نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 سبزوار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

2 هیات علمی دانشگاه حکیم سبزواری

3 هیات علمی دانشگاه اصفهان

چکیده

چغندر قند با نام علمی Beta vulgaris L. گیاهی است دولپه و دوساله از خانواده اسفناجیان که اهمیت اقتصادی آن به دلیل خاصیت منحصر به فرد آن در تولید مقادیر بالای قند می‌باشد. نماتد سیستی چغندرقند یا Heterodera schachtii مهم‏ ترین بیماری‌های چغندر قند در اراضی تحت کشت این محصول به شمار می‏آید. لذا این مطالعه به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی، با استفاده از نشانگر مولکولی SSR انجام گردید. تکثیر قطعات ژنومی با استفاده از 10 جفت آغازگر اختصاصی SSR انجام شد بطوریکه از بین باندهای حاصل، 49 باند چندشکل از 7 جفت آغازگر منتخب بدست آمد. بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی و بیشترین مقدار شاخص نشانگر به ترتیب مربوط به جفت آغازگرهایREP و 10114 بدست آمد. تجزیه خوشه‌ای با نرم‌افزار NTSYS به روش UPGMA براساس ماتریس تشابه دایس، ژنوتیپ‌ها را به چهار گروه تقسیم کرد. در این مطالعه بیشترین تشابه ژنتیکی بین دو ژنوتیپ متحمل و حساس به نماتد سیستی چغندرقند مشاهده شد. با توجه به نتایج بدست آمده می‌توان استنباط کرد که تنوع ژنتیکی ایجاد شده رابطه مستقیمی با مقاوم یا حساس بودن ژنوتیپ-ها ندارد. در واقع مشخص گردید که ژنوتیپ‏های چغندرقند از نظر ژنتیکی بر اساس طیف‏های مختلف مقاومت، حساسیت و متحمل بودن به بیماری نماتد سیستی در گروه‌های مجزا قرار نگرفتند و همبستگی قابل توجهی را نشان ندادند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Assessment of Genetic Diversity among Resistant and Susceptible Sugar Beet Genotypes to Cyst Nematod Heterodera schachtii using SSR molecular markers

نویسندگان [English]

  • Parinaz Askarnejad 1
  • Jafar Vatandoost 2
  • Mahdi Nasr Esfahani 3

1 Biotechnology Dept., Faculty of Agriculture, Islamic Azad University, Sabzevar, I.R. of Iran

2 Biology Dept., Hakim Sabzevari University, Sabzevar, I.R. of Iran

3 Isfahan University, Isfahan, I.R. of Iran

چکیده [English]

Sugar beet (Beta vulgaris L.) is a dicotyledonous and two years plant from Chenopodiceae family and its economic importance is due to unique ability to produce high amounts of sugar. Sugar beet cyst nematode is the most important disease in the area under cultivation of this product. So this study was performed to assess the genetic diversity of 20 genotypes resistant and susceptible nematode using SSR markers. Following DNA extraction, PCR amplification was performed using 10 pairs of SSR primers and 49 polymorphic bands were selected from 7 pairs. The highest of Polymorphism Information Content (PIC) and highest Marker Index (MI) related to REP primer pairs and 10114 respectively. Cluster analysis using NTSYS software with UPGMA method based on Dice's similarity matrix divided genotypes into 4 clusters. The highest genetic similarity between tolerant and susceptible sugar beet cyst nematode was found. According to the results, it can be concluded that genetic variation does not have a direct relationship with resistant or sensitive genotypes. In fact, it was found that genotypes of sugar beet based resistance spectrum, sensitivity and tolerance to nematode disease were not in separate groups and a significant correlation was not observed.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Beta vulgaris
  • Genetic diversity
  • SSR Marker
  • Cyst Nematod

ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ های چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی Heterodera schachtii با استفاده از نشانگرهای مولکولی  SSR

پریناز عسکری نژاد1، جعفر وطن دوست2 و مهدی نصر اصفهانی3* 

1 سبزوار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی 

2 سبزوار، دانشگاه حکیم سبزواری، گروه زیست شناسی

3 اصفهان، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان اصفهان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، بخش تحقیقات گیاه پزشکی 

