نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 سبزوار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
2 هیات علمی دانشگاه حکیم سبزواری
3 هیات علمی دانشگاه اصفهان
چکیده
چغندر قند با نام علمی Beta vulgaris L. گیاهی است دولپه و دوساله از خانواده اسفناجیان که اهمیت اقتصادی آن به دلیل خاصیت منحصر به فرد آن در تولید مقادیر بالای قند میباشد. نماتد سیستی چغندرقند یا Heterodera schachtii مهم ترین بیماریهای چغندر قند در اراضی تحت کشت این محصول به شمار میآید. لذا این مطالعه به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی، با استفاده از نشانگر مولکولی SSR انجام گردید. تکثیر قطعات ژنومی با استفاده از 10 جفت آغازگر اختصاصی SSR انجام شد بطوریکه از بین باندهای حاصل، 49 باند چندشکل از 7 جفت آغازگر منتخب بدست آمد. بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی و بیشترین مقدار شاخص نشانگر به ترتیب مربوط به جفت آغازگرهایREP و 10114 بدست آمد. تجزیه خوشهای با نرمافزار NTSYS به روش UPGMA براساس ماتریس تشابه دایس، ژنوتیپها را به چهار گروه تقسیم کرد. در این مطالعه بیشترین تشابه ژنتیکی بین دو ژنوتیپ متحمل و حساس به نماتد سیستی چغندرقند مشاهده شد. با توجه به نتایج بدست آمده میتوان استنباط کرد که تنوع ژنتیکی ایجاد شده رابطه مستقیمی با مقاوم یا حساس بودن ژنوتیپ-ها ندارد. در واقع مشخص گردید که ژنوتیپهای چغندرقند از نظر ژنتیکی بر اساس طیفهای مختلف مقاومت، حساسیت و متحمل بودن به بیماری نماتد سیستی در گروههای مجزا قرار نگرفتند و همبستگی قابل توجهی را نشان ندادند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Assessment of Genetic Diversity among Resistant and Susceptible Sugar Beet Genotypes to Cyst Nematod Heterodera schachtii using SSR molecular markers
نویسندگان [English]
1 Biotechnology Dept., Faculty of Agriculture, Islamic Azad University, Sabzevar, I.R. of Iran
2 Biology Dept., Hakim Sabzevari University, Sabzevar, I.R. of Iran
3 Isfahan University, Isfahan, I.R. of Iran
چکیده [English]
Sugar beet (Beta vulgaris L.) is a dicotyledonous and two years plant from Chenopodiceae family and its economic importance is due to unique ability to produce high amounts of sugar. Sugar beet cyst nematode is the most important disease in the area under cultivation of this product. So this study was performed to assess the genetic diversity of 20 genotypes resistant and susceptible nematode using SSR markers. Following DNA extraction, PCR amplification was performed using 10 pairs of SSR primers and 49 polymorphic bands were selected from 7 pairs. The highest of Polymorphism Information Content (PIC) and highest Marker Index (MI) related to REP primer pairs and 10114 respectively. Cluster analysis using NTSYS software with UPGMA method based on Dice's similarity matrix divided genotypes into 4 clusters. The highest genetic similarity between tolerant and susceptible sugar beet cyst nematode was found. According to the results, it can be concluded that genetic variation does not have a direct relationship with resistant or sensitive genotypes. In fact, it was found that genotypes of sugar beet based resistance spectrum, sensitivity and tolerance to nematode disease were not in separate groups and a significant correlation was not observed.
