نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه مازندران

2 دانشگاه تزبیت مدرس

چکیده

تنوع ژنتیکی توس (Betula pendula)، که یک گونه ارزشمند دارویی و در معرض خطر انقراض است، در سطح اندک جمعیت های باقیمانده از آن در نیمرخ شمالی ایران شامل: مارمیشو، سیاه مرزکوه، سنگده و شهرستانک، با استفاده از پلی مورفیسم DNAی کلروپلاستی سه منطقه 3800، 1800 و 2700 جفت بازی و تکنیک PCR-RFLP مطالعه شد. این مناطق به ترتیب CD ، DT و K1K2 نامیده می شوند. درصد جایگاه پلی مورفیک، هتروزیگوتی مورد انتظار (He) و شاخص شانون (I) در چهار جمعیت، به ترتیب برابر با 51/24 درصد، 096/0و 14/0 محاسبه شد. آنالیز واریانس مولکولی نیز نشان داد که 66 درصد از کل تنوع مربوط به درون جمعیت ها و 34 درصد آن بین جمعیتی است. محاسبه شاخص تمایز ژنتیکی (206/0Gst =)، تمایز بالای جمعیت‌های توس از یکدیگر را نشان داد. مقایسه دو به دو میزان تمایز ژنتیکی جمعیت‌ها از یکدیگر نشان داد که جمعیت مارمیشو بیشترین تمایز را از سایر جمعیت ها نشان داد. برآورد میزان جریان ژنی بین جمعیت‌ها حاکی از وقوع رانش ژنتیکی بین آنها است (96/0= (Nm. همچنین نتایج آزمون مانتل همبستگی معنی‌داری (77%r= ) را بین تمایز ژنتیکی جمعیت و فاصله جغرافیایی آنها از یکدیگر نشان داد. نتایج تحقیق حاضر وقوع رانش ژنتیکی در جمعیت های توس ایران و خطر در معرض انقراض بودن این گونه را تایید می کند. که به‌کارگیری راهکاری سریع و مناسب برای حفاظت آن را تاکید می نماید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Genetic Diversity and Differentiation of the Iranian's Betula pendula Populations by DNA Polymorphisms of Three (CD, DT, K1K2) Chloroplast Genome Regions

چکیده [English]

Genetic diversity of Betula pendula, which is a medicinal value and endangered species, in small populations remaining in profile of northern Iran including: Marmishoo, Siahmarzkoh, Sangdeh and Shahrestanak, studied by polymorphisms of the three (3800, 1800, 2700 bp) regions of chloroplast DNA and PCR-RFLP technique. These regions named to CD, DT, K1K2, respectively. The percentage of polymorphic loci, expected heterozygosity (He) and Shannon’s information index (I) in four populations, calculated to 24.51%, 0.096 and 0.14, respectively. Analysis of molecular variance (AMOVA), revealed that 66% of total variation was found within populations, while only 34% among populations. Genetic differentiation index (Gst= 0.206) revealed a high differentiation of birch populations to each other. Pair-wise comparison of genetic differentiation showed that, Marmishoo's population by highest level of differentiation from other populations. Assessment of gene flow among populations indicate the occurrence of genetic drift between them (Nm= 0.96). In addition, Mantel test revealed a significant correlation (r=0.77) between genetic and geographical distances. Our results confirmed that the occurrence of genetic drift in birch populations, and the extinction risk of this species. Which emphasize to deployment fast and convenient strategy to it's protect.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Betula pendula
  • Genetic drift
  • Choloroplast DNA
  • Touch-down PCR

تنوع و تمایز ژنتیکی جمعیتهای توس (Betula pendula) ایران، با استفاده از چند شکلی DNA سه  ناحیه (CD، DT و K1K2) ژنوم کلروپلاستی

اباصلت حسین زاده کلاگر1*، فاطمه فلاح1 و حامد یوسف زاده2

1 بابلسر، دانشگاه مازندران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی

2 نور، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده منابع طبیعی، گروه جنگلداری 

تاریخ دریافت: 29/7/93                              تاریخ پذیرش: 6/10/93 

چکیده

تنوع ژنتیکی توس (Betula pendula)، که یک گونه ارزشمند دارویی و در معرض خطر انقراض است،  در سطح اندک جمعیتهای باقیمانده از آن در نیمرخ شمالی ایران شامل: مارمیشو، سیاه مرزکوه، سنگده و شهرستانک، با استفاده از پلی مورفیسم DNA کلروپلاستی سه منطقه 3800، 1800 و 2700 جفت بازی و تکنیک PCR-RFLP مطالعه شد. این مناطق به ترتیب CD ، DT و K1K2 نامیده می شوند. درصد جایگاه پلی مورفیک، هتروزیگوتی مورد انتظار (He) و شاخص شانون (I) در چهار جمعیت، به ترتیب برابر با 51/24 درصد، 096/0و 14/0 محاسبه شد. آنالیز واریانس مولکولی نیز نشان داد که 66 درصد از کل تنوع مربوط به درون جمعیتها و 34 درصد آن بین جمعیتی است. محاسبه شاخص تمایز ژنتیکی (206/0Gst =)، تمایز بالای جمعیتهای توس از یکدیگر را نشان داد. مقایسه دو به دو میزان تمایز ژنتیکی جمعیتها از یکدیگر نشان داد که جمعیت مارمیشو بیشترین تمایز را از سایر جمعیتها نشان داد. برآورد میزان جریان ژنی بین جمعیتها حاکی از وقوع رانش ژنتیکی بین آنها است (96/0=  (Nm. همچنین نتایج آزمون مانتل همبستگی معنی­داری (77 درصدr= ) را بین تمایز ژنتیکی جمعیت و فاصله جغرافیایی آنها از یکدیگر نشان داد. نتایج تحقیق حاضر وقوع رانش ژنتیکی در جمعیتهای توس ایران و خطر در معرض انقراض بودن این گونه را تأیید می کند. که به­کارگیری راهکاری سریع و مناسب برای حفاظت آن را تأکید می نماید.

