نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه گلستان

چکیده

در حال حاضر روش‌های in silico یکی از کم هزینه‌ترین و سریعترین روش‌های موجود جهت طراحی و کشف دارو در زمینه درمان محسوب می گردد. در این مطالعه ما علاقه‌مند شدیم تا با انجام طراحی محاسباتی دارو به روش داکینگ مولکولی ترکیباتی را معرفی کنیم که نقش موثری در مهار پلی‌مریزاسیون توبولین‌ها به عنوان عوامل اصلی تقسیم سلولی در تومورهای سرطانی دارند. بدین منظور ترکیبات کرومنی که توسط محققین مختلف خواص ضد سرطانی آنها مورد آزمایش قرار گرفته بودند، جمع آوری، و بر اساس جایگاه اتصال آنها به توبولین، آنالوگ‌های جدیدی طراحی شدند. سپس، با استفاده از روش داکینگ مولکولی توسط نرم افزار آکادمیک AutoDock Vina ترکیبات قوی‌تر شناسایی شدند و برهمکنش‌های احتمالی این ترکیبات با جایگاه اتصال کلشی‌سین در توبولین آنالیز شد. با توجه به اینکه ترکیبات طراحی شده با مقدار انرژی پایین‌تری نسبت به کلشی‌سین به ساختار پروتئین داک شدند، می‌توانند به عنوان ترکیبات بالقوه دارویی مورد ارزیابی‌های بعدی قرار بگیرند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Designing new chromene compounds with anticancer activity and studying their interaction with tubulin by molecular docking method

نویسندگان [English]

  • Mostafa Javaheri Moghadam
  • Hasan Aryapour
  • Ali Akbar Dehno Khalaji

Golestan University

چکیده [English]

Currently, in silico methods considered as one of the least expensive and fastest ways for drug design and discovery in the field of therapy. In the present study, we were interested to introduce compounds, which have an important role in inhibiting tubulins polymerization as the main factor of cell division in cancerous cells using computational drug design, especially molecular docking method. For this purpose, chromene compounds, which their anticancer properties had been tested by several researchers, were gathered and based on their binding site of tubulin, new analogs were designed. Then, by using AutoDock Vina software, stronger compounds which had the lowest affinity energy, were identified and their possible interaction with the colchinine binding site analyzed by LigPlot and UCSF Chimera. Given that newly designed compounds docked to the protein structure with lower affinity energy than colchicine as the control sample, they could be the subject of further assessment as the potential pharmaceutical compounds.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Tubulin
  • Chromene
  • Molecular Docking
  • Cancer

طراحی ترکیبات کرومنی جدید با فعالیت ضد سرطانی و بررسی چگونگی میانکنش آنها با توبولین به روش داکینگ مولکولی

مصطفی جواهری مقدم 1، حسن آریاپور1* و علی­اکبر دهنوخلجی2

1 گرگان، دانشگاه گلستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

2 گرگان، دانشگاه گلستان، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی

تاریخ دریافت: 21/9/92               تاریخ پذیرش: 11/5/93 

چکیده

در حال حاضر روشهای in silico یکی از کم هزینه­ترین و سریع ترین روشهای موجود جهت طراحی و کشف دارو در زمینه درمان محسوب می­گردد. این مطالعه بر آن است تا با انجام طراحی محاسباتی دارو به روش داکینگ مولکولی ترکیباتی را معرفی کند که نقش مؤثری در مهار پلی­مریزاسیون توبولین­ها به عنوان عوامل اصلی تقسیم سلولی در تومورهای سرطانی دارند. بدین منظور ترکیبات کرومنی که توسط محققین مختلف خواص ضد سرطانی آنها مورد آزمایش قرار گرفته بودند، جمع­آوری و بر اساس جایگاه اتصال آنها به توبولین، آنالوگهای جدیدی طراحی شدند. سپس، با استفاده از روش داکینگ مولکولی توسط نرم افزار آکادمیک AutoDock Vina ترکیبات قویتر شناسایی شدند و برهمکنشهای احتمالی این ترکیبات با جایگاه اتصال کلشی­سین در توبولین آنالیز شد. با توجه به اینکه ترکیبات طراحی شده با مقدار انرژی پایین­تری نسبت به کلشی­سین به ساختار پروتئین داک شدند، می­توانند به عنوان ترکیبات بالقوه دارویی مورد ارزیابیهای بعدی قرار بگیرند.

واژه های کلیدی: توبولین، کرومن، داکینگ مولکولی، سرطان

* نویسنده مسئول، تلفن: 01714427173، پست الکترونیکی: aryapour@ibb.ut.ac.ir

مقدمه

 