کلیدواژهها [English]
ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ های چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی Heterodera schachtii با استفاده از نشانگرهای مولکولی SSR
پریناز عسکری نژاد1، جعفر وطن دوست2 و مهدی نصر اصفهانی3*
1 سبزوار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
2 سبزوار، دانشگاه حکیم سبزواری، گروه زیست شناسی
3 اصفهان، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان اصفهان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، بخش تحقیقات گیاه پزشکی
تاریخ دریافت: 5/1/95 تاریخ پذیرش: 7/3/95
چکیده
چغندر قند با نام علمی Beta vulgaris L. گیاهی است دولپه و دوساله از خانواده اسفناجیان که اهمیت اقتصادی آن به دلیل خاصیت منحصر به فرد آن در تولید مقادیر بالای قند میباشد. نماتد سیستی چغندرقند مهم ترین بیماریهای چغندر قند در اراضی تحت کشت این محصول به شمار میآید. این مطالعه به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی، با استفاده از نشانگر مولکولی SSR انجام گردید. تکثیر قطعات ژنومی با استفاده از 10 جفت آغازگر اختصاصی SSR انجام شد به طوری که از بین باندهای حاصل، 49 باند چندشکل از 7 جفت آغازگر منتخب به دست آمد. بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی و بیشترین مقدار شاخص نشانگر به ترتیب مربوط به جفت آغازگرهایREP و 10114 بدست آمد. در این مطالعه بیشترین تشابه ژنتیکی بین دو ژنوتیپ متحمل و حساس به نماتد سیستی چغندرقند مشاهده شد. با توجه به نتایج به دست آمده میتوان استنباط کرد که تنوع ژنتیکی ایجاد شده رابطه مستقیمی با مقاوم یا حساس بودن ژنوتیپها ندارد. در واقع مشخص گردید که ژنوتیپهای چغندرقند از نظر ژنتیکی بر اساس طیفهای مختلف مقاومت، حساسیت و متحمل بودن به بیماری نماتد سیستی در گروههای مجزا قرار نگرفتند و همبستگی قابل توجهی را نشان ندادند.
واژه های کلیدی: چغندرقند، تنوع ژنتیکی، نشانگر SSR، نماتد سیستی
* نویسنده مسئول: تلفن: 03137885478 ، پست الکترونیکی: mne2011@gmail.com
مقدمه
نماتد مولد سیست چغندرقند با نام علمیHeterodera schachtii ، مهمترین عامل ایجاد بیماری در چغندرقند و یکی از زیانبارترین عوامل بیماریزایی در اراضی تحت کشت این محصول به شمار میرود. از نشانههای حمله این بیماری، ضعف، زردی، کاهش عملکرد و کاهش کیفیت محصول در چغندر قند است (4). گیاهان آلوده، دارای ریشه اصلی کوتاه بوده و ریشههای فرعی متعددی همراه با سیستهای سفید رنگ بر روی ریشههای فرعی قابل رؤیت میباشند (17). نماتد چغندرقند در سال 1850 توسط هرمان شاخت در آلمان به عنوان آفت چغندر قند مشاهده و در سال 1871 توسط آدولف اشمیت نامگذاری گردید. نماتد چغندرقند اولین بار در ایران در سال 1348 از مزارع چغندر قند تربت حیدریه استان خراسان جمعآوری شد و پس از آن در مزارع چغندر قند مشهد، بیرجند، مرودشت، اراک و میاندوآب گزارش شد (2). شناسایی مولکولی نماتدهای انگل گیاهی، به خصوص نماتدهای سیستی میتواند بر پایه روشهای مبتنی بر PCR بسیار سریعتر و راحتتر از روشهای دشوار و وقتگیر مورفولوژیکی باشد (8، 13). غالباً برای مبارزه با نماتد سیستی، روشهایی مانند تناوب 3 تا 7 ساله با گیاهان غیر میزبان، ضدعفونی خاک با سموم شیمیایی ضد نماتد، استفاده از گیاهان تله و استفاده از ارقام مقاوم چغندرقند توصیه شده است (، 1817). استفاده از ارقام مقاوم در مبارزه با آفات و بیماریهای گیاهی و بالاخص نماتد سیستی چغندر قند از روشهایی است که کمترین هزینه را برای کشاورز داشته و قابل اجرا در سطوح وسیع میباشد. این روش همچنین فاقد اثرات سوء زیست محیطی با توجه به استانداردهای تولید محصولات میباشد. نکته قابل توجه در این بحث عدم مشاهده مقاومت به نماتد در چغندرقندهای زراعی است، این در حالی است که در گونههای وحشی Beta procumbens، B. webbiana و B. pattelaris مقاومت به صورت کامل و غالب و در گونه B.maritima به صورت مغلوب به ارث میرسد (10).