تاریخ دریافت: 5/1/95                  تاریخ پذیرش: 7/3/95

چکیده

چغندر قند با نام علمی Beta vulgaris L. گیاهی است دولپه و دوساله از خانواده اسفناجیان  که اهمیت اقتصادی آن به دلیل خاصیت منحصر به فرد آن در تولید مقادیر بالای قند می­باشد. نماتد سیستی چغندرقند مهم‏ ترین بیماریهای چغندر قند در اراضی تحت کشت این محصول به شمار می‏آید. این مطالعه به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی، با استفاده از نشانگر مولکولی SSR انجام گردید. تکثیر قطعات ژنومی با استفاده از 10 جفت آغازگر اختصاصی SSR انجام شد به طوری که از بین باندهای حاصل، 49 باند چندشکل از 7 جفت آغازگر منتخب به دست آمد. بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی و بیشترین مقدار شاخص نشانگر به ترتیب مربوط به جفت آغازگرهایREP  و 10114 بدست آمد. در این مطالعه بیشترین تشابه ژنتیکی بین دو ژنوتیپ متحمل و حساس به نماتد سیستی چغندرقند مشاهده شد. با توجه به نتایج به دست آمده می­توان استنباط کرد که تنوع ژنتیکی ایجاد شده رابطه مستقیمی با مقاوم یا حساس بودن ژنوتیپها ندارد. در واقع مشخص گردید که ژنوتیپهای چغندرقند از نظر ژنتیکی بر اساس طیف‏های مختلف مقاومت، حساسیت و متحمل بودن به بیماری نماتد سیستی در گروههای مجزا قرار نگرفتند و همبستگی قابل توجهی را نشان ندادند.

واژه های کلیدی: چغندرقند، تنوع ژنتیکی، نشانگر SSR، نماتد سیستی

* نویسنده مسئول: تلفن: 03137885478 ، پست الکترونیکی: mne2011@gmail.com

مقدمه 

 

نماتد مولد سیست چغندرقند با نام علمیHeterodera schachtii ، مهم­ترین عامل ایجاد بیماری در چغندرقند و یکی‏ از زیانبارترین عوامل بیماری­زایی در اراضی تحت کشت این محصول به شمار می­رود. از نشانه­های حمله این بیماری، ضعف، زردی، کاهش عملکرد و کاهش کیفیت محصول در چغندر قند است (4).  گیاهان آلوده، دارای ریشه اصلی کوتاه بوده و ریشه­های فرعی متعددی همراه با سیست­های سفید رنگ بر روی ریشه­های فرعی قابل رؤیت می­باشند (17). نماتد چغندرقند در سال 1850 توسط هرمان شاخت در آلمان به عنوان آفت چغندر قند مشاهده و در سال 1871 توسط آدولف اشمیت نامگذاری گردید. نماتد چغندرقند اولین بار در ایران در سال 1348 از مزارع چغندر قند تربت حیدریه استان خراسان جمع­آوری شد و پس از آن در مزارع چغندر قند مشهد، بیرجند، مرودشت، اراک و میاندوآب گزارش شد (2). شناسایی مولکولی نماتدهای انگل گیاهی، به خصوص نماتدهای سیستی می­تواند بر پایه روش­های مبتنی بر PCR بسیار سریع­تر و راحت­تر از روش­های دشوار و وقت­گیر مورفولوژیکی باشد (8، 13). غالباً برای مبارزه با نماتد سیستی، روش­هایی مانند تناوب 3 تا 7 ساله با گیاهان غیر میزبان، ضدعفونی خاک با سموم شیمیایی ضد نماتد، استفاده از گیاهان تله و استفاده از ارقام مقاوم چغندرقند توصیه شده است (، 1817). استفاده از ‏ارقام ‏مقاوم در مبارزه با آفات و بیماری­های گیاهی و بالاخص نماتد سیستی چغندر قند از روش­هایی است که کمترین هزینه را برای کشاورز داشته و قابل اجرا در سطوح وسیع می­باشد. این روش همچنین فاقد اثرات سوء زیست محیطی با توجه به استانداردهای تولید محصولات می­باشد. نکته قابل توجه در این بحث عدم مشاهده مقاومت به نماتد در چغندرقندهای زراعی ‏است، این در حالی است که در گونه‏های وحشی  Beta procumbens، B. webbiana و B. pattelaris مقاومت به صورت کامل و غالب و در گونه B.maritima به صورت مغلوب به ارث می­رسد (10).