سرطان یکی از پر چالش­ترین بیماریهای است که بشر تاکنون با آن روبرو بوده و هنوز به عوامل درمانی مؤثر زیادی نیاز است تا با رشد خارج از کنترل تومورهای بدخیم بتوان مقابله کرد. ثابت شده است که ترکیبات ضد سرطانی طبیعی در بین داروهای ضد سرطانی جزء دسته درمانی موفق بوده­اند (28). عوامل متصل شونده به میکروتوبول به طور وسیعی در شیمی درمانی سرطان استفاده می­شوند. این عوامل منجر به اختلال در ناپایداری دینامیک میکروتوبول­ها در طی فرآیند پلی­مریزاسیون و دپلی­مریزاسیون می­گردند. احتمالاً مهمترین نقشی که میکروتوبول­ها در سلول ایفاء می­کنند، شرکت در فرآیند میتوز و عملکرد صحیح دوکها می­باشد. اختلال در فرآیند تجمع میکروتوبول­ها چه با مهار پلی­مریزاسیون توبولین­ها و چه با مهار دپلی­مریزاسیون، منجر به افزایش شمار سلولهایی می­شود که در مرحله متافاز متوقف می­شوند. بنابراین هدف­گیری توبولین­ها به عنوان اجزاء اصلی میکروتوبول­ها راهکار مهمی در کنترل سرطان است. تا کنون مشخص شده است که ترکیبات مختلف زیادی به میکروتوبول­ها متصل می­شوند. به لحاظ جایگاه اتصال این ترکیبات به چهار گروه تقسیم می­گردند (شکل1) که عبارتند از: 1- لیگاندهایی که به جایگاه تاکسول (T) اتصال می­یابند، 2- لیگاندهایی که به جایگاه وینبلاستین (V) اتصال می­یابند، 3- لیگاندهایی که به جایگاه بنزایمیدازول (B) اتصال می­یابند و 4- لیگاندهایی که به جایگاه کلشی­سین (C) اتصال می­یابند. این ترکیبات میکروتوبول­ها را ناپایدار می­کنند و منجر به آپوپتوز سلولی می­شوند (11).

آپوپتوز فرآیندی است که طی آن ارگانیسم می تواند تعداد سلولهایش را کنترل و سلولهایی را که غیرضروریند و تهدیدی احتمالی برای بقای آن به حساب می آید را محدود کند. تعادل مناسب بین آپوپتوز و مهار آپوپتوز در حفظ همئوستازی و مورفولوژی اندام اهمیت دارد. از آنجایی که خیلی از سلولهای سرطانی مهار غیرطبیعی آپوپتوز را نشان می­دهند، این مسئله اهمیت ویژه­ای در جستجو و طراحی القاء کننده­های آپوپتوز به عنوان عوامل بالقوه ضد سرطانی پیدا می­کند (23).

با در نظر گرفتن این مطلب که طراحی دارو کاری است چند بعدی، لذا روش قدیمی نشستن و خیره شدن به ساختارهای شیمیایی روی کاغذ برای سنتز و غربالگری طیف گسترده­ای از ترکیبات نا امید کننده است. همچنین مشکلات مربوط به مدیریت داده­ها با حجیم تر شدن آنها افزایش می­یابد. دارو علاوه بر فعالیت مناسب باید فراهمی زیستی خوراکی بالا، سمیت پایین، قابلیت ثبت علمی و نیمه عمر کافی در جریان خون داشته باشد. هزینه تولید یک ترکیب دارویی موضوع مهمی است، که برای داروهای انسانی کمتر، برای داروهای دامپزشکی بیشتر و برای ترکیبات شیمیایی کشاورزی بسیار اهمیت دارد. برنامه­های رایانه­ای برای تحلیلهای چند بعدی، بهینه­سازی و انتخاب ترکیبات پیشرو ایجاد شده­اند (41).

روش محاسباتی طراحی دارو بر اساس ساختار، که در آن مولکولهای کوچک درون ساختار ماکرومولکولهای هدف "داک" می­شوند و به اتصال آنها در جایگاه مورد نظرامتیاز داده می­شود به طور گسترده­ای در تعیین نحوه برخورد، یافتن و بهینه سازی ترکیبات رهبر کاربرد دارد. در واقع تاکنون توسعه شماری از داروها نظیر مهار کننده پروتئاز HIV به طور زیادی تحت تأثیر یا بر پایه طراحی براساس ساختار و استراتژیهای غربالگری بوده است (29).

 

شکل 1- نمایی از جایگاههای اتصال لیگاند­های مختلف بر روی هترودیمر αβ- توبولین (13).

کرومنها ترکیباتی هستند که در بسیاری از ارگانیسم­های دریایی نظیر شاخه کورنتراتا، ماهیها، اسفنجها، نیامداران و جلبکهای بزرگ با خواص بیولوژیکی متنوع یافت می شوند (19). ترکیبات کرومنی خواص سایتوتاکسیک شدید و همین طور توانایی مهار پلی­مریزاسیون توبولین­ها را نشان می­دهند. که مکانیسم اصلی عمل این دسته از ترکیبات القای آپوپتوز می­باشد. این ترکیبات و همچنین مشتقات آن نمونه­های بالینی بسیار خوبی برای درمان سرطان در انسانها هستند. به علاوه ثابت شده است که تعدادی از این ترکیبات را می­توان به عنوان پیش دارو در نظر گرفت، که جزء عوامل شیمی درمانی برای هدف­گیری رگهای توموری هستند و فعالیت ضد رگزایی دارند. جایگاه اتصال آنها نزدیک به محل اتصال کلشی­سین است، و در سلولهای مقاوم به دارو نسبت به عوامل ضد میتوزی دیگر مثل تاکسانها و وینکاها فعال باقی می­مانند، بنابراین می­توانند در درمان سرطانهای مقاوم به دارو یک مزیت به حساب آیند (23 و 34).

تاکنون مشتقات زیادی از کرومنها استخراج یا طراحی و سنتز شده­اند ولی هیچ گونه مطالعه شبیه­سازی مولکولی در ارتباط با میانکنش این ترکیبات با هترودیمر توبولین صورت نگرفته است بنابراین در این تحقیق تصمیم گرفته شد تا یک سری مطالعات داکینگ و شبیه­سازی مولکولی بر روی تعدادی کرومن منتخب اجرا گردد با این هدف که فهم بهتری نسبت به چگونگی اتصال این دسته از ترکیبات درون توبولین به دست آید. نتایج به دست آمده می­تواند در ادامه روند طراحی و سنتز ترکیبات مؤثرتر، مفید واقع شود.

