نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 پژوهشگاه رویان

2 دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرکان

3 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک

چکیده

سیستم بیانی باکتری توانایی تولید مقادیر بالایی از پروتئین های نوترکیب را داراست، اما ممکن است پروتئین های تولید شده تاشدگی ساختاری مناسبی نداشته و فاقد اصلاحات پس از ترجمه ای باشند. از طرف دیگر سلول های پستانداران اگرچه انتخاب مناسبی برای تولید پروتئین نوترکیب محسوب می شوند اما هزینه های بالای تولید و میزان کم محصول نوترکیب در این سیستم ها، محققان را به سمت مطالعه بر روی سیستم بیانی مخمری سوق داده است. مخمرها به دلیل داشتن ویژگی های بیشمار ازجمله دستکاری ژنتیکی آسان، میزان بالای بیان پروتئین های برون سلولی و درون سلولی، و توانایی انجام اصلاحات پس از ترجمه ای متناسب با سلول های یوکاریوتی، برای بیان پروتئین های خارجی مناسب هستند. مخمر متانول دوست پیکیا پاستوریس برای تولید پروتئین های نوترکیب در تراکم سلولی بالا و محیط کشت ارزان، توسعه یافته است. ترشح مقادیر کمی از پروتئین های درونی مخمر در محیط کشت، باعث خالص سازی آسان پروتئین های نوترکیب از آن می شود. به هرحال، سویه های گلایکوسویچ مخمر پیکیا پاستوریس با قابلیت انجام اصلاحات پس ترجمه ای یکسان با سیستم بیانی یوکاریوتی، تنها نقص سیستم های بیانی مخمر را رفع کرده است. بر این اساس، پیکیا پاستوریس نسبت به سایر میزبان ها، سیستم ترشحی مناسبی برای دستیابی به مقادیر بالاتری از پروتئین های نوترکیب با ساختار درست بشمار می رود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Pichia pastoris yeast: an appropriate experimental tool for recombinant proteins production

نویسندگان [English]

  • Zahra Elyasi Gorji 1
  • Amir Amiri Yekta 1
  • Saeed Hassani 2
  • mohammad hossein Sanati 3

چکیده [English]

The bacterial expression system has the ability to produce high amounts of recombinant proteins, but the produced proteins might not have suitable structure folding and post-translational modifications. In the other hand, the mammalian cell expression system also provides the suitable form for protein production; however the higher costs and generally low production yielding for this expression system made the researchers to have tendency to study on the yeast expression system. Yeasts are particularly suited to expression of foreign proteins for numerous features, including easy genetic manipulation, high levels of intracellularly or extracellularly protein expression, and the ability to carry out higher eukaryotic protein modifications. The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been developed for the production of various recombinant proteins and growth into high cell densities in an inexpensive medium. Secretion of low amounts of yeast endogenous proteins in cell culture media makes the simple purification of expressed recombinant proteins. However, the Pichia pastoris Glyco-switch strains with the ability to produce eukaryotic glycoproteins with the same post-translational modifications fixed the only deficiency in yeast expression system. Accordingly, Pichia pastoris is an appropriate secretory system for obtaining larger quantities of correct products, in compare to other host cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Pichia pastoris
  • Recombinant protein
  • Genetic engineering

مخمر پیکیا­پاستوریس: ابزار آزمایشگاهی مناسب برای تولید پروتئینهای نوترکیب 

زهرا الیاسی گرجی1،2، امیر امیری یکتا1، سعید حسنی2، محمدحسین صنعتی1،3* 

1 تهران، پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولید مثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه ژنتیک

2 گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده علوم دامی 

3 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فنآوری، پژوهشکده زیست فنآوری پزشکی، گروه ژنتیک پزشکی 

تاریخ دریافت: 17/11/92             تاریخ پذیرش: 26/9/93

چکیده 

سیستم بیانی باکتری توانایی تولید مقادیر بالایی از پروتئینهای نوترکیب را داراست، اما ممکن است پروتئینهای تولید شده تاشدگی ساختاری مناسبی نداشته و فاقد اصلاحات پس از ترجمه­ای باشند. از طرف دیگر سلولهای پستانداران اگرچه انتخاب مناسبی برای تولید پروتئین نوترکیب محسوب می­شوند اما هزینه­های بالای تولید و میزان کم محصول نوترکیب در این سیستمها، محققان را به سمت مطالعه بر روی سیستم بیانی مخمری سوق داده است. مخمرها به دلیل داشتن ویژگیهای بیشمار از جمله دستکاری ژنتیکی آسان، میزان بالای بیان پروتئینهای برون سلولی و درون سلولی، و توانایی انجام اصلاحات پس از ترجمه­ای متناسب با سلولهای یوکاریوتی، برای بیان پروتئینهای خارجی مناسب هستند. مخمر متانول دوست پیکیا­پاستوریس برای تولید پروتئینهای نوترکیب در تراکم سلولی بالا و محیط کشت ارزان، توسعه یافته است. ترشح مقادیر کمی از پروتئینهای درونی مخمر در محیط کشت، باعث خالص سازی آسان پروتئینهای نوترکیب از آن می­شود. به هر حال، سویه­های گلایکوسویچ مخمر پیکیا­پاستوریس با قابلیت انجام اصلاحات پس ترجمه­ای یکسان با سیستم بیانی یوکاریوتی، تنها نقص سیستمهای بیانی مخمر را رفع کرده است. بر این اساس، پیکیا­پاستوریس نسبت به سایر میزبانها، سیستم ترشحی مناسبی برای دستیابی به مقادیر بالاتری از پروتئینهای نوترکیب با ساختار درست بشمار می­رود.

واژه های کلیدی: پیکیا­پاستوریس، پروتئین نوترکیب، مهندسی ژنتیک

* نویسنده مسئول، تلفن: 23562720-021، پست الکترونیکی: m-sanati@nigeb.ac.ir

مقدمه


تاریخچه کاربرد مخمر در عرصه زیست فنآوری: در اوایل سال 1960 انسولین انسانی به عنوان اولین داروی نوترکیب در باکتری تولید شد به طوری که امروزه این فرآورده نوترکیب برای بسیاری از بیمارانی که از دیابت رنج می­برند استفاده می­شود. پس از آن چندین پروتئین دیگر و بخصوص هورمون رشد انسانی نیز در باکتری نوترکیب تولید شده­است (48). بیان موفق پروتئین نوترکیب در باکتری، به ساختار­های اول، دوم، سوم و خصوصیات عملکردی پروتئین موردنظر وابسته است و از آنجایی که باکتری یک موجود پروکاریوت است، بیان پروتئینهای یوکاریوتی در آن با محدودیت­هایی روبروست (22). همچنین بسیاری از پروتئینهای نوترکیب تولید شده در سلولهای حشرات در زمان استفاده در بدن پستانداران غیرفعال عمل می­کنند که علت آن حذف سریع این نوع پروتئینها در چرخش خون بدن پستاندار است (55). بنابراین، امروزه گرایش زیادی برای یافتن سیستمهای تولیدی جایگزین وجود دارد.

از اوایل سال 1980 تا به امروز به دلیل شناخت ساختار­های ژنتیکی، زیست­شیمیایی، فیزیولوژیکی و فن­آوری تخمیر در مخمر ساکارومایسزسرویسیه، سازمان غذا و دارو آمریکا (FDA) این میکروارگانیزم را به عنوان یک موجود تک­سلولی بی­خطر به رسمیت شناخته است. در طی سال 1980، پروتئینهای نوترکیب در مخمر ساکارومایسزسرویسیه بیان شدند؛ اما چندی بعد مشخص شد که این موجود برای تولید تمام پروتئینهای موردنیاز مناسب نیست (21، 45 و 73). از نیمه سال 1980، جستجو برای میزبانهای جایگزین در میان گونه­های مخمری آغاز شد (65). کلی­ورومایسزلاکتیس اولین گونه بعد از ساکارومایسزسرویسیه بود که برای بیان پروتئینهای نوترکیب استفاده شد و هم­اکنون برای تولید رنین در فرآیند پنیرسازی کاربرد بسیاری دارد (91).

امروزه مخمر­های پیکیا­پاستوریس اصلاح ژنتیکی شده، تحت عنوان سویه­های گلایکوسویچ، به طور جالب توجه دارای ژنهای کدکننده آنزیمهای مسئول اصلاحات پس­ترجمه­ای بوده و قادر به ترشح مقادیر بالایی از پروتئینهای نوترکیب با ساختارهای طبیعی و گلیکوزیلاسیون صحیح هستند که این امر مشکلات استفاده از پروتئینهای نوترکیب تولید شده در مخمر پیکیا­پاستوریس را برای انسان حل کرده­است. با توجه به این موارد در سالهای اخیر این مخمر توانسته سیستم مناسبی برای تولید پروتئینهای دارویی به­حساب آید (42 و 47). به طوری که هم اکنون سویه­های گلایکوسویچ مخمر پیکیا­پاستوریس، برای تولید پروتئینهای نوترکیب با اصلاحات N-گلیکوزیلاسیون مختص پروتئینهای انسانی، در دسترس هستند (74).

به طور کلی مخمر­ها براساس مصرف متانول به دو گروه عمده تقسیم می­شوند که مثالهایی از هر یک از این دو گروه در جدول 1ذکر شده است (65). این دو گروه عبارت است از:

1) میزبانهای متانول دوست.

2) میزبانهای غیرمتانول دوست.

مخمر­های متانول دوست، از متانول به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده می­کنند. در ابتدا این گروه از مخمر­ها برای تولید پروتئین خوراکی مورد استفاده قرار گرفتند و اولین پروتئین خوراکی تولید شده در آنها جهت مصرف خوراک دام بوده است (64). پس از چندی به دلیل وجود دو ویژگی، به عنوان سیستم مناسب برای تولید پروتئین نوترکیب دارویی مورد توجه قرار گرفتند (64 و 65) که این دو ویژگی عبارتند از: 1) توانایی رشد در غلظتهای سلولی بالا (21 و 65) و 2) وجود پروموترهای قوی که تنظیم تولید آنزیمهای اکسیدکننده متانول را در این مخمر بر عهده دارند (21، 28، 64، 65 و 99 ).

 

 

جدول 1-تقسیم­بندی مخمر براساس مصرف متانول (65).

مخمرهای متانول­دوست

 

هانسنولاپلی­مورفا (Hansenula polymorphaپیکیا­پاستوریس، پیکیا متانولیکا (Pichia methanolica)، کاندیدابویدینی (Candida boidini)، اوگاتامینوتا (Ogataea minuta

ساکارومایسز­سرویسیه، کلی ورومایسزلاکتیس،

مخمرهای غیرمتانول­دوست

 

یارویالیپولیتیکا (Yarrowia lipolytica)، زایگوساکارومایسزروکسی (Zygosaccharomyces rouxi)، زایگوساکارومایسزبایلی (Zygosaccharomyces bailii)، سارکوسیفااکسیدنتالیس (Sarcoscypha occidetalis)

 

به طور کلی دو سویه از مخمرهای متانول دوست برای بیان پروتئینهای خارجی استفاده می­شوند:

1) پیکیا­پاستوریس (18 و 64)

2) هانسنولاپلی­مورفا (36 و 86).

مخمر پیکیا­پاستوریس: امروزه، دانشمندان به طور پیوسته در حال دستکاری ژنتیکی مخمر­ها به­منظور بیان پروتئینهای یوکاریوتی خارجی هستند (29). در طول 20 سال گذشته سیستمهای بیانی مخمرها که مشهورترین آنها پیکیا­پاستوریس است، برای تولید پروتئینهای نوترکیب مورد توجه بسیار قرار گرفته­اند (10 و 23). اهمیت ویژه این مخمر، توانایی ترشح پروتئین خارجی در محیط کشت است. محصول ترشح­شده می­تواند بیش از 80 درصد پروتئینهای محیط کشت را شامل شود (60). با توجه به قابلیت این سیستم بیانی، تاکنون بیش از 1000 پروتئین در سیستم بیانی فوق کلون و بیان شده­اند (10، 71 و 96).

پیکیا­پاستوریس یک سیستم بیانی مفید با بازدهی مؤثر و یک ابزار تجربی-کاربردی در مهندسی پروتئین به شمار می­رود (18، 60، 73 و 99). در سال 1980، پیکیا­پاستوریس برای بیان پروتئینهای خارجی توسعه یافت (10، 17، 61 و 99) و در سال 2009 اولین پروتئین نوترکیب دارویی (آنزیم بازدارنده کالیکرین) در آن تولید شد (65).

ویژگیهای سیستم بیانی مخمر پیکیا­پاستوریس: سیستم بیانی پیکیا­پاستوریس نسبت به دیگر سیستمهای بیانی مزایا و معایب مختص به خود را دارد (60)؛ که برخی از این ویژگیها را می­توان از مقالات مختلف استخراج نمود و در قالب جدول 2 تقسیم بندی کرد.