واژه های کلیدی:  توس؛  Betula pendula؛ رانش ژنتیکی؛ DNA کلروپلاستی؛  Touch-down PCR

* نویسنده مسئول، تلفن: 01135302452 پست الکترونیکی: ahcolagar@umz.ac.ir

مقدمه

 

نوسانات شدید آب و هوایی مربوط به اواخر دوران سوم و چهارم زمین شناسی، به ویژه دوره چهارم یخبندان، تأثیر به سزایی در تغییر محدوده پراکنش و ساختار جمعیت گونه­های گیاهی داشت (20). این تغییرات آب و هوایی منجر به جدایی، مهاجرت، انقراض جمعیت و تسریع در میزان تکامل آنها شد (7 و13). علاوه بر این، ساختار ژنتیکی جمعیتهای گیاهی می تواند تحت تأثیر محدودیت جریان ژنی از طریق پراکندگی دانه و فعالیت گرده افشانها نیز قرار گیرد (19). درختان و درختچه­های جنس توس (Betula L. متعلق به اواخر دوران سوم زمین شناسی (22)، یکی از اجزای مهم اکولوژیکی و اقتصادی جنگلهای معتدله نیمکره شمالی محسوب می شوند. توس از جمله گونه­های پیشگام است که به دلیل تولید دانه فراوان و زایا به سرعت در مناطق تخریب شده از جمله مناطق قطع شده و آتش سوزی جایگزین می­شود (9). متأسفانه تراکم اندک و آسیب پذیری بالا سبب قرارگرفتن آن در لیست قرمز گیاهان در معرض خطر انقراض شد (11).

در ایران نیز پراکنش توس به چند ناحیه کوچک در نیمرخ شمالی کشور محدود شده است. لکه­های کوچک از این گونه در ارتفاعات بالای مرز جنگل، شامل ارتفاعات طالقان و دره غربی شهرستانک در کرج، دره لار در شهرستان آمل، رویشگاه سنگده در ساری، رویشگاه سیاه مرزکوه در علی آباد و شاهرود در استان سمنان گزارش شد (6). همچنین تنها یک رویشگاه از این گونه در زاگرس شمالی، منطقه مارمیشو در استان آذربایجان غربی گزارش شده است (2).

عدم آگاهی از تاریخچه زیستی و پراکنش لکه­ای و پراکنده رویشگاههای این گونه و کاهش جریان ژنی به دلیل فاصله زیاد جمعیتها از یکدیگر، میزان آسیب پذیری این گونه را نسبت به تخریب رویشگاه بیشتر نمود. بنابراین آگاهی از ساختار و میزان تنوع ژنتیکی جمعیتهای این گونه اهمیت ویژه ای در ارائه راهکار حفاظتی و مدیریتی مناسب دارد (4، 15 و21). در سالیان اخیر هم از ژنوم هسته ای و هم از ژنوم کلروپلاستی برای بررسی تنوع و ساختار ژنتیکی گونه های گیاهی استفاده فراوان شده است (3،17،23،27و32). اما با توجه به عدم وقوع نوترکیبی و توارث تک والدی ژنوم کلروپلاستی (وراثت مادری) و همچنین از آنجاییکه جریان ژنی در نهاندانگان بیشتر از طریق بذر صورت می گیرد تا از طریق دانه گرده، نشانگرهای کلروپلاستی عموماً سطوح بالاتری از تمایز ژنتیکی را نسبت به نشانگرهای هسته ای نشان می دهند (17و29). تاکنون مطالعات متعددی در مورد چند شکلی DNA کلروپلاستی در طیف وسیعی از گونه های درختی از جمله جنس توس گزارش شده است (22، 29 و37).

