نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه بین المللی امام خمینی

چکیده

بسیاری از ژن‌های کنترل کننده گلدهی در گیاهان شناسایی شده‌اند که بیشتر آنها متعلق به خانواده بزرگ عوامل رونویسی MADS-box هستند. گیاه زعفران (Crocus sativus) یک گیاه تریپلوئید نرعقیم و ارزشمند است که به منظور استفاده از گل و بویژه کلاله آن کشت می‌شود. درک چگونگی تشکیل گل در گیاه زعفران به افزایش عملکرد و کاهش هزینه‌های تولید آن کمک زیادی می‌کند. در این تحقیق بیان ژن‌های دو گروه Ag1 و Sep3 از خانواده MADS-box که در تشکیل گل بویژه در شکل‌گیری کلاله نقش دارند با روش PCR نیمه کمی (semi quantitative RT-PCR) در زعفران واریته ایرانی بررسی شد و میزان بیان این ژن‌ها در کلاله و سایر اندام‌های گل و نیز اندام‌های رویشی مورد مقایسه قرار گرفت. ژن‌های Ag1a و Ag1b از کلاس C خانوادهMADS-box در سه اندام جنسی تخمدان، کلاله و پرچم بیان شدند بطوریکه میزان بیان آنها در اندام‌های کلاله و پرچم نسبت به تخمدان بیشتر بود. بیان این ژن‌ها در اندام‌های گلبرگ، برگ، پیاز و ریشه در مقایسه با کلاله و پرچم پایین بود. بیان ژن‌های Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3d از کلاس E این خانواده ژنی در چهار اندام گلبرگ، پرچم، کلاله و تخمدان تعیین شد در صورتیکه میزان بیان با روش PCR نیمه کمی در اندام‌های رویشی برگ، پیاز و ریشه تعیین نگردید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Study of expression of the MADS-box transcription factors involved in flower formation in saffron (Crocus sativus L.)

نویسنده [English]

  • fatemeh DEHGHAN NAYERI

چکیده [English]

In plants many genes have been identified with a significant role in the control of flowering pathway. Most of these genes belong to a large family of MADS-box transcription factors. Crocus sativus is a triploid sterile plant characterized by its long red stigmas having commercial value. Understanding flower development in this plant can be useful in increasing yield and reducing production cost. In the present study, the expression pattern of two classes of MADS-box genes (Ag1 and Sep3) involved in flower formation was analyzed in both flower parts and vegetative organs by semi quantitative RT-PCR. Based on the analysis, two C classes of MADS-box genes including Ag1a and Ag1b were expressed in three sexual organs including ovary, stigma and stamens. These two genes showed higher expression in saffron stigma and stamens compared to ovary. Expression level of Ag1a and Ag1b genes was low in petal, leaf, corn and root organs. The expression of Sep3a, Sep3b, Sep3c and Sep3d genes from class E of MADS-box family detected in petal, stamen, stigma and ovary while it was not detectable in vegetative organs including corn and root by semi quantitative RT-PCR.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Gene expression
  • Saffron
  • MADS-box transcription factors
  • Semi quantitative RT-PCR

بررسی بیان ژنهای عوامل رونویسی MADS-box موثر در تشکیل گل در زعفران (Crocus sativus L.)

سونیا جدیر و فاطمه دهقان نیری* 

قزوین، دانشگاه بین­المللی امام خمینی(ره)، دانشکده فنی و مهندسی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخ دریافت: 13/9/93                تاریخ پذیرش: 23/12/93 

چکیده 

بسیاری از ژنهای کنترل کننده گلدهی در گیاهان شناسایی شده­اند که بیشتر آنها متعلق به خانواده بزرگ عوامل رونویسی MADS-box هستند. گیاه زعفران (Crocus sativus) یک گیاه تریپلوئید نرعقیم و ارزشمند است که به منظور استفاده از گل و به ویژه کلاله آن کشت می­شود. درک چگونگی تشکیل گل در گیاه زعفران به افزایش عملکرد و کاهش هزینه­های تولید آن کمک زیادی می­کند. در این تحقیق بیان ژنهای دو گروه Ag1 و Sep3 از خانواده MADS-box که در تشکیل گل به ویژه در شکل­گیری کلاله نقش دارند با روش PCR نیمه کمی (semi quantitative RT-PCR) در زعفران واریته ایرانی بررسی شد و میزان بیان این ژنها در کلاله و سایر اندامهای گل و نیز اندامهای رویشی مورد مقایسه قرار گرفت. ژنهای Ag1a و Ag1b از کلاس C خانوادهMADS-box  در سه اندام جنسی تخمدان، کلاله و پرچم بیان شدند به طوری که میزان بیان آنها در اندامهای کلاله و پرچم نسبت به تخمدان بیشتر بود. بیان این ژنها در اندامهای گلبرگ، برگ، پیاز و ریشه در مقایسه با کلاله و پرچم پایین بود. بیان ژنهای Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3d از کلاس E این خانواده ژنی در چهار اندام گلبرگ، پرچم، کلاله و تخمدان تعیین شد در صورتی که میزان بیان با روش PCR نیمه کمی در اندامهای رویشی برگ، پیاز و ریشه تعیین نگردید.

واژه­های کلیدی: بیان ژن، زعفران، عوامل رونویسی MADS-box، روش PCR نیمه کمی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02833901157، پست الکترونیکی: nayeri@eng.ikiu.ac.ir

مقدمه

 

