomycin

 

 

 

 

 

 

 

ردیف

سویه

10 

20 

30 

40 

50 

10

20

30

40

50

10 

20 

30 

40

50

10

20

30

40

50

10

20

30

40

50

 

 

 

 

 

 

 

 

mg.l-1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

F1

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

2

F3

R

R

R

S

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

3

F4

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

 

-

-

-

4

F7

R

R

S

-

-

R

R

R

R

R

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

R

R

R

S

-

5

F9

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

S

-

-

-

R

R

R

S

-

S

-

-

-

-

6

F10

S

-

-

-

-

R

S

-

-

-

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

7

F14

S

S

-

-

-

R

R

R

R

S

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

8

F15

S

S

-

-

-

R

R

R

R

S

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

9

F16

S

S

-

-

-

R

R

S

-

-

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

S

-

-

-

-

10

F17

R

S

-

-

-

R

R

R

R

S

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

11

F18

R

R

S

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

12

F19

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

13

F20

R

R

R

S

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

S

S

-

-

-

14

F21

S

S

-

-

-

R

R

R

R

S

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

15

F22

R

R

R

S

-

R

S

-

-

-

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

R

R

R

R

R

16

F23

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

S

-

-

-

-

17

F26

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

18

F27

R

S

-

-

 

R

S

-

-

-

S

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

19

F28

S

S

-

-

-

R

R

R

S

-

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

S

-

-

-

-

20

F29

R

R

S

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

21

F30

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

S

S

S

-

-

-

-

22

F31

R

R

R

S

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

23

F32

R

R

R

S

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

R

S

-

-

-

24

F34

R

R

S

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

25

F35

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

26

F36

R

R

R

S

-

R

S

-

-

-

S

S

-

-

-

R

R

S

-

-

S

-

-

-

-

27

F37

R

R

R

S

-

R

R

R

S

-

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

S

-

-

-

-

28

F39

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

S

-

-

-

R

R

R

-

-

S

-

-

-

-

29

F40

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

30

F41

R

R

R

S

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

31

F42

R

S

-

-

-

R

R

S

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

R

S

-

-

-

32

F43

R

R

R

R

R

R

R

R

R

S

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

S

-

-

-

-

33

F44

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

R

R

R

R

R

S

-

-

-

-

34

F45

R

S

-

-

 

R

R

R

R

S

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

S

-

-

-

-

35

F46

R

R

R

S

-

R

R

R

R

R

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

R

R

R

S

R

36

F49

R

R

S

-

-

R

R

R

R

S

S

S

-

-

-

R

R

S

-

-

S

-

-

-

-

37

F50

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

38

F51

R

R

R

R

R

R

R

R

R

S

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

R

R

R

R

S

39

F52

R

S

-

-

-

R

S

-

-

-

S

S

-

-

 

S

-

-

-

-

S

-

-

-

-

40

F53

R

R

R

R

S

R

R

R

R

S

R

S

-

-

-

S

-

-

-

-

R

S

-

-

-

41

F54

R

S

-

-

-

R

R

-

-

-

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

R

S

-

-

-

42

F55

R

R

R

R

R

R

R

R

R

S

S

S

-

-

-

S

-

-

-

-

R

S

-

-

-

* S= Sensitive, R= Resistant, (-) = No growth

 

 

تنوع زیستی جدایه­های R. leguminosarum bv. viciae  جداسازی شده از مصر نیز بر اساس مطالعات مقاومت به آنتی بیوتیکها گزارش شده است (14).

در منابع مختلف نگاههای متفاوتی به تحلیل نمودارهای فیلوژنی می­شود. با این حال تفسیر این نمودارها نیاز به دقت دارند. در شکل یک دایره­ها در محل اتصال اضلاع، به عنوان گره (Node) نامیده می­شوند. گره واحد تاکسونومیک بوده و به عنوان والد موارد پایین­تر در نظر گرفته می­شود. . نگاهی به بالاترین دایره در شکل یک این مسئله را در مورد سویه­های مورد بررسی نشان می­دهد که منشاء (Root) همه سویه­ها یکی بوده، به طوری که در طول زمان دچار گوناگونی و تنوع و تفکیک سویه­ای شده­اند. اضلاع عمودی به عنوان شاخه (Branch) نامیده می­شوند و رابط بین والد و گونه محسوب می­شوند. بر اساس مقاومت و حساسیت به پنج نوع آنتی­بیوتیک ذکر شده تنوع و تغییرات در سطح سویه کاملاً مشهود می­باشد. از دلایل این تنوع می­تواند پراکنش جغرافیایی مکانهای مورد نمونه­برداری باشد.