با توجه به پراکنش وسیع گونه­های توس در اروپا مطالعات زیادی هم در زمینه تنوع ژنتیکی و هم با رویکرد فیلوجغرافیایی صورت گرفت. یکی از این مطالعات به کارگیری تکنیک PCR-RFLP روی نواحی مختلف کلروپلاستی گونه  B. pendula Roth، در سرتاسر اروپا بود که در نهایت از بین 13 هاپلوتایپ شناسایی شده دو هاپلوتایپ در تمامی مناطق تحت مطالعه مشترک بودند. محققان به این نتیجه رسیدند که اروپا بعد از عصر یخبندان از دو مسیر، یک مسیر از غرب و مسیر دیگر از شرق اروپا مجدداً توسط گونه B. pendula Roth  مورد اشغال قرار گرفت. همچنین آنها دو جمعیت از گونه B. pendula، یکی در ایتالیا و دیگری در شبه جزیره ایبرین(Iberian) را به دلیل عدم وجود هاپلوتایپ عمومی A، جمعیتهای متمایزی از سایر جمعیتهای بررسی شده معرفی نمودند که دارای منشاء متفاوتی نیز بودند (29). همچنین در ادامه این مطالعات مالیوچنکو و همکاران در سال 2007 با استفاده از نشانگرهای کلروپلاستی و ریز­­ماهواره­ای ساختار ژنتیکی و فیلوجغرافیایی 53 جمعیت از دوگونه B. pendula و B. pubescens مورد مقایسه قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که این دو گونه علی­رغم دارا بودن هاپلوتایپ مشترک، ساختار ژنتیکی متفاوتی دارند که علت آن را به تفاوت شرایط اکولوژیکی بین دو گونه مرتبط دانستند (25). در چین نیز تنوع ژنتیکی چهار جمعیت از گونهB. luminifera ، در کوههای ویای (Wuyi) مورد بررسی قرار گرفت که تجزیه واریانس مولکولی حاکی از بالا بودن سطح تنوع ژنتیکی بین جمعیتها بود. همچنین ضریب همبستگی پیرسون نشان داد که تنوع ژنتیکی در داخل جمعیتها همبستگی معنی­داری با ارتفاع از سطح دریا و عوامل آب و هوایی از جمله؛ متوسط درجه حرارت سالانه، میزان بارش و عوامل مغذی خاک دارد (41). محققان DNA کلروپلاستی گونه B. maximowicziana واقع در محدوده مرکزی ژاپن را با تکنیک PCR-RFLP مورد بررسی قرار دادند و 11 هاپلوتایپ شناسایی کردند که مرز اصلی دو هاپلوتایپ اصلی (شمالی و جنوبی) از این گونه در منطقه توهوکو در شمال شرقی ژاپن واقع شده بود. آنها تنوع ژنتیکی بالایی را میان 25 جمعیت مورد مطالعه شناسایی و در نهایت با مقایسه الگوی ساختار ژنتیکی به دست آمده از ژنوم کلروپلاستی و هسته­ای به این نتیجه رسیدند که ژنوم هسته­ای منتقل شده از طریق دانه گرده از هاپلوتایپ شمالی به جنوبی بسیار بیشتر از انتقال آنها در جهت مخالف است (37).

بنابراین با توجه به اینکه تا کنون هیچ گونه مطالعه­ای با رویکرد مولکولی مبتنی بر DNA کلروپلاستی در زمینه تنوع ژنتیکی گونه­های توس در ایران گزارش نشد، تحقیق حاضر در نظر دارد تا با استفاده از تکنیک PCR-RFLP نواحی مختلف کلروپلاستی، میزان تنوع ژنتیکی در سطح جمعیتهای توس در ایران و همچنین میزان تمایز آنها را از یکدیگر جهت تعیین میزان ضرورت اتخاذ تدابیر حفاظتی برای رویشگاههای این گونه را مورد بررسی قرار دهد.

مواد وروشها

نمونه برداری: برای انجام این تحقیق چهار رویشگاه طبیعی این گونه در ایران انتخاب شدند (جدول1). از هر رویشگاه حداقل 6 درخت و با فاصله حداقل 100 متر (در صورت امکان) از یکدیگر به روش Miles و همکاران انتخاب و نمونه های برگ آنها تهیه شد (26).

 

 

جدول 1- اطلاعات مربوط به رویشگاههای مورد بررسی

منطقه

استان

ارتفاع از سطح دریا (متر)

طول جغرافیایی (شرقی)

 

عرض جغرافیایی (شمالی)

سیاه­مرز­کوه

گلستان

2344

55°10′

36°38′

سنگده

مازندران

1600

53°10′

36°58′

شهرستانک

البرز

2404

51°23′

35°44′

مارمیشو

آذربایجان غربی

1741

44°35′

37°34′


استخراج DNA، تکثیر نواحی کلروپلاستی: استخراج کل DNA ژنومی از برگ توس، با استفاده از روش CTAB و به کارگیری غلظت نمکی بالا (به منظور حذف پلی ساکاریدها) صورت گرفت (34). سه قطعه ژنی trnC-trnD، trnD-trnT و trnK2- trnK1 (شکل1-A) با استفاده از پرایمرهای عمومی کلروپلاستی (شکل1- B) و از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز (شکل1- C) تکثیر شدند (8 و12).

بهینه سازی واکنش زنجیره ای پلیمراز: قطعاتCD ، DT و K1K2 در حجم نهایی 25 میکرولیتر در شرایط بافری 1X PCR، 2میلی مولارکلرید منیزیم، 2/0 میکرومولار dNTP، در غلظت نهایی1/0 میلی­گرم از آلبومین سرم گاوی یا همان BSA (Bovine serum albumin)، 2/0 میکرومولار از هر آغازگر و 25/0 واحد آنزیم DNA پلی مراز  Taqتکثیر شد. سپس هر ناحیه به روش Touch-down تکثیر شدند، این روش با هدف افزایش اختصاصیت، حساسیت و محصول PCR بدون نیاز به بهینه سازی طولانی و طراحی مجدد پرایمر به ویژه برای نمونه هایی که تکثیر آنها مشکل است، صورت می گیرد (30).

برای تکثیر ناحیه CD، ازPCR  Touch-downدر شرایط دمایی واسرشت سازی اولیه 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه در دو مرحله؛ مرحله اول با 14 چرخه (94 درجه سانتی گراد به مدت 45ثانیه، 50-57 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه که در هر چرخه به اندازه نیم درجه تا رسیدن به دمای 50 درجه سانتی گراد کاهش می یابد، 70 درجه سانتی گراد به مدت سه دقیقه) و مرحله دوم با 18 چرخه (94 درجه سانتی گراد به مدت 45ثانیه، 50 درجه سانتی گراد به مدت 45ثانیه، 70 درجه به مدت سه دقیقه) و در پایان فرآورده­های تکثیر به منظور بسط نهایی در 70 درجه سانتی گراد به مدت سه دقیقه نگهداری شدند.