مطالعه جهشهای هومئوتیک (Homeotic) گل منجر به شناسایی بسیاری از ژنهای کنترل کننده فرآیند تکامل گل شده است (12 و 34). اغلب این ژنها متعلق به خانواده بزرگ عوامل رونویسی MADS-box هستند (35). عوامل MADS-box علاوه بر گیاهان در مخمر و جانوران نیز وجود دارند و نقش مهمی در کنترل فرآیندهای مهم به ویژه تمایز ایفاء می­کنند به طور مثال، در جانوران سبب تمایز بافت ماهیچه می­شوند (40). ژنهای MADS-box علاوه بر تعیین نوع اندام گل و تکامل آن در گیاه، در فعالیتهای تنظیمی مثل تعیین نوع مریستم، توسعه جانبی ریشه و کنترل زمان گلدهی نیز دخالت دارند (25، 26 و 46). برای درک چگونگی تکامل و نمو گل مطالعه فعالیت و برهمکنش ژنهای MADS-box با سایر عوامل رونویسی در تنظیم بیان ژنهای دخیل در گلدهی ضروری است (16 و 17). در اوایل دهه 1990 میرز و کوئن براساس مطالعات مورفولوژیکی و ژنتیکی جهشهای هومئوتیک گل در دو گیاه آرابیدوپسیس و آنتوریوم مدلی برای تکامل و تمایز اندامهای گل پیشنهاد کردند. این مدل بعدها به عنوان مدل ABC شناخته شد و به دلیل سادگی و قابل اجرا بودن به طور گسترده برای بسیاری از گونه­های نهاندانگان مورد توجه قرار گرفت (42). گل آرابیدوپسیس مانند بسیاری از گونه­های نهاندانگان شامل چهار نوع اندام است که در چهار محور متحدالمرکز سازماندهی شده­اند. در محور شماره 1 (خارجی­ترین محور) کاسبرگها، در محور شماره 2 گلبرگها، در محور شماره 3 پرچمها و در محور شماره 4 که داخلی­ترین محور است مادگی قرار دارد (8 و 10). مطالعه ژنتیکی جهشهای هومئوتیک که سبب اختلال در فرآیند تکامل گل و تغییر هومئوتیک یک اندام به اندام دیگر می­شود منجر به ارائه مدل ABC شد (13). این جهشها در سه کلاس A، B و C گروه­بندی می­شوند. در جهشهای کلاس A که شامل جهش در ژنهای Ap1 و Ap2 هستند نقص اندام در محورهای 1 و 2 باعث جایگزینی مادگی در محور اول به جای کاسبرگها می­شود و در محور دوم به جای گلبرگ، پرچمها توسعه می­یابند. در جهش ژن Ap2 علاوه بر نقص اندام، نوعی نقص در تعیین مریستم گل نیز به وجود می­آید و بخشی از مریستم گل به شاخه تبدیل می­شود. جهشهای کلاس B (جهش در ژنهای Pi و Ap3) منجر به توسعه کاسبرگ به جای گلبرگ در محور 2 و تبدیل مادگی به پرچم در محور 3 می­شود. جهش در کلاس C (جهش در ژن Ag) سبب نقص اندام در محورهای 3 و 4 می­شود به طوری که در محور 3 گلبرگها و در حلقه 4 کاسبرگها توسعه می­یابند. براساس مدل ABC، ژنهای کلاس A، B و C در دو محور مجاور فعالیت دارند و فعالیت هر یک از آنها به تنهایی و یا به صورت ترکیبی در هر محور گل نوع اندام را تعیین می­کند. در محور اول فعالیت ژنهای کلاس A به تنهایی سبب تشکیل کاسبرگها می­شود. بیان همزمان ژنهای کلاس A و B گلبرگ­ها را در محور دوم ایجاد می­کند. در محور سوم پرچمها از فعالیت مشترک ژنهای کلاس B و C به وجود می­آیند و سرانجام مادگی در محور چهارم نتیجه بیان ژنهای کلاس C به تنهایی است (7 و 9).

مدل ABC فنوتیپ اندامهای گل را در بسیاری از جهشهای منفرد، دوگانه و سه­گانه پیش­بینی می­کند اما در جهشهای سه­گانه­ای که همه ژنهای کلاسهای A، B و C غیرفعال شده­اند مدل نمی­تواند نوع اندامی را که در هر محور توسعه می­یابد پیش­بینی نماید. ممکن است فرض شود که اگر همه ژنهای کلاسهای A، B و C مورد نیاز برای تعیین نوع اندام گل حذف شوند، اندام حاصل برگ است. اما واقعیت این است که در جهشهای سه­گانه نوع اندامی که به وجود می­آید دارای ظاهری مشابه با برگ و مادگی است. بنابراین باید ژنهای دیگری وجود داشته باشند که در عدم حضور ژنهای کلاس C سبب ظهور مادگی شده­اند (6 و 9). از سوی دیگر بیان نابه­جای ژنهای ABC به طور مثال ژنهای کلاس B (25) و یا ژنهای کلاس C (11، 14، 15و 31) تغییری را در اندامهای رویشی ایجاد نکرد. این یافته­ها نشان می­دهد که ژنهای ABC برای تشکیل اندامهای گل ضروری هستند اما کافی نیستند و این ژنها تنها می­توانند در بافتهای گل که از پیش تثبیت شده­اند دارای فعالیت باشند. به خوبی مشخص شده است که عوامل رونویسی MADS-box از طریق تشکیل ساختارهای همودایمر و یا هترودایمر به DNA متصل می­شوند (38). بنابراین این فرضیه پیش آمد که فعالیت ترکیبی عوامل رونویسی MADS-box جهت تعیین نوع اندام از طریق تشکیل ساختارهای پیچیده صورت می­گیرد. به طور مثال در تشکیل پرچم برهمکنش میان عوامل کلاس B و C و ایجاد ساختارهای دایمر مکانیسمی را برای اتصالهای مختلف با DNA فراهم می­کند. اما شواهد نشان داد که پروتئینهای کلاس B به طور مستقیم هیچ برهمکنشی با سایر عوامل ABC ندارند و تنها به یکدیگر متصل می­شوند (16 و 37). برای اولین بار عوامل موثر بر فعالیت ژنهای ABC شامل ژنهای Fbp2 و Tm5 بترتیب در گونه­های اطلسی و گوجه­فرنگی شناسایی شدند (20). غیرفعال کردن این ژنها منجر به فنوتیپی مشابه فنوتیپ جهش یافته­های کلاسهای B و C شد (4، 5، 16 و 34). سپس سه ژن Sep1، Sep2 و Sep3 از گیاه آرابیدوپسیس جداسازی شدند. در هیچ یک از جهشهای منفرد و دوگانه این ژنها فنوتیپ قابل توجهی مشاهده نشد در حالی­که جهش سه­گانه در ژنهای Sep1، Sep2 و Sep3 فنوتیپی مشابه لاینهای Tm5 و Fbp2 نشان می­داد که در تمام محورها کاسبرگ تشکیل شده بود (5 و 35). این فنوتیپها که یادآور جهشهای دوگانه C و B (Pi , Ag) و (Ap3, Ag) بودند نشان دادند که اولا این گروه از ژنها برای فعالیت کلاسهای B و C ضروری هستند و جهش یک یا دو ژن Sep بر نوع اندام گل اثری ندارد اما حذف به طور همزمان هر سه ژن Sep نقص چشمگیری را در نوع اندام گل ایجاد می­کند. با وجود این بعید بنظر می­رسد که بیان ژنهایSep به طور کامل بی­تأثیر باشد. اگر این ژنها یکی باشند هیچ مزیت انتخابی در حفظ کپیهای این سه ژن وجود ندارد در حالی­که آنالیزهای تکاملی نشان می­دهد که ژنهای Sep برای میلیون­ها سال در گیاهان حفظ شده­اند (20). از طرفی الگوی بیان Sep3 در مقایسه با Sep1 و Sep2 متفاوت است. ژنهای Sep1 و Sep2 در مراحل اولیه تکامل گل و در همه محورها بیان می­شوند (21 و 36). اما Sep3 تنها در محورهای دوم، سوم و چهارم بیان می­شود (29). بررسی بیان این ژنها و نیز ژنهای مرتبط از گیاه آنتوریوم (ژنهای Defh200 وDerh72 ) (17 و 39) این نکته را آشکار کرد که این ژنها بعد از بیان ژنهای تعیین کننده مریستم گل و پیش از بیان ژنهای ABC تعیین کننده نوع اندام هستند. این یافته­ها نقش این ژنها را در ایجاد بافت اولیه گل به خوبی مشخص می­کند. قبلاً این گروه ژنها به عنوان ژنهای حدواسط MADS نامیده می­شدند اما اکنون در همراهی با نام­گذاری مدل ABC به عنوان ژنهای کلاس E شناخته می­شوند. براساس مطالعاتی که روی پروتئینها صورت گرفته است پروتئینهای کلاس E به طور مستقیم با پروتئینهای کلاس C برهمکنش دارند (16، 19 و 22). پروتئینهای Sep با هترودایمرهای کلاس B برهمکنش دارند و نیز در حضور Sep3 میان هترودایمر Pi-Ap3 و پروتئین Ag برهمکنش صورت می­گیرد (24). این نتایج آشکار می­کند که مدل ترکیبی ABC برای واکنش میان پروتئینهای تعیین کننده نوع اندام به حضور پروتئینهای Sep به عنوان حدواسط نیاز دارد. به نظر می­رسد که پروتئینهای Sep نه تنها سبب ایجاد کمپلکسهای پیچیده میان پروتئینهای ABC طی دوره تکامل گل می­شوند بلکه در بسیاری دیگر از فرآیند­های تنظیمی گیاه که توسط پروتئینهای MADS-box کنترل می­شوند نیز نقش دارند (42).