مواد و روشها

آماده­سازی پروتئین: ساختار کریستالوگرافی شده توبولین به همراه کلشی­سین با قدرت تفکیک 73/2 آنگستروم از بانک اطلاعات پروتئین دانلود گردید (PDB ID: 3UT5). دیمر α و β توبولین به همراه هترومولکولهای GDP، GTP و Mg از بقیه بخشهای اضافی استخراج شدند. لوپها و رزیدوهای از دست رفته در فایل کریستالوگرافی که شامل لوپ­های 46-38 و 451-440 از زیرواحد α-توبولین و 455-442 از زیرواحد β-توبولین هستند، توسط برنامه Modeller9.11 (15) به روش چند الگویی بازسازی شدند، این نواحی از دست رفته پروتئین 3UT5 در الگوهای پروتئینی استفاده شده نظیر 1FFX، 2XRP و 4I4T دارای ساختار رندوم کویل بودند. در نهایت سکانس و ساختار سه بعدی پروتئین کریستالوگرافی شده با سکانس و ساختار سه بعدی پروتئین مدل سازی شده و همین طور شبیه­سازی شده ، توسط برنامه UCSF Chimera (33) تطبیق داده شدند. کلشی­سین و تمامی هترواتمها به غیر از کوآنزیمها و کوفاکتورها از دیمر توبولین حذف شدند سپس با استفاده از برنامه AutoDockTools (35)، بعد از معین کردن بار Gasteiger (17)، اتمهای هیدروژن قطبی، به توبولین اضافه شدند.

بهینه­سازی پروتئین همولوژی شده به روش شبیه­سازی دینامیک مولکولی: برای بهبود جهت­گیری زنجیره­های جانبی، متعادل­سازی پروتئین و همچنین آرایش صحیح اتمها، از شبیه­سازی دینامیک مولکولی با به کارگیری میدان نیروی CHARMM27 (8) استفاده گردید. پارامترهای کوآنزیمها توسط سرور SwissParam (42) محاسبه شدند. کمپلکس پروتئین-کوآنزیم در جعبه مکعبی با حفظ شرایط PBC و فاصله nm1 با لبه جعبه در تمام جهات درون محلول آبی با فرمت TIP3P قرار گرفت. با جایگزینی یون Na+ بار کلی سیستم خنثی و نوع میانکنشهای الکترواستاتیک PME تعیین گردید. کمینه­سازی اولیه انرژی برای عاری کردن سیستم از برهمکنشهای پرانرژی و برخوردهای حاصل از ممانعتهای فضایی تا رسیدن به مقدار انرژی kJ/mol1000 برای مدت زمان 50 پیکو ثانیه انجام شد. طول تمام پیوندها توسط الگوریتم LINCS (20) محدود شدند. سپس سیستم مورد نظر به ترتیب در دما ی ثابت 310 کلوین و فشار ثابت 1 بار به مدت 50 پیکو ثانیه به تعادل رسید. در نهایت محاسبات دینامیک مولکولی به مدت 5 نانو ثانیه به وسیله سرور تحت وب GROMACS که بخشی از تورین WeNMR می­باشد، انجام گرفت (37 و 39). نتایج حاصل از شبیه سازی توسط برنامه Grace مورد ارزیابی قرار گرفت (3).

آماده­سازی لیگاند: ابتدا تمامی ساختارهای ترکیبات کرومنی از مقالاتی که تا سال 2011 منتشر شده بودند استخراج، با استفاده از  برنامه کاربردی MarvinSketch ترسیم و همین طور با کمک برنامه کاربردی MolConverter از مجموعه ChemAxon (4) بهینه­سازی و به ساختار سه بعدی تبدیل شدند،که مجموعاً حاوی 189 ترکیب شامل 125 ترکیب از کارهای Kemnitzer و همکاران(9, 22-27)، 8 ترکیب از کار Pinney و همکاران(34)، 9 ترکیب از کار Batista و همکاران(7)، 4 ترکیب از کار Endo و همکاران(14)، 4 ترکیب از کار Conti و همکاران(12)، 15 ترکیب از کار Mun و همکاران(31) و نهایتاً 24 ترکیب از کار Cheng و همکاران(10) می­باشد. با در نظر گرفتن این ترکیبات و کانفورماسیون آمینو اسیدهای موجود در جایگاه کشی­سین 100 آنالوگ جدید طراحی شدند و با استفاده از برنامه کاربردی Evaluator از مجموعه ChemAxon (4) بر اساس اصل پنجم لیپینسکی (30) آنالوگهای نامناسب از سایر آنالوگها طراحی شده، فیلتر شدند.

داکینگ مولکولی: فرآیند داکینگ لیگاندها به جایگاه اتصال کلشی­سین در پروتئین توبولین با استفاده از نرم­افزار AutoDock Vina انجام گرفت (36). تمامی محاسبات داکینگ با استفاده از الگوریتم بهینه کننده جستجوی محلی تکرار شونده با در نظر گرفتن پروتئین به صورت انعطاف­ناپذیر و لیگاند به صورت انعطاف­پذیر انجام شد. جعبه گرید با ابعاد 29×29×29 نقطه ساخته و در محدوده جایگاه اتصال کلشی­سین قرار داده شد. فاصله گرید Å 1000 و سایر پارامترها به صورت پیش­فرض در نظر گرفته شدند. پس از انجام داکینگ بهترین کانفورماسیون با پایین­ترین میزان انرژی اتصال، به عنوان نتیجه انتخاب شد. در نهایت مؤثرترین ترکیبات انتخاب و میانکنشهای هیدروژنی و هیدروفوبی کمپلکس توبولین-لیگاند و طول پیوندهای هیدروژنی به وسیله نرم افزار UCSF Chimera و LigPlot آنالیز گردید (38).