برای تکثیر ناحیه K1K2، از PCR  Touch-down در شرایط دمایی واسرشت سازی اولیه 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه در دو مرحله؛ مرحله اول با 14 چرخه (45 ثانیه در 94 درجه، 45 ثانیه در 60 درجه که در هر چرخه به اندازه نیم درجه تا رسیدن به دمای 53 درجه کاهش می یابد.سه دقیقه در 72 درجه) و مرحله دوم با 14 چرخه (45 ثانیه در 94 درجه، 45 ثانیه در 53 درجه، سه دقیقه در 72 درجه) و در پایان فرآورده­های تکثیر 10 دقیقه در 72 درجه به منظور تکمیل سنتز نگهداری شدند.

برای تکثیر ناحیه DT، از PCR  Touch-down در شرایط دمایی واسرشت سازی اولیه 94 درجه به مدت 4 دقیقه در دو مرحله؛ مرحله اول با 20 چرخه (45 ثانیه در 94 درجه ، 45 ثانیه در 53 درجه که در هر چرخه به اندازه نیم درجه تا رسیدن به دمای 43 درجه کاهش می یابد. سه دقیقه در 68 درجه)و مرحله دوم با 20 چرخه (45 ثانیه در 94 درجه ، 45 ثانیه در 43 درجه، سه دقیقه در 68 درجه) و در پایان فرآورده­های تکثیر به منظور بسط نهایی 10 دقیقه در 68 درجه نگهداری شدند.

هضم آنزیمی محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز: تمامی نواحی تکثیر یافته به جز ناحیه  CD(که فقط با HinfI، برش زده شد) با سه آنزیم برشگر HinfTaqEcoRI،برش زده شدند. مقدار 9 میکرولیتر (تقریبا 100 نانو گرم) از قطعات تکثیر شده CD،  DTو K1K2، با 3 واحد آنزیمهای HinfI  و TaqI و EcoRI در حجم نهایی 15 میکرولیتر به مدت 16ساعت به ترتیب در دمای اپتیمم 37، 65 و 37 درجه سانتی گراد، انکوبه شدند. محصول نهایی به وسیله الکتروفورز پلی اکریل آمید 8 درصد جداسازی شدند (شکل 2). کلیه واکنش گرهای PCR و RFLP از شرکت سیناژن (ایران) تهیه گردید.

 

 

شکل1- شماتیک قطعات ژنی تکثیر شده موقعیت و توالی پرایمری و محصولات PCR در ژل آگارز: شماتیک قطعات ژنی تکثیر شده کلروپلاستی (A)؛  نام و توالی پرایمری(B)؛ محصولات PCR در ژل آگارز 1 درصد

 

شکل 2- الکتروفورز محصولات PCR-RFLP منطقه DT برش زده با سه آنزیم HinfTaqEcoRI در ژل پلی آکریلامید با رنگ آمیزی نیترات نقره آمونیاکی: نمونه های شماره 1تا4 از (منطقه سیاه مرزکوه)، 5تا8 (سنگده)، 9تا 12 (شهرستانک)، 13تا 15 (شهرستانک) جمع آوری شد؛ M نمایانگر مارکر DNA


تجزیه و تحلیل: به منظور بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت توس در ایران ضرایب ژنتیکی مختلف از جمله درصد باند چند شکل (P)، شاخص شانون (I)، تعداد آلل مشاهده شده(Na)  و تعداد آلل مؤثر(Ne) با استفاده از نرم افزار Popgene v1.32 محاسبه شد (28و42). برآورد تمایز ژنتیکی (Gst یا Fst) با استفاده از فرمول Gst = (HT-HS)/HT انجام شد. همچنین میزان جریان ژنی (Nm) بین جمعیتهای توس با استفاده از فرمول  Nm={(1/Fst) -1)}/ 4 محاسبه شد (39). آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA)، به منظور برآورد تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتی با استفاده از نرم افزار GenAlEx v6.5 مورد ارزیابی قرار گرفت (31). معنی داری همبستگی بین تمایز ژنتیکی و فاصله جغرافیایی با استفاده از آزمون مانتل و نمایش فضایی فاصله ژنتیکی بین افراد و میزان تمایز افراد هر جمعیت از یکدیگر با استفاده از آزمون تجزیه به مؤلفه های هماهنگ اصلی (PCoA) انجام شد.

نتایج

نواحی CD، K1K وDT ژنوم کلروپلاستی با استفاده از برنامه Touch-down PCR تکثیر شدند به طوری که اندازه تقریبی این مناطق به ترتیب3800 ،2700 و1800جفت باز در الکتروفورز ژل آگارز را نشان داد (شکل1-C). هر سه ناحیه برش یافته با سه آنزیم محدودکننده HinfTaqEcoRI، قطعات پلی مورفیک نشان دادند. به عنوان نمونه، الگوی هضم آنزیمی ناحیه DT با سه آنزیم برشگر HinfTaqEcoRI روی ژل پلی­آکریل­آمید نشان داده شد(شکل2). تعداد کل باندهای RFLP و طول قطعات پلی مورفیک هر ناحیه نیز به طور جداگانه گزارش شد(جدول2).