لذا با توجه به اینکه روشهای ارزیابی کلاسیک گزینش مقاومت به بیماری از نوع فنوتیپی و وابسته به شرایط محیطی و یکنواختی عامل آلوده کننده بوده و در فصل خاصی از سال انجام گرفته و نیز بعضی از گیاهان از عامل آلوده کننده به نحوی میگریزند و به ظاهر مقاوم تلقی می شوند، از این رو با استفاده از روشهای مولکولی به عنوان روش تکمیلی یا جایگزین میتوان گیاهان در بردارنده ژن مقاومت را در سطح ژنوتیپی شناسایی نمود. نشانگرهای DNA میتوانند ابزارهای مفیدی برای انتخاب ژنوتیپ های مقاوم باشند و باعث صرفهجویی در زمان ارزیابی و افزایش دقت انتخاب گردند (9،11).
در تحقیقات گذشته، ارزیابی مقاومت نژادگان چغندرقند نسبت به نماتد سیستی و همچنین ارزیابی روابط ژنتیکی و تنوع ژنتیکی در داخل و بین ژنوتیپ های چغندرقند از نشانگرهایی همچون ایزوزیمها، RAPD و ISSR (16)، RFLP (5) و SSR (5، 7، 15) استفاده شده است که برای شناسایی تعداد محدودی از جمعیتهای گونه H. Schachtii ، RFLP نواحی ITS ژن rDNA مورد استفاده قرار گرفته است.
از آنجایی که نشانگر ریز ماهواره یا توالیهای ساده تکراری (SSR)، به علت توزیع فراوان خود در ژنوم و توان بالا در تجزیه و تحلیل، نشانگر انتخابی مناسب در ژنوم بسیاری از حیوانات و گیاهان میباشند، در این پژوهش برای بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای مختلف چغندر قند مقاوم و حساس به نماتد سیستی و بررسی قرابت ژنتیکی ژنوتیپهای مختلف چغندرقند با طیفهای مختلف مقاومت در هر گروه و نیز چگونگی همبستگی ژنوتیپها در طیفهای مختلف از نشانگر SSR استفاده شد.
در این مطالعه 20 نژادگان چغندر قند که از موسسهی تحقیقات چغندرقند کرج تهیه شده بود، مورد بررسی قرار گرفت. این بذور از نظر جوانه زنی شامل انواع مونوژرم (تک جوانه ای) و مولتی ژرم (چند جوانه ای) بوده و از نظر نحوه تولید به ارقام تجاری، هیبرید، تلاقی های برادر خواهر ناتنی و گرده افشان تقسیم می شوند. مشخصات 20 ژنوتیپ مورد آزمون در جدول 1 آورده شده است.
استخراج DNA : بعد از کشت بذور در گلخانه و گذشت حدود یک ماه، از برگهای تازه و جوان جهت استخراج DNA استفاده شد. استخراج DNA بر اساس روش تغییر یافته روش استخراج CTAB انجام شد (6) و کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با دو روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز تعیین گردید.