 

 

شکل2- انطباق سکانسهای کریستالوگرافی و مدل سازی شده پروتئین 3UT5 که با استفاده از نرم­افزار UCSF Chimera صورت گرفت. رنگ آمیزی سکانسها بر اساس ساختار دو بعدی پروتئین صورت گرفت. نواحی سبز مربوط به صفحات بتا، آبی مارپیچهای آلفا و قرمز مربوط به رندوم کویلها می­باشد. نواحی که دارای رزیدوهای گمشده­اند به صورت نقطه چین به نمایش درآمدند.


نتایج

پروتئین: سکانسهای هر دو پروتئین کریستالوگرافی و مدل سازی شده نیز با کمک نرم افزار UCSF Chimera بر روی هم منطبق و بر مبنای ساختار دو بعدی رنگ آمیزی و شاخص یکسانی آنها سنجیده شد (شکل2)، میزان یکسانی برای زنجیره­های A برابر با 96 درصد و برای زنجیره­های B برابر با 97 درصد مشاهده شد. در این تطبیق رزیدوهای گمشده در کریستالوگرافی به صورت خط چین نشان داده شده است. همچنین فایل کریستالوگرافی شده 3UT5 نسبت به سکانس اصلی توبولین دارای رزیدوهای گمشده شامل یک لوپ در زنجیره آلفا و دو لوپ در C ترمینالهای هر دو زنجیره بود، که با کمک برنامه Modeller بازسازی و همولوژی شدند، سپس پروتئین مدل سازی شده توسط برنامه GROMACS به مدت 5 نانو ثانیه شبیه­سازی دینامیک مولکولی شد. ساختار سه بعدی پروتئین کریستالوگرافی با ساختار پروتئین مدل سازی شده (شکل3.الف) و پروتئین شبیه­سازی شده (شکل3.ب) مقایسه شد. مقدار RMSD حاصل از شبیه­سازی 5/0آنگسترم می­باشد. آنالیز نتایج حاصل از شبیه سازی دینامیک ملکولی پروتئین 3UT5 مدل سازی شده نشان داد که پروتئین مورد نظر بعد از حدود یک نانو ثانیه به تعادل رسیده است (شکل4).

داکینگ: تمام محاسبات داکینگ توسط برنامه Vina صورت گرفت که طی آن 100 ترکیب تازه طراحی شده همراه با کلشی­سین به عنوان نمونه کنترل مثبت به درون ساختار پروتئین داک شدند. انرژی تمایل ترکیبات به پروتئین هدف به صورت kcal/mol محاسبه شد، هرچه مقدار انژری کمتر باشد تمایل لیگاند به جایگاه اتصال بیشتر می­باشد و برعکس. این میزان برای کلشی­سین برابر با (kcal/mol)6/7- برآورد شد. از بین ترکیبات طراحی شده نیز 5 ترکیب پایین­ترین میزان انرژی را از خود نشان دادند مقادیر انرژی تمایل این ترکیبات به پروتئین هدف در جدول1 ارائه شده است. ساختار این ترکیبات نیز در شکل 5 نشان داده شده است.

جهت معتبر سازی نتایج حاصل از داکینگ ترکیبات طراحی شده از مولکول کلشی­سین موجود در ساختار کریستاله پروتئین 3UT5 استفاده گردید. صحت نتایج، از مقایسه حالت پیش­بینی شده لیگاند کلشی­سین نسبت به حالت کریستاله آن و اندازه­گیری مقدار RMSD تأیید شد.

 

شکل3- الف- ساختار پروتئینهای کریستالوگرافی و مدل سازی شده قبل از شبیه­سازی که بر روی هم منطبق شده اند. ب- ساختار پروتئینهای کریستالوگرافی و مدل سازی شده بعد از شبیه­سازی که بر روی هم منطبق شده­اند. ساختار کریستالوگرافی با رنگ قرمز و ساختار مدل سازی شده با رنگ آبی مشخص شده­اند.

برای این منظور کلشی­سین مجددا به درون جایگاه خود داک گردید و RMSD آن با ساختار اولیه به کمک نرم­افزارMolsoft ICM-Browser (5) برآورد شد (شکل6). مقدار RMSD کلشی­سین داک شده و کریستاله 6/0 آنگسترم بود که نشان می­دهد پارامترهای لحاظ شده در داکینگ، در مورد این قبیل لیگاندها و جایگاه مذکور دقت مناسبی دارند.

 

 

شکل4- RMSD حاصل از شبیه­سازی دینامیک مولکولی پروتئین مدل سازی شده در مدت زمان 5 پیکو ثانیه

 

شکل5- ساختار کلشی­سین و ترکیبات منتخب حاصل از امتیازدهی داکینگ

 

شکل6- مقایسه ساختار پیش­بینی شده و واقعی کلشی­سین. ساختار داک شده با رنگ سبز و ساختار کریستاله با رنگ قرمز مشخص شده است.