آنچه در بالا ذکر شد مکانیسم تکامل گل در گیاهان دولپه­ای بود. ساختمان گل در گیاهان تک­لپه­ای با گیاهان دولپه­ای تفاوت دارد و از این رو تکامل گل در گیاهان تک­لپه­ای با مدل ABC در گیاهان دولپه­ای متفاوت است. در گیاهان تک­لپه­ای به طور مثال در خانواده لیلیاسه مانند گیاهان دولپه­ای دو محور داخلی شامل پرچم ومادگی است اما برخلاف گیاهان دولپه­ای در گیاهان تک­لپه­ای پوشش گل تنها شامل یک نوع اندام است که در دو محور مجزا قرار گرفته­اند. در این گونه­ها در محورهای اول و دوم بجای کاسبرگ و گلبرگ، اندامهای گلبرگ مانند وجود دارد. علت این امر دخالت ژنهای کلاس B در حلقه دوم است (28).

ژنهای خانواده MADS-box عوامل رونویسی را رمز می کنند که در فرآیندهای گوناگون در یوکاریوتها نقش دارند. در گیاهان این ژنها در تکامل گل و میوه دخالت دارند (6). براساس منشاء تکاملی، عوامل رونویسی MADS-box به دو گروه I و گروه II تقسیم می­شوند. ژنهای گروه II بیشتر مورد مطالعه قرار گرفته­اند و تنظیم کننده­های کلیدی در فرآیندهای تکاملی مانند تعیین نوع مریستم، زمان گلدهی و تکامل میوه و بذر هستند، در مقابل ژنهای گروه I خیلی شناخته شده نیستند. گروه II دارای 4 دامین و گروه I تنها دارای 1 دامین حفاظت شده هستند (32 و 41).

 

ساختار عوامل رونویسی MADS-box. عوامل گروه I دارای1 دامین و عوامل گروه II دارای 4 دامین هستند.

تسافتاریس و همکاران (2004) بیان 3 ژن همولوگ Ap1 را در گیاه زعفران واریته یونانی بررسی و آنها را به صورت CsAp1a، CsAp1b و CsAp1c نام­گذاری کردند. این ژنها اولین ژنهای MADS-Box بودند که در گیاه زعفران شناسایی شدند. توالی اسیدآمینه­ای این 3 ژن همولوژی بالایی را با عوامل رونویسی MADS-Box به ویژه خانواده Ap1-like نشان دادند. تمامی توالیهای جدا شده فاقد موتیف CAAX بودند. این موتیف در پروتئینهای Ap1 گیاهان تک‌لپه‌ای برخلاف گیاهان دولپه­ای وجود ندارد. آنالیز فیلوژنی ژنهای جداسازی شده در سطح اسیدهای آمینه نشان داد که آنها دارای اجداد مشترکی با ژنهای Ap1 گیاهان تک‌لپه‌ای ذرت، جو و برنج هستند (46).

تسافتاریس و همکاران (2011) همسانه­سازی چهار ژن از کلاس E خانواده MADS-Box با نامهای Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3c-as را گزارش کردند. نتایج توالی­یابی نشان داد که توالی Sep3c-as محصول پردازش ژن Sep3c است. نتایج بررسی خویشاوندی نشان داد که این توالیها بسیار مشابه با توالیهای Sep3-like جدا شده از سایر گیاهان تک‌لپه‌ای هستند. هر چهار توالی به طور قوی در تمام اندامهای گل بیان شدند. تسافتاریس و همکاران اظهار داشتند که بیان ژنهای Sep3-like به همراه ژنهای کلاس A و کلاس B اولا تشکیل گلبرگ بجای کاسبرگ در محور اول و ثانیاً توسعه مدل تکامل گل را از ABC به ABCE توضیح می­دهد. از سوی دیگر بیان ژنهای کلاس C به همراه ژنهای کلاس E و B در اندام مادگی نشان داد که برای یافتن نقش این ژنها در تشکیل مادگی باید آزمایشات بیشتری صورت گیرد (43).