لذا با توجه به اینکه روش­های ارزیابی کلاسیک گزینش مقاومت به بیماری از نوع فنوتیپی و وابسته به شرایط محیطی و یکنواختی عامل آلوده کننده بوده و در فصل خاصی از سال انجام گرفته و نیز بعضی از گیاهان از عامل آلوده کننده به نحوی می­گریزند و به ظاهر مقاوم تلقی می شوند، از این رو با استفاده از روش‏های مولکولی به عنوان روش تکمیلی یا جایگزین می­توان گیاهان در بردارنده ژن مقاومت را در سطح ژنوتیپی شناسایی نمود. نشانگرهای DNA می­توانند ابزارهای مفیدی برای انتخاب ژنوتیپ های مقاوم باشند و باعث صرفه­جویی در زمان ارزیابی و افزایش دقت انتخاب گردند (9،11).

در تحقیقات گذشته، ارزیابی مقاومت نژادگان چغندرقند نسبت به نماتد سیستی و همچنین ارزیابی روابط ژنتیکی و تنوع ژنتیکی در داخل و بین ژنوتیپ های چغندرقند از نشانگرهایی همچون ایزوزیم­ها، RAPD و ISSR (16)، RFLP (5) و SSR (5، 7، 15) استفاده شده است که برای شناسایی تعداد محدودی از جمعیت‏های گونه H. Schachtii ، RFLP نواحی ITS ژن rDNA مورد استفاده قرار گرفته است.

از آنجایی که نشانگر ریز ماهواره یا توالی­های ساده تکراری (SSR)، به علت توزیع فراوان خود در ژنوم و توان بالا در تجزیه و تحلیل، نشانگر انتخابی مناسب در ژنوم بسیاری از حیوانات و گیاهان می­باشند، در این پژوهش برای بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‏های مختلف چغندر قند مقاوم و حساس به نماتد سیستی و بررسی قرابت ژنتیکی ژنوتیپ­های مختلف چغندرقند با طیف­های مختلف مقاومت در هر گروه و نیز چگونگی همبستگی ژنوتیپ­ها در طیف‏های مختلف از نشانگر SSR استفاده شد. 

مواد و روشها

در این مطالعه 20 نژادگان چغندر قند که از موسسه‏ی تحقیقات چغندرقند کرج تهیه شده بود، مورد بررسی قرار گرفت. این بذور از نظر جوانه زنی شامل انواع مونوژرم (تک جوانه ای) و مولتی ژرم (چند جوانه ای) بوده و از نظر نحوه تولید به ارقام تجاری، هیبرید، تلاقی های برادر خواهر ناتنی و گرده افشان تقسیم می شوند. مشخصات 20 ژنوتیپ مورد آزمون در جدول 1 آورده شده است.

استخراج DNA : بعد از کشت بذور در گلخانه و گذشت حدود یک ماه، از برگ­های تازه و جوان جهت استخراج DNA استفاده شد. استخراج DNA بر اساس روش تغییر یافته روش استخراج CTAB انجام  شد (6) و کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با دو روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز تعیین گردید.

تکثیر قطعات DNA : جهت انجام PCR و بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‏های مختلف چغندرقند مقاوم، متحمل و حساس به نماتد سیستی از 10 جفت آغازگر SSR استفاده شد که مشخصات آن­ها در جدول 2 قابل مشاهده است. واکنش زنجیره ای پلیمراز در حجم 25 میکرولیتر شامل 50 نانوگرم DNA، 2 میکرولیتر آغازگر، 1 میکرولیترdNTP، 2 میکرولیتر کلرید منیزیم، 3/0 میکرولیتر تک دی ان آ پلیمراز، 5/2 میکرولیتر بافر PCR و 2/16 میکرولیتر آب دیونیزه بود. تکثیر در دستگاه ترموسایکلر شامل مراحل واسرشتگی مقدماتی به مدت 5 دقیقه در 95 درجه سانتی­گراد، واسرشتگی به مدت 1 دقیقه در 95 درجه سانتی­گراد، اتصال به مدت 1 دقیقه که دمای اتصال با توجه به نوع پرایمر از 40 تا 60 درجه سانتی گراد متفاوت بود، گسترش به مدت 1 دقیقه در 72 درجه و گسترش نهایی به مدت 8 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد بود. مراحل واسرشتگی تا گسترش 35 مرتبه تکرار و در نهایت DNAی ژنوتیپ ها مورد بررسی با استفاده از آغازگرهای SSR تکثیر گردیدند. الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز 3 درصد در بافر ×5/0 TAE و با ولتاژ ثابت 90 به مدت 120 دقیقه انجام شد. مشاهده و عکسبرداری ژل متأثر شده از رنگ GelRed در زیر نور UV به کمک دستگاه ژل­ نگار صورت گرفت.