نتایج بررسی درجه گره­بندی جدایه­های مختلف بر اساس نتایج آزمون آلودگی گیاه در جدول چهار ارائه شده است.

 

 

 شکل 1- درخت فیلوژنی جدایه­های انتخابی از لحاظ مقاومت به آنتی­بیوتیکها

 

 

جدول 4- درجه گره­بندی جدایه­های مختلف

ردیف

جدایه

گره­بندی

جدایه

گره­بندی

جدایه

گره­بندی

  1.  

F1

5/2

F22

5/2

F40

2

  1.  

F3

5/2

F23

5/2

F41

1

  1.  

F4

2

F26

1

F42

1

  1.  

F7

1

F27

1

F43

4

  1.  

F9

5/2

F28

5/2

F44

4

  1.  

F10

5/1

F29

1

F45

4

  1.  

F14

1

F30

1

F46

5

  1.  

F15

2

F31

1

F49

4

  1.  

F16

5/2

F32

5/1

F50

3

10.   

F17

1

F34

1

F51

3

11.   

F18

1

F35

5/1

F52

4

12.   

F19

1

F36

5/1

F53

4

13.   

F20

5/2

F37

1

F54

3

14.   

F21

1

F39

2

F55

3

 

همان طوری که جدول چهار نشان می­دهد جدایه­های مختلف دارای درجه­بندی گره متفاوتی از یک تا 5 بودند (سویه­های کمتر از یک ارائه نشده است). بر اساس معیار درجه­بندی گره ارائه شده در جدول یک، جدایه­های دارای درجه بیشتر از دو  به عنوان جدایه­های انتخابی از نظر گره­بندی برای ادامه پژوهشها در نظر گرفته شدند. بر اساس نتایج این مرحله 19 جدایه که دارای درجه­بندی گره بیشتر از دو بودند برای بررسی کارآیی تثبیت نیتروژن (S.E.) انتخاب شدند.

در جدول پنچ نتایج مربوط به آزمون کارآیی تثبیت نیتروژن (S.E.) ارائه شده است.

 

 

جدول 5- کارآیی تثبیت نیتروژن (S.E.) سویه­های انتخابی

سویه

مقدار S.E.

کارایی

سویه

مقدار S.E.

کارایی

F1

33

ضعیف

F23

70

متوسط

F3

13

ضعیف

F28

5

ضعیف

F51

56

متوسط

F16

58

متوسط

F52

15

ضعیف

F39

75

خوب

F53

31

ضعیف

F43

165

خیلی­خوب

F54

11

ضعیف

F44

53

متوسط

F55

5

ضعیف

F45

20

ضعیف

F20

33

ضعیف

F46

151

خیلی­خوب

F50

87

خوب

F49

93

خوب

F22

5

ضعیف

Nitrogen

-

-

 

 

بر اساس نتایج جدول پنج، دو جدایه F43 و F46 به عنوان سویه­های خیلی خوب و سه جدایه F50، F49 و F39 به عنوان جدایه خوب از نظر کارآیی همزیستی تثبیت نیتروژن انتخاب شدند. این سویه­ها برای پژوهشهای تکمیلی، مورد استفاده قرار خواهند گرفت.

گزارش شده است که از 49 جدایه ریزوبیوم جداسازی شده همزیست با باقلا در اتیوپی مرکزی، شش درصد جدایه­ها دارای کارآیی خیلی مؤثر(100<(S.E. و 88 درصد نیز مؤثر بودند (5).

در بررسی دیگری در اتیوپی از 38 جدایه ریزوبیوم جداسازی شده از گره ریزوبیومی باقلا در کشت درون شن، 74 درصد دارای کارآیی همزیستی مؤثر (خوب) و 5 جدایه خیلی مؤثر (خیلی خوب) بودند )16).

همان طوری که نتایج نشان داد S.E. برخی سویه­ها خوب و خیلی خوب بود. این موضوع به علت تثبیت نیتروژن قابل توجه جدایه­ها بود. گزارشات مختلف نیز نشان می دهد بیشترین مقدار تثبیت نیتروژن در بین حبوبات مهم مربوط به باقلااست. برخی از این گزارشات در جدول شش خلاصه شده است. در این جدول مقدار نیتروژن مشتق شده از اتمسفر در بررسیهای آزمایشگاهی و مزارع کشاورزان نشان داده شده است. بیشترین درصد نیتروژن تأمین شده از طریق تثبیت همزیستی در هر دو مورد مربوط به باقلا می­باشد (15).