 

جدول 2- مزایا و معایب سیستم بیانی پیکیا­پاستوریس.

مزایای مخمر پیکیا­پاستوریس

قادر به ادغام یک ژن خارجی در ژنوم خود و تولید پروتئین خارجی است (22).

دارای پروموتر قوی به نام AOX در ژنوم خود است (79).

از منبع کربن ارزان نظیر متانول برای تحریک پروموتر AOX استفاده می­کند (41).

نرخ رشد بالا و سریع به همراه تخمیر آسان و ارزان در غلظت سلولی بالا را دارا است (60).

میزان قابل­ملاحظه­ای از پروتئین نوترکیب را در محیط کشت ترشح می­سازد (60 و 97).

میزان کمی از پروتئین خود را در محیط کشت ترشح می­سازد (23، 27 و 63).

آلودگیهای آندوتوکسین و باکتریوفاژ در این مخمر دیده نمی­شود (60).

دستکاری ژنتیکی آن آسان است (22 و 60).

توانایی انجام اصلاحات پس­ترجمه­ای گوناگون شامل تشکیل ساختار پلی­پپتیدی، تشکیل پیوند دی­سولفیدی و گلیکوزیلاسیون را دارد (23 و 52).

سطوح پروتئین نوترکیب تولید شده در این مخمر یک تا دو برابر بیشتر از مخمر ساکارومایسزسرویسیه گزارش شده­است (2).

دسترسی به این سیستم بیانی به صورت تجاری امکان­پذیر است (10).

معایب مخمر پیکیا­پاستوریس

این مخمر در مقایسه با سیستم بیانی پستانداران، قادر به اصلاح گلیکوپروتئینها به طور یکسان با الیگوساکاریدهای انسانی نیست (52).

تمام پروتئینهای نوترکیب نمی­توانند با موفقیت در این مخمر ترشح شوند و حفظ بیان بالای پروتئین در شبکه آندوپلاسمی هنوز یک مشکل محسوب می­شود (23).

به طور کلی چرخه زیستی و بیوشیمیایی پیچیده­ای دارند (65).

خصوصیات ساختاری و عملکردی آن در مقایسه با میزبان باکتریایی ناشناخته­تر است (22).

قادر به سنتز آنتی بادیهای مونوکلونال در الگویی مناسب نیستند (47).

در برخی موارد قندهایی را به پروتئینهای انسانی اضافه می­کنند. که این قندها در این نوع پروتئینها به طور طبیعی یافت نمی­شود (47).


ژنوتیپهای مختلف در مخمر پیکیا­پاستوریس: تمام سویه­های تجاری مخمر پیکیاپاستوریس از سویه اولیه و طبیعی NRRL-Y 11430 منشاء گرفته­اند. سویه­های تغییر یافته­ای که تنها در یک جایگاه ژنی نسبت به سویه اصلی دچار دستکاری شده­اند شامل GS115، GS190، و JC254، سویه­هایی که در دو جایگاه ژنی دچار تغییر و دستکاری شده­اند شامل GS200 وJC227 ، سویه­هایی که در سه جایگاه ژنی دچار تغییر شده­اند شامل JC300  و در نهایت سویه­هایی که در چهار جایگاه ژنی دچار دستکاری و تغییر شده­اند شاملJC308  هستند. این تغییرات در این سویه­ها می­تواند به عنوان نشانگر انتخاب در طی فرآیند نوترکیبی استفاده شود (34). در حال حاضر سویه­های متعددی از پیکیا­پاستوریس با طیف گسترده­ای از ژنوتیپ در دسترس هستند. انتخاب یک سویه خاص با توجه به کاربرد آن تعیین می­شود. هر سویه ویژگی منحصر به فرد خود را دارا است و محققان طبق نیاز و صلاح­دید سویه موردنظر خود را انتخاب می­کنند. تا کنون گزارش مستندی مبنی بر برتری و رجحان مشخص یک سویه بر سویه دیگر در تولید یک محصول خاص گزارش نشده است چرا که الگوی بیان یک پروتئین بر اساس یک ویژگی خاص بررسی و تفسیر نمی­شود بلکه وابسته به عوامل متعدد و پیچیده­ای است. براساس نوع پروتئین و میزان اصلاحات مورد نیاز پس از بیان، هر یک از سویه­ها که مناسب­تر باشند انتخاب خواهند شد (22). لازم به ذکر است که اولین سویه­ای که برای بیان پروتئینهای نوترکیب استفاده شد سویه GS115 بوده است (25). نکته مهم در ویژگی اکثر این سویه­ها، وجود پروتئازهای واکوئلی است. پروتئازهای واکوئلی فاکتور بسیار مهمی در تجزیه پروتئین به حساب می­آیند. به طور مثال برخی از پروتئینها در محیط کشت پیکیا­پاستوریس به طور ناپایدار تولید می­شوند زیرا این گونه از پروتئینها به حضور پروتئازها حساس بوده و به سرعت توسط آنها تجزیه می­شوند. به خصوص اینکه در شرایط کشت در مقیاس انبوه به علت تراکم بالای سلولی این آنزیمها به شکل فراوان در محیط کشت یافت می­شود. چندین سویه عاری از پروتئاز از جمله سویه­های SMD1163، SMD1165، SMB1168 (5 و 80) و SMD1168H (95) فاقد آنزیمهای تجزیه کننده پروتئین هستند که به عنوان سویه­های موفق در کاهش تجزیه برخی از پروتئینهای خارجی گزارش شدند (60). سویه­های دارای این خصوصیت می­توانند در غلظت سلولی بالا و با تجزیه درصد کمی از سلولها رشد کنند اما نرخ رشد آهسته دارند (10). سویه­های GS115 و SMD1168 فاقد ژن هیستیدین دهیدرژناژ (HIS4)  هستند؛ در نتیجه برای بیان یک ژن خارجی در ژنوم آنها نیاز به حضور هیستیدین در محیط کشت است. سویه­های SMD1168 و GS115 دارای ژن الکل اکسیداز-1 هستند که این ژن با کدکردن آنزیم الکل اکسیداز-1 مسئولیت مصرف تقریباً 85 درصد از متانول موجود در محیط کشت را بر عهده دارند (50). سویهKM71 ، اگرچه فاقد پروموتر الکل اکسیداز-1 است اما با استفاده از پروموتر دیگری به نام الکل اکسیداز-2، آنزیم الکل اکسیداز-2 را فعال می­سازد که این پروموتر نسبت به پروموتر الکل اکسیداز-1 ضعیف­تر است. (6، 21 و 50). MC100-3 سویه دیگری است که در آن هر دو پروموتر الکل اکسیداز حذف شده­است (10).

فنوتیپهای موجود در مخمر پیکیا­پاستوریس: مطالعات فیزیولوژیکی سلول میزبان برای تولید پروتئینهای نوترکیب ضروری است (65). براساس ژنوتیپ، سه نوع فنوتیپ متفاوت از مخمر پیکیا­پاستوریس وجود دارد (64 و 65):

فنوتیپ  : Mut+این گروه فنوتیپ طبیعی و اصلی مخمر پیکیا­پاستوریس هستند. سویه­های حاوی این نوع فنوتیپ هر دو ژن رمزکننده­ی پروموترهای الکل اکسیداز-1 و الکل اکسیداز-2 را دارند. در این گروه متانول به میزان بالا و سریع استفاده می­شود (33 و 77) و با حضور متانول به عنوان منبع کربن، بیان پروتئین در سطح بالا انجام خواهد شد (20). سویه­های Mut+ بدلیل مصرف سریع متانول توانایی تحمل غلظت بالاتری از متانول را دارا هستند و با احتمال کمتری دچار مسمومیت متانولی می­شوند، اما به همان نسبت به میزان بیشتری نیازمند اکسیژن بوده و بیشتر از سایر سویه­ها با کمبود اکسیژن مواجه می­شوند (10، 22 و 53). رایج­ترین میزبان بیانی مورد استفاده در مخمر پیکیا­پاستوریس، سویه GS115، دارای فنوتیپ +Mut است (60).

فنوتیپ : Muts در این گروه پروموتر AOX1 حذف شده است، اما پروموتر AOX2 دست نخورده باقی می­ماند. تعداد کمی از مخمر­های متانول دوست در این دسته جای دارند. این گروه به آرامی از منابع متانول استفاده می­کنند (20، 62، 64 و 65). سویه­های Muts با مقادیر کمتری از متانول نسبت به سویه­های Mut+ القاء می­شوند (20 و 33). پروتئینهایی که دارای فرآیند شکل­گیری آهسته هستند بهتر است توسط این نوع فنوتیپ تولید شوند زیرا نرخ القای پروتئین در آنها آهسته­تر و در نتیجه در بیشتر موارد تولید محصول نوترکیب صحیح­تر است (2، 22، 67 و 70). به عبارت دیگر وقتی رشد و تولید پروتئین در این فنوتیپ آهسته­تر انجام شود پروتئینهای حاوی فولدینگ پیچیده که نیاز به زمان بیشتری برای تشکیل ساختارهای سوم خود دارند، این فرصت را خواهند داشت تا قبل از ترشح، به ساختار صحیح خود دست یابند. از سویی دیگر با یک نگاه مقایسه­ای مشخص می­شود که در حضور میزان کم متانول در محیط کشت سویه­های Muts نسبت به سویه­های Mut+، میزان تولید آنزیم کربوکسی پپتیداز-A2 (مسئول کد کردن پروتئین)در این سویه­ها بیشتر است؛ لذا مقدار محصول تولیدی نیز در این شرایط در سویه  Mutsبیشتراز سویه Mut+ خواهد بود (22). لازم به ذکر است که نرخ افزودن متانول در محیط کشت این سویه­ها نسبت به سویه­های Mut+ سه برابر آرام­تر است تا غلظت متانول در محیط به میزان موردنظر یعنی بین g/l 8-2 باقی بماند زیرا مصرف متانول آهسته صورت می­گیرید و غلظت بالای متانول در محیط کشت برای این سویه­ها سمّ محسوب می­شود (91). این سویه­ها در مقایسه با سویه­های Mut+ به اکسیژن کمتری نیازمند هستند (21). در سویه­های Muts، به دلیل سوخت و ساز پایین، زمان مورد نیاز برای رسیدن به پروتئین تولیدی طولانی هستند و عمدتاً بین 150 تا 200 ساعت بعد از مصرف متانول بطول می­انجامد (43؛ 48 و 49)؛ درحالیکه این زمان برای سویه­های طبیعی حاوی ژن الکل اکسیداز-1، 50 ساعت و یا حتی کمتراست (40 و 50).

تا به امروز اکثر آزمایشات در مخمر پیکیا­پاستوریس در سویه­ی +Mut انجام شده­است زیرا این سویه­ها در حضور متانول سرعت رشد بالاتر و در نتیجه درصد تولید محصول نوترکیب بیشتری دارند، اما با این وجود چندین مطالعه نشان داده­است که سویه­های Muts از نظر تولید پروتئین نوترکیب ارجحیت دارند. به طور مثال آنزیم HRP در دو سویه از دو نوع فنوتیپ +Mut و Muts  تولید شد. نتایج به دست آمده نشان داد که نرخ رشد در سویه +Mut نسبت به سویه Muts به میزان یک و نیم برابر بیشتر بوده­است اما نرخ بهره­دهی محصول در سویه +Mut نسبت به سویه Muts سه برابر کمتر بوده است (57). KM71 سویه­ای است که بر روی محیط کشت حاوی متانول با نرخ ضعیفی رشد می­کند و دارای فنوتیپ Muts است (12 و 60).

3) فنوتیپ Mut- :تعدادی از سویه­های مخمر پیکیا­پاستوریس از متانول به عنوان منبع کربن استفاده نمی­کنند زیرا هر دو پروموتر در این گروه حذف شده است (19، 64 و 65). در نتیجه این گروه عمدتاً از گلیسرول، سوربیتول یا مانیتول به عنوان منبع کربن استفاده می­کنند؛ همچنین ممکن است کشت آنها در زمان القاح با دستورالعمل تغذیه­ای مخلوط همراه باشد؛ به این صورت که از مقدار کنترل­شده­ای از متانول به عنوان محرک القایی بیان پروتئین نوترکیب و از مقدار محدودی گلیسرول، سوربیتول یا مانیتول به عنوان منبع کربن و رشد استفاده کنند (22، 57 و 65).این شرایط در زمانی است که اگر تمام سویه­ها حتی فنوتیپهای Mut- پروموتر AOX1 در آنها قرار گیرد، به توانمندی القای بیان در سطوح بالا خواهند رسید (60). مثلا MC100-3 سویه­ای است که قادر به استفاده از متانول نیست؛ به عبارت دیگر دارای فنوتیپ Mut است (12 و 60). این فنوتیپ به طور معمول قادر به رشد در متانول نیست. برای این سویه تنها زمانی از متانول استفاده می­شود که از پروموتر AOX1 برای بیان پروتئین نوترکیب در وکتور وارد شده به ژنوم این مخمر استفاده شود (34).