زعفران (Crocus sativus) گیاهی تک لپه و تریپلوئید از خانواده زنبقیان (Iridaceae) و دارای گلهایی با ارزش اقتصادی بالاست. کلاله قرمز رنگ آن با نام تجاری زعفران یک افزودنی محبوب در صنایع غذایی با خواص دارویی به شمار می­رود که دارای رایحه و رنگ جذابی است. گل زعفران دوجنسی و عقیم است. پوشش گل در این گیاه شامل 6 قسمت گلبرگ مانند است که 3 گلبرگ در محور اول (گلبرگهای خارجی) و 3 گلبرگ در محور دوم (گلبرگهای داخلی) قرار دارند. نرینگی شامل 3 پرچم مجزا است و مادگی آن از یک تخمدان که در وسط قرار گرفته تشکیل شده است. از قسمت تخمدان خامه باریک و بلندی خارج می­شود که در انتها به کلاله بوقی شکل ختم می­شود (41). درک چگونگی رشد گل در گیاه زعفران به افزایش عملکرد و کاهش هزینه­های تولید گل به ویژه کلاله کمک به سزایی خواهد کرد. در این مطالعه بیان ژنهایی از خانواده MADS-box که در تشکیل گل بویژه کلاله نقش دارند مورد بررسی قرار گرفت و میزان بیان آنها با یکدیگر در کلاله و سایر اندامهای گل و اندامهای رویشی مقایسه شد.

مواد و روشها

مواد گیاهی مورد استفاده در این تحقیق شامل اندامهای تخمدان،کلاله، پرچم، گلبرگ، برگ، پیاز و ریشه گیاه زعفران بود. پس از برداشت گلها از منطقه قائنات استان خراسان، اندامهای ذکر شده توزین و درون ورقه­های آلومینیومی پیچیده شدند. نمونه­های آماده شده فورا" درون ازت مایع تثبیت و در دمای 80- درجه سانتی­گراد تا زمان استخراج RNA نگهداری شدند.

استخراج RNA: استخراج RNA از 7 اندام رویشی و زایشی گیاه زعفران شامل ریشه، پیاز، برگ، گلبرگ، پرچم،کلاله و تخمدان با کیت استخراج RNA (ساخت شرکت سیناکلون ((RNXTM – PLUS) صورت گرفت.

واکنش نسخه­برداری معکوس (سنتز cDNA): سنتز cDNA با استفاده از 1 میکروگرم از RNA کل با استفاده از Oligo dT به عنوان آغازگر عمومی توسط آنزیم ترانسکریپتازمعکوس با نام تجاری M-MuLV Reverse Transcriptase Rnase H صورت گرفت. برای انجام روش PCR نیمه کمی، غلظت cDNA نمونه­های حاصل از واکنش نسخه­برداری معکوس با اسپکتروفتومتری تعیین شد و سپس جهت انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز از هر یک از نمونه­ها استوک کاری با غلظت  µg/µl1 تهیه شد.

واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR): در این تحقیق از روش PCR نیمه کمی جهت بررسی بیان ژنهای مورد نظر استفاده شد. برای این منظور ابتدا با استفاده از یک جفت آغازگر ژن18S rRNA  به عنوان ژن خانه­دار شرایط انجام واکنش بهینه شد. ژن 18S rRNA براساس منابع موجود از گیاه زعفران انتخاب شد (3). سپس واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای 6 ژن اختصاصی شامل Ag1a و Ag1b از ژنهای کلاس C  و Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3d از ژنهای کلاس E صورت گرفت. آغازگرهای اختصاصی ژن با استفاده از توالیهای موجود ژنها در پایگاه NCBI (EU424140.1، EU424139.1، EU424138.1، EU424137.1، AY555580.1، AY555579.1) بوسیله نرم­افزار Oligo 5 (http://www.oligo.net) و با در نظر گرفتن همه پارامترهای لازم طراحی شدند. درستی آغازگرهای طراحی شده از لحاظ عدم اتصال غیراختصاصی و تشکیل دایمر آغازگرها، با استفاده ازPrimer Blast  مورد تایید قرار گرفت (جدول 1). شرایط انجام واکنش PCR نیمه کمی به این شرح بود: واسرشتگی اولیه 3 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی­گراد، 35 چرخه شامل واسرشتگی بمدت 1 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی­گراد، اتصال بمدت 1 دقیقه در دمای بهینه شده برای هر آغازگر، گسترش بمدت 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی­گراد و گسترش نهایی بمدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی­گراد.

 

جدول 1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده برای ژنهای MADS-Box گیاه زعفران. در این جدول F و R به ترتیب نشان دهنده آغازگرهای Forward (رفت) و Reverse (برگشت) هستند.

%GC

دمای اتصال (ºC)

طول قطعه

توالی '5 به '3 آغازگرها

آغازگرها

60

60

681

'-AACGGATCCATGGGGAgGGGGAAgATCG-3'5

Ag1a F

 

60

'5'-TGCGGATCCTTACCCTAgTTGGAgGGCAgTC-3

Ag1a R

57

60

686

'-TAgGATCCATGGGGAgGGGGAAgATCG-3'5

Ag1b F

55

60

'-CGCGGATCCCTACACAAAACCTAgTTGGAg-3'5

Ag1b R

57

58

716

'-ATGGGATCCATGGGGAgAgGAAgAgTCGAg-3'5

Sep3a F

51

58

'-ATCGGATCCTCATTGCAACCATCCAgGCA-3'5

Sep3aR

59

58

719

'-AAgGGATCCATGGGGAgAgGGAgAgTCGAg-3'5

Sep3bF

55

58

'-GTCGGATCCTCATTGCAACCATCCAgGCA-3'5

Sep3bR

60

58

724

'-ACCGGATCCATGGGTAgAgGGAgAgTCGAgC-3'5

Sep3cF

59

58

'-ACGGGATCCTCATGGGAACCATCCTGGAg-3'5

Sep3cR

57

58

720

'-ATCGGATCCATGGGTAgAgGGAgAgTCGAg-3'5

Sep3dF

55

58

'-ATCGGATCCTCATGGGAACCATCCTGGAg-3'5

Sep3dR

50

56

703

5'-TTCAATCCGTAGGAGCGACA-3'