جمع­آوری داده­ها: تصویر ژل های الکتروفورز حاصل از آغازگرهایی که باندهای چندشکل با وضوح مناسب تولید کرده بودند، به صورت دستی تجزیه شد. سپس به حضور یا عدم حضور یک باند در هر نمونه، با استفاده از اعداد صفر و یک امتیازدهی و در نهایت ماتریس داده­ها در نرم­افزار  NTSYS-pcمورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

 

جدول 1- مشخصات ژنوتیپ‏های مورد آزمون از نظر نحوه اصلاح، جوانه ژنی بذر و مقاومت به نماتد

ردیف 

شماره ژنوتیپ 

نحوه اصلاح 

جوانه زنی 

مقاومت به نماتد 

1 

3 

تلاقی برادر خواهر ناتنی

مولتی ژرم

مقاوم

2 

7

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

متحمل

3

11

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

متحمل

4

15

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

متحمل

5

19

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

حساس

6

21

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

متحمل

7

25

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

متحمل

8

29

هیبرید

مونوژرم

مقاوم

9

33

گرده افشان

مولتی ژرم

 حساس

10

37

هیبرید

مونوژرم

متحمل

11

43

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

حساس

12

47

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

حساس

13

51

تلاقی برادر و خواهر ناتنی

مولتی ژرم

حساس

14

55

واریته تجاری

مونوژرم

حساس

15

59

واریته تجاری

مونوژرم

متحمل

16

62

واریته تجاری

مونوژرم

حساس

17

63

واریته تجاری

مونوژرم

حساس

18

66

گرده افشان

مونوژرم

متحمل

19

70

گده افشان

مولتی ژرم

حساس

20

35

گرده افشان

مولتی ژرم

حساس

جدول 2- فهرست و مشخصات آغازگر های SSR

 

دمای اتصال

توالی آغازگر

نام آغازگر

ردیف

 

58.0

59.0

5`-TTG GAG AGA GAA AAG AGA GAA G-3`

5`-ATC CCT TGA CAG TAG AAC TCC-3`

Unigene57236

Unigene57236

1

 

59.0

58.0

5`-CTT TAG TGT AGC GTT AGA GCG-3`

5`-TAA CAG CAG GAC TGG AGA AG-3`

Unigene77067

Unigene77067

2

 

53.0

58.0

5`-AGT TGG GGA AGA GAA A-3`

5`-CAC CAT ACT GAA CCT AAG A-3`

Unigene25611-F

Unigene25611-R

3

 

58.0

58.0

5`-GTA AAC TCG GGT AAT AAC AAG C-3`

5`-TAT AAG TCA TGC AGT CGA GCT A-3`

Unigene11506-F

Unigene11506-R

4

 

58.0

60.0

5`-AAC CTT CCC TCT GAT TTC T-3`

5`-GGA GAT ACA ACT TAC AAG AGC C-3`

Unigene17923-F

Unigene17923-R

5

 

58.0

57.0

5`-AAC ATC TCA CTC ATC CTT CTT C-3`

5`-ATG ATA GCA AAC GAC TAG CAG-3`

Unigene24552-F

Unigene24552-R

6

 

58.0

58.0

5`-AAA GGA AAC TAC CCC TAC ACT T-3`

5`-AAG AGA GAA AGA AGA CGA TGA G-3`

Unigene22373-F

Unigene22373-R

7

 

57.0

54.0

5`-ATT AGA CCT CAA TCT TCC AGC-3`

5`-AAT AAT GGC AAT CTA CCA GC-3`

Unigene17623-F

Unigene17623-R

8

 

58.0

60.0

5`-GCA AGT GGA GAA ATA TGT GAG-3`

5`-TAT GTG GTA GTG GTA CTG CTT-3`

Unigene10114-F

Unigene10114-R

9

 

41.0

40.0

5`-CGT AAG AGA CTA TGA-3`

5`-TGA ACA CCT TTC AAA-3`

REP-F

REP-R

10

 


در این پژوهش برای محاسبه ضریب تشابه از سه روش محاسبه دایس با فرمول  ، جاکارد با فرمول  و تشابه مقابل ساده با فرمول  استفاده شد. که در این روابط a، تک شکلی حاصل از حضور باند، b و c جایگاه­های ژنی چند شکل و d جایگاه ژنی تک شکل حاصل از باند صفر می باشد. همچنین با استفاده از تجزیه خوشه­ای و دندروگرام بدست آمده، ماتریس ضرایب کوفنتیک برآورد شد. سپس با نرم­افزار NTSYS همبستگی بین این ماتریس و ماتریس تشابه اولیه محاسبه گردید. در این مطالعه نسبت چندشکلی نشانگرها با استفاده از فرمول  و پارامتر محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) با استفاده از فرمول  محاسبه شد که در این روابط Pi و Pj به ترتیب فراوانی آلل های i و j در یک جایگاه ریز ماهواره می باشد (14). شاخص نشانگر (MI) از رابطه  به دست آمد (3، 12). تجزیه مولفه­های اصلی با استفاده از نرم­افزار NTSYS به منظور بررسی نحوه پراکنش نشانگرها در سطح ژن گیاه انجام شد.