 

جدول 2-  قطعات تکثیر شده CD، K1K، DT، آنزیمهای برشگر، طول قطعات پلی مورفیک در RFLP و نوع متغیرهای مشاهده شده

نام واندازه تقریبی فرآورده PCR

  آنزیم برشگر

تعداد کل باند RFLP

اندازه باندهای پلی مورفیک  (جفت باز)

نوع جهش هرمتغیر

 CD(3800 جفت باز)

HinfI

14

800؛ 420؛ 400؛ 120؛ 100؛ 75؛ 74

حذف / اضافه

K1K2 (2700 جفت باز)

HinfI

8

130؛ 220

حذف / اضافه

TaqI

9

450؛ 480

حذف / اضافه

EcoRI

4

230

حذف / اضافه

DT (1800 جفت باز)

HinfI

7

120

حذف / اضافه

TaqI

4

250

حذف / اضافه

EcoRI

4

200؛ 800

حذف / اضافه

 

نتایج تجزیه و تحلیل حاصل از پارامترهای مختلف ژنتیکی که به تفکیک هر جمعیت آورده شد(جدول3)، نشان داد که جمعیت سنگده با 18/41 و جمعیت مارمیشو با 88/5 درصد به ترتیب دارای بیشترین و کمترین درصد جایگاه پلی مورفیک بودند. بیشترین و کمترین میزان تنوع شانون و هتروزیگوسیتی نیز به ترتیب در جمعیت سنگده و مارمیشو مشاهده شد.

آنالیز واریانس مولکولی نشان داد تنوع درون جمعیتها سهم قابل توجه ای از میزان کل تنوع را به خود اختصاص داده است به طوری که 66 درصد از کل تنوع، درون جمعیتی و34 درصد بین جمعیتی بود (جدول4).

شاخص تنوع ژنتیکی، تنوع ژنتیکی  Neiبه تفکیک هر جمعیت و نیز تنوع و تمایز کل جمعیتهای مورد مطالعه در جدول های 5 و 6 آورده شد.

مقایسه دو به دو میزان تمایز ژنتیکی جمعیتها از یکدیگر نشان داد که جمعیت مارمیشو واقع در حد غربی شمال ایران در منطقه زاگرس شمالی بیشترین تمایز از سایر جمعیتها را دارد (جدول6). تجزیه وتحلیل (PCoA) نیز، تمایز بالای جمعیت مارمیشو را از سایر جمعیتها به­ویژه جمعیت سیاه مرزکوه و سنگده را تأیید می نماید (شکل 3). نتایج آزمون مانتل همبستگی معنی داری (77%r=) را بین تمایز ژنتیکی جمعیت و فاصله جغرافیایی آنها از یکدیگر نشان داد، طوری که جمعیتهای دورتر از هم تمایز ژنتیکی بیشتری  از همدیگر نشان دادند.

 

 

 

جدول 3- پارمترهای ژنتیکی بررسی شده بین جمعیتهای مورد مطالعه

جمعیت

تعداد اللهای متفاوت (Na)

تعداداللهای مؤثر

(Ne)

شاخص شانون

 (I)

هتروزیگوتی مورد انتظار(He)

درصدجایگاه پلی مورفیک (%P)

سیاه­مرزکوه

07/0±157/1

05/0±173/1

03/0±149/0

02/0±102/0

53/23%

سنگده

07/0±373/1

06/0±343/1

04/0±259/0

03/0±182/0

18/41%

شهرستانک

07/0±216/1

04/0±149/1

03/0±136/0

02/0±089/0

45/27%

مارمیشو

06/0±863/0

008/0±014/1

01/0±020/0

006/0±011/0

88/5%

کل

04/0±152/1

02/0±170/1

01/0±141/0

01/0±096/0

51/24%

 

جدول4 - آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) درون و بین جمعیت  گونه  Betula pendula

منبع تغییرات

درجه آزادی

مجموع مربعات

میانگین مربعات

درصد فراوانی

احتمال

بین جمعیت

3

997/31

666/10

34%

010/0

درون جمعیت

18

867/50

826/2

66%

کل

21

864/82

 

100%

 

جدول5- میزان شاخص تنوع ژنتیکی و تمایز ژنتیکی به تفکیک هر جمعیت و کل جمعیت

 جمعیت

تنوع ژنتیکی در هر جمعیت

تنوع ژنتیکی Nei(H)     

تنوع­ژنتیکی کلی (Ht)

تمایز­ژنتیکی نسبی(Fst)

سیاه­مرزکوه

208/0

094/0

251/0

170/0

سنگده

200/0

181/0

245/0

183/0

شهرستانک

194/0

089/0

240/0

191/0

مارمیشو

140/0

011/0

200/0

299/0

کل

743/0

374/0

936/0

206/0

 

جدول6- میزان تمایز ژنتیکی جمعیتهای مورد مطالعه از یکدیگر بر اساس شاخص Nei

 

سیاه مرزکوه

سنگده

شهرستانک

مارمیشو

سیاه مرزکوه

0

 

 

 

سنگده

023/0

0

 

 

شهرستانک

025/0

027/0

0

 

مارمیشو

042/0

045/0

047/0

0


 