بنابراین به نظر می­رسد برای تأمین پروتئین جامعه بهتر است به این محصول و رابطه همزیستی آن با باکتری ریزوبیوم توجه بیشتری شود. همچنین کشت این گیاه به عنوان یک منبع غنی از نیتروژن به صورت برگرداندن آن به زمین و مصرف به صورت کود سبز برای تقویت خاکهای ایران که عمدتاً دارای کمبود مواد آلی و نیتروژن هستند مورد توجه بیشتری قرار گیرد. گزارش شده است که در غرب واشنگتن و شمال آیداهوی آمریکا که از مناطق کشت گندم هستند، باقلا به عنوان تناوب در کشت گندم به جای نخود، عدس و نخودفرنگی معرفی شده است. در این گزارش اشاره شده است که باقلا به علت توان تثبیت بالای نیتروژن به عنوان کشت دوم در تناوب با گندم به عنوان کود سبز برای تقویت زمین به خاک برگردانده شود (10).

جدول 6- درصد نیتروژن مشتق شده از تثبیت در حبوبات مختلف (15)

نوع حبوبات

در آزمایشات

در مزارع کشاورزان

لوبیا

40

36

نخود، عدس، ماش، نخود فرنگی، لوبیا چشم بلبلی

63

65

سویا و بادام زمینی

68

58

باقلا

75

68

با این حال با توجه به اینکه ممکن است در همه مناطق مورد نظر، باکتری ریزوبیوم همزیست با باقلا در خاک مرزعه مورد کشت وجود نداشته باشد و یا اینکه باکتری دارای کارآیی مناسب و همچنین توان تثبیت نیتروژن کافی را نداشته باشد لذا ضرورت تلقیح مزارع زیر کشت این محصول با سویه­های برتر که از بین تعداد زیادی باکتری بومی غربالگری شده­اند روشن است. گزارش شده است مهم ترین عامل در به حداکثر رساندن بهره­وری لگومهای دانه­ای و مرتعی تطابق گیاه میزبان و ریزوبیوم همزیست است (19).  بنابراین سویه­های ریزوبیوم به دست آمده از این پژوهش می­توانند در ادامه بررسیها به عنوان مایه تلقیح برای باقلا مورد استفاده قرار گیرند. بدیهی است موفقیت نهایی در این زمینه موجب کاهش مصرف کودهای شیمیایی نیتروژنی، تولید محصول سالم و حفظ منابع خاک و آب و در نتیجه سلامت گیاه، دام و در نهایت انسان خواهد شد. بی­شک این مسئله گامی در جهت تولید محصول ارگانیک و در نتیجه توسعه کشاورزی پایدار خواهد بود.

نتیجه­گیری

تعداد 5 جدایه برتر R. Leguminosarum bv.viciae از نظر گره­بندی و کارآیی همزیستی تثبیت نیتروژن با S.E. خوب و خیلی خوب که دارای پتانسیل مناسبی برای ادامه بررسیها در جهت ارائه مایه تلقیح ریزوبیوم برای گیاه باقلا بودند انتخاب شدند. تمام باکتریهای تأیید شده در بانک ریزجانداران مفید خاک زی مؤسسه تحقیقات خاک و آب نگهداری شدند. 