18srnaF

52

56

5'-CGAACGAGACCTCAGTCTGCTAA-3'

18srnaR







 


بررسی بیان ژنها: در بررسی بیان هر ژن به ازای هر نمونه، واکنش زنجیره­ای پلیمراز 3 بار تکرار شد. پس از انجام این واکنش مقدار µl 5 محصول واکنش روی ژل 2/1 درصد آگارز الکتروفورز و سپس به وسیله نرم­افزار v 1.42q ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)  شدت باند موجود روی ژل آنالیز شد. این نرم­افزار قادر است شدت نسبی باند موجود روی ژل را اندازه­گیری کند و به صورت عدد نمایش دهد. در نهایت آنالیز آماری داده­های حاصل و رسم نمودارها با نرم­افزارهای  SPSS v 15(www.spss.com) و Excel انجام شد.

نتایج

بررسی بیان ژنهای کلاس C : ژنهای Ag1a و Ag1b از کلاس C خانواده MADS-box به ترتیب دارای طول 1078 و 1127 جفت باز هستند. مقایسه میانگین داده­های مربوط به بیان ژن Ag1a در اندامهای مختلف گیاه زعفران نشان داد که اختلاف بین اندامها در سطح 1 درصد معنی­دار شد. آنالیزهای آماری، شدت باند Ag1a در اندامهای مختلف زعفران را در دو سطح کاملاً متفاوت قرار می­دهد به طوری که شدت باند در اندامهای کلاله و پرچم خیلی زیاد است در حالی­که در اندامهای تخمدان، گلبرگ، برگ، پیاز و ریشه در مقایسه با کلاله و پرچم پایین است. از سوی دیگر همان گونه که در شکل1 نشان داده شده است ژن Ag1a در اندامهای کلاله، پرچم و تخمدان بیان شده است، با این تفاوت که میزان بیان آن در اندامهای کلاله و پرچم نسبت به تخمدان بیشتر است.

اختلاف میانگین بیان ژن Ag1b در اندامهای مختلف گیاه زعفران در سطح 1 درصد معنی­دار بود. براساس آنالیزهای آماری شدت باند ژن Ag1b بدست آمده در اندامهای مختلف گیاه زعفران نیز مانند ژن Ag1a در دو سطح متفاوت قرار می­گیرد و در اندامهای کلاله و پرچم نسبت به سایر اندامها اختلاف معنی­داری دارد. با وجود این، شکل1 نشان می­دهد که این ژن در اندامهای تخمدان، کلاله و پرچم بیان می­شود، البته با این تفاوت که میزان بیان آن در اندامهای کلاله و پرچم نسبت به تخمدان بیشتر است.

بررسی بیان ژنهای کلاس E: ژنهای Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3d متعلق به کلاس E خانواده MADS-box هستند. طول این ژنها به ترتیب 1110، 1157، 1070 و 1059 جفت باز است. مقایسه میانگین بیان ژن Sep3a در اندامهای مختلف گیاه زعفران معنی­دار شد.

 

 

 

 

شکل1- بیان ژنهایAg1a  و Ag1b در اندامهای مختلف زعفران. این ژنها در اندامهای تخمدان و به ویژه در کلاله و پرچم بیان بالایی دارند ولی در اندامهای رویشی (برگ، پیاز و ریشه) بیان نمی­شوند یا بیان بسیار کمی دارند. شکل پایین بیان ژن18S rRNA  را نشان می­دهد که در همه اندامها به یک میزان بیان شده است. طول قطعه مربوط به ژن Ag1b 681، ژن Ag1a 686 و ژن 18S rRNA 703 جفت باز است.

آنالیزهای آماری بیشترین میزان شدت باند را در اندامهای گلبرگ و پرچم و سپس در اندامهای تخمدان و کلاله نشان داد. شکل2 تفاوت در میزان بیان Sep3a را در اندامهای مختلف گیاه زعفران نشان می­دهد، این ژن در اندامهای گل شامل تخمدان، کلاله، پرچم و گلبرگها بیان می­شود ولی در اندامهای رویشی برگ، ریشه و پیاز بیان نمی­شود. مقایسه میانگین بیان ژنSep3b در اندامهای مختلف زعفران در سطح 1 درصد معنی­دار بود. بیشترین میزان شدت باند در اندامهای کلاله، پرچم، گلبرگ و سپس در اندام تخمدان مشاهده شد. همانطور که در شکل2 نشان داده شده است این ژن در اندامهای برگ، ریشه و پیاز بیان نمی­شود.

 

 

 

 

 

اختلاف میانگین بیان ژن Sep3c در اندامهای مختلف گیاه زعفران در سطح 1 درصد معنی­دار شد. آنالیزهای آماری شدت باند در اندامهای مختلف گیاه زعفران را در 2 سطح متفاوت قرار می­دهد. ژن Sep3c در اندامهای مختلف گل شامل تخمدان، کلاله، پرچم و گلبرگ بیان می­شود ولی در اندامهای غیر گل شامل برگ، پیاز و ریشه بیان نمی­شود (شکل2). اختلاف میانگین بیان ژن Sep3d در اندامهای مختلف زعفران در سطح 1 درصد معنی­دار شد. آنالیزهای آماری شدت باند در اندامهای مختلف را در 3 سطح متفاوت قرار داد به طوری که اندامهای کلاله، پرچم، گلبرگ و سپس تخمدان دارای بیشترین شدت باند بودند و اندامهای رویشی برگ، پیاز و ریشه کمترین شدت باند را نشان دادند. شکل2 میزان بیان این ژن را در اندامهای مختلف گیاه زعفران نشان می­دهد.