شکل 3- نمودار دو بعدی (PCoA) حاصل از داده های PCR-RFLP جمعیتهای توس B. pendula

بحث

یکی از مهم ترین راههای حفاظت و مدیریت گونه­های گیاهی در معرض خطر انقراض، آگاهی از ساختار ژنتیکی و میزان تنوع آنها می باشد (4و21). در این پژوهش مشخص شد که سطح تنوع ژنتیکی در جمعیتهای توس ایران (9/0=ht) نسبت به جمعیتهای توس در اروپا از میزان بالاتری برخوردار است (25و29). که البته این میزان برای گونه های درختی دیر زی با سیستم تولید مثلی دگرلقاحی و باد گرده افشان قابل انتظار است (15و36). برای طیف گسترده­ای از گونه­های گیاهی خصوصیات تاریخچه زندگی از جمله سیستم لقاحی، سیستم پرورشی، مکانیسم پراکنش، محدوده جغرافیایی (به عنوان یک عامل مهم در اکوسیستم جنگل) نقش مهمی را در الگوی تنوع ژنتیکی آنها بازی می کنند (15). به­طور کلی قابل انتظار است که گونه­هایی با پراکنش جغرافیایی محدود به مراتب از تنوع ژنتیکی کمتری در مقایسه با گونه­های با پراکنش وسیع برخوردار باشند (24، 38 و43). اما بر خلاف انتظار میزان تنوع ژنتیکی در جمعیتهای کوچک و جدا افتاده توس ایران بالا است. این موضوع علی رغم تخریب رویشگاههای توس ایران و شرایط سخت رویشگاهی آن تعجب بر انگیز است. مشابه این تحقیق برای گونه های  Betula humilis، Prunus spinosa و Nouelia insignis نیز گزارش شده (22، 24 و 43) و دلیل آن را کاهش اندازه جمعیت (به ویژه کاهش یک یا دونسل برای گونه های نزدیک) اصلی دانستند که به تازگی رخ داده است. در چنین حالتی تنوع ژنتیکی بین افراد باقیمانده به شدت تحت تأثیر جمعیت بزرگتری که از قبل وجود داشتند می باشند (24، 35 و 43). همچنین اختلاف شرایط محیطی نیز می تواند در میزان تنوع ژنتیکی مؤثر باشد به گونه­ای که جنگلهای صخره­ای سنگده و سیاه مرزکوه به دلیل برخورداری از شرایط طبیعی و جغرافیایی مناسب از جمله بارندگی و حرارت مناسب، نزدیکی به دریا، وجود کوهها و دامنه­های متعدد با اختلاف ارتفاع شدید توانسته زیستگاه مناسبی برای اجتماعات توس و بسیاری از گونه های گیاهی باشند (1)، که بیشترین تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص می دهند.

بررسی میزان تمایز ژنتیکی بین جمعیتهای توس ایران حاکی از تمایز ژنتیکی بالای (206/0Gst=) جمعیتهای توس ایران است. در واقع اگر میزان Gst بین محدوده 05/0-0 باشد نشان­دهنده تمایز ژنتیکی کم و اگر بین 15/0-05/0 باشد نمایانگر تمایز ژنتیکی متوسط و در نهایت اگر بین 25/0-15/0 باشد نشان­دهنده تمایز ژنتیکی بسیار بالاست (5، 16 و 40).

گونه های گیاهی از دو طریق مهاجرت دانه گرده و انتقال بذر به جمعیتهای مجاور با یکدیگر جریان ژنی برقرار می کنند. در واقع این دو مکانیسم بر میزان تنوع و تمایز ژنتیکی جمعیتها گیاهی تأثیر به سزایی دارند (33). در این تحقیق میزان جریان ژنی بین جمعیتهای توس ایران پایین بود (96/0Nm =). این مسئله را می توان ناشی از شرایط رویشگاهی و فاصله زیاد جمعیتهای توس ایران از یکدیگر دانست به­طوری که 4 رویشگاه مورد بررسی در مناطق کوهستانی و صخره ای و با شیب بسیار تند عموما بالای مرز جنگل حضور دارند. در واقع محدودیت جریان ژنی از هر دو طریق بذر و دانه گرده در جمعیتهای پراکنده منجر به تمایز ژنتیکی بالا در جمعیتهای توس در ایران شده است. از طرف دیگر میزان جریان ژنی کمتر از یک بین جمعیتهای گیاهی بیانگر وقوع پدیده رانش ژنتیکی است که خود می تواند سبب افزایش تنوع ژنتیکی درون جمعیتی باشد(10). همچنین نتایج آزمون آنالیز واریانس مولکولی حاکی از سهم بالای تنوع در درون جمعیتها (66 درصد) در مقایسه با تنوع بین جمعیتها (34 درصد) است.

توس از جمله گونه هایی است که در عصر یخبندان از عرضهای جغرافیایی بالا به سمت عرضهای جغرافیایی پایین مهاجرت نموده است. سپس بعد از عصر یخبندان با گرم شدن تدریجی هوا، به دلیل کاهش رقابت با سایر گونه ها مجدد به عرضهای جغرافیایی بالا مهاجرت نمودند. اما در برخی از مناطق از جمله مناطق کوهستانی شمال ایران که شرایط رویشگاهی سخت است و امکان حضور سایر گونه ها چندان فراهم نیست همچنان به حضور خود ادامه دادند. یکی از مشخصه های اصلی جمعیتهای به جا مانده از عصر یخبندان (پناهگاهها) وجود تنوع درون جمعیتی بالا به همراه تمایز ژنتیکی بالا از جمعیتهای مجاور است (14، 18). بنابراین با توجه به اینکه چنین شرایطی بین اندک جمعیتهای توس در ایران نیز برقرار است محتمل است جمعیتهای کنونی باقیمانده جمعیت بزرگی باشد که در عصر پس از یخبندان مجدد به سمت عرضهای جغرافیایی بالا مهاجرت نمودند.