 

 

جدول 1- مقادیر انرژی اتصال ترکیبات طراحی شده موثرتر از کلشی­سین

شماره ترکیب

انرژی اتصال (kcal/mol)

358

304

505

457

266

کلشی­سین*

4/10-

7/9-

5/9-

5/9-

10-

6/7-

* نمونه کنترل

 

پس از داکینگ نحوه میانکنش 5 ترکیب مؤثرتر به همراه کلشی­سین توسط برنامه UCSF Chimera و LigPlot مورد ارزیابی قرار گرفت. رزیدوهای کلیدی کاتالیتیک در واکنش با کلشی­سین شامل 181Val درگیر در پیوند هیدروژنی و 352Lys، 258Asn، 255Leu، 254Lys، 318Ile، 259Met، 250Ala به همراه 10 رزیدوی دیگر درگیر در واکنشهای غیر پیوندی هستند (شکلهای 7 و 8). رزیدوهای کاتالیتیک درگیر با ترکیب 358 عبارتند از 11Gln با دو پیوند هیدروژنی به گروه نیترو و همچنین رزیدوهای 224Tyr، 259Met، 258Asn، 352Lys، 255Leu، 318Ile، 181Val با برهمکنشهای غیر پیوندی (شکلهای 7 و 8). برای ترکیب 304 برهمکنشهای 258Asn، 259Met، 352Lys با هسته کرومن و 249Asn، 254Lys، 178Ser، 255Leu، 318Ile با گروههای (trifluoromethyl)benzene و N-( pyridin-4-yl)acetamide مشاهده شد (شکلهای 7 و 8). در ترکیب 505 برهمکنشهای غیر پیوندی رزیدوهای 254Lys ، 352Lys ، 258Asn ، 249Asn ، 181Val ، 255Leu ، 259Met ، 318Ile و پیوندهای هیدروژنی احتمالی رزیدوهای 350Asn و 315Val با OH متصل به حلقه کرومنی تشکیل شدند نرم افزار UCSF Chimera این پیوندهای هیدروژنی را تأیید نکرد (شکلهای 7 و 8). در ترکیب 457 رزیدوهای 250Ala ، 258Asn ، 259Met ، 315Val ، 352Lys ، 180Ala ، 178Ser ، 183Glu ، 255Lue درگیر واکنش­اند (شکلهای 7 و 8). در ترکیب 266 پیوندهای هیدروژنی احتمالی رزیدوهای 221Arg ، 178Ser ، 351Val تنها توسط نرم افزار LigPlot تأیید و همین طور برهمکنشهای غیر پیوندی رزیدوهای 224Tyr ، 353Thr ، 352Lys ، 175Pro ، 222Pro نیز تشخیص داده شدند (شکلهای 7 و 8). اتمهای درگیر در پیوند هیدروژنی لیگاندهای 266، 358 و 505 با آمینواسیدهای جایگاه اتصال در جدول 2 ارائه شده است.

 

 

شکل7- برهمکنشهای احتمالی ترکیبات با جایگاه اتصال کلشی­سین در پروتئین توبولین توسط  LigPlot: (الف) کلشی­سین، (ب) ترکیب 358، (ج) ترکیب 304، (د) ترکیب 505 (و) ترکیب 457 (ز) ترکیب 266. در LigPlot پیوندهای هیدروژنی با رنگ سبز و رزیدوهای درگیر در برهمکنشهای غیر پیوندی با رنگ قرمز و همین طور اتم­های کربن با رنگ مشکی، اکسیژن با رنگ قرمز ، نیتروژن با رنگ آبی، و فلور با رنگ سبز به نمایش گذاشته شده است. برای نمایش دادن لیگاندها از مدل گوی و میله استفاده شد.

 

بحث  

متابولیتهای طبیعی سهم عمده­ای از داروهای ضد سرطانی را به خود اختصاص داده­اند، این ترکیبات عرصه مناسبی برای کشف و توسعه داروها محسوب می­شوند. مطالعات بر روی پکتین سیب نشان داد که این ترکیب قادر به القای آپوپتوز در رده سلولی سرطان پروستات Du145 می­باشد (2). همچنین طبق مطالعات پارساسرشت و همکاران تیمار متابولیتهای حاصل از باکتریLactobacillus rhamnosus GG در غلظتهای 100، 200 و 300 میکرولیتر/ میلی­لیتر بر روی رده سلولهای سرطانی CacoII به ترتیب موجب مهار 8/60، 5/72 و 1/82 درصدی این سلولها شد (1).

با این وجود طراحی و توسعه داروها فرآیندی بسیار پرهزینه، زمان بر و همچنین نیازمند ارزیابیهای آزمایشگاهی فراوانی برای رسیدن دارو به بازار می­باشد، از این رو گسترش روشهایی که بتوان طی آن میلیونها ترکیب را در بازه زمانی کوتاه­تر و با هزینه کمتر غربال نمود از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. امروزه روشهای in silico به عنوان یکی از کم هزینه­ترین و سریع ترین راهکارها برای رسیدن به ترکیبات رهبر و یا دارو مورد استفاده قرار می­گیرند (6).

مطالعات in silico توسط Bai و همکاران منجر به شناسایی 306 مهار کننده از میان 50000 ترکیب برای غیر فعال کردن سم ریسین شد. ارزیابیهای بیوشیمیایی و سلولی بر روی ترکیبات غربال شده نشان داد که دو مهارکننده دارای اثر محافظتی قوی بر روی سلولهای Vero در برابر سم ریسین می­باشند (6). اختلال در فعالیت پروتئین Tip60 به عنوان یکی از عوامل مهم در مسیرهای سیگنالینگ سلولی، باعث بروز بیماریهای نظیر سرطان و زوال مغزی می­گردد. روش غربالگری مجازی که در این مطالعات به کار گرفته شده است باعث شناسایی چهار مهارکننده برای پروتئین Tip60 از میان ترکیبات گردآوری شده از پایگاه اطلاعاتی ChemBridge شد. ارزیابیهای بعدی صورت گرفته بر روی این مهارکننده­ها در شرایط in vitro نتایج حاصل از in silico را تأیید کرد (40).