وکتورهای مورد استفاده در مخمر پیکیا­پاستوریس: تمام وکتور­های بیانی پیکیا­پاستوریس به عنوان شاتل وکتور پیکیا­پاستوریس/ اشریشیاکلی طراحی می­شوند؛ زیرا عمل واردسازی یک توالی خارجی به درون وکتور بیانی پیکیا­پاستوریس معمولاً در باکتری سویه اشریشیاکلی انجام می­گیرد. به این صورت که وکتور حاوی ژن مورد نظر ابتدا وارد باکتری اشریشیاکلی شده چرا که این باکتری سیستم تکثیری سریع و ساده­تری نسبت به مخمر پیکیا­پاستوریس دارد، لذا پس از کشت این میکروارگانیزم از حضور پایدار وکتور نوترکیب در یک سیستم میزبان مطمئن شده و بدون صرف هزینه و وقت، توالی نوکلئوتیدی سازه مربوطه از لحاظ هرگونه تغییر و جهش بررسی می­شود و در صورت عدم مشاهده هرگونه تغییر، وکتور مربوطه آماده انتقال به ژنوم مخمر است (1 و 60).

آنچه که در یک وکتور بیانی پیکیا­پاستوریس باید طراحی شود شامل موارد زیر است (60):

1)               توالی 5'AOX1 در بالا دست ژن

2)               توالی پیام ترشحی

3)               جایگاه کلونینگ چندگانه

4)               جایگاه پایان رونویسی

5)               جایگاه نشانگر انتخابی

6)               جایگاه ژن مقاومت به آنتی­بیوتیک

7)               توالی 3'AOX1 در پایین دست ژن

اولین اقدام در انتخاب یک وکتور بیانی در پیکیا­پاستوریس تعیین این موضوع است که ترشح یک پروتئین در محیط خارج سلولی صورت بگیرد یا به صورت درون سلولی باشد (91).

چندین وکتور تجاری برای بیان ژن خارجی در مخمر، وجود دارد. در شکل 1، PHIL-D2 و pPIC9 به عنوان دو نمونه از وکتورهای مورداستفاده در مخمر پیکیا­پاستوریس برای تولید پروتئین نوترکیب نشان داده شده­است (22).

از دیگر وکتورهای این گونه مخمری می­توان pPIC9K و pPICZa را نام برد که هر یک ویژگی منحصربه فرد خود را دارند (22).

 

 

 

 

شکل 1- نمونه‌هایی از وکتورهای رایج در پیکیا­پاستوریس (22).



به­عنوان دستآورد جدید در سیستم ترشحی مخمر پیکیا­پاستوریس، وکتورهای گلایکوسوییچ طوری طراحی گردیدند که قادر به بیان پروتئینهای نوترکیب انسانی با اصلاحات پس ترجمه­ای صحیح در این مخمر هستند. از این دسته می­توان به وکتورهای تجاری شامل pGlycoSwitchM8، pGlycoSwitchM5، pGlycoSwitchGnT-I، pGlycoSwitchGalT/1، pGlycoSwitchGalT/2،pGlycoSwitchMan-II/1 ، pGlycoSwitchMan-II/2 و pGlycoSwitchGnT-II اشاره نمود (51).

پروموترهای مورد استفاده در مخمر پیکیا­پاستوریس: یکی از معیار­های کلیدی برای تولید پروتئینهای خارجی، افزایش بازدهی رونویسی (بیان) ژن مورد نظر با استفاده از پروموتر مناسب است (64). پروموترهای AOX1 و AOX2 در مخمر پیکیا­پاستوریس به عنوان پروموترهای طبیعی و اصلی شناسایی گردیدند که در پی آنها سه فنوتیپ برای پیکیا­پاستوریس به وجود می­آورد. مشخص شده است که موفقیت سیستم بیانی پیکیا­پاستوریس به میزان زیادی بدلیل وجود پروموتر AOX است (10). پروموتر AOX به شدت توسط متانول تحریک و توسط منابع کربنی دیگر نظیر گلیسرول و گلوکز متوقف می­شود (22 و 99)، به طوری که در محیط کشت حاوی متانول به عنوان منبع کربن، mRNA آنزیم AOX بیش از پنج درصد از ذخیره RNA را شامل می­شود (22). به عبارت دیگر فراوانی آنزیم الکل اکسیداز-1 زمانی که در محیط کشت حاوی متانول به­عنوان منبع کربن رشد می­کند، می­تواند به 30 درصد غلظت پروتئینهای سلولی برسد (22، 43 و 64) که این نشان­دهنده قدرت برجسته پروموتر الکل اکسیداز-1 است. این پروموتر 85 درصد از فعالیت الکل اکسیداز را به خود اختصاص می­دهد (19، 32، 90 و 100). در مقابل آن، آنزیم الکل اکسیداز-2 توسط پروموتر ضعیف­تری به نام پروموتر الکل اکسیداز-2 کنترل می­شود و 15 درصد از فعالیت الکل اکسیداز را در سلول به خود اختصاص می دهد (19 و 76). علاوه­بر این، پروموترهای جدیدی برای بیان ژنهای خارجی جداسازی و بکار گرفته شده­اند که شامل پروموترهای گلیسرآلدئید تری فسفات دهیدروژناز (GAP) (10، 21، 91، 94 و 99)، فرمالدئید دهیدروژناز(FLD)  (21، 71 و 99)، و دی هیدروکسی استون سنتتاز (DHAS)  (56) در مخمر پیکیا­پاستوریس هستند (94).

مسیر پروموتر AOX در متابولیسم متانول در مخمر پیکیا­پاستوریس: مطالعات بیوشیمیایی نشان داد که استفاده از متانول نیازمند یک مسیر متابولیکی خاص به همراه چندین آنزیم مشخص است (93).

بر اساس شکل 2، مخمر­های متانول­دوست دارای یک مسیر عمومی و مشابه برای استفاده از متانول هستند (74). این گروه می­توانند با استفاده از پروموتر الکل اکسیداز از متانول به عنوان منبع کربن استفاده نمایند؛ بدین صورت که پس از ورود متانول به محیط کشت مخمر، پروموتر الکل اکسیداز فعال شده و در پی آن ژن الکل اکسیداز بیان می­شود. در ادامه آنزیم الکل اکسیداز توسط مخمر در محیط ترشح می­شود (43). در حضور آنزیم الکل اکسیداز و اکسیژن در محیط پراکسی­زوم، متانول به فرمالدئید اکسیده می­شود و محصول جانبی این واکنش پراکسید هیدروژن است (10 و 35). پراکسید هیدرژن، یک محصول جانبی در مسیر مصرف متانول بشمار می­رود و منجر به استرس سلولی و تحریک مرگ سلولی می­شود (56). مقداری از فرمالدئید وارد سیتوزول شده و با حضور آن مجموعه­ای از فرآیند­ها انجام می­شود. در این مسیر ابتدا فرمالدئید دهیدروژناز، فرمالدئید را به فرمات تبدیل ساخته و سپس فرمات دهیدروژناز، فرمات را به دی اکسیدکربن تبدیل می­کند (35، 37 و 43). در مسیر دیگر فرمالدئید باقیمانده در پراکسی­زوم با زایلولوز 5-فسفات واکنش می­دهد و به وسیله آنزیم دی­هیدروکسی استون سنتتاز دو ماده سه کربنه یعنی دی­هیدروکسی استون و گلیسرآلدئید تری فسفات تولید می­شود (35 و 43). این اجزا طی واکنشهایی در سیتوزول، بار دیگر زایلولوز 5-فسفات را تولید خواهند کرد. تنظیم متابولیسم متانول در مخمر یک فرآیند پیچیده است (93). سنتز آنزیمهای متابولیز کننده متانول با حضور متانول، فرمالدئید و فرمات تحریک و با حضور گلوکز و اتانول متوقف می­شود (30، 77 و 93). تبدیل متانول به فرمالدئید، مرحله محدودکننده چرخه مصرف متانول در سلول محسوب می­شود و زمانی که مقدار فرمالدئید و متانول به طور همزمان افزایش یابد، رشد سلول متوقف خواهد شد (22). فرمالدئید دهیدروژناز، فرمات دهیدروژناز و دی هیدروکسی استون سنتتاز آنزیمهای کلیدی در این واکنش به­حساب می­آیند (57).

 

 

شکل 2- مسیر استفاده از متانول در پیکیا­پاستوریس (74).

AOX1: الکل اکسیداز؛ :FLD2 فرمالدئید دهیدروژناز؛ FGH3: s- فرمیل گلوتاتیون هیدرولاز؛ FDH4: فرمات دهیدروژناز؛ CAT5: کاتالاز؛ DAS6: دی هیدروکسی استون سنتتاز؛ DAK7: دی هیدروکسی استون کیناز؛ TPI8: تریوفسفات ایزومراز؛ FBA9: فروکتوز-1و6- بیس فسفات آلدولاز؛ FBP10: فروکتوز-1و6 بیس فسفاتاز؛ DHA: دی هیدروکسی استون؛ GAP: گلیسرآلدئید سه فسفات؛ DHAP: دی هیدروکسی استون فسفات؛ F1,6BP: فروکتوز-1 و -6 بیس فسفاتاز؛ F6P: فروکتوز-6-فسفات؛ Pi: فسفات؛ Xu5P: زایلولوز-5-فسفات؛ GSH: گلوتاتیون.


توالی پیام ترشحی در مخمر پیکیا­پاستوریس: بسیاری از پروتئینها بخصوص پروتئینهای ترشحی دارای یک منطقه پروپپتید هستند که برای شکل­گیری صحیح پروتئین لازم است (73). این منطقه پیشین، شامل یک توالی کوچک متشکل از 15-6 اسیدآمینه است که پروتئینها را به سیستم ترشحی منتقل می­سازد (68 و 73). اگرچه منطقه پروپپتید پروتئین، در هنگام آزادسازی پروتئین بالغ حذف می­شود اما حضور آن در mRNA بالغ برای پایداری بیان و جلوگیری از تجزیه­شدن پروتئین ضروری است (73)؛ همچنین عدم حضور آن در هنگام بیان پروتئین می­تواند منجر به خارج­سازی آرام­تر پروتئینها از شبکه آندوپلاسمی و در برخی موارد از دست­دادن ساختار پروتئینی شود (46، 66 و 75). پروتئینهای اولیه پس از خروج از شبکه آندوپلاسمی، به جسم گلژی منتقل می­شوند تا منطقه پروپپتید حذف شود (24، 73 و 82). در مخمر، دسترسی به پیام ترشحی منجر به خارج­سازی پروتئین از سلول می­شود (9، 13 و 92). ژنهای خارجی می­توانند با توالی پیام طبیعی خود و یا توالی پیام مخمری ترشح شوند (68). ساکارومایسزسرویسیه و پیکیا­پاستوریس توالیهای پیام اختصاصی کمی دارند، اما به طور موفقیت­آمیزی بسیاری از پروتئینهای نوترکیب تولیدشده در مخمر پیکیا­پاستوریس، قادر به استفاده از توالی پیام طبیعی خود هستند و مشاهده گردیده محصولات ترشح­یافته با توالی پیام طبیعی زیست فعال­تر هستند (22، 68، 73 و 81).

جایگاه توالی پیام ترشحی در وکتورهای مخمری و نیز دیگر یوکاریوتها، پس از شروع توالی پروموتر است (13، 58 و 68).

توالیهای پیام ترشحی مخمری که به طور موفقیت­آمیزی برای بیان پروتئینهای نوترکیب در پیکیا­پاستوریس استفاده شدند شامل توالی پیام ترشحی آلفا فاکتور (a-MF) و توالی پیام ترشحی اسید فسفاتاز  (PHO1)هستند (14، 22، 58، 64 و 85).

توالی پیام ترشحی MF-a به عنوان پرکاربردترین توالی پیام ترشحی برای بیان پروتئین خارجی در پیکیا­پاستوریس معرفی شده است (10، 14 و 92).