 

 

 

 

 

شکل2- بررسی بیان ژنهای کلاسE  خانواده MADS box در اندامهای مختلف گیاه زعفران. این ژنها در اندامهای گل شامل تخمدان، کلاله ، پرچم و گلبرگ بیان بالایی دارند ولی در اندامهای رویشی (برگ، پیاز و ریشه) بیان نمی­شوند یا بیان بسیار کمی دارند. شکل پایین بیان ژن18S rRNA  را نشان می­دهد که در همه اندامها به یک میزان بیان شده است. طول قطعه ژن Sep3a  716، ژن Sep3b  719، ژن Sep3c 724، ژن Sep3d 720  و ژن 18S rRNA 703 جفت باز است.

بحث

زعفران از گیاهان زراعی و ارزشمندی است که از جنبه­های مختلفی مورد مطالعه قرار گرفته است. از جمله تحقیقات صورت گرفته در ایران می­توان به تکثیر سریع و انبوه بنه­های سالم زعفران در شرایط آزمایشگاهی اشاره کرد که توسط رجب پور و همکاران (1390) انجام شده است. براساس گزارش این محققین از آنجایی که روش سنتی به علت حمله عوامل بیماری­زا به بنه­ها زمان­بر است می­توان از روشهای آزمایشگاهی برای تولید بنه­های عاری از بیماری استفاده نمود (1). همچنین در تحقیق دیگری که توسط رضوانی و همکاران (1393) صورت گرفته است تأثیر هورمون اکسین و عنصر مس روی خصوصیات ظاهری ریشه و برگ زعفران مطالعه شده است. براساس نتایج این مطالعه اثر متقابل اکسین و مس باعث افزایش تعداد ریشه و وزن خشک برگ و ریشه می­شود (2). در تحقیق حاضر نیز بیان ژنهای دو گروه Ag1 و Sep3 متعلق به کلاسهای C و E خانواده عوامل رونویسی MADS-box که در تشکیل گل به ویژه در تشکیل کلاله نقش دارند با روش PCR نیمه کمی در زعفران واریته ایرانی بررسی شد و میزان بیان این ژنها در کلاله و سایر اندامهای گل و نیز اندامهای رویشی مورد مقایسه قرار گرفت.

بیان ژنهای کلاس C: ژنهای Ag متعلق به کلاس C خانواده MADS-box هستند. دو ژن Ag1a و Ag1b فرمهای حاصل از پیرایشهای متفاوت ژن AG1 می­باشند که 99 درصد تشابه توالی نوکلئوتیدی دارند. مطالعه الگوی بیان ژنهای Ag در سطح رونویسی طی دوره تکامل گل در گیاه آرابیدوپسیس، بیان این ژنها را در پریموردیای پرچم و مادگی نشان داد در صورتی که در اندامهای کاسبرگ و گلبرگ بیانی مشاهده نشد (18، 27 و 30). بیان این ژنها در محورهای سوم و چهارم نقش مهمی در تشکیل اندامهای جنسی پرچم و مادگی در این محورها دارد. ژنهای Ag در گیاهان دولپه­ای در محور سوم همراه با ژنهای کلاس B و E بیان می­شوند. در محور چهارم این ژنها با ژنهای کلاس E به طور مشترک بیان می­شوند. اما الگوی بیان در گیاه تک­لپه­ای زعفران نسبت به آنچه در گیاهان دو لپه­ای گفته شد کمی متفاوت است. بررسی بیان ژن Ag1a در سه اندام کلاله، پرچم و برگ زعفران واریته ایرانی نشان داد که ژن Ag1a در اندامهای کلاله و پرچم دارای بیان ولی در برگ فاقد بیان است (44 و 45). نتایج این تحقیق نشان داد که ژنهای Ag فقط در اندامهای جنسی زعفران شامل تخمدان، کلاله و پرچم بیان می­شوند و در گلبرگ و سایر اندامهای رویشی بیان نمی­شوند.

بیان ژنهای کلاس E: ژنهای Sep در کلاس E ژنهای خانواده MADS-box تقسیم­بندی می­شوند و نقش مهمی در تکامل گل دارند. عوامل رونویسی Sep تشکیل اندامهای مختلف گل را کنترل می­کنند. ژنهای Sep1،Sep2  و Sep3 از ژنهای تعیین کننده اندام هستند که برای تکامل گلبرگ، پرچم و مادگی ضروری می­باشند (34). الگوی بیان ژنهان Sep در گیاهان دولپه­ای و تک­لپه­ای با هم متفاوت است. در گیاهان دولپه­ای بیان این ژنها در محورهای دوم، سوم و چهارم همراه با ژنهای ABC سبب تشکیل اندامهای مختلف گل می­شود (33). این در حالی است که ژنهای Sep در محور اول بیان نمی­شوند و بیان ژنهای کلاس A به تنهایی در این محور سبب تشکیل کاسبرگ می­شود. مطالعه ژنهای Sep در گیاهان تک لپه­ای و به ویژه در برنج و ذرت صورت گرفته است (23). برخلاف گیاهان دو لپه­ای، بررسی بیان ژنهای Sep در گیاهان تک لپه­ای نشان می­دهد که این ژنها در همه محورهای گل این گیاهان بیان می­شوند. بیان ژنهای Sep3 در واریته یونانی گیاه زعفران در هر چهار حلقه گل در اندامهای کلاله، پرچم و گلبرگ شناسایی شده است (43).

در این تحقیق بیان ژنهای Sep3 در اندامهای مختلف گیاه زعفران واریته ایرانی مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده ژنهای Sep3 در همه اندامها و محورهای گل زعفران بیان می­شوند. به نظر می­رسد این ژنها در تشکیل همه اندامهای گل زعفران و یا به عبارت دیگر در تشکیل بافت اولیه گل جهت فعالیت ژنهای ABC نقش دارند. این نتایج با مدل تکامل گل ABCE در گیاهان سازگار است. با وجود این، جهت درک بیشتر چگونگی تشکیل گل زعفران و به خصوص مادگی آن آزمایشهای بیشتری در ارتباط با چگونگی تجمع پروتئینهای MADS و برهمکنش عوامل A، B، C و E باید انجام شود.