تکثیر قطعات DNA : جهت انجام PCR و بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای مختلف چغندرقند مقاوم، متحمل و حساس به نماتد سیستی از 10 جفت آغازگر SSR استفاده شد که مشخصات آنها در جدول 2 قابل مشاهده است. واکنش زنجیره ای پلیمراز در حجم 25 میکرولیتر شامل 50 نانوگرم DNA، 2 میکرولیتر آغازگر، 1 میکرولیترdNTP، 2 میکرولیتر کلرید منیزیم، 3/0 میکرولیتر تک دی ان آ پلیمراز، 5/2 میکرولیتر بافر PCR و 2/16 میکرولیتر آب دیونیزه بود. تکثیر در دستگاه ترموسایکلر شامل مراحل واسرشتگی مقدماتی به مدت 5 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد، واسرشتگی به مدت 1 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد، اتصال به مدت 1 دقیقه که دمای اتصال با توجه به نوع پرایمر از 40 تا 60 درجه سانتی گراد متفاوت بود، گسترش به مدت 1 دقیقه در 72 درجه و گسترش نهایی به مدت 8 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد بود. مراحل واسرشتگی تا گسترش 35 مرتبه تکرار و در نهایت DNAی ژنوتیپ ها مورد بررسی با استفاده از آغازگرهای SSR تکثیر گردیدند. الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز 3 درصد در بافر ×5/0 TAE و با ولتاژ ثابت 90 به مدت 120 دقیقه انجام شد. مشاهده و عکسبرداری ژل متأثر شده از رنگ GelRed در زیر نور UV به کمک دستگاه ژل نگار صورت گرفت.
جمعآوری دادهها: تصویر ژل های الکتروفورز حاصل از آغازگرهایی که باندهای چندشکل با وضوح مناسب تولید کرده بودند، به صورت دستی تجزیه شد. سپس به حضور یا عدم حضور یک باند در هر نمونه، با استفاده از اعداد صفر و یک امتیازدهی و در نهایت ماتریس دادهها در نرمافزار NTSYS-pcمورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
جدول 1- مشخصات ژنوتیپهای مورد آزمون از نظر نحوه اصلاح، جوانه ژنی بذر و مقاومت به نماتد
ردیف |
شماره ژنوتیپ |
نحوه اصلاح |
جوانه زنی |
مقاومت به نماتد |
1 |
3 |
تلاقی برادر خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
مقاوم |
2 |
7 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
متحمل |
3 |
11 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
متحمل |
4 |
15 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
متحمل |
5 |
19 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
حساس |
6 |
21 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
متحمل |
7 |
25 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
متحمل |
8 |
29 |
هیبرید |
مونوژرم |
مقاوم |
9 |
33 |
گرده افشان |
مولتی ژرم |
حساس |
10 |
37 |
هیبرید |
مونوژرم |
متحمل |
11 |
43 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
حساس |
12 |
47 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
حساس |
13 |
51 |
تلاقی برادر و خواهر ناتنی |
مولتی ژرم |
حساس |
14 |
55 |
واریته تجاری |
مونوژرم |
حساس |
15 |
59 |
واریته تجاری |
مونوژرم |
متحمل |
16 |
62 |
واریته تجاری |
مونوژرم |
حساس |
17 |
63 |
واریته تجاری |
مونوژرم |
حساس |
18 |
66 |
گرده افشان |
مونوژرم |
متحمل |
19 |
70 |
گده افشان |
مولتی ژرم |
حساس |
20 |
35 |
گرده افشان |
مولتی ژرم |
حساس |
جدول 2- فهرست و مشخصات آغازگر های SSR
|
دمای اتصال |
توالی آغازگر |
نام آغازگر |
ردیف |
|
58.0 59.0 |