نشانگرهای انتخاب در مخمر پیکیا­پاستوریس: تعدادی از ژنها به عنوان نشانگر­های انتخاب در فرآیند دستکاری ژنتیکی در پیکیا­پاستوریس استفاده می­شوند. این نشانگرهای انتخاب در سویه­های مخمری نظیر پیکیا­پاستوریس در اثر جهشهایی در برخی از نواحی ژنی به دست می­آیند. به طور مثال برخی از نشانگرهای انتخاب نظیر HIS1، HIS2، HIS4، HIS5، و HIS6 مربوط به مسیر بیوسنتز هیستیدین هستند برخی دیگر نظیر ARG1 ، ARG2، ARG3 وARG4  مربوط به مسیر بیوسنتز آرژنین هستند. نشانگرهای دیگری نظیر ADE1، MET2، URA3 و FLD1 نیز تا کنون گزارش شده­اند (34). به طور مثال سویه­های دارای نشانگر انتخابی HIS4 ناشی از جهش در ژن هیستیدینول دهیدروژناز خود هستند که قادر به سنتز هیستیدین نیستند به طوری که حضور هیسیتیدن در محیط کشت برای ادامه رشد آنها ضروری است؛ لذا می­توان از این ویژگی برای غربالگری کلنیهای نوترکیب استفاده نمود (10، 15، 17 و 44). پایفر و همکارانش (1992) بیان داشتند که گزینش نشانگرها و انتخاب پروموترهای صحیح برای دستیابی میزان بالایی از محصول نوترکیب ضروری است. انتخاب این دو ویژگی برای هر پروتئین متفاوت بوده که نشان دهنده تنظیم گسترده آن برای بهینه­سازی فرآیند تولید پروتئین است (68). از طرف دیگر، به طور مثال با اینکه استفاده از نشانگر URA3 در مخمر پیکیا­پاستوریس گسترش یافت اما استفاده از این نشانگر به دلیل آنکه رشد سویه مورد نظر را کند و زمان­بر می­سازد منجر به مشکلاتی می­شود که در نهایت دانشمندان برای حل این مشکل نشانگرهای دیگری را معرفی نمودند. این نشانگرها بخشی از توالیهای ژنی مختص ژنوم مخمر هستند که با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) شناسایی شدند و با وجود این توالیها دیگر نیازی به واردسازی یک نشانگر با استفاده از وکتور نیست (69).

انتقال سازه ژنی به ژنوم مخمر پیکیا­پاستوریس: به دلیل آنکه هیچ وکتور خارج کروموزومی پایدار برای پیکیا­پاستوریس وجود ندارند، وکتور­های بیانی معمولا به درون ژنوم مخمری وارد می­شوند تا سویه­های بیانی و پروتئینهای خارجی پایدار به دست آید (21 و 60).

اولین مرحله واردسازی وکتور­های نوترکیب خطی­شده به ژنوم مخمر، هضم وکتور در یک جایگاه خاص با استفاده از آنزیم محدودالاثر و سپس انتقال وکتور خطی به درون سلول مخمر است (10 و 60). معمولاً پس از آماده­سازی نهایی وکتور نوترکیب در باکتری اشریشاکلی و خطی نمودن آن توسط آنزیمهای محدودالاثر، وکتور آماده درج درون ژنوم مخمر پیکیا­پاستوریس است. توالی DNA موجود در انتهای وکتور خطی­شده ورود DNA نوترکیب را به جایگاه ژنومی مخمر تحریک می­سازد و در نتیجه وکتور به ژنوم مخمر ملحق می­شود (91). در شکل 3 مراحل انتقال سازه نوترکیب به ژنوم مخمر و در نهایت ترشح پروتئین نشان داده شده است (1).

 

 

 

سازه نوترکیب

انتقال سازه نوترکیب به ژنوم مخمر

اصلاحات پس ترجمه­ای در شبکه آندوپلاسمی

ترشح پروتئین از جسم گلژی

 

 


 

شکل 3- نمای شماتیکی از وارد شدن یک سازه نوترکیب به سیستم بیانی مخمر پیکیاپاستوریس. هر سازه نوترکیب پس از طراحی و آماده­سازی، به ژنوم مخمر وارد می­شود؛ توالی نوکلئوتیدی کدکننده پروتئین نوترکیب پس از بیان و ترجمه جهت انجام اصلاحات پس ترجمه­ای به شبکه آندوپلاسمی و جسم گلژی وارد می­شود و در نهایت بر اساس نوع پروتئین به خارج از سلول یا درون سیتوپلاسم منتقل می­گردد (1).

 

روشهای مورداستفاده برای انتقال DNA در مخمر پیکیا­پاستوریس مشابه با مخمر ساکارومایسزسرویسیه است و نتایج مشابهی را نیز به­همراه دارد (15). انتقال سازه ژنی به ژنوم مخمر با استفاده از چهار روش متفاوت انجام می­گیرد که شامل الکتروپوریشن، اسفروپلاست، استفاده از لیتیم کلراید و پلی­اتیلن گلیکول هستند (16، 17، 22، 62، 91 و 94). در روش اسفروپلاست به دلیل انجام مراحل زیاد، احتمال آلودگی افزایش می­یابد و علاوه بر آن فرآیندهای هضم سلولی ممکن است زنده­مانی سلول را کاهش دهد (4 و 38). الکتروپوریشن آسان ترین و سریع ترین روش انتقال ژن در ژنوم پیکیا­پاستوریس است (89). این روش رایج­ترین روش بوده (22 و 91) زیرا به مراحل کمتری نیازمند است و احتمال آلودگی در آن کمتر است (3).

در صورتی که جایگاه ژنی یکسانی در سازه ژنی وکتور نوترکیب و ژنوم مخمر وجود داشته باشد ادغام یک ژن به درون ژنوم مخمر، نوترکیبی همسان نامیده می­شود. با واردسازی سازه بیانی در جایگاههای خاصی از کروموزوم پیکیا­پاستوریس، این مخمر به میزبان نوترکیب تبدیل می شود. اندازه وکتور نوترکیب ممکن است بر روی پایداری ژنوم میزبان تأثیرگذار باشد. بنابراین، توسعه سویه­های بیانی پایدار از نظر ژنتیکی که نرخ از دست دادن وکتور در آنها کمتر از یک درصد در هر نسل است بسیار مورد توجه است (73 و 88).

مسیر شکل گیری پروتئین در مخمر پیکیا­پاستوریس: شکل­گیری پروتئینها، اغلب با تشکیل ساختارهای دوم پروتئین آغاز می­شود (22). پروتئینهای آماده برای ترشح به شبکه آندوپلاسمی هدایت شده و در آنجا دستخوش اصلاحات پس از ترجمه­ای می­شوند. در ادامه، تنها پروتئینهای دارای ساختار صحیح، شبکه آندوپلاسمی را ترک خواهند کرد (40 و 46) و در نهایت پروتئینهای بالغ به صورت بسته­هایی به سطح سلول منتقل می­شوند (73).

اصلاحات پس­ترجمه­ای پروتئین در مخمر پیکیا­پاستوریس: یکی از مزایای عمده استفاده از پیکیا­پاستوریس توانایی اصلاحات پس­ترجمه­ای پروتئینهای نوترکیب است. دسترسی به سویه­های مهندسی­شده گلایکوسویچ در پیکیا­پاستوریس، آنها را به سیستم بیانی مفیدی برای تولید و ترشح پروتئینهای نوترکیب تبدیل ساخته است (23). به طور کلی، اصلاحاتی که باید پس از ترجمه پروتئین انجام گیرد شامل تشکیل باندهای دی­سولفیدی، خارج کردن توالی پیام ترشحی از توالی اصلی پروتئین و گلیکوزیلاسیون پپتید بالغ است (59). پروتئولیزاسیون و گلیکوزیلاسیون از جمله مشکلات پس ترجمه­ای در پیکیا­پاستوریس هستند که بر کیفیت پروتئین نوترکیب ترشح شده تأثیر می­گذارد. پروتئینهای مختلف دارای وزن مولکولی مختص به خود هستند. بر اساس این خصوصیت می­توان تولید محصول نوترکیب مورد نظر را ارزیابی نمود. اگر اندازه محصول نوترکیب تولیدی کوچک­تر از وزن مولکولی طبیعی مورد انتظارش به دست آید، این فرآیند حاصل پروتئولیزاسیون خواهد بود. به این معنا که پروتئین نوترکیب تولیدی در معرض آنزیمهایی قرار گرفته است که منجر به تجزیه آن شده است (91). یکی از مؤثرترین راهکارهای جلوگیری از فرآیند پروتئولیزاسیون، استفاده از سویه­های عاری از آنزیمهای تجزیه کننده پروتئین است (60) همان طور که قبلاً اشاره گردید این سویه­ها می­توانند در غلظت سلولی بالا و با تجزیه درصد کمی از پروتئینها رشد کنند (10). اگر اندازه محصول نوترکیب تولیدی بیشتر از میزان واقعی آن باشد، این مشکل در اثر گلیکوزیلاسیون پدید می­آید یعنی پیوندهای بین رشته­ای و تاشدگیهای ساختاری در این محصول منجر به اتصال و ادغام چندین رشته از پروتئین شده و سبب تشکیل پروتئین با اندازه چند برابر می­شود (91). محققان اعلام نمودند که اصلاح مسیر N-گلیکوزیلاسیون در سویه­های گلایکوسویچ، فیزیولوژی مخمر را تحت تأثیر قرار نمی­دهد و چنین سویه­های مهندسی شده، کاملاً قادر به تولید میزان بالایی از گلیکوپروتئینهای پستانداران با الگوی N-گلیکوزیلاسیون مورد انتظار هستند (52).

شبکه آندوپلاسمی محیط منحصربه فرد و بهینه­ای برای انجام اصلاحات پس از ترجمه پروتئینها، نظیر تاشدگی، سرهم بندی و تشکیل باندهای دی­سولفیدی ایجاد می­کند (91). ژآنگ و همکارانش (53) به همراه اینان و همکارانش (50)، در سال 2006 به این نتیجه رسیدند که بهبود توانایی تکمیل ساختار پروتئینی و اصلاحات پس­ترجمه­ای در شبکه آندوپلاسمی منجربه افزایش ترشح پروتئینهای نوترکیب در پیکیا­پاستوریس می­شود (23)؛ زیرا هرچه ساختار پروتئین نوترکیب تولید شده در میزبان به ساختار طبیعی آن پروتئین نزدیک­تر باشد پایداری و نیمه عمر پروتئین مورد نظر بیشتر خواهد شد؛ لذا نرخ ترشح پروتئین در محیط کشت و در پی آن درصد شناسایی آن افزایش می­یابد.

الگوی گلیکوزیلاسیون در مخمر پیکیا­پاستوریس: تقریباً نیم تا یک درصد از پروتئینهای ترجمه­شده در سیستم یوکاریوتی، گلیکوپروتئین هستند (22). گلیکوزیلاسیون رایج­ترین نمونه از اصلاحات پس­ترجمه­ای گلیکوپروتئینها در فرآیند ترشح به شمار می­آیند که در شبکه آندوپلاسمی و پس از ترجمه پروتئین اتفاق می­افتد (39). در این فرآیند، الیگوساکارید­ها به آسپارژینهای خاص موجود در یک توالی معین از اسیدآمینه­های آسپارژین –X– سرین/ترئونین متصل می­شوند (51). طول و نوع الیگوساکاریهای اضافه شده به گلیکوپروتئینها متفاوت است. این تفاوت تنها مربوط به ساختار پروتئین هدف نیست بلکه سیستم بیانی نیز به طور قابل ملاحظه­ای در آن دخیل است (22). در پستانداران الیگوساکارید­های متصل به جایگاه گلیکوزیلاسیون موجود در توالی اسیدآمینه­ای اغلب از اسیدسیالیک، گالاکتوز و -N استیل گالاکتوزآمین و در مخمر پیکیا­پاستوریس این توالی تنها از قند مانوز و مانوزیل فسفات تشکیل شده است (10). گلیکوپروتئینهای بیان شده در مخمر پیکیا­پاستوریس تنها 8 تا 14 مانوز اضافی با خود حمل می­کنند، درحالی که این تعداد در مخمر ساکارومایسزسرویسیه در حدود 50 الی 200 است (8، 10 و 89). در مخمر ساکارومایسزسرویسیه، الیگوساکارید­های اضافه شده به پروتئینهای ترشحی، فعالیت آنتی­ژنی را افزایش خواهند داد و در نتیجه پروتئین مصرفی در خون، به سرعت توسط کبد پاکسازی می­شود اما در مورد پیکیا­پاستوریس این حالت دیده نشده­است (10، 18 و 89).

بیان سیتوپلاسمی در مقایسه با بیان ترشحی در مخمر پیکیا­پاستوریس: اولین مرحله در بیان پروتئینهای نوترکیب، تعیین نحوه­ بیان است یعنی مشخص شود هدف تولید داخل سلولی یا ترشح خارج سلولی پروتئین است. ترشح حالت ترجیحی تولید پروتئین است زیرا دسترسی و شناسایی محصول آسان است اما انتخاب نوع بیان بستگی به پروتئین موردنظر دارد. اگر یک پروتئین در میزبان طبیعی­اش به صورت درون سلولی تولید می­شود در میزبان نوترکیب هم باید این اصل رعایت شود، و اگر به صورت ترشحی بوده پس باید وکتور مورد استفاده در میزبان جدید نیز خاصیت ترشحی داشته باشد زیرا شرایط محیطهای درون سلولی و ترشحی متفاوت است و در صورت عدم توجه به این اصل ممکن است یک پروتئین به طور ناصحیح ساختاربندی شده و در نهایت به صورت غیرفعال تولید گردد (72).