نتایج

مقاومت نژادگان چغندرقند مورد مطالعه نسبت به نماتد سیستی با استفاده از شاخص تخم و لارو، در شرایط گلخانه­ای ارزیابی شد و ژنوتیپ ها در سه گروه مقاوم، متحمل و حساس طبقه بندی شدند. از 20 ژنوتیپ مورد مطالعه، 2 ژنوتیپ مقاوم، 8 ژنوتیپ متحمل و 10 ژنوتیپ حساس ارزیابی شدند (جدول 1).

واکنش PCR با استفاده از 10 جفت آغازگر SSR بر روی 20 نژادگان مورد مطالعه، انجام گرفت که از میان آغازگرها، 3 جفت آغازگر 17623-R-F، 24552-R-F و 17923-R-F موفق به تولید هیچ باندی نشدند. این در حالی است که 7 جفت آغازگر SSR در مجموع 49 قطعه چند­شکل تولید نمودند که تقریباً 5/84 درصد از کل 58 آلل تولید شده را شامل گردید. تمامی باندها با وضوح مناسب در محدوده 150 تا 3000 جفت­باز امتیازدهی شدند (شکل1).

 

 

 

شکل 1- الگوی باندی حاصل از الکتروفورز DNA­های تکثیر شده 20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی با جفت آغازگر REP در ژل آگارز 3 درصد، M: مارکر وزن مولکولی 1Kb ، C: کنترل منفی. اعداد اسامی ژنوتیپ­ها می­باشد.

 


شاخص های تغییرات آللی: تعداد آلل­های چندشکل در هر جایگاه ژنی از 2 تا 9 باند متغیر بود. حداقل این مقدار مربوط به آغازگر22373 (2 آلل) و حداکثر آن مربوط به آغازگرهای 77067، 10114، 25611 و REP (9 آلل) می باشد. بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) مربوط به جفت آغازگرهای REP (94/0) و 10114 (85/0) و کمترین PIC مربوط به جفت آغازگر 22373 (58/0) بود. در این پژوهش بیشترین مقدار شاخص نشانگر مربوط به جفت آغازگرهای REP (46/8) و 10114 (65/7) و کمترین مقدار آن مربوط به جفت آغازگر 22373 (16/1) بود (جدول 3).

 

جدول3- تعداد باندها و میزان اطلاعات چندشکلی جفت آغازگرهای SSR

ردیف

نام جفت

آغازگر

تعداد آلل­ها

باندهای

چندشکل

درصد

چند شکلی

محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC)

شاخص نشانگر(MI)

1

77067

11

9

8/81%

82/0

38/7

2

57236

7

7

100%

74/0

18/5

3

REP

9

9

100%

94/0

46/8

4

11506

8

5

5/62%

66/0

3/3

5

22373

4

2

50%

58/0

16/1

6

10114

9

9

100%

85/0

65/7

7

25611

10

9

90%

73/0

57/6

 

مجموع

58

49

-

32/5

7/39

 

میانگین

28/8

7

5/84%

76/0

67/5

جدول 4- مقایسه ضرایب همبستگی کوفنتیک در روش های مختلف رسم کلاستر

الگوریتم

روش

دایس

جاکارد

ساده

UPGMA

5/88

9/87

6/80

UPGMC

2/22

30

27

Complete

7/77

3/81

5/77

 

جدول 5- مقادیر ویژه، حاصل از تجزیه مولفه­های اصلی براساس نشانگرهای SSR

واریانس تجمعی

درصد واریانس

مقادیر ویژه

مولفه اصلی

90/31

90/31

95/1

مولفه اول

95/46

05/15

32/1

مولفه دوم

03/57

08/10

01/1

مولفه سوم

 