5`-TTG GAG AGA GAA AAG AGA GAA G-3` 5`-ATC CCT TGA CAG TAG AAC TCC-3` |
Unigene57236 Unigene57236 |
1 |
|
59.0 58.0 |
5`-CTT TAG TGT AGC GTT AGA GCG-3` 5`-TAA CAG CAG GAC TGG AGA AG-3` |
Unigene77067 Unigene77067 |
2 |
|
53.0 58.0 |
5`-AGT TGG GGA AGA GAA A-3` 5`-CAC CAT ACT GAA CCT AAG A-3` |
Unigene25611-F Unigene25611-R |
3 |
|
58.0 58.0 |
5`-GTA AAC TCG GGT AAT AAC AAG C-3` 5`-TAT AAG TCA TGC AGT CGA GCT A-3` |
Unigene11506-F Unigene11506-R |
4 |
|
58.0 60.0 |
5`-AAC CTT CCC TCT GAT TTC T-3` 5`-GGA GAT ACA ACT TAC AAG AGC C-3` |
Unigene17923-F Unigene17923-R |
5 |
|
58.0 57.0 |
5`-AAC ATC TCA CTC ATC CTT CTT C-3` 5`-ATG ATA GCA AAC GAC TAG CAG-3` |
Unigene24552-F Unigene24552-R |
6 |
|
58.0 58.0 |
5`-AAA GGA AAC TAC CCC TAC ACT T-3` 5`-AAG AGA GAA AGA AGA CGA TGA G-3` |
Unigene22373-F Unigene22373-R |
7 |
|
57.0 54.0 |
5`-ATT AGA CCT CAA TCT TCC AGC-3` 5`-AAT AAT GGC AAT CTA CCA GC-3` |
Unigene17623-F Unigene17623-R |
8 |
|
58.0 60.0 |
5`-GCA AGT GGA GAA ATA TGT GAG-3` 5`-TAT GTG GTA GTG GTA CTG CTT-3` |
Unigene10114-F Unigene10114-R |
9 |
|
41.0 40.0 |
5`-CGT AAG AGA CTA TGA-3` 5`-TGA ACA CCT TTC AAA-3` |
REP-F REP-R |
10 |
در این پژوهش برای محاسبه ضریب تشابه از سه روش محاسبه دایس با فرمول ، جاکارد با فرمول و تشابه مقابل ساده با فرمول استفاده شد. که در این روابط a، تک شکلی حاصل از حضور باند، b و c جایگاههای ژنی چند شکل و d جایگاه ژنی تک شکل حاصل از باند صفر می باشد. همچنین با استفاده از تجزیه خوشهای و دندروگرام بدست آمده، ماتریس ضرایب کوفنتیک برآورد شد. سپس با نرمافزار NTSYS همبستگی بین این ماتریس و ماتریس تشابه اولیه محاسبه گردید. در این مطالعه نسبت چندشکلی نشانگرها با استفاده از فرمول و پارامتر محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) با استفاده از فرمول محاسبه شد که در این روابط Pi و Pj به ترتیب فراوانی آلل های i و j در یک جایگاه ریز ماهواره می باشد (14). شاخص نشانگر (MI) از رابطه به دست آمد (3، 12). تجزیه مولفههای اصلی با استفاده از نرمافزار NTSYS به منظور بررسی نحوه پراکنش نشانگرها در سطح ژن گیاه انجام شد.
مقاومت نژادگان چغندرقند مورد مطالعه نسبت به نماتد سیستی با استفاده از شاخص تخم و لارو، در شرایط گلخانهای ارزیابی شد و ژنوتیپ ها در سه گروه مقاوم، متحمل و حساس طبقه بندی شدند. از 20 ژنوتیپ مورد مطالعه، 2 ژنوتیپ مقاوم، 8 ژنوتیپ متحمل و 10 ژنوتیپ حساس ارزیابی شدند (جدول 1).
واکنش PCR با استفاده از 10 جفت آغازگر SSR بر روی 20 نژادگان مورد مطالعه، انجام گرفت که از میان آغازگرها، 3 جفت آغازگر 17623-R-F، 24552-R-F و 17923-R-F موفق به تولید هیچ باندی نشدند. این در حالی است که 7 جفت آغازگر SSR در مجموع 49 قطعه چندشکل تولید نمودند که تقریباً 5/84 درصد از کل 58 آلل تولید شده را شامل گردید. تمامی باندها با وضوح مناسب در محدوده 150 تا 3000 جفتباز امتیازدهی شدند (شکل1).
شکل 1- الگوی باندی حاصل از الکتروفورز DNAهای تکثیر شده 20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی با جفت آغازگر REP در ژل آگارز 3 درصد، M: مارکر وزن مولکولی 1Kb ، C: کنترل منفی. اعداد اسامی ژنوتیپها میباشد.