بیان سیتوپلاسمی، اغلب منجربه بیان سطوح بالا می­شود زیرا محدودیتهای بالقوه مسیرهای ترشحی را دارا نیست. اما این نوع بیان چندین جنبه منفی نیز دارد برای مثال در بسیاری از موارد به دلیل ساختاربندی و پردازش پروتئینها نظیر تشکیل باندهای دی­سولفیدی، محدودیت شدیدی برای بیان سیتوپلاسمی وجود دارد. همچنین شکستن سلولها به منظور خارج­سازی پروتئین نیازمند مراحل اضافی در طول پردازش محصول است زیرا دیواره سلولی مخمر بسیار محکم است. در ادامه فرآیند نیز مواد حاصل از تجزیه سلولی باید پاکسازی شوند و محصول نهایی تنها بخش جزئی از اجزای سلولی در دسترس است چرا که تنها یک درصد از پروتئینهای داخل سلولی را پروتئینهای هدف تشکیل می­دهند (61، 72 و 98).

عوامل مؤثر بر بیان پروتئین در مخمر پیکیا­پاستوریس: برای بیان یک ژن در پیکیا­پاستوریس سه اصل مهم است (61 و 64):

1)               وارد ساختن ژن مورد نظر به وکتور بیانی

2)               انتقال وکتور بیانی به ژنوم سویه مورد نظر از مخمر پیکیا­پاستوریس

3)               بررسی بیان محصولات حاصل از ژن خارجی

بیان پروتئینهای خارجی تنها به تعداد کپیهای ژن واردشده به ژنوم بستگی ندارد (31 و 76)، بلکه به دیگر عوامل نظیر ورود سازه نوترکیب به درون کروموزوم، جایگاه ورود ژن در وکتور، نواحی '5 و'3 ترجمه نشده در mRNA(توالی پیام ترشحی)، درصد ترکیب A+T در cDNA، نوع و ماهیت پیام ترشحی، فعالیت آنزیمهای تجزیه کننده پروتئینها، فیزیولوژی سویه­های میزبان، شرایط رشد و کشت و پارامتر­های تخمیری وابسته است که همه این موارد باید در طراحی یک سیستم تولیدی بهینه ملاحظه شوند(84). در توضیح این مطلب می­توان به بررسی برخی از این موارد پرداخت. روش ترجیحی برای بیان یک ژن در مخمر پیکیا پاستوریس انتقال سازه نوترکیب به درون ژنوم مخمر با استفاده از وکتورهای بیانی است این روش مزایای منحصر به فردی دارد از جمله آنکه سازه نوترکیب پایدار شده و امکان حضور چندین نسخه از آن در ژنوم مخمر وجود دارد. بهترین جایگاه قرارگیری ژن در سازه نوترکیب بعد از پروموتر است تا حداکثر بازدهی و کیفیت بیان ژن مورد نظر به دست آید. در سویه­هایی که پروموتر AOX1 در آنها حذف شده است (یعنی فنوتیپهای Mut-) سرعت رشد سویه­ها بسیار پایین­تر از سویه­های Mut+ است که با حضور پروموتر AOX1 رشد طبیعی خود را دارند. برای بیان پروتئینهای درون سلولهای ترجیح داده می­شود که از فنوتیپهای Mut- استفاده شود زیرا در این سویه­ها پروتیئن­های طبیعی خود سلول که وابسته به مسیر متابولیسم پروموتر AOX1 هستند تولید نمی­شوند و در نتیجه خالص سازی پروتئین از حجم انبوهی از پروتئینهای درون سلولی راحت­تر است. اما برای تولید پروتیئن­های ترشحی از هر دو نوع فنوتیپ می­توان استفاده نمود. بار و همکاران در سال 1992 پروتئین ترشحی آلبومین سرم انسانی (HSA)را در هر دو فنوتیپ تولید نموده اما تفاوت قابل ملاحظه­ای در ترشح این پروتئین در این دو نوع فنوتیپ مشاهده نکردند. شواهد بسیاری وجود دارد که اثبات می­کند وجود یک کپی از ژن مورد نظر در ژنوم مخمر برای بیان بهینه پروتئین مورد نظر کافی است و افزایش تعداد کپیهای یک ژن تأثیر آن چنانی در تولید محصول مورد نظر ندارد. اما با این وجود، مطالعات بسیار دیگری نشان دادند که حضور چند نسخه از ژن مورد نظر در ژنوم مخمر برای افزایش سطح بیان ضروری است. همچنین تعداد شواهد اندکی نیز نشان داد که حضور چند نسخه از ژن مورد نظر در ژنوم مخمر می­تواند تأثیرات منفی در بیان ژن مورد نظر داشته باشد. بنابراین تأثیر تعداد کپیهای یک ژن بر روی بیان آن ژن خاص غیر قابل پیش بینی است. طول ناحیه توالی UTR-ʹ5 یک ژن می­تواند نقش تعیین کننده­ای در تولید بهینه محصول موردنظر داشته باشد. برای سنتز بهینه یک پروتئین خارجی بهتر است طول توالی ناحیه UTR-ʹ5 با طول توالی mRNA-AOX یکسان باشد. اسریکریشنا و همکاران (1993) مشاهده نمودند که سطح بیان پروتئینHSA  با تنظیم یکسان سازی طول توالی UTR-ʹ5 با طول توالی mRNA-AOX در حدود 50 برابر افزایش یافت(84). ژنهایی که دارای درصد باز A+T بالایی هستند قادر به ترجمه با بازدهی بالا نیستند یک مثال از این موارد که در نهایت منجر به بلوکه شدن فرآیند ترجمه در مخمر پیکیا­پاستوریس شده است توالی ATTATTTTATAAAA موجود در ژن HIV-gp120 است. الگوی عمومی برای یک ژن طوری باید باشد که در حدود 55-30 درصد از توالی ژنی حاوی باز­های A+T باشد. همان طور که قبلاً بیان شد، ترشح یک پروتئین روش ترجیحی در تولید محصول نوترکیب است، به دلیل آنکه خالص سازی محصول نوترکیب راحت­تر است. برای پروتئینی که به طور طبیعی به حالت ترشحی تولید نمی­شود ترشح آن در سیستم میزبان بسیار سخت و یا حتی غیر ممکن است. همچنین برای پروتیئنهایی که به طور طبیعی ترشحی هستند نظیر HSA و یا هورمون رشد تولید آنها به صورت درون سلولی غیرممکن است. برای ترشح یک پروتئین نیاز به توالی پیام ترشحی است. انتخاب توالی پیام ترشحی برای یک پروتئین دلخواه است. در برخی پروتئینها نظیر HSA و لیزوزیم گاوی استفاده از توالی پیام ترشحی طبیعی خود پروتئین کافی است. اگر توالی پیام ترشحی یک پروتئین در دسترس نیست می­توان از توالیهای پیام ترشحی موجود در مخمر نظیر  α-MFاستفاده نمود (79).

کشت مخمر پیکیا­پاستوریس: کشت مخمر پیکیا­پاستوریس طی دو مرحله انجام می­گیرد. در مرحله اول، سلولها در محیط کشتی به نام Batch (حاوی یک منبع کربن غیرقابل تخمیر نظیر گلیسرول) رشد می­کنند و در مرحله دوم از یک محیط کشت القایی برای تحریک پروموتر AOX و استفاده از منبع کربن قابل تخمیر(نظیر متانول) بمنظور بیان ژن و القای پروتئین نوترکیب استفاده می­شود. این محیط کشت Fed- Batch نامیده می­شود (8، 60 و 73). در طول رشد و تکثیر مخمر، منبع عمومی کربن که اغلب گلیسرول است فقط تا حدی که نیازمندیهای سلول را برطرف سازد مورد استفاده قرار می­گیرد (60 و 94). رشد هر سه فنوتیپ پیکیا­پاستوریس بر روی گلیسرول یکسان است. اما سویه­های دارای فنوتیپهای مختلف در استفاده از متانول متفاوت عمل می­کنند. حدود 4 تا 5 ساعت موردنیاز است تا سلولها پس از خروج از محیط گلیسرول و ورود به محیط متانول با آن تطبیق یابند (87). بریرلی و همکارانش مشاهده نمودند که سویه­های Mut+ به تغییرات سطح متانول در محیط بسیار حساس هستند (6).

عوامل مؤثر بر کشت مخمر پیکیا­پاستوریس: جهت تولید پروتئین نوترکیب با ساختار صحیح در مخمر پیکیا­پاستوریس، فراهم نمودن شرایط کشت مناسب از مهم­ترین عوامل به شمار می­رود (22)، که می­توان به موارد زیر اشاره کرد:

ظرف کشت مخمر پیکیا­پاستوریس: به طور کلی انتخاب ظرف کشت، اولین مرحله برای بیان بهینه پروتئین در مقیاس کم است. طی مطالعه­ای که توسط بار و همکارانش در سال 1992 انجام شد، نوع ظرف کشت با تأثیر بر میزان انتقال اکسیژن به داخل محیط کشت، بر روی بیان پروتئین بسیار تأثیرگذار بوده­است. در این مطالعه، براساس تصویر 4، پنج نوع ظرف کشت با اشکال مختلف استفاده شد. آنها مشاهده کردند ظرف کشت سوم به­طور مؤثر تولید را بهبود می­بخشد (22). در توضیح این مطب می­توان اظهار داشت که ظروف شیشه­ای قابل استفاده برای کشت مخمر در مقیاس کم، دارای زوایای مشخصی در هر یک از گوشه­های دیواره خود هستند که بر حسب نوع این زوایا میزان اکسیژن ورودی و خروجی به ظرف در هنگام کشت مخمر تغییر خواهد کرد. چرا که کشت مخمر در این ظروف با تکان دادن مداوم در طول کشت همراه است، لذا شکل ظرف در میزان انتقال اکسیژن تأثیر به سزایی دارد. به طور مثال در ظرف کشت اول زاویه شیشه در حدود 45 درجه است در حالی که در هر یک از ظروف دو، سه، چهار و پنج زوایای دیواره­ها و در نهایت اشکال ظروف به طور متفاوت طراحی شده است، لذا میزان درصد اکسیژن ورودی و خروجی و در پی آن میزان بیان ژن تغییر خواهد کرد. به طوری که در ظرف دو زاویه دیواره نسبت به ظرف یک، از ناحیه سطح به میزان نیم سانتیمتر و از ناحیه بالا به میزان هشت سانتی متر به سمت داخل انحراف داشته و سپس این زوایا به یکدیگر متصل شده تا دیواره ظرف را تشکیل دهند. تشکیل دیواره­های هر یک از ظروف با زوایای مختلف طبق توضیح بالا در شکل 4 مشخص شده است.

 

 

 

شکل 4- انواع ظروف کشت مخمر. ظروف یک تا پنج به ترتیب نمایانگر اشکال مختلفی از ظرف کشت مخمر هستند که نرخ اکسیژن رسانی به سلولهای مخمری را با توجه به زوایای دیواره­های ظروف تغییر می­دهند. در شکل یک زاویه دیواره 45 درجه است، در شکل دو، سه، چهار و پنج این زاویه با تغییر شکل دیواره شیشه­های ظرف به فرم­های مختلف تغییر کرده است (22).

اجزای محیط کشت مخمر پیکیا­پاستوریس: نظیر دیگر مخمر­ها، رشد پیکیا­پاستوریس نیازمند منابع کربن و نیتروژن است. رایج­ترین منابع کربن، گلوکز و گلیسرول و رایج­ترین منابع نیتروژن، پپتون و عصاره مخمری است. اجزای سازنده محیط­کشت با اثرگذاری بر روی رشد و تکثیر سلولها، بیان پروتئینهای خارجی را در مخمر تحت تأثیر قرار می­دهند (11 و 54).

دمای محیط کشت مخمر پیکیا­پاستوریس: درجه حرارت در طول مرحله القای پروتئین نه تنها بر روی میزان تجزیه پروتئین بلکه بر روی بیان پروتئین نیز تأثیر می­گذارد (11). دمای بالاتر از حد طبیعی ممکن است منجربه تشکیل باندهای دی­سولفیدی درون مولکولی شده و در نتیجه امکان تجمع پروتئین بیشتر شود. پروتئینهای تجمع یافته با از دست­دادن ساختار خود نسبت به پروتئولیزاسیون درون سلولی حساس­تر می­شوند. دمای پایین­تر از حد طبیعی منجربه کاهش تجزیه پروتئولیزاسیون شده، در حالی که با کاهش سرعت تشکیل پروتئین، زمان تشکیل صحیح پلی­پپتید در حال تولید را افزایش می­دهد (84).