نتیجه گیری نهایی

گونه Betula pendula  یکی از گونه های با ارزش دارویی و در معرض خطر انقراض است که ارائه راهکار مدیریتی مناسب برای حفاظت و بهره برداری از آن مستلزم آگاهی از سطح و میزان تنوع ژنتیکی در سطح جمعیتهای آن است. در این تحقیق علاوه بر تمایز  ژنتیکی بالا بین جمعیتها، بر خلاف انتظار، تنوع درون جمعیتی نیز در سطح هر جمعیت بالا بود. این موضوع که مشخصه مناطق پناهگاه (Refuge) در عصر یخبندان است فرضیه قدمت طبیعی بالای رویشگاههای توس ایران را تقویت می نماید. همچنین در این تحقیق مشخص شد که عملاً امکان تبادل ژنی بین جمعیتهای توس ایران وجود ندارد. از آنجایی که میزان بالای تمایز درون جمعیتی و جریان ژنی کم، خطر واگرایی جمعیتها را به دنبال دارد و با توجه به اینکه اندازه جمعیت در جمعیتهای توس ایران عموماً کمتر از استاندارد حداقل اندازه جمعیت مؤثر تخمین زده شده برای اغلب گیاهان است، بنابراین تعداد و اندازه جمعیتهای توس ایران حفظ تنوع ژنتیکی باقی مانده را تضمین نمی کند و اقدامات حفاظتی باید درجهت ایجاد تعداد زیاد نهال، به کارگیری افراد مختلف به عنوان والدین به منظور حفظ همان اندازه تنوع ژنتیکی موجود، در نسلهای بعدی صورت گیرد. نتایج تحقیق حاضر ضمن تأیید وقوع رانش ژنتیکی در جمعیتهای توس ایران، خطر در معرض انقراض بودن این گونه ارزشمند دارویی تأیید و به­کارگیری راهکاری سریع و مناسب برای حفاظت از آن را تأکید می نماید.

1. اکبری، م.، زارع، ح.، حسینی، م،. اجتهادی، ح. 1383. بررسی فلور، ساختار رویشی و کورولوژی عناصر گیاهی اجتماعات توس در سنگده ساری. پژوهش و سازندگی. (64)96 -84.

2. ثابتی، ح،. 1381. جنگل­ها، درختان و درختچه­های ایران، دانشگاه یزد.

3. صالحی شانجانی، پ.، 1381. مطالعه فیلوجغرافیایی DNA کلروپلاستی راش. مجله زیست شناسی ایران 17: 117

4. اشرفی جعفری، ع.، صالحی شانجانی، پ.، کوهی، ل.، بخشی خانیکی، غ.، 1392. بررسی تنوع ژنتیکی و رابطه جغرافیایی میان 11 جمعیت وحشی Dactylis glomerata توسط پروتئینهای کل. مجله زیست شناسی ایران 26: 278

 

5. Balloux, F., & Lugon-Moulin, N., 2002.  The estimation of population differentiation with microsatellite markers. Molecular Ecology. 11: 155-165.

6. Browicz, K.,  1972 Betulaceae in KH Rechinger (ed.) Flora Iranica no. 96.

7. Comes, H. P., & Kadereit, J. W., 1998. The effect of Quaternary climatic changes on plant distribution and evolution. Trends in Plant Science. 3: 432-438.

8. Demesure B, Sodzi N, Petit RJ., 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology. 4: 129-131

9. Fischer, A., Lindner, M., Abs, C., & Lasch, P., 2002. Vegetation dynamics in central European forest ecosystems (near-natural as well as managed) after storm events. Folia Geobotanica. 37: 17-32.

10. Fischer, M., Husi, R., Prati, D., Peintinger, M., van Kleunen, M., & Schmid, B., 2000. RAPD variation among and within small and large populations of the rare clonal plant Ranunculus reptans (Ranunculaceae). American Journal of Botany. 87: 1128-1137.

11. Gardenfors, U., Hilton-Taylor, C., Mace, G. M., & Rodriguez, J. P., 2001. The application of IUCN Red List criteria at regional levels. Conservation Biology. 15: 1206-1212.

12. Grivet, D., Heinze, B., Vendramin, G. G., & Petit, R. J., 2001. Genome walking with consensus primers: application to the large single copy region of chloroplast DNA. Molecular Ecology Notes. 1: 345-349.

13. Hampe, A., Arroyo, J., Jordano, P., & Petit, R. J., 2003. Rangewide phylogeography of a bird dispersed Eurasian shrub: contrasting Mediterranean and temperate glacial refugia. Molecular Ecology. 12: 3415-3426.

14. Hampe, A., & Petit, R. J., 2005. Conserving biodiversity under climate change: the rear edge matters. Ecology Letters. 8: 461-467.

15. Hamrick, J. L., Godt, M. J. W., & Sherman-Broyles, S. L., 1992. Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species. In Population genetics of forest trees (pp. 95-124). Springer Netherlands

16. Hartl, D. L., & Clark, A. G., 1997.  Principles of population genetics (Vol. 116). Sunderland: Sinauer associates.

17. Heuertz, M., Hausman, J. F., Hardy, O. J., Vendramin, G. G., Frascaria-Lacoste, N., & Vekemans, X., 2004.  Nuclear microsatellites reveal contrasting patterns of genetic structure between western and southeastern European populations of the common ash (Fraxinus excelsior L.). Evolution. 58: 976-988.