شاخص های تغییرات آللی: تعداد آللهای چندشکل در هر جایگاه ژنی از 2 تا 9 باند متغیر بود. حداقل این مقدار مربوط به آغازگر22373 (2 آلل) و حداکثر آن مربوط به آغازگرهای 77067، 10114، 25611 و REP (9 آلل) می باشد. بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) مربوط به جفت آغازگرهای REP (94/0) و 10114 (85/0) و کمترین PIC مربوط به جفت آغازگر 22373 (58/0) بود. در این پژوهش بیشترین مقدار شاخص نشانگر مربوط به جفت آغازگرهای REP (46/8) و 10114 (65/7) و کمترین مقدار آن مربوط به جفت آغازگر 22373 (16/1) بود (جدول 3).
جدول3- تعداد باندها و میزان اطلاعات چندشکلی جفت آغازگرهای SSR
ردیف |
نام جفت آغازگر |
تعداد آللها |
باندهای چندشکل |
درصد چند شکلی |
محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) |
شاخص نشانگر(MI) |
1 |
77067 |
11 |
9 |
8/81% |
82/0 |
38/7 |
2 |
57236 |
7 |
7 |
100% |
74/0 |
18/5 |
3 |
REP |
9 |
9 |
100% |
94/0 |
46/8 |
4 |
11506 |
8 |
5 |
5/62% |
66/0 |
3/3 |
5 |
22373 |
4 |
2 |
50% |
58/0 |
16/1 |
6 |
10114 |
9 |
9 |
100% |
85/0 |
65/7 |
7 |
25611 |
10 |
9 |
90% |
73/0 |
57/6 |
|
مجموع |
58 |
49 |
- |
32/5 |
7/39 |
|
میانگین |
28/8 |
7 |
5/84% |
76/0 |
67/5 |
جدول 4- مقایسه ضرایب همبستگی کوفنتیک در روش های مختلف رسم کلاستر
الگوریتم |
روش |
||
دایس |
جاکارد |
ساده |
|
UPGMA |
5/88 |
9/87 |
6/80 |
UPGMC |
2/22 |
30 |
27 |
Complete |
7/77 |
3/81 |
5/77 |
جدول 5- مقادیر ویژه، حاصل از تجزیه مولفههای اصلی براساس نشانگرهای SSR
واریانس تجمعی |
درصد واریانس |
مقادیر ویژه |
مولفه اصلی |
90/31 |
90/31 |
95/1 |
مولفه اول |
95/46 |
05/15 |
32/1 |
مولفه دوم |
03/57 |
08/10 |
01/1 |
مولفه سوم |
تجزیه خوشه ای: به منظور گروه بندی ژنوتیپ ها براساس فواصل ژنتیکی، تجزیه خوشهای به روش UPGMA و با استفاده از ماتریس تشابه دایس انجام گرفت. در واقع با توجه به اینکه در مقایسه ضرایب همبستگی، مقدار ضریب همبستگی مربوط به روش دایس از دیگر روش ها بالاتر بدست آمد و همچنین انطباق بالاتری بین تفکیک ژنوتیپ ها و اطلاعات موجود وجود داشت، تجزیه و تحلیل دادهها برای گروهبندی تودهها با استفاده از ضریب تشابه دایس و الگوریتم UPGMA انجام گرفت (جدول 4). بطوریکه 20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی در ضریب تشابه 70/0 به چهار زیرگروه تقسیمبندی شدند. ضریب همبستگی کوفنتیک براساس ضریب تشابه دایس، 885/0 و با توجه به آزمون مانتل در سطح 1 درصد معنی دار به دست آمد (شکل2).