کنترل اسیدیته (pH) محیط کشت: بهینه سازی اسیدیته برای رشد سلول، تشکیل و پایداری پروتئین ضروری است؛ بنابراین، تخمیر با اسیدیته کنترل­شده اغلب در سیستم بیانی پیکیا­پاستوریس انجام می­شود (83). تعیین اسیدیته بهینه به ویژگیهای منحصربه فرد هر پروتئین به خصوص پایداری آن پروتئین بستگی دارد (60). پیکیا­پاستوریس، قادر به رشد در محیط با اسیدیته­ای بین سه تا هفت است، لذا این امکان وجود دارد که اسیدیته محیط کشت مخمر بر اساس خصوصیات منحصر به فرد هر پروتئین تغییر کند (8).

کنترل اکسیژن محلول و القای متانول: اکسیژن محلول می­تواند با میزان جریان هوا کنترل شود. در بیشتر تخمیر­ها پس از اتمام کامل گلیسرول و شروع مصرف متانول، میزان اکسیژن محلول به طور مداوم در نرخ 30 تا 35 درصد نگهداری می­شود اما پروتئینهای متفاوت نیازمند سطوح مختلف اکسیژن هستند که تنها با تکرار آزمایش به دست می­آید (60).

و) غلظت سلولی مخمر پیکیا­پاستوریس: تولید پروتئینهای ترشح­شده با افزایش غلظت سلولی افزایش می­یابد اما متأسفانه در این راستا، تجمع دیگر مواد سلولی به خصوص آنزیمهای تجزیه کننده پروتئین به همان نسبت افزایش خواهد یافت. در چنین محیطی برخی از پروتئینهای ترشح شده به طور کامل پایدارند درحالی که سایر پروتئینها به طور قابل ملاحظه­ای کاهش می­یابند. سه رویکرد برای کاهش تأثیر آنزیمهای تجزیه کننده پروتئین برروی پروتئینهای خارجی ترشح شده در محیط کشت سلول پیکیا­پاستوریس وجود دارد: 1)افزودن اسیدآمینه­های مکمل نظیر پپتون و یا کاسامینواسید به محیط کشت که احتمال تجزیه محصول را کاهش می­دهد، 2)تغییر اسیدیته محیط کشت به سمتی که حداقل میزان پروتئازها در محیط وارد شود و 3) استفاده از یک سویه میزبان که در آن ژنهای PEP4 و PRB1(کدکننده آنزیمهای تجزیه­کننده پروتئین)، حذف شده باشد (8). برای مثال سویه­هایSMD1163 ، SMD1165،SMB1168  (5 و 80) وSMD1168H  (95) فاقد این دو ژن هستند که این خصوصیت در کاهش تجزیه بعضی پروتئینهای خارجی مؤثر است. لازم به ذکر است ژن PEP4 آنزیم پروتئینازA- و ژن PRB1 آنزیم پروتئینازB- را کدگذاری می­کند(60).

ز) غلظت متانول در محیط کشت مخمر پیکیا­پاستوریس: براساس یافته­های بار و همکارانش در سال 1992، غلظت متانول مورد استفاده در میزان بیان پروتئین مؤثر است. به طور کلی غلظتهای بین نیم تا یک درصد از متانول در محیط کشت پیکیا­پاستوریس استفاده می­شود. تجمع متانول می­تواند بر رشد سلول تأثیرات منفی به همراه داشته باشد و میزان بیان پروتئین را کم کند. بنابراین، دسترسی به سطوح بهینه متانول برای بیان هر پروتئین لازم است (22).

مدت زمان القاء: طول دوره القاء نیز بر روی پروتئولیزاسیون موثر است با گذشت زمان القاء، تعداد سلولهای زنده کم می­شود در نتیجه میزان تجزیه سلولی افزایش می­یابد (11).

ترشح پروتئین در مخمر پیکیا­پاستوریس: به طور کلی مخمر در مقایسه با قارچهای رشته­ای میزان کمی از پروتئینهای طبیعی خود را در محیط کشت ترشح می­کند. این خصوصیت، مخمر را به یک میزبان جذاب برای تولید پروتئینهای ترشحی تبدیل می­سازد زیرا در نهایت، خالص سازی محصول آسان و تجزیه محصول پروتئینی کمتر خواهد شد (83). بنابراین، پروتئین نوترکیب درصد زیادی از پروتئینهای کل محیط بیانی را تشکیل می­دهد (7). به هرحال به دلیل وجود شرایط و نیازمندیهای خاص نظیر پایداری و تاشدگی پروتئین، ترشح پروتئین اغلب برای پروتئینهایی توصیه می­شود که به طور طبیعی در میزبان اصلی خود ترشحی هستند (19).

شناسایی محصول نوترکیب ترشح شده در محیط کشت مخمر پیکیا­پاستوریس: تا به امروز سیستم بیانی مخمر در تولید مقادیر بالایی از بسیاری از پروتئینهای نوترکیب موفق بوده است. برای مثال میزان محصولات، بین  g/l10-1 در محیط کشت سویه­های پیکیا­پاستوریس گزارش شده­است. اما با این وجود تمام محصولات در این میزان در سطوح بالایی تولید نمی­شوند و برای شناسایی تمام محصولات نباید انتظار داشت که همواره باندی در ژل پلی اکریلآمید که توسط روش کوماسی بلو رنگ­آمیزی می­شود، مشاهده گردد. زیرا این روش یک روش اختصاصی نبوده و تنها بر اساس وزن مولکولی پروتئینها را جداسازی می­کند و قادر به شناسایی پروتئینها با مقادیر کمتر از میکروگرم نیست. با توجه به اینکه میزان تولید هر پروتئین در مخمر متفاوت است احتمال عدم شناسایی محصول با این روش وجود دارد. بنابراین، لازم است برای بررسی بیان یک ژن در یک سویه از مخمر نوترکیب از یک یا چند آزمون حساس برای تشخیص پروتئین استفاده شود. آزمایشها می­تواند بر مبنای فعالیت آنزیمی و یا استفاده از یک آنتی بادی علیه پروتئین یا محصول ژن موردنظر باشند (91). از جمله آزمونهای حساس می­توان به وسترن بلاتینگ، الایزا و فلوسایتومتری اشاره نمود.

محصولات تجاری تولید شده در پیکیا­پاستوریس: بر طبق گزارشات حاصل از سایت شرکت Pichia، در حال حاضر شمار زیادی از محصولات پروتئینی تولید شده در پیکیا­پاستوریس، برای کاربردهای صنعتی و دارویی وارد بازار شده است. این میزان در حدود هفتاد محصول نوترکیب است که در جدول 3 به تعدادی از آنها اشاره شده است (49).

همچنین در جدول 4، تعدادی از آنزیمهایی که به طور گسترده در صنایع کاغذ و خمیر کاغذ، منسوجات، صنایع مواد شوینده، و صنایع مواد غذایی و شیمیایی کاربرد دارند و در سطوح آزمایشگاهی در پیکیا­پاستوریس تولید شده، نشان داده شده است (34).

 

جدول 3- فهرست محصولات نوترکیب تجاری تولید شده در مخمر پیکیا­پاستوریس (49).

نام محصول نوترکیب

شرکت سازنده

کاربرد

 

Kalbitor® (DX-88 ecallantide, a recombinant kallikrein inhibitor protein)

Dyax (Cambridge, MA)

درمان آنژیوادم ارثی

Insugen® (recombinant human insulin)

Biocon (India)

درمان دیابت

Medway (recombinant human serum albumin)

Mitsubishi Tanabe
Pharma (Japan)

افزایش حجم خون

Shanvac ™ (recombinant hepatitis B vaccine)

Shantha/Sanofi (India)

پیش­گیری از هپاتیت B

Shanferon™ (recombinant interferon-alpha 2b)

Shantha/Sanofi (India)

درمان هپاتیت C و سرطان

Ocriplasmin (recombinant microplasmin)

ThromboGenics (Belgium)

درمان چسبندگی زجاجیه(VMA)

Nanobody® ALX-0061 (recombinant anti-IL6 receptor single domain antibody fragment)

Ablynx (Belgium)

درمان ورم مفاصل روماتیسمی

Nanobody® ALX00171 (recombinant anti-RSV single domain antibody fragment)

Ablynx (Belgium)

درمان عفونت ویروسی سینسیشال تنفسی(RSV)

Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF)

Trillium (Canada)

درمان التهاب درون شبکه­ای مثانه/ درمان سندرم درد مثانه (IC/BPS)

Purifine (recombinant phospholipase C)

Verenium/DSM (San Diego, CA/Netherlands)

صمغ زدایی از روغنهای حاوی میزان فسفر زیاد

Recombinant trypsin

Roche Applied Science (Germany)

هضم پروتئین­ها

Recombinant collagen

Fibrogen (San Francisco, CA)

واکنشگرهای تحقیقات پزشکی/ پرکننده­های غشایی

AQUAVAC IPN (recombinant infectious pancreatic necrosis virus capsid proteins)

Merck/Schering Plough Animal Health (Summit, NJ)

واکسن نکروز پانکراس عفونی در ماهی قزل آلا

Recombinant phytase

Phytex, LLC (Sheridan, IN)

افزودنی خوراک دام

Superior Stock recombinant nitrate reductase

The Nitrate Elimination Co. (Lake Linden, MI)

محصولات مبتنی بر آنزیم، جهت آزمایش و تصفیه آب

Recombinant human cystatin C

Scipac (United Kingdom)

واکنشگر تحقیقاتی

 

جدول 4- برخی از آنزیمهای نوترکیب تولید شده در پیکیا­پاستوریس (34).

آنزیم

پروموتر

توالی پیام ترشحی

میزان تولید محصول

زایلاناز

 

 

 

Endo-β-1,4-xylanase

pAOX1

α-MF

 mgl-160

Thermostable endoβ-1,4-xylanase

pAOX1

α-MF

 mgl-1148

Acidophilic endo-1,4-β-xylanase

pAOX1

native

 mgl-1178

سلولاز

 

 

 

Carboxy methyl cellulase

pAOX1

HAS

___

Endo- β-1,4-glucanase

pAOX1

α-MF

 mgl-165

پروتئاز

 

 

 

Aspartic protease

pAOX1

SUC2

___

Aspergillus oryzae

pAOX1

α-MF

 mgl-1513

Thermo monosporafusca

pGAP

α-MF

 Ul-1135

لیپاز

 

 

 

Lipase Lip2p

pAOX1

α-MF

 mgl-1630

Lipase

pGAP

α-MF

184 Ul-1

Lipase B

pGAP

α-MF

 mgl-188

آمیلاز

 

 

 

Salivary α-amylase

pAOX1

GKL

 mgl-10.24

α-Amylase

pAOX1

PHO1

 mgl-150

α-Amylase

pGAP

α-MF

500 Ul-1

فسفاتاز

 

 

 

Alkaline phosphatase

pAOX1

PHO1

 mgl-12

Phosphatase

pAOX1

α-MF

 mgl-110


مقایسه سیستم بیانی مخمر با دیگر سیستمهای تولیدی: در جدول 5 سیستمهای تولیدی متفاوت که تاکنون مطالعه شدند و یا برای بیان پروتئینهای نوترکیب استفاده شدند به طور خلاصه گنجانده­شده­اند. مزایا و معایب هر سیستم در این جدول مشخص شده­است (47).


جدول 5- مقایسه سیستمهای مختلف برای تولید پروتئینهای نوترکیب (47).