بنابر گزارش Endo و همکارانش، مشتقات 3-کربوکسی­آمید کرومنها مهارکننده آلدو کتو ردوکتاز (AKR) هستند (14). از سوی دیگر نتایج حاصل از مطالعات Cheng و همکاران نشان داد که این ترکیبات مهار کننده فاکتور نکروز توموری آلفا (TNFα) نیز می­باشند (10).

 

شکل8- برهمکنشهای احتمالی ترکیبات با جایگاه اتصال پروتئین توسط UCSF Chimera: (الف) کلشی­سین (ب) ترکیب 358 (ج) ترکیب 304 (د) ترکیب 505 (و) ترکیب 457 (ز) ترکیب 266. در UCSF Chimera لیگاندها به صورت مدل گوی و میله و اتمهای کربن با رنگ خاکستری، نیتروژن آبی، اکسیژن قرمز، فلئور سبز ، ساختار پروتیئن با رنگ سفید و رزیدوهای در گیر در پیوند هیدورژنی سبز و مابقی رزیدوهای درگیر در برهمکنش با رنگ صورتی مشخص شده­اند، مابقی تنظیمات مربوط به رنگ­بندی همانند برنامه LigPlot صورت گرفته است.

 

اهمیت توبولینها در میتوز و تقسیم سلولی باعث شده است تا مهار پویایی توبولینها به عنوان هدفی در طراحی داروهای ضد سرطانی قرار بگیرد (21). ترکیباتی نظیر کرومنها و کامبری­تاستاتینها که در جایگاه کلشی­سین و یا نزدیک به آن داک می­شوند باعث مهار فرآیند پلی­مریزاسیون میکروتوبول­ها می­شوند (23)، لذا توسعه و طراحی چنین ترکیباتی بعنوان ترکیباتی بالقوه ضدسرطانی مورد توجه بسیاری از محققین قرار گرفته است.

 

جدول2- پیوند های هیدروژنی درگیر در کمپلکس ترکیبات با توبولین

لیگاند

پیوند هیدروژنی

اتم لیگاند

آمینو اسید

فاصله (Å)

358

1

O2

:NE11Gln

96/2

2

O3

:NE11Gln

17/3

505

1

O3

:O315Val

95/2

2

O3

:O350Asn

35/3

266

1

O4

1:NH221Arg

81/2

2

N2

:OG178SER

88/2

3

N3

:OG178SER

02/3

4

O1

:O351Val

99/2

 

 

نتایج حاصل از مطالعات Furst و همکاران نشان داد که مشتقات سیکلوپروپیلی کمبری­تاستاتین از طریق حلقه فنولی و آنیلین به ترتیب با آمینواسیدهای 179Thr و 178Ser درگیر پیوند هیدروژنی شده و موجب مهار پلی­مریزاسیون توبولینها می­شوند (16). در حالی که نتایج حاصل از مشاهدات این تحقیق نشان داد که اسیدآمینه 178Ser فقط با ترکیب 266 درگیر پیوند هیدروژنی می گردد و با ترکیبات 304، 358 و 457 درگیر برهمکنشهای غیرپیوندی می­شود. علاوه بر این، برهمکنشهای غیرپیوندی بین اسیدآمینه 179Thr و ترکیبات 457 و کلشی­سین مشاهده گردید.

همچنین مطالعات Blanch و همکاران بر روی آنالوگهای کمبری­تاستاتین و مشتقات تری­آزول نشان داد که اسیدآمینه­های 181Val، 241Cys و 258Asn با این ترکیبات درگیر پیوند هیدروژنی می­شوند (32). در صورتی که نتایج حاصل از داکینگ ترکیبات ارائه شده در این مطالعه، برهمکنشهای غیر پیوندی با اسیدآمینه­های 181Val و 258Asn را نشان می­دهد. همچنین پیوند هیدروژنی اسیدآمینه 181Val و برهمکنشهای غیر پیوندی اسیدآمینه­های 241Cys و 258Asn با کلشی­سین مشاهده شد.

پروتئین مدل سازی شده با Modeller توسط GROMACS شبیه­سازی مولکولی شد. مقدار RMSD بین پروتئین کریستاله و شبیه سازی شده 5/0 آنگستروم می­باشد که کمتر از دو می­باشد و نشان دهنده مدل سازی و پارامترسازی صحیح فرآیند شبیه­سازی می­باشد. علاوه بر این معتبر سازی مطالعات داکینگ نیز با اندازه­گیری RMSD کشی­سین داک شده با کریستاله انجام شد که مقدار آن 6/0 آنگسترم به دست آمد. معمولاً میزان Å2 > RMSD برای گزارش تقارن بین دو مولکول مناسب است. این موضوع نشان می­دهد فرآیند داکینگ به درستی جایگاه کلشی­سین را پیش­بینی کرده است. انرژی اتصال برای بهترین مد کلشی­سین kcal/mol 6/9- به دست آمد.