در این مطالعه جهت تفکیک و گروهبندی نمودار خوشهای، مکان خط برش با استفاده از روش جذرگیری و میانگین ماتریس تشابه دایس بر روی محور فاصله مشخص گردید. بر این اساس خط برش نمودار خوشهای را در فاصله 71/0، به 4 زیر گروه مجزا تقسیم کرد. بطوریکه گروه سوم دندروگرام (III) بیشترین تعداد ژنوتیپ چغندرقند را در خود جای داد که خود شامل تمام ژنوتیپهای مقاوم (3 و 29)، ژنوتیپهای حساس (43، 47، 19 و 51) و ژنوتیپهای متحمل (7، 11، 15، 21 و 37) به نماتد سیستی چغندرقند بود. ژنوتیپ متحل (25) و دو ژنوتیپ حساس (33 و 55) با 90/0 درصد تشابه در گروه چهارم (IV) قرار گرفتند. در گروه دوم (II)ژنوتیپ های حساس (35، 70) و ژنوتیپ متحمل (66) قرار داشتند که هر سه ژنوتیپ دارای بذر مولتی ژرم بودند و طی گردهافشانی حاصل شده بودند. در گروه اول دندروگرام (I) ژنوتیپ های حساس (62 و 63) و یک ژنوتیپ متحمل (59) به نماتد سیستی چغندرقند قرار گرفتند که هر سه ژنوتیپ بذر مونوژرم و واریته تجاری بودند.
به منظور تعیین نحوه پراکنش نشانگرهای SSR در چغندرقند، آزمون تجزیه به مؤلفههای اصلی انجام گرفت. بطوریکه سه مؤلفه اول 03/57 درصد از کل تغییرات را بین 20 ژنوتیپ چغندرقند توجیه نمودند که سهم مؤلفه اول به تنهایی 9/31 درصد، مؤلفه دوم 05/15 درصد و مؤلفه سوم 08/10 درصد از کل تغییرات را توجیه میکند. نتایج تجزیه مؤلفههای اصلی شامل مقادیر ویژه و نسبت واریانس مورد انتظار توسط سه مؤلفه اول برای هر جفت آغازگر در جدول 5 آمده است.
در این مطالعه نحوه گروهبندی تجزیه مؤلفههای اصلی (PCoA) با گروهبندی حاصل از تجزیه خوشهای کاملاً مطابقت داشت. بطوریکه تعداد زیرگروه های به دست آمده در گروهبندی تجزیه مؤلفههای اصلی با زیرگروه های حاصل از تجزیه خوشه ای مشابهت کامل دارد. نتایج بدست آمده نشان داد که بیشترین فاصله ژنتیکی بین دو ژنوتیپ 25 (متحمل به نماتد) و 63 ( حساس به نماتد) با 33 درصد تشابه مشاهده شد. در گروهبندی خوشهای و نمودار حاصل از تجزیه مولفههای اصلی نیز هر دو ژنوتیپ در گروههای جداگانهای قرار گرفتند. این در حالی است که ژنوتیپ 15 (متحمل) با 94 درصد تشابه فاصله ژنتیکی کمی با ژنوتپ 19 (حساس) کمترین فاصله ژنتیکی را داشتند. (شکل 3).
شکل 2- دندروگرام حاصل از پلیمورفیسم 20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی با جفت آغازگرهای SSR
شکل 3- نمودار سه بعدی (A) و دوبعدی (B) دادههای حاصل از تجزیه مولفههای اصلی براساس ماتریس تشابه دایس برای 20 ژنوتیپ چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی
نتایج بدست آمده از این تحقیق نشان داد که نشانگرهای SSR به خوبی در سطح ژنوم پراکنده شده اند و کارایی مناسبی در ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی دارند. تولید تعداد باند زیاد و میزان چندشکلی بالا در ژنوتیپهای مورد مطالعه نشان دهنده کارایی بالای نشانگرهای SSR در ارزیابی تنوع ژنتیکی در ژنوتیپهای چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی بود.