18. Hewitt, G. M., 1996. Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and speciation. Biological Journal of the Linnean Society. 58: 247-276.

19. Hewitt, G. M., 2000. The genetic legacy of the Quaternary ice ages. Nature. 405: 907-913.

20. Hewitt, G.M., 2004. Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359: 183–195.

21. Holsinger, K. E., & Gottlieb, L. D., 1991. Conservation of rare and endangered plants: principles and prospects. Genetics and Conservation of Rare Plants. 195- 208.

22. Jadwiszczak, K. A., Banaszek, A., Jabłonska, E., & Sozinov, O. V.,  2012.  Chloroplast DNA variation of Betula humilis Schrk. in Poland and Belarus. Tree Genetics & Genomes. 8: 1017-1030.

23. Jarvinen, P., Palme, A., Morales, L. O., Lannenpaa, M., Keinanen, M., Sopanen, T., & Lascoux, M., 2004. Phylogenetic relationships of Betula species (Betulaceae) based on nuclear ADH and chloroplast matK sequences. American Journal of Botany. 91: 1834-1845.

24. Luan, S., Chiang, T. Y., & Gong, X., 2006. High genetic diversity vs. low genetic differentiation in Nouelia insignis (Asteraceae), a narrowly distributed and endemic species in China, revealed by ISSR fingerprinting. Annals of Botany. 98: 583-589.

25. Maliouchenko, O., Palme, A. E., Buonamici, A., Vendramin, G. G., & Lascoux, M., 2007. Comparative phylogeography and population structure of European Betula species, with particular focus on B. pendula and B. pubescens. Journal of Biogeography. 34: 1601-1610.

26. Miles, T. R., Miles Jr, T. R., Baxter, L. L., Bryers, R. W., Jenkins, B. M., & Oden, L. L., 1995. Alkali deposits found in biomass power plants: A preliminary Investigation of Their Extent and Nature. 1: 433-8142.

27. Nagamitsu, T., Kawahara, T., & Kanazashi, A., 2006.  Endemic dwarf birch Betula apoiensis (Betulaceae) is a hybrid that originated from Betula ermanii and Betula ovalifolia. Plant Species Biology. 21: 19-29.

28. Nei, M., 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 70: 3321-3323.

29. Palme, A. E., Su, Q., Rautenberg, A., Manni, F., & Lascoux, M., 2003.  Postglacial recolonization and cpDNA variation of silver birch, Betula pendula. Molecular Ecology. 12: 201-212.

30. Palme, A.E., Vendramin, G.G., 2002.  Chloroplast DNA variation, postglacial recolonisation and hybridisation in hazel, Corylus avellana. Molecular Ecology. 11:1769-1780.

31. Peakall, R., & Smouse, P. E., 2012. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research an update. Bioinformatics. 28: 2537-2539.

32. Petit, R. J., Kremer, A., & Wagner, D. B., 1993. Geographic structure of chloroplast DNA polymorphisms in European oaks. Theoretical and Applied Genetics. 87: 122-128.

33. Pfeifer, M., & Jetschke, G., 2006. Influence of geographical isolation on genetic diversity of Himantoglossum hircinum (Orchidaceae). Folia Geobotanica. 41: 3-20.

34. Porebski, S., Bailey, L. G., & Baum, B. R., 1997. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant molecular biology reporter. 15: 8-15.

35. Qiao, Q., Zhang, C. Q., & Milne, R. I.,  2010. Population genetics and breeding system of Tupistra pingbianensis (Liliaceae), a naturally rare plant endemic to SW China. Journal of Systematics and Evolution. 48: 47-57.

36. Rusanen, M., Vakkari, P., & Blom, A.,  2003. Genetic structure of Acer platanoides and Betula pendula in northern Europe. Canadian Journal of Forest Research. 33: 1110-1115.

37. Tsuda, Y., & Ide, Y., 2010.  Chloroplast DNA phylogeography of Betula maximowicziana, a long lived pioneer tree species and noble hardwood in Japan. Journal of Plant Research. 123: 343-353.

38.  Wang, X. M., Hou, X. Q., Zhang, Y. Q., Yang, R., Feng, S. F., Li, Y., & Ren, Y., 2012.  Genetic diversity of the endemic and medicinally important plant Rheum officinale as revealed by inter-simpe sequence repeat (ISSR) markers. International Journal of Molecular Sciences. 13: 3900-3915.

39. Wright, S., 1949 The genetical structure of populations. Annals of eugenics. 15: 323-354.

40. Wright, S., 1978 Evolution and the genetics of populations. Variability within and among natural populations. Vol. 4. University of Chicago press, Chicago, IL, USA.

41.  Xie, Y., Li, Z., Huang, R., Xiao, X., & Huang, Y., 2009.  Genetic diversity of Betula luminifera populations at different elevations in Wuyi Mountain and its association with ecological factors. Frontiers of Forestry in China. 4: 90-95.

42. Yeh, F. C., Yang, R. C., Boyle, T., Ye, Z. H., & Mao, J. X., 1999.  POPGENE, version 1.32: the user friendly software for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Edmonton, AB, Canada.

43.  Zhao, X., Ma, Y., Sun, W., Wen, X., & Milne, R., 2012.  High genetic diversity and low differentiation of Michelia coriacea (Magnoliaceae), a critically endangered endemic in southeast Yunnan, China. International Journal of Molecular Sciences. 13: 4396-4411.