مطالعات داکینگ توسط AutoDock Vina (یکی از پرکاربردترین نرم­افزارهای داکینگ که در سال 2009 منتشر شد) صورت گرفت. Vina نسل جدیدی از AutoDock محسوب می­شود، به خدمت گرفتن تابع امتیازدهی تجربی در مقابل تابع نیمه تجربی AutoDock و همین طور استفاده از الگورتیم بهینه کننده جستجوی محلی تکرار شونده در مقایسه با الگوریتم ژنتیکی لامارک باعث افزایش سرعت و دقت داکینگ شده است (18). هر چند که شارژ محاسبه شده با ADT براساس روش Gasteiger-Marsili (17) می­باشد، اما باید توجه داشت که Vina برای محاسبات خود به هیچ شارژی نیاز ندارد و شارژ را بر اساس تابع درونی خود تغییر می­دهد (36). ترکیبات طراحی شده به جایگاه کلشی­سین توسط برنامه Vina داک و بر اساس انرژی اتصال رتبه­بندی شدند. بهترین مد هر یک از چهار ترکیب ارائه شده در جدول 1 نسبت به بقیه ترکیبات و همین طور نسبت به کلشی­سین دارای پایین­ترین میزان انرژی تمایل بودند. بنابراین تمایل آنها به این جایگاه بهتر بوده و نسبت به بقیه ترکیبات اختصاصی­تر عمل می­کنند.

برای درک بهتر جایگاه اتصال و همین طور نحوه اتصال لیگاندها به این جایگاه برهمکنشهای احتمالی میان ترکیبات و توبولین­ توسط نرم افزار LigPlot برآورد شد و به صورت دو بعدی به نمایش درآمد (شکل7). پیوند هیدروژنی در اتصال ترکیبات 266، 505 و 358 و برهمکنشهای غیر پیوندی در دو ترکیب 304 و 457 نقش مهمی ایفا می­کند.

برای تأیید این گزارشها از نرم­افزار Chimera استفاده و در ارزیابی این نرم­افزار پیوند هیدروژنی فقط در مورد ترکیب 358 مشاهده شد، با توجه به میزان انرژی اتصال این لیگاند (جدول1) و میزان انرژی پیوند هیدروژنی که حدوداً معادل Kcal/mol3-1 می­باشد، و همین طور در مقایسه با ترکیب 304 می­توان گفت پیوند هیدروژنی استخلاف NO2 در موقعیت 5 گروه (pyridin-2-ylamino)-methanone نقش مهمی در افزایش امتیاز این ترکیب داشته است. بررسی اطلاعات حاصل از نحوه برهمکنش ترکیبات توسط هر دو نرم­افزار تأیید می­کند که رزیدوی 352Lys واقع در زنجیره β در تمام برهمکنشهای غیر پیوندی حضور داشته است و می­تواند به عنوان یک رزیدوی کلیدی در این جایگاه مورد ارزیابیهای بیشتر قرار گیرد.

براساس گزارش Kemnitzer و همکاران ترکیبات کرومنی به جایگاه کلشی­سین متصل می­شوند (23)، اما اتصال این ترکیبات به توبولین تا کنون شبیه­سازی نشده و نحوه اتصال آنها برآورد نشده است. به نظر می­رسد که ترکیبات طراحی شده بیشتر از طریق میانکنشهای هیدروژنی و هیدروفوبیک با رزیدوهای موجود در جایگاه اتصال ارتباط برقرار می­کنند. آنالوگهای ارائه شده در این تحقیق می­توانند به عنوان ترکیبات رهبر در مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گیرند.

 

1- پارساسرشت، لادن. فاضلی، محمد رضا. صمدی، نسرین. جمالی­فر، حسین. عیدی، اکرم. محمودی اصل­زاده، حمیده (1391). تاثیر متابولیت­های Lactobacillus rhamnosus GG بر روی رده سلول سرطانی CacoII. مجله زیست شناسی ایران. 25(4):492-484

2- دشت بزرگی، سارا. سپهری، حوری. گلیایی، بهرام. دلفی، لادن. جان زمین، احسان (1392). بررسی اثر مشتقات پکتینی در القای مرگ برنامه ریزی شده یا آپوپتوز در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی DU145. مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی. 26(2):199-186

 

3- http://plasma-gate.weizmann.ac.il/Grace/.

4- http://www.chemaxon.com.

5- Abagyan R, Totrov M, Kuznetsov D.(1994) ICM—a new method for protein modeling and design: applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation. Journal of computational chemistry, 15(5):488-506.

6- Bai Y, Watt B, Wahome PG, Mantis NJ, Robertus JD.(2010) Identification of new classes of ricin toxin inhibitors by virtual screening. Toxicon : official journal of the International Society on Toxinology, 56(4):526-534.

7- Batista JM, Jr., Lopes AA, Ambrosio DL, Regasini LO, Kato MJ, Bolzani Vda S, Cicarelli RM, Furlan M.(2008) Natural chromenes and chromene derivatives as potential anti-trypanosomal agents. Biological & pharmaceutical bulletin, 31(3):538-540.

8- Bjelkmar Pr, Larsson P, Cuendet MA, Hess B, Lindahl E.(2010) Implementation of the CHARMM force field in GROMACS: Analysis of protein stability effects from correction maps, virtual interaction sites, and water models. Journal of Chemical Theory and Computation, 6(2):459-466.

9- Cai SX, Drewe J, Kemnitzer W.(2009) Discovery of 4-aryl-4H-chromenes as potent apoptosis inducers using a cell- and caspase-based Anti-cancer Screening Apoptosis Program (ASAP): SAR studies and the identification of novel vascular disrupting agents. Anticancer Agents Med Chem, 9(4):437-456.