در این مطالعه هفت نشانگر SSR توانستند 58 آلل با دامنه 4 تا 11 آلل در هر مکان ژنی را شناسایی کنند که متوسط تعداد باند چندشکل به ازای هر جفت آغازگر 7 باند بود. در این تحقیق محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) برای هر جفت آغازگر SSR نیز محاسبه شد. بیشترین PIC مربوط به جفت آغازگرهای REP و 10114-R-F به ترتیب 94/0 و 85/0 و کمترین PIC مربوط به جفت آغازگر 22373-R-F با مقدار 58/0 بود. میانگین PIC برای کل جفت آغازگرها بالا (76/0) بود. عباسی و همکاران (1) در مطالعه خود بر روی تنوع ژنتیکی 168 ژنوتیپ چغندرقند با استفاده از 18 نشانگر SSR گزارش کردند که دامنه تعداد آلل به ازای هر جفت آغازگر 2-10 و متوسط آن 7/5 آلل بود. همچنین دامنه PIC از 36/0 تا 83/0 متغیر و میانگین PIC 64/0 بود. در تحقیق اسمولدر و همکاران (15) بر روی بررسی خصوصیات واریتههای چغندرقند با 25 نشانگر ریزماهواره تعداد آللها از 3 تا 21 آلل متغیر بود و واریتهها تا حدود 7 آلل مختلف را در یک مکان ژن برای هر نشانگر نشان دادند.
هر چه عدد متوسط تعداد قطعه چندشکل و محتوای اطلاعات چندشکلی به ازای هر جفت آغازگر بیشتر باشد کارایی آن نشانگر در گیاه مورد مطالعه بالاتر است و نمایانگر قدرت تمایز بیشتر نشانگر میباشد. بیشتر بودن تعداد آلل های مشاهده شده در هر مکان ژنی در این مطالعه می تواند بیانگر تنوع بالاتر توده های استفاده شده باشد. همچنین PIC بالاتر در این مطالعه، بیانگر قدرت تمایز بیشتر نشانگرهای SSR استفاده شده در این مطالعه است. با توجه به اینکه جفت آغازگرهای REP و 10114 دارای بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی و شاخص نشانگر بودند، علاوه بر آن چندشکلی بسیار بالایی (100 درصد) نشان دادند، بنابراین میتوان آنها را به عنوان جفت آغازگرهای مفید و کارآمد برای بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای چغندرقند مقاوم و حساس به نماتد سیستی معرفی و انتخاب کرد.
از طرفی بر اساس آزمون تجزیه مولفههای دو مولفه اول 95/46 درصد از کل تغییرات را بین 20 ژنوتیپ چغندرقند توجیه نمودند. توجیه بخش کمتری از تغییرات توسط چند مولفه اول، دلیل بر توزیع مناسب جفت آغازگرهای بکار رفته بر روی ژنوم میباشد و بیان می کند که آغازگرها در یک قسمت ژنوم متمرکز نشدهاند.
همچنین نتایج این مطالعه بیانگر تنوع ژنتیکی قابل ملاحظه بین ژنوتیپ ها بود ولی با توجه به نتایج بدست آمده از دندروگرام ژنوتیپها میتوان استنباط کرد که تنوع ژنتیکی ایجاد شده رابطه مستقیمی با مقاوم یا حساس بودن ژنوتیپها ندارد. در واقع با توجه به بررسیهای انجام شده در خصوص وجود تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای مختلف چغندرقند با نشانگر SSR مشخص گردید که ژنوتیپهای چغندرقند از نظر ژنتیکی بر اساس طیفهای مختلف مقاومت، حساسیت و متحمل بودن به بیماری نماتد سیستی در گروههای مجزا قرار نگرفتند و همبستگی قابل توجهی را نشان ندادند. مقاوم یا حساس بودن گیاه چغندرقند می تواند تحت تأثیر یک و یا چند ژن خاص باشد که لزوماً وجود یا عدم وجود این ژنها باعث تشابه ژنتیکی و یا عدم تشابه ژنوتیپها با یکدیگر نمیشود.