تجزیه خوشه ای: به منظور گروه بندی ژنوتیپ ها براساس فواصل ژنتیکی، تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA و با استفاده از ماتریس تشابه دایس انجام گرفت. در واقع با توجه به اینکه در مقایسه ضرایب همبستگی، مقدار ضریب همبستگی مربوط به روش دایس از دیگر روش ها بالاتر بدست آمد و همچنین انطباق بالاتری بین تفکیک ژنوتیپ ها و اطلاعات موجود وجود داشت، تجزیه و تحلیل داده­ها برای گروه­بندی توده­ها با استفاده از ضریب تشابه دایس و الگوریتم UPGMA انجام گرفت (جدول 4). بطوریکه 20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی در ضریب تشابه 70/0 به چهار زیرگروه تقسیم­بندی شدند. ضریب همبستگی کوفنتیک براساس ضریب تشابه دایس، 885/0 و با توجه به آزمون مانتل در سطح 1 درصد معنی دار به دست آمد (شکل2).

در این مطالعه جهت تفکیک و گروه­بندی نمودار خوشه­ای، مکان خط برش با استفاده از روش جذرگیری و میانگین ماتریس تشابه دایس بر روی محور فاصله مشخص گردید. بر این اساس خط برش نمودار خوشه­ای را در فاصله 71/0، به 4 زیر گروه مجزا تقسیم کرد. بطوریکه گروه سوم دندروگرام (III) بیشترین تعداد ژنوتیپ چغندرقند را در خود جای داد که خود شامل تمام ژنوتیپ­های مقاوم (3 و 29)، ژنوتیپ­های حساس (43، 47، 19 و 51) و ژنوتیپ­های متحمل (7، 11، 15، 21 و 37) به نماتد سیستی چغندرقند بود. ژنوتیپ متحل (25) و دو ژنوتیپ حساس (33 و 55) با 90/0 درصد تشابه در گروه چهارم (IV) قرار گرفتند. در گروه دوم  (II)ژنوتیپ های حساس (35، 70) و ژنوتیپ متحمل (66) قرار داشتند که هر سه ژنوتیپ دارای بذر مولتی ژرم بودند و طی گرده­افشانی حاصل شده بودند. در گروه اول دندروگرام (I) ژنوتیپ های حساس (62 و 63) و یک ژنوتیپ متحمل (59) به نماتد سیستی چغندرقند قرار گرفتند که هر سه ژنوتیپ بذر مونوژرم و واریته تجاری بودند.

به منظور تعیین نحوه پراکنش نشانگرهای SSR در چغندرقند، آزمون تجزیه به مؤلفه­های اصلی انجام گرفت. بطوریکه سه مؤلفه اول 03/57 درصد از کل تغییرات را بین 20 ژنوتیپ چغندرقند توجیه نمودند که سهم مؤلفه اول به تنهایی 9/31 درصد، مؤلفه دوم 05/15 درصد و مؤلفه سوم 08/10 درصد از کل تغییرات را توجیه می­کند. نتایج تجزیه مؤلفه­های اصلی شامل مقادیر ویژه و نسبت واریانس مورد انتظار توسط سه مؤلفه اول برای هر جفت آغازگر در جدول 5 آمده است.

در این مطالعه نحوه گروه­بندی تجزیه مؤلفه­های اصلی (PCoA) با گروه­بندی حاصل از تجزیه خوشه­ای کاملاً مطابقت داشت. بطوریکه تعداد زیرگروه های به دست آمده در گروه­بندی تجزیه مؤلفه­های اصلی با زیرگروه های حاصل از تجزیه خوشه ای مشابهت کامل دارد. نتایج بدست آمده نشان داد که بیشترین فاصله ژنتیکی بین دو ژنوتیپ 25 (متحمل به نماتد) و 63 ( حساس به نماتد) با 33 درصد تشابه مشاهده شد. در گروه­بندی خوشه­ای و نمودار حاصل از تجزیه مولفه­های اصلی نیز هر دو ژنوتیپ در گروه­های جداگانه­ای قرار گرفتند. این در حالی است که ژنوتیپ 15 (متحمل) با 94 درصد تشابه فاصله ژنتیکی کمی با ژنوتپ 19 (حساس) کمترین فاصله ژنتیکی را داشتند. (شکل 3).

 

 

شکل 2- دندروگرام حاصل از پلی­مورفیسم 20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی با جفت آغازگرهای SSR

 

 

شکل 3- نمودار سه بعدی (A) و دو­بعدی (B) داده­های حاصل از تجزیه مولفه­های اصلی براساس ماتریس تشابه دایس برای 20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی


بحث

نتایج بدست آمده از این تحقیق نشان داد که نشانگرهای SSR به خوبی در سطح ژنوم پراکنده شده اند و کارایی مناسبی در ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­های چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی دارند. تولید تعداد باند زیاد و میزان چندشکلی بالا در ژنوتیپ­های مورد مطالعه نشان دهنده کارایی بالای نشانگرهای SSR در ارزیابی تنوع ژنتیکی در ژنوتیپ­های چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی بود.