پلاز و همکاران (2000) نشان دادند که در گیاه آرابیدوپسیس فعالیت ژنهای کلاس B و C به فعالیت 3 ژن SepSep2 و Sep3 از خانواده MADS-Box نیاز دارد. در گیاهان جهش یافته سه­گانه که فاقد فعالیت هر سه ژن Sep بودند در تمام محورهای گل کاسبرگ تشکیل شد. براین اساس پلاز و همکاران اعلام کردند که ژنهای Sep1، Sep2 و Sep3 از ژنهای تعیین کننده اندام هستند که برای تکامل گلبرگ، پرچم و مادگی ضروری می­باشند. پلاز و همکاران (2001) طی آزمایشهایی توانستند در گیاه آرابیدوپسیس برگ را به گلبرگ تبدیل کنند. ترکیب فعالیت ژنهای Sep با ژنهای A و B سبب تغییر برگهای رزت به گلبرگ شد (34). هونما و گوتو (2001) نشان دادند پروتئینهای کلاس B از طریق پروتئینهای Sep با پروتئینهای Ap1 و Ag برهمکنش دارند. در این بررسی بیان نابجای PAp3 و Ap1 همچنین بیان نابجای Pi، Ap3 و Sep3 سبب تبدیل برگ به گلبرگ شد. بیان نابجای Pi، Ap3، Sep3 و Ag باعث تغییر برگ به پرچم شد (24).

درک چگونگی رشد گل در گیاه زعفران می­تواند راه را برای افزایش عملکرد آن و کاهش هزینه­های تولید گل به ویژه کلاله هموار سازد. در تحقیق حاضر بیان ژنهایی از خانواده MADS-Box را که در تشکیل گل به ویژه کلاله نقش دارند مورد بررسی قرار گرفت و میزان بیان آنها با یکدیگر در کلاله، سایر اندامهای گل و نیز اندامهای رویشی مقایسه شد. گام بعدی استفاده از مهندسی ژنتیک برای افزایش بیان ژنهایی است که در کلاله بیان می­شوند.

1. رجب پور، ش. صبورا، ع. وطن پور ازغندی، ع. 1390. تغییر غلظت هورمونهای برون­زا و تاثیر آن بر روی بلوغ رویان­های بدنی و ریزبنه­زایی زعفران زراعی (Crocus sativus L.). مجله زیست­شناسی گیاهی ایران. شماره 8. ص 41-58.

2. رضوانی، ن. سروش زاده، ع. شریفی، م. 1393. تاثیر اکسین و عنصر مس بر رشد زعفران. مجله زیست­شناسی گیاهی ایران. شماره 19. ص 124-111.

 

3. Ahrazem, O., Rubio-Moraga, A., Trapero, A., Gomez-Gomez, L. 2011. Developmental and stress regulation of gene expression for a 9-cis- epoxycarotenoid dioxygenase, CstNCED, isolated from Crocus sativus stigmas. Journal of Experimental Botany. 1-14.

4. Angenent, G.C., John, F., Marco, B., Lucia, C., Tunen, A.J. 1993. Petal and stamen formation in petunia is regulated by the homeotic gene Fbp1. The Plant Journal. 1: 101-112.

5. Angenent, G.C., Franken, J., Busscher, M., Weiss, D., Tunen, A.J. 1994. Co‐suppression of the petunia homeotic gene Fbp2 affects the identity of the generative meristem. The Plant Journal. 1: 33-44.

6. Bowman, J.L., Baum, S.F., Eshed, Y., Putterill, J., Alvarez, J. 1999. Molecular genetics of gynoecium development in Arabidopsis. Current Topics in Developmental Biology. 45: 155-205.

7. Bowman, J.L. 1997. Evolutionary conservation of angiosperm flower development at the molecular and genetic levels. Journal of Biosciences. 4: 515-527.

8. Bowman, J.L., Alvarez, J., Weigel, D., Meyerowitz, E.M., Smyth, D.R. 1993. Control of flower development in Arabidopsis thaliana by Apetala1 and interacting genes. Development. 3: 721-743.

9. Bowman, J.L., David, R.S., Meyerowitz, E.M. 1991. Genetic interactions among floral homeotic genes of Arabidopsis. Development. 1: 1-20.

10. Bowman, J.L., David, R.S., Meyerowitz, E.M. 1989. Genes directing flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 1: 37-52.

11. Bradley, D., Rosemary, C., Hans, S., Nigel, H., Coen, E. 1993. Complementary floral homeotic phenotypes result from opposite orientations of a transposon at the plena locus of Antirrhinum. Cell. 1: 85-95.

12. Carpenter, R., Coen, E.S. 1990. Floral homeotic mutations produced by transposon-mutagenesis in Antirrhinum majus. Genes and Development. 4: 1483-1493.

13. Causier, B., Schwarz-Sommer, Z., Davies, B. 2010. Floral organ identity: 20 years of ABCs. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21: 73-79.

14. Causier, B., Rosa, C., Zhou, J., Ingram, R., Xue, Y., Schwarz-Sommer, Z., Davies, B. 2005. Evolution in action: following function in duplicated floral homeotic genes. Current Biology. 16: 1508-1512.

15. Coen, E.S., Meyerowitz, E.M. 1991. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower Development. Nature. 6339: 31-37.

16. Davies, B., Egea-Cortines, M., Silva, E.D.A, Saedler, H., Sommer, H. 1996. Multiple interactions amongst floral homeotic MADS-box proteins. The EMBO Journal. 16: 4330-4343.

17. Davies, B., Rosa, A., Eneva, T., Saedler, H., Sommer, H. 1996. Alteration of tobacco floral organ identity by expression of combinations of Antirrhinum MADS‐box genes. The Plant Journal. 4: 663-677.

18. Drews, G.N., Bowman, J.L., Meyerowitz, E.M. 1991. Negative regulation of the Arabidopsis homeotic gene Agamous by the Apetala2 product. Cell. 6: 991-1002.

19. Fan, H.Y., Hu, Y., Tudor, M., Ma, H. 1997. Specific interactions between the k domains of Ag and Agls, members of the MADS-domain family of DNA binding proteins. The Plant Journal. 5: 999-1010.

20. Ferrario, S., Immink, R.G.H., Shchennikova, A., Busscher-Lange, J., Angenent, G.C. 2003. The MADS-box gene Fbp2 is required for sepallata function in Petunia. The Plant Cell Online. 4: 914-925.