موارد مورد ارزیابی

سیستمهای تولیدی

باکتری

مخمر

سلولهای حشرات + باکلوویروس

سلولهای حیوانی(سلول CHO)

گیاهان ترانس­ژن

حیوانات ترانس­ژن

میزان تولید از نظر تئوری

+++++

+++++

+++

+

+++++

+++++

میزان تولید از نظر تجربی

++(+)

++(+)

+

+

++

++++

هزینه سرمایه گذاری

+++++

+++++

++

+

++++

+++

هزینه تولید

+++++

+++++

++

++

+++++

++++

انعطاف­پذیری سیستم

+++++

+++++

++

+

+++++

++++

پایداری سیستم بیانی

+++++

+++++

++++

+++

+++++

+++++

اصلاحات پس­ترجمه­ای

+

++

+++

++++

+++

++++

پایداری محصول نوترکیب تولیدشده

+++++

+++++

+++

+++

++++

++++

خالص سازی محصول

+++

+++

+++

++++

+++

+++

آلودگی سیستم تولیدی با پاتوژن­ها

+++++

+++++

+++++

+++

+++++

+++

میزان محصولات تولیدی در بازار

++++

+++

+++

+++++

+

+++

 


بحث و نتیجه گیری

تولید یک محصول نوترکیب با انتخاب یک میزبان مناسب آغاز می­شود. در این راستا مهم­ترین معیارهای موردنظر شامل: کیفیت، کمیت و میزان محصول است که ارتباط مستقیمی با کاربرد نهایی آن محصول دارد. کلید موفقیت برای افزایش تولید محصول، شناسایی تمام محدودیتهایی است که در مراحل ساخت آن نقش دارند. در حدود 20 درصد از پروتئینهای نوترکیب دارویی در میزبانهای مخمری، 30 درصد از آنها در باکتری اشریشیاکلی و 50 درصد در سلولهای یوکاریوتی تولید می­شوند. علی رغم این واقعیت، امروزه گرایش فراوانی برای جایگزینی میزبانهای میکروبی اصلاح شده نظیر مخمر و باکتری با سلولهای یوکاریوتی وجود دارد (65). از سویی دیگر، میزبانهای باکتریایی فاقد توانایی تغییرات پس از ترجمه پروتئینها هستند و بیشتر پروتئینهای تولید­شده در آنها به مرور زمان فعالیت خود را از دست می­دهند. به همین دلیل کاربرد باکتری برای تولید پروتئینهای پیچیده و نیازمند اصلاحات پس از ترجمه، در عمل حذف شده است (47 و 65). در میان میزبانهای میکروبی، مخمرها از جمله میکروارگانیسمهای مناسب برای تولید پروتئینهای نوترکیب به شمار می­روند (36، 47 و 88)؛ به دلیل آنکه این گونه­ها قابلیت دستکاری ژنتیکی آسان داشته، لذا رشد سریع بر روی محیط کشت ارزان قیمت با غلظت سلولی بالا و توانایی اصلاحات پس­ترجمه­ای پیچیده را دارند (23، 29، 36 و 65). علاوه بر این، محصولات نوترکیب تولید­شده در آنها عاری از سم و آلودگی به DNA ویروسی است (100). در طول 20 سال گذشته سیستمهای بیانی مخمر به طور موفقیت آمیزی در تحقیقات پایه و صنعت زیست­فناوری برای تولید و ترشح پروتئینهای نوترکیب با منشاء انسانی، حیوانی، گیاهی، قارچی، باکتریای و ویروسی استفاده شده­اند (26).

با توجه به مطالعات انجام گرفته می­توان اظهار داشت که مخمر پیکیا­پاستوریس شرایط لازم برای تولید پروتئینهای نوترکیب را دارد (10) زیرا این مخمر توانایی ترشح پروتئین نوترکیب انسانی و غیر انسانی با خصوصیات زیستی مورد انتظار را نشان داده است (23). با نگاهی به مطالعات لی و همکارانش در سال 2007 می­توان بیان داشت که وجه مشترک در میان تمام سیستمهای تولیدی مخمر پیکیا­پاستوریس، فقدان تشابه در جزئیات کار در فرآیند تولید است؛ که در نهایت مقایسه این سیستم تولیدی را در تحقیقات مختلف مشکل ساخته است (60). با وجود اینکه دستورالعملهای عمومی تخمیر پیکیا­پاستوریس به وسیله شرکت Invitrogen فراهم گردید اما بسیاری از مطالعات نشان می­دهد که بهینه سازی تولید پروتئینهای نوترکیب در پیکیا­پاستوریس باید بر مبنای تجربیات فردی انجام شود. همچنین علی­رغم کاربرد موفقیت آمیز پیکیا­پاستوریس در تحقیقات انجام شده، هنوز مطالعات بیشتری نیاز است تا درک عمیق­تری از پیامهای ترشحی، گلیکوزیلاسیون و آنزیمهای تجزیه کننده پروتئینها در پیکیا­پاستوریس به دست آید تا با پیشرفتهای بیشتر، مشکلات ترشح پروتئینهای پستانداران در این موجود بهبود یابد؛ و در نهایت منجر به تولید دامنه وسیع­تری از پروتئینهای خارجی در این سیستم شود.

تشکر و قدردانی

مطالعه حاضر با حمایت علمی و مالی پژوهشگاه رویان تهران انجام شده است.

1.Ahmad, M., Hirz, M, Pichler , H., and Schwab, H. (2014) Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production, Journal of Appl Microbiol Biotechnol, 98: 5301-5317.

2.Ascacio-Martinez, J.A., and Barrera-Saldana, H.A. (2004) Production and secretion of biologically active recombinant canine growth hormone by Pichia pastoris. J. Gene. 340: 261-266.

3.Beall, M.J., and Pearce, E.J. (2001) Human transforming growth factor-beta activates a receptor serine/threonine kinase from the intravascular parasite Schistoso mamansoni. J. Biol. Chem. 276: 31613-31619.

4.Berger, D.H., Feng, X.H., Yao, J., Saha, D., Beauchamp, R.D., and Lin, X. (2002) Resistance to transforming growth factor-beta occurs in the presence of normal Smad(signaling) activation. J. Surgery. 132: 310-316.

5.Brankamp, R.G., Sreekrishna, K., Smith, P.L., Blankenship, D.T., and Cardin, A.D., (1995) Expression of a synthetic gene encoding the anticoagulant-antimetastatic protein ghilanten by the methylotropic yeast Pichia pastoris. J. Protein. Expr. Purif. 6: 813-820.

6.Brierley, R.A., Bussineau, C., Kosson, R., Melton, A., and Siegel, R.S. (1990) Fermentation development of recombinant Pichia pastoris expressing the heterologous gene: bovine lysozyme. J. Ann. N. Y. Acad. Sci. 589: 350-362.

7.Burrowes, O.J., Diamond, G., and Lee, T.C. (2005) Recombinant expression of pleurocidincDNA using the Pichia pastoris expression system. J. Biomed. Biotechnol. 4: 374-384.

8.Byrd, J.C., Tarentino, A.L., Maley, F., Atkinson, P.H., and Trimble, R.B. (1982) Glycoprotein synthesis in yeast. Identification of Man8GlcNAc2 as an essential intermediate in oligosaccharide processing. J. Biol. Chem. 257: 14657-14666.

9.Cereghino, G.P., Cereghino, J.L., Ilgen, C., and Cregg, J.M. (2002) Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. J. Curr. Opin. Biotechnol. 13: 329-332.

10.Cereghino, J.L., and Cregg, J.M. (2000) Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. FEMS. Microbiol. Rev. 24: 45-66.

11.Chen, Y., Jin, M., Egborge, T., Coppola, G., Andre, J., and Calhoun, D.H. (2000) Expression and characterization of glycosylated and catalytically active recombinant human alpha-galactosidase A produced in Pichia pastoris. J. Protein. Expr. Purif. 20: 472-484.

12.Chiruvolu, V., Cregg, J.M., and Meagher, M.M. (1997) Recombinant protein production in an alcohol oxidase-defective strain of Pichia pastoris in fed-batch fermentations. J. Enzyme and Microbial Technology. 21: 277-283.

13.Clare, J.J., Rayment, F.B., Ballantine, S.P., Sreekrishna, K., and Romanos, M.A. (1991) High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. J. Biotechnology. 9: 455-460.

14.Clare, J.J., Romanos, M.A., Rayment, F.B., Rowedder, J.E., Smith, M.A., Payne, M.M., Sreekrishna, K., and Henwood, C.A. (1991) Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies. J. Gene 105: 205-212.

15.Cregg, J.M., and Madden, K.R. (1989) Use of site-specific recombination to regenerate selectable markers. J. Mol. Gen. Genet. 219: 320-323.

16.Cregg, J.M., and Russell, K.A. (1998) Transformation. J. Methods Mol. Biol. 103: p. 27-39.

17.Cregg, J.M., Barringer, K.J., Hessler, A.Y., and Madden, K.R., (1985) Pichia pastoris as a host system for transformations. J. Mol. Cell. Biol. 5: 3376-3385.

18.Cregg, J.M., Cereghino, J.L., Shi, J., and Higgins, D.R. (2000) Recombinant protein expression in Pichia pastoris. J. Mol. Biotechnol. 16: 23-52.

19.Cregg, J.M., Madden, K.R., Barringer, K.J., Till, G.P., and Stilman, C.A. (1989) Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris. J. Mol. Cell. Biol. 9: 1316-1323.

20.Cregg, J.M., Tschopp, J.F., Stillman, C., Siegel, R., Akong, M., Craig, W.S., et al. (1987) High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris. J. Nat. Biotech. 5: 479-485.

21.Cregg, J.M., Vedvick, T.S., and Raschke, W.C. (1993) Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. J. Nat. Biotech. 11: 905-910.

22.Daly, R., and Hearn, M.T. (2005) Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18: 119-138.

23.Damasceno, L.M., Huang, C.J., and Batt, C.A. (2012) Protein secretion in Pichia pastoris and advances in protein production. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93: 31-39.

24.Davey, J., Davis, K., Hughes, M., Ladds, G., and Powner, D. (1998) The processing of yeast pheromones. J. Semin. Cell. Dev. Biol. 9: 19-30.

25.De Schutter, K., Lin, Y.C., Tiels, P., Van Hecke, A., Glinka, S.,Weber-Lehmann, J., Rouzé, P.,Van de Peer, Y., and Callewaert, N. (2009) Genome sequence ofthe recombinant protein production host Pichia pastoris. J. Nat Biotechnol 27: 561–566.

26.Demain, A.L., and Vaishnav, P. (2009) Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. J. Biotechnol. Adv. 27: 297-306.

27.Du, C., Han, L., Xiao, A., and Cao, M. (2011) Secretory expression and purification of the recombinant duck interleukin-2 in Pichia pastoris. J. Microbiol. Biotechnol. 21: 1264-1269.

28.Ecamilla-Treviño, L. L., Viader-Salvadó, J. M., Barrera-Saldaña, H. A., and Guerrero-Olazarán, M., (2000) Biosynthesis and secretion of recombinant human growth hormone in Pichia pastoris. J. Biotechnol. Lett. 22: 109-114.

29.Eckart, M.R., and Bussineau, C.M., (1996) Quality and authenticity of heterologous proteins synthesized in yeast. J. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 525-530.

30.Egli, Th., Dijken, J.P., Veenhuis, M., Harder, W., and Fiechter, A. (1980) Methanol metabolism in yeasts: Regulation of the synthesis of catabolic enzymes. J. Archives of Microbiology. 4: 115-121.

31.Eldin, P., Pauza, M.E., Hieda, Y., Lin, G., Murtaugh, M.P., Pentel, P.R., and Pennell, C.A., 1997. High-level secretion of two antibody single chain Fv fragments by Pichia pastoris. J. Immunol. Methods. 201: 67-75.

32.Ellis, S.B., Brust, P.F., Koutz, P.J., Waters, A.F., Harpold, M.M., and Gingeras, T.R. (1985) Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatablegenes from the yeast Pichia pastoris. J. Mol. Cell. Biol. 5: 1111-1121.

33.Fan, Q.R., and Hendrickson, W.A. (2005) Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor. J. Nature 433: 269-277.

34.Fickers, P. (2014) Pichia pastoris: a workhorse for recombinant protein production. Journal of Current Research in Microbiology and Biotechnology, 2: 354-363.

35.Gellissen, G. (2000) Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 741-750.

36.Gellissen, G., Kunze, G., Gaillardin, C., Cregg, J.M., Berardi, E., Veenhuis, M., and van der Klei, I., (2005) New yeast expression platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and on dimorphic Arxula adeninivorans and Yarrowiali polytica - a comparison. J. FEMS. Yeast Res. 5: 1079-1096.

37.Gleeson, M.A. and Sudbery, P.E. (1988) The methylotrophic yeasts. J. Yeast. 4: 1-15.

38.Greenwald, J., Le, V., Corrigan, A., Fischer, W., Komives, E., Vale, W., and Choe, S. (1998) Characterization of the extracellular ligand-binding domain of the type II activin receptor. J. Biochemistry. 37: 16711-16718.

39.Grinna, L.S., and J.F. Tschopp. (1989) Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. J. Yeast. 5: 107-115.

40.Guerfal, M., Ryckaert, S., Jacobs, P.P., Ameloot, P., Van Craenenbroeck, K., Derycke, R., and Callewaert, N. (2010) The HAC1 gene from Pichia pastoris: characterization and effect of its overexpression on the production of secreted, surface displayed and membrane proteins. J. Microb. Cell. Fact. 9: 1-12.

41.Gurramkonda, C., Polez, S., Skoko, N., Adnan, A., Gabel, T., Chugh, D., Swaminathan, S., Khanna, N., Tisminetzky, S., and Rinas, U. (2010) Application of simple fed-batch technique to high-level secretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequent purification and conversion to human insulin. J. Microb. Cell. Fact. 9: 1-11.

42.Hamilton S.R., Bobrowicz, P., Bobrowicz, B., Davidson, R.C., Li, H., Mitchell, T., et al. (2003) Production of complexhuman glycoproteins in yeast. Journal of Science .301: 1244–1246.

43.Hartner, F.S., and Glieder, A. 2006. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. J. Microb. Cell. Fact. 5: 1-21.

44.Higgins, D.R., Busser, K., Comiskey, J., Whittier, P.S., Purcell, T.J., and Hoeffler, J.P. (1998) Small vectors for expression based on dominant drug resistance with direct multicopy selection. J. Methods Mol. Biol. 103: 41-53.