در این مطالعه هفت نشانگر SSR توانستند 58 آلل با دامنه 4 تا 11 آلل در هر مکان ژنی را شناسایی کنند که متوسط تعداد باند چند­شکل به ازای هر جفت آغازگر 7 باند بود. در این تحقیق محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) برای هر جفت آغازگر SSR نیز محاسبه شد. بیشترین PIC مربوط به جفت آغازگرهای REP و 10114-R-F به ترتیب 94/0 و 85/0 و کمترین PIC مربوط به جفت آغازگر 22373-R-F با مقدار 58/0 بود. میانگین PIC برای کل جفت آغازگرها بالا (76/0) بود. عباسی و همکاران (1) در مطالعه خود بر روی تنوع ژنتیکی 168 ژنوتیپ چغندرقند با استفاده از 18 نشانگر SSR گزارش کردند که دامنه تعداد آلل به ازای هر جفت آغازگر 2-10 و متوسط آن 7/5 آلل بود. همچنین دامنه PIC از 36/0 تا 83/0 متغیر و میانگین PIC 64/0 بود. در تحقیق اسمولدر و همکاران (15) بر روی بررسی خصوصیات واریته­های چغندرقند با 25 نشانگر ریزماهواره­ تعداد آلل­ها از 3 تا 21 آلل متغیر بود و واریته­ها تا حدود 7 آلل مختلف را در یک مکان ژن برای هر نشانگر نشان دادند.

هر چه عدد متوسط تعداد قطعه چندشکل و محتوای اطلاعات چندشکلی به ازای هر جفت آغازگر بیشتر باشد کارایی آن نشانگر در گیاه مورد مطالعه بالاتر است و نمایانگر قدرت تمایز بیشتر نشانگر می­باشد. بیشتر بودن تعداد آلل های مشاهده شده در هر مکان ژنی در این مطالعه می تواند بیانگر تنوع بالاتر توده های استفاده شده باشد. همچنین PIC بالاتر در این مطالعه، بیانگر قدرت تمایز بیشتر نشانگرهای SSR استفاده شده در این مطالعه است. با توجه به اینکه جفت آغازگرهای REP و 10114 دارای بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی و شاخص نشانگر بودند، علاوه بر آن چندشکلی بسیار بالایی (100 درصد) نشان دادند، بنابراین می­توان آن­ها را به عنوان جفت آغازگرهای مفید و کارآمد برای بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­های چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی معرفی و انتخاب کرد.

 از طرفی بر اساس آزمون تجزیه مولفه­های دو مولفه اول 95/46 درصد از کل تغییرات را بین 20 ژنوتیپ چغندرقند توجیه نمودند. توجیه بخش کمتری از تغییرات توسط چند مولفه اول، دلیل بر توزیع مناسب جفت آغازگرهای بکار رفته بر روی ژنوم می­باشد و بیان می کند که آغازگرها در یک قسمت ژنوم متمرکز نشده­اند.

همچنین نتایج این مطالعه بیانگر تنوع ژنتیکی قابل ملاحظه بین ژنوتیپ ها بود ولی با توجه به نتایج بدست آمده از دندروگرام ژنوتیپ­ها می­توان استنباط کرد که تنوع ژنتیکی ایجاد شده رابطه مستقیمی با مقاوم یا حساس بودن ژنوتیپ­ها ندارد. در واقع با توجه به بررسی‏های انجام شده در خصوص وجود تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‎‏های مختلف چغندرقند با نشانگر SSR مشخص گردید که ژنوتیپ‏های چغندرقند از نظر ژنتیکی بر اساس طیف‏های مختلف مقاومت، حساسیت و متحمل بودن به بیماری نماتد سیستی در گروه­های مجزا قرار نگرفتند و همبستگی قابل توجهی را نشان ندادند. مقاوم یا حساس بودن گیاه چغندرقند می تواند تحت تأثیر یک و یا چند ژن خاص ­باشد که لزوماً وجود یا عدم وجود این ژن­ها باعث تشابه ژنتیکی و یا عدم تشابه ژنوتیپ­ها با یکدیگر نمی­شود. 

1- Abbasi, Z., Arzani, A., and Majidi, M. M. 2014. Study of adaptability and stability of sugar beet monogerm cultivars in different locations of IRAN. Sugar beet, 24(2), 1-11.