21. Flanagan, C.A., Ma, H. 1994. Spatially and temporally regulated expression of the MADS-box gene Agl2 in wild-type and mutant Arabidopsis flowers. Plant Molecular Biology. 2: 581-595.

22. Folter, S., Immink, R.G.H., Kieffer, M., Pařenicová, L., Henz, S.R., Weigel, D., Busscher, M., Kooiker, M., Colombo, L., Kater, M.M. 2005. Comprehensive interaction map of the Arabidopsis MADS-box transcription factors. The Plant Cell Online. 5: 1424-1433.

23. Gao, X., Liang, W., Yin, C., Ji, S., Wang, H., Su, X., Guo, C., Kong, H., Xue, H., Zhang, D. 2010. The SEPALLATA like gene OsMADS34 is required for rice inflorescence and spikelet development. Plant Physiology. 153: 728-740.

24. Honma, T., Goto, K. 2001. Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs. Nature. 6819: 525-529.

25. Huijser, P., Klein, J., Lönnig, W.E., Meijer, H., Saedler, H., Sommer, H. 1992. Bracteomania, an inflorescence anomaly, is caused by the loss of function of the MADS-box gene squamosa in Antirrhinum majus. The EMBO Journal. 4: 1239-1249.

26. Jofuku, K.D., Boer, B.G.D., Montagu, M.V., Okamuro, J.K. 1994. Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene Apetala2. The Plant Cell Online. 9: 1211-1225.

27. Kempin, S.A., Savidge, B., Yanofsky, M.F. 1995. Molecular bBasis of the cauliflower phenotype in Arabidopsis. Science. 5197: 522-525.

28. Krizek, A.Β., Meyerowitz, Ε.Μ. 1996. The Arabidopsis homeotic genes Apetala3 and Ριstiιlατα are sufficient to provide the Β class organ identity function. Development. 4: 11-22.

29. Liu, Z., Meyerowitz, E.M. 1995. Leunig regulates Agamous expression in Arabidopsis flowers. Development. 4: 975-991.

30. Mandel, M.A., Yanofsky, M.F. 1998. The Arabidopsis Agl9 MADS-box gene is expressed in young flower primordia. Sexual Plant Reproduction. 1: 22-28.

31. Martienssen, R., Irish, V. 1999. Copying out Our Abcs: The role of gene redundancy in interpreting genetic hierarchies. Trends in Genetics. 11: 435-437.

32. Masiero, S., Colombo, L., Grini, P.E, Schnittger, A., Kater, M.M. 2011. The emerging iImportance of type I MADS-box transcription factors for plant reproduction. The Plant Cell Online. 3: 865-872.

33. Parenicová, L., Folter, S.D., Kieffer, M., Horner, D.S., Favalli, C., Busscher, J., Cook, H.E., Ingram, R.M., Kater, M.M., Davies, B. 2003. Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-box transcription factor family in Arabidopsis new openings to the MADS world. The Plant Cell Online. 7: 1538-1551.

34. Pelaz, S., Ditta, G.S., Baumann, E., Wisman, E., Yanofsky, M.F. 2000. B and C floral organ identity functions Require sepallata MADS-box genes. Nature. 6783: 200-203.

35. Pnueli, L., Hareven, D., Broday, L., Hurwitz, C., Lifschitz, E. 1994. The Tm5 MADS-box gene mediates organ differentiation in the three inner whorls of tomato flowers. The Plant Cell Online. 2: 175-186.

36. Riechmann, J.L., Meyerowitz, E.M. 1997. MADS-domain proteins in plant development. Biological Chemistry. 10: 1079-1102.

37. Riechmann, J.L., Krizek, B.A., Meyerowitz, E.M. 1996. Dimerization specificity of Arabidopsis MADS-domain homeotic proteins Apetala1, Apetala3, Pistillata, and Agamous. Proceedings of the National Academy of Sciences. 10: 4793-4798.

38. Savidge, B., Rounsley, S.D., Yanofsky, M.F. 1995. Temporal relationship between the transcription of two Arabidopsis MADS-box genes and the floral organ identity genes. The Plant Cell Online. 6: 721-733.

39. Schwarz-Sommer, Z., Hue, I., Huijser, P., Flor, P.J., Hansen, R., Tetens, F., Lönnig, W.E., Saedler, H., Sommer, H. 1992. Characterization of the Antirrhinum floral homeotic MADS-box gene deficiens: evidence for DNA binding and autoregulation of its persistent expression throughout flower development. The EMBO Journal. 1: 251-263.

40. Schwarz-Sommer, Z., Huijser, P., Nacken, W., Saedler, H., Sommer, H. 1990. Genetic control of flower development by homeotic genes in Antirrhinum majus. Science. 4983: 931-936.

41. Theissen, G., Kim, J.T., Saedler, H. 1996. Classification and phylogeny of the MADS-box multigene family suggest defined roles of MADS-box gene subfamilies in the morphological evolution of eukaryotes. Journal of Molecular Evolution. 5: 484-516.

42. Thomas, J. 2001. Relearning our ABCs: new twists on an old model. Trends in Plant Science. 7: 310-316.

43. Tsaftaris, A., Pasentsis, K., Makris, A., Darzentas, N., Polidoros, A., Kalivas, A., Argiriou, A. 2011. The study of the E-class Sepallata3-like MADS-box genes in wild-type and mutant flowers of cultivated saffron crocus (Crocus sativus L.) and its putative progenitors. Journal of Plant Physiology. 14: 1675-1684.

44. Tsaftaris, A., Alexios, S., Polidoros, N., Pasentsis, K., Kalivas, A. 2006. Tepal formation and expression pattern of B-class paleo Ap3- like MADS-box genes in crocus (Crocus sativus L.). Plant Science. 2: 238-246.

45. Tsaftaris, A.S., Pasentsis, K., Polidoros, A.N. 2005. Isolation of a differentially spliced C-type flower specific Ag-Like MADS-box gene from Crocus sativus and characterization of its expression. Biologia Plantarum. 4: 499-504.

46. Tsaftaris, A.S., Pasentsis, K., Iliopoulos, I., Polidoros, A.N. 2004. Isolation of three homologous Ap1-like MADS-box genes in crocus (Crocus sativus L.) and characterization of their expression. Plant Science. 5: 1235-1243.