45.Hitzeman, R.A., Hagie, F.E., Levine, H.L., Goeddel, D.V., Ammerer, G., and Hall, B.D. (1981) Expression of a human gene for interferon in yeast. J. Nature. 293: 717-722.

46.Holst, B., Bruun, A.W., Kielland-Brandt, M.C., and Winther, J.R. (1996) Competition between folding and glycosylation in the endoplasmic reticulum. J.EMBO. 15: 3538-3546.

47.Houdebine, L.M. (2009) Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. J. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 32: 107-121.

48.Howles, C.M. (1996) Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). J. Hum. Reprod. Update. 2: 172-191.

49.http://www.pichia.com/science-center/commercialized-products/

50.Inan, M., and Meagher, M.M. (2001) Non-repressing carbon sources for alcohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris. J. Biosci. Bioeng. 92: 585-589.

51.Jacobs, P.P., Geysens, S., Vervecken, W., Contreras, R., and Callewaert, N. (2009) Engineering complex-type N-glycosylation in Pichia pastoris using GlycoSwitch technology. J. Nat. Protoc. 4: 58-70.

52.Jacobs, P.P., Inan, M., Festjens, N., Haustraete, J., Van Hecke, A., Contreras, R., Meagher, M.M. and Callewaert, N. (2010) Fed-batch fermentation of GM-CSF-producing glycoengineered Pichia pastoris under controlled specific growth rate. J. Microb Cell Fact. 9: 1475-2859.

53.Jungo, C., Marison, I., and von Stockar, U. (2007) Mixed feeds of glycerol and methanol can improve the performance of Pichia pastoris cultures: A quantitative study based on concentration gradients in transient continuous cultures. J. Biotechnol. 128: 824-837.

54.Kang, H.A., Choi, E.S., Hong, W.K., Kim, J.Y., Ko, S.M., Sohn, J.H., and Rhee, S.K. (2000) Proteolytic stability of recombinant human serum albumin secreted in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 575-582.

55.Kazeto, Y., Kohara, M., Miura, T., Miura, C., Yamaguchi, S., Trant, J.M., Adachi, S., and Yamauchi, K. (2008) Japanese eel follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH): production of biologically active recombinant FSH and LH by Drosophila S2 cells and their differential actions on the reproductive biology. J. Biol. Reprod. 79: 938-946.

56.Kern, A., Hartner, F.S., Freigassner, M., Spielhofer, J., Rumpf, C., Leitner, L., Frohlich, K.U., and Glieder, A. (2007) Pichia pastoris just in time alternative respiration. J. Microbiology. 153: 1250-1260.

57.Krainer, F. W., Dietzsch, C., Hajek, T., Herwig, C., Spadiut, O., and Glieder, A. (2012) Recombinant protein expression in Pichia pastoris strains with an engineered methanol utilization pathway. J. Microb. Cell. Fact. 11: 1-14.

58.Laroche, Y., Storme, V., De Meutter, J., Messens, J., and Lauwereys, M. (1994) High-level secretion and very efficient isotopic labeling of tick anticoagulant peptide (TAP) expressed in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. J. Biotechnology. 12: 1119-1124.

59.Li, J.F., Zhao, S.G., Tang, C.D., Wang, J.Q., and Wu, M.C. (2012) Cloning and functional expression of an acidophilic beta-mannanase gene (Anman5A) from Aspergillusniger LW-1 in Pichia pastoris. J. Agric. Food. Chem. 60: 765-7.

60.Li, P., Anumanthan, A., Gao, X.G., Ilangovan, K., Suzara, V.V., Duzgunes, N., and Renugopalakrishnan, V., (2007) Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris. J. Appl. Biochem. Biotechnol. 142: 105-124.

61.LinCereghino, G.P., Lin Cereghino, J., Sunga, A.J., Johnson, M.A., Lim, M., Gleeson, M.A., and Cregg, J.M. (2001) New selectable marker/auxotrophic host strain combinations for molecular genetic manipulation of Pichia pastoris. J. Gene.263: 159-169.

62.Liu, H., Tan, X., Veenhuis, M., McCollum, D., and Cregg, J.M. (1992) An efficient screen for peroxisome-deficient mutants of Pichia pastoris. J. Bacteriol. 174: 4943-4951.

63.Lu, H., Huang, J., Li, G., Ge, K., Wu, H., and Huang, Q. (2012) Expression, purification and characterization of recombinant human serine proteinase inhibitor Kazal-type 6 (SPINK6) in Pichia pastoris. J. Protein Expr. Purif. 82: 144-149.

64.Macauley-Patrick, S., Fazenda, M.L., McNeil, B., and Harvey, L.M. (2005) Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. J. Yeast. 22: 249-270.

65.Mattanovich, D., Branduardi, P., Dato, L., Gasser, B., Sauer, M., and Porro, D. (2012) Recombinant protein production in yeasts. J. Methods Mol. Biol. 824: 329-358.

66.Oka, C., Tanaka, M., Muraki, M., Harata, K., Suzuki, K., and Jigami, Y. (1999) Human lysozyme secretion increased by alpha-factor pro-sequence in Pichia pastoris. J. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 1977-1983.

67.Orman, M.A., Calik, P., and Ozdamar, T.H. (2009) The influence of carbon sources on recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris is dependent on phenotype: a comparison of Muts and Mut+ strains. J. Biotechnol. Appl. Biochem. 52: 245-255.

68.Paifer, E., Margolles, E., Cremata, J., Montesino, R., Herrera, L., and Delgado, J.M. (1994) Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences. J. Yeast. 10: 1415-1419.

69.Pan R., Zhang J., Shen W.L., et al. (2011) Sequential deletion of Pichia pastoris genes by a self-excisable cassette. FEMS Yeast Res. 11: 292–298.

70.Pla, I.A., Damasceno, L.M., Vannelli, T., Ritter, G., Batt, C.A., and Shuler, M.L. (2006) Evaluation of Mut+ and MutS Pichia pastoris phenotypes for high level extracellular scFv expression under feedback control of the methanol concentration. J. Biotechnol. Prog. 22: 881-888.

71.Prinz, B., Schultchen, J., Rydzewski, R., Holz, C., Boettner, M., Stahl, U., and Lang, C., (2004) Establishing a versatile fermentation and purification procedure for human proteins expressed in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris for structural genomics. J. Struct. Funct. Genomics. 5: 29-44.

72.Rees, G.S., Gee, C.K., Ward, H.L., Ball, C., Tarrant, G.M., Poole, S., and Bristow, A.F. (1999) Rat tumour necrosis factor-alpha: expression in recombinant Pichia pastoris, purification, characterization and development of a novel ELISA. J. Eur. Cytokine. Netw. 10: 383-392.

73.Romanos, M.A., Scorer, C.A., and Clare, J.J. (1992) Foreign gene expression in yeast: a review. J. Yeast. 8: 423-488.

74.Schutter, K., Lin, Y.C., Tiels, p., Van Hecke, A., Glinka, S., and Weber-Lehmann, J. (2009) Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris, j. of Nat Biotechnol, 27: 561-56.

75.Sears, I.B., O'Connor, J., Rossanese, O.W., and Glick, B.S. (1998) A versatile set of vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pastoris. J. Yeast. 14: 783-790.

76.Shen, S., Sulter, G., Jeffries, T.W., and Cregg, J.M., (1998) A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. J. Gene. 216: 93-102.

77.Sibirny, A.A., Titorenko, V.I., Efremov, B.D., and Tolstorukov, I.I. (1987) Multiplicity of mechanisms of carbon catabolite repression involved in the synthesis of alcohol oxidase in the methylotrophic yeast Pichia pinus. J. Yeast. 3: 233-241.

78.Siegel, R.S., and Brierley, R.A. (1989) methylotrophic yeast Pichia pastoris produced in high-cell-density fermentations with high cell yields as vehicle for recombinant protein production. J. Biotechnol. Bioeng. 34: 403-404.

79.Sigoillot, M., Brockhoff, A., Lescop, E., Poirier, N., Meyerhof, W., and Briand, L. (2012) Optimization of the production of gurmarin, a sweet-taste-suppressing protein, secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 4: 4-6.

80.Sinha, J., Plantz, B.A., Inan, M., and Meagher, M.M. (2005) Causes of proteolytic degradation of secreted recombinant proteins produced in methylotrophic yeast Pichia pastoris: case study with recombinant ovine interferon-tau. J. Biotechnol. Bioeng. 89: 102-112.

81.Sleep, D., Belfield, G.P., and Goodey, A.R. (1990) The secretion of human serum albumin from the yeast Saccharomyces cerevisiae using five different leader sequences. J. Biotechnology. 8: 42-46.

82.Smeekens, S.P. (1993) Processing of protein precursors by a novel family of subtilisin-related mammalian endoproteases. J. Biotechnology. 11: 182-186.

83.Soden, D.M., O'Callaghan, J., and Dobson, A.D. (2002) Molecular cloning of a laccaseisozyme gene from Pleurotussajor-caju and expression in the heterologous Pichia pastoris host. J. Microbiology. 148: 4003-4014.

84.Sreekrishna, K., Brankamp, R.G., Kropp, K.E., Blankenship, D.T., Tsay, J.T., Smith, P.L., et al. (1997) Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Gene. 190: 55-62.

85.Sreekrishna, K., Nelles, L., Potenz, R., Cruze, J., Mazzaferro, P., Fish, W., et al. (1989) High-level expression, purification, and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Biochemistry. 28: 4117-4125.

86.Stockmann, C., Scheidle, M., Dittrich, B., Merckelbach, A., Hehmann, G., Melmer, Get al., (2009) Process development in Hansenula polymorpha and Arxula adeninivorans, a re-assessment. J. Microb. Cell. Fact. 8: 1-10.

87.Stratton, J., Chiruvolu, V., and Meagher, M. (1998) High cell-density fermentation. J. Methods Mol. Biol. 103: 107-120.

88.Thiry, M. and Cingolani, D. (2002) Optimizing scale-up fermentation processes. J. Trends Biotechnol. 20: 103-105.

89.Trimble, R.B., Atkinson, P.H., Tschopp, J.F., Townsend, R.R., and Maley, F. (1991) Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Biol. Chem. 266: 22807-22817.

90.Tschopp, J.F., Sverlow, G., Kosson, R., Craig, W., and Grinna, L. (1987) High-Level Secretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia Pastoris. J. Nat. Biotech. 5: 1305-1308.

91.Van Ooyen, A.J., Dekker, P., Huang, M., Olsthoorn, M.M., Jacobs, D.I., Colussi, P.A., and Taron, C. H. (2006) Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis. J. FEMS Yeast Res. 6: 381–392.

92.Vedvick, T., Buckholz, R.G., Engel, M., Urcan, M., Kinney, J., Provow, S., Siegel, R.S., and Thill, G.P. (1991) High-level secretion of biologically active aprotinin from the yeast Pichia pastoris. J. Ind. Microbiol. 7: 197-201.

93.Veenhuis, M., Van Dijken, J.P., and Harder, W. (1983) The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts. J. Adv. Microb. Physiol. 24: 1-82.

94.Waterham, H.R., de Vries, Y., Russel, K.A., Xie, W., Veenhuis, M., and Cregg, J.M. (1996) The Pichia pastoris PER6 gene product is a peroxisomal integral membrane protein essential for peroxisome biogenesis and has sequence similarity to the Zellweger syndrome protein PAF-1. J. Mol. Cell. Biol. 16: 2527-2536.

95.White, C.E., Kempi, N.M., and Komives, E.A. (1994) Expression of highly disulfide-bonded proteins in Pichia pastoris. J. Structure. 2: 1003-1005.

96.Yokoyama, S. (2003) Protein expression systems for structural genomics and proteomics. J. Curr. Opin. Chem. Biol. 7: 39-43.

97.Yu, X., Lin, S.W., Kobayashi, M., and Ge, W., (2010) Expression of recombinant zebrafish follicle-stimulating hormone (FSH) in methylotropic yeast Pichia pastoris. J. Fish Physiol. Biochem. 36: 273-281.

98.Zanchin, N.I., McCarthy, J.E. (1995) Characterization of the in vivo phosphorylation sites of the mRNA.cap-binding complex proteins eukaryotic initiation factor-4E and p20 in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 270: p. 26505-26510.

99.Zhang, A.L., Luo, J.X., Zhang, T.Y., Pan, Y.W., Tan, Y.H., Fu, C.Y., and Tu, F.Z. (2009) Recent advances on the GAP promoter derived expression system of Pichia pastoris. J. Mol. Biol. Rep. 36: 1611-1619.

100.Zhang, W., Inan, M., and Meagher, M. (2000) Fermentation strategies for recombinant protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Biotechnology and Bioprocess Engineering 5: 275-287.