2- Akhyani, A., Damadzadeh, M., and Ahmadi, A.R. 2000. Distribution and infestation rate of Heteadera schachtii in sugarbeet fields of Esfahan province. Sugar beet, 68(1), 137-142.

3- Anderson, JA, Churchill, GA, Autrique, JE, Tanksley, SD, and Sorrells, ME. 1993. Optimizing parental selection for genetic linkage maps. Genome, 36(1), 181-186.

4- Behdad, E. 2006. Phytopathology And Important Plant Disease. Iran. Tehran: Atr-e-Etrat Publication.

5- Desplanque, B, Boudry, P, Broomberg, K, Saumitou-Laprade, P, Cuguen, J, and Van Dijk, H. 1999. Genetic diversity and gene flow between wild, cultivated and weedy forms of Beta vulgaris assessed by RFLP and microsatellite markers. Theoretical and Applied Genetics, 98(8), 1194-1201.

6- Ganesh, CT, Gowda, RV, Narayanaswamy, P, Gowda, PHR, Keshavachandran, R, Nazeem, P, . . . Peter, KV. (2007). Development of protocols for DNA extraction and amplification in onion (Allium cepa L.) for RAPD analysis. Paper presented at the Recent trends in horticultural biotechnology, Vol. II. ICAR national symposium on biotechnological interventions for improvement of horticultural crops: issues and strategies, Vellanikkara, Kerala, India, 10-12 January, 2005.

7- Laurent, V, Devaux, P, Thiel, T, Viard, F, Mielordt, S, Touzet, P, and Quillet, MC. 2007. Comparative effectiveness of sugar beet microsatellite markers isolated from genomic libraries and GenBank ESTs to map the sugar beet genome. Theoretical and applied genetics, 115(6), 793-805.

8- Maafi, Zahra Tanha, Subbotin, Sergei A, and Moens, Maurice. 2003. Molecular identification of cyst-forming nematodes (Heteroderidae) from Iran and a phylogeny based on ITS-rDNA sequences. Nematology, 5(1), 99-111.

9- Mahuku, George S. 2004. A simple extraction method suitable for PCR-based analysis of plant, fungal, and bacterial DNA. Plant Molecular Biology Reporter, 22(1), 71-81.

10- Müller, Joachim. 1998. New pathotypes of the beet cyst nematode (Heterodera schachtii) differentiated on alien genes for resistance in beet (Beta vulgaris). Fundamental and applied nematology, 21(5), 519-526.

11- Norouzi, P. 2003. The Simple and effective method for Genomic DNA extraction from plant an Fungus for PCR-based analyses. Sugar beet, 19(2), 175-176.

12- Powell, Wayne, Morgante, Michele, Andre, Chaz, Hanafey, Michael, Vogel, Julie, Tingey, Scott, and Rafalski, Antoni. 1996. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular breeding, 2(3), 225-238.

13- Powers, Thomas O, Todd, TC, Burnell, AM, Murray, PCB, Fleming, CC, Szalanski, Allen L, . . . Harris, TS. 1997. The rDNA internal transcribed spacer region as a taxonomic marker for nematodes. Journal of Nematology, 29(4), 441.

14- Prasad, M, Varshney, RK, Roy, JK, Balyan, HS, and Gupta, PK. 2000. The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity in wheat. Theoretical and Applied Genetics, 100(3-4), 584-592.

15- Smulders, MJM, Bredemeijer, G, Rus-Kortekaas, W, Arens, P, and Vosman, B. 1997. Use of short microsatellites from database sequences to generate polymorphisms among Lycopersicon esculentum cultivars and accessions of other Lycopersicon species. Theoretical and Applied Genetics, 94(2), 264-272.

16- Srivastava, Sangeeta, Gupta, Prashant S, Saxena, Vimal Kumar, and Srivastava, Hari Mohan. 2007. Genetic diversity analysis in sugarbeet (Beta vulgaris L.) using isozymes, RAPD and ISSR markers. Cytologia, 72(3), 265-274.

17- Whitney, ED, and Duffus, James E. 1986. Compendium of beet diseases and insects (Vol. 76). St. Paul Minnesota: APS press.

18- Zhang, C‐L, Xu, D‐C, Jiang, X‐C, Zhou, Y, Cui, J, Zhang, C‐X, . . . Scott, Nigel W. 2008. Genetic approaches to sustainable pest management in sugar beet (Beta vulgaris). Annals of Applied Biology, 152(2), 143-156.