  1. زرپرور پ. آموزگار م.ع. و فلاحیان م.ر. 1393. بررسی تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک قابل کشت در تالاب پرشور اینچه برون. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی(مجله زیست شناسی ایران). جلد 27 ، شماره 1، ص56-44.
  2. کیان مهر ا.س. و مهدی زاده دهوسطی ر. 1393. مطالعه فیلوژنتیکی باکتری سودوموناس پوتیدا تولید کننده پرولین دهیدروژناز و آنالیز بیوانفورماتیکی آنزیم جداسازی شده. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی(مجله زیست شناسی ایران). جلد 27 ، شماره 2، ص 295-285.
    1. Amanuel, G., Kuhne, R.F. Tanner, D.G. and Vlek, P.L.G. 2000. Biological nitrogen fixation in fababean (Vicia faba L.) in the Ethiopian highlands as affected by P fertilization and inoculation. Biology and Fertility of Soils, 32: 353-359.
    2. Anonymous. 2013. FAO Statistics. http://data.fao.org/.
    3. Argaw A. 2012. Characterization of symbiotic effectiveness of Rhizobia nodulating faba bean (Vicia faba L.) isolated from central Ethiopia. Research Journal of Microbiology, 7(6):280-296.
    4. Beck, D.P., Materon, L.A. and Afandi, F. 1993. Practical Rhizobium- legume technology manual. ICARDA. Technical Manual No. 19.
    5. Beck, D.P., Wery, J., Saxena, M.C. and Ayadi, A. 1991. Dinitrogen fixation and nitrogen balance in cool-season food legumes. Agronomy Journal,  83: 341-343.
    6. Corbin, EJ., Brockwell, j. and Gault, R.R. 1977. Nodulation studies on chickpea (Cicer arietinum). Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry, 17, 126-134.
    7. Dixon, R.O.D., and Wheeler, C.T. 1986. Nitrogen Fixation in Plants. Chapman and Hall, New York.
    8. Elise Mwengi, J. 2011. Faba bean growth response to soil temperature and nitrogen. A M.Sc. thesis submitted in soil science, Washington state University, Department of Crop and Soil Sciences. 60 pages.
    9. ElkanG.H. (Ed.). 1987. Symbiotic Nitrogen Fixation Technology. Marcel Dekker, Inc., New York. 440 p.
    10. Elsheikh, E.A.E. and Elzidany, A.A. 1997. Effects of Rhizobium inoculation, organic and chemical fertilizers on yield and physical properties of faba bean seeds. Plant foods for Human Nutrition, 51: 137-144.
    11. Garrity, G.M., Bell, J.A., and Lilburn. T. 2005. Class III.Gammaproteobacteria class. nov. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edn, vol. 2 (The Proteobacteria), part B (The Gammaproteobacteria), p. 1. Edited by D. J. Brenner, N. R. Krieg, J. T. Staley & G. M. Garrity. New York: Springer.
    12. Hassan M.M., Fahmi, A.I., Eissa, R.A. and Nagaty, H.H. 2015. Diversity of Rhizobia nodulating faba bean (Vicia faba) growing in Egypt. Microbial & Biochemical Technology, 7(3): 152-159.
    13. Herridge D.F., Peoples, M.B., Robert, D.F. and Boddey, M. 2008. Global inputs of biological nitrogen fixation in agricultural systems. Plant and Soil, 311:1–18
    14. Legesse, S, Assefa, F. 2014. Symbiotic and phenotypic characteristics of Rhizobia nodulating fababean (Vicia faba) from Tahtay Koraro, northwestern zone of Tigray Regional state, Ethiopia.  International Journal of Technology Enhancements and Emerging Research, 2, Issue 11: 15-23.
    15. Rodelas, B. 1999. Response of faba bean (Vicia faba L.) to combined inoculation with Azotobacter and Rhizobium Legominosarum bv. viceae. Applied Soil Ecology, 12: 51-59.
    16. Rweyemamu, C.L. and Kondra, Z.P. 1989. Nitrogen fixation in faba bean (Vicia faba L.) and its economic benefit in central Alberta. Canada. Fabis news Letter (ICARDA). 25: 14-18.
    17. Slattery J. and Pearce, D. 2002. Development of elite inoculants Rhizobium strains in southeastern Australia. In: Inoculants and Nitrogen Fixation of Legumes in Vietnam.D. Herridge (Ed.), ACIAR Proceedings 109e. pp: 86-94.
    18. Somasegaran, P. and Hoben, H.J. 1994. Handbook for Rhizobia, methods in legume-Rhizobium Technology. Springier-verlag. New York.
    19. Sorwli, F.K. and Mytton, L.R. 1986. The nitrogen fixing potential of vicia faba rhizobia (R. leguminosarum) form different agricultural locations. Plant and Soil, 92: 249-254.
    20. Stajkovic, O., Elisabeth, S., Meyer, De,  Milicic, B., Willems, A. and  Delic, D.. 2009. Isolation and characterization of endophytic non-rhizobial bacteria from root nodules of alfalfa (Medicago sativa L.). Botanica Serbica, 33(1); 107-114.
    21. Steven- son, F.J. 1982. Nitrogen in agricultural soils. American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin U.S.A., 940 p.
    22. Xue K.W., Zou L. Penttinen, P. Wang, K., Heng N.N. Zhang X.P Xua, C.W., Zoua, L., Penttinenb, P., Wanga, K., Zhanga, Q. 2015. Symbiotic effectiveness and phylogeny of Rhizobia isolated from fababean (Vicia faba L.) in Sichuan hilly areas, China. Systematic and Applied Microbiology, 38(7): 515-523.
    23. Zapata,F., Danso, S.K.A., Hardarson, G. and Fried, M. 1987. Nitrogen fixation and translocation in field growth faba bean. Agronomy Journal, 79: 505-509.