10- Cheng JF, Ishikawa A, Ono Y, Arrhenius T, Nadzan A.(2003) Novel chromene derivatives as TNF-alpha inhibitors. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 13(21):3647-3650.

11- Coluccia A, Sabbadin D, Brancale A.(2011) Molecular modelling studies on Arylthioindoles as potent inhibitors of tubulin polymerization. European journal of medicinal chemistry, 46(8):3519-3525.

12- Conti C, Desideri N.(2009) Synthesis and antirhinovirus activity of new 3-benzyl chromene and chroman derivatives. Bioorganic & medicinal chemistry, 17(10):3720-3727.

13- Downing KH.(2000) Structural basis for the interaction of tubulin with proteins and drugs that affect microtubule dynamics. Annual review of cell and developmental biology, 16:89-111.

14- Endo S, Matsunaga T, Kuwata K, Zhao HT, El-Kabbani O, Kitade Y, Hara A.(2010) Chromene-3-carboxamide derivatives discovered from virtual screening as potent inhibitors of the tumour maker, AKR1B10. Bioorganic & medicinal chemistry, 18(7):2485-2490.

15- Fiser A, Do RKG, Šali A.(2000) Modeling of loops in protein structures. Protein science, 9(9):1753-1773.

16- Furst R, Zupko I, Berenyi A, Ecker GF, Rinner U.(2009) Synthesis and antitumor-evaluation of cyclopropyl-containing combretastatin analogs. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 19(24):6948-6951.

17- Gasteiger J, Marsili M.(1978) A new model for calculating atomic charges in molecules. Tetrahedron letters, 19(34):3181-3184.

18- Handoko SD, Ouyang X, Su CT, Kwoh CK, Ong YS.(2012) QuickVina: accelerating AutoDock Vina using gradient-based heuristics for global optimization. IEEE/ACM transactions on computational biology and bioinformatics / IEEE, ACM, 9(5):1266-1272.

19- Heo SJ, Kim KN, Yoon WJ, Oh C, Choi YU, Affan A, Lee YJ, Lee HS, Kang DH.(2011) Chromene induces apoptosis via caspase-3 activation in human leukemia HL-60 cells. Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, 49(9):1998-2004.

20- Hess B, Bekker H, Berendsen HJ, Fraaije JG.(1997) LINCS: a linear constraint solver for molecular simulations. Journal of computational chemistry, 18(12):1463-1472.

21- Jordan MA, Wilson L.(2004) Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature reviews Cancer, 4(4):253-265.

22- Kemnitzer W, Drewe J, Jiang S, Zhang H, Crogan-Grundy C, Labreque D, Bubenick M, Attardo G, Denis R, Lamothe S et al.(2008) Discovery of 4-aryl-4H-chromenes as a new series of apoptosis inducers using a cell- and caspase-based high throughput screening assay. 4. Structure-activity relationships of N-alkyl substituted pyrrole fused at the 7,8-positions. Journal of medicinal chemistry, 51(3):417-423.

23- Kemnitzer W, Drewe J, Jiang S, Zhang H, Wang Y, Zhao J, Jia S, Herich J, Labreque D, Storer R et al.(2004) Discovery of 4-aryl-4H-chromenes as a new series of apoptosis inducers using a cell- and caspase-based high-throughput screening assay. 1. Structure-activity relationships of the 4-aryl group. Journal of medicinal chemistry, 47(25):6299-6310.

24- Kemnitzer W, Drewe J, Jiang S, Zhang H, Zhao J, Crogan-Grundy C, Xu L, Lamothe S, Gourdeau H, Denis R et al.(2007) Discovery of 4-aryl-4H-chromenes as a new series of apoptosis inducers using a cell- and caspase-based high-throughput screening assay. 3. Structure-activity relationships of fused rings at the 7,8-positions. Journal of medicinal chemistry, 50(12):2858-2864.

25- Kemnitzer W, Jiang S, Wang Y, Kasibhatla S, Crogan-Grundy C, Bubenik M, Labrecque D, Denis R, Lamothe S, Attardo G et al.(2008) Discovery of 4-aryl-4H-chromenes as a new series of apoptosis inducers using a cell- and caspase-based HTS assay. Part 5: modifications of the 2- and 3-positions. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 18(2):603-607.

26- Kemnitzer W, Jiang S, Zhang H, Kasibhatla S, Crogan-Grundy C, Blais C, Attardo G, Denis R, Lamothe S, Gourdeau H et al.(2008) Discovery of 4-aryl-2-oxo-2H-chromenes as a new series of apoptosis inducers using a cell- and caspase-based high-throughput screening assay. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 18(20):5571-5575.

27- Kemnitzer W, Kasibhatla S, Jiang S, Zhang H, Zhao J, Jia S, Xu L, Crogan-Grundy C, Denis R, Barriault N et al.(2005) Discovery of 4-aryl-4H-chromenes as a new series of apoptosis inducers using a cell- and caspase-based high-throughput screening assay. 2. Structure-activity relationships of the 7- and 5-, 6-, 8-positions. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 15(21):4745-4751.

28- Khan I, Nisar M, Ahmad M, Shah H, Iqbal Z, Saeed M, Halimi SM, Kaleem WA, Qayum M, Aman A et al.(2011) Molecular simulations of Taxawallin I inside classical taxol binding site of beta-tubulin. Fitoterapia, 82(2):276-281.

29- Kitchen DB, Decornez H, Furr JR, Bajorath J.(2004) Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications. Nature reviews Drug discovery, 3(11):935-949.

30- Lipinski CA, Lombardo F, Dominy BW, Feeney PJ.(1997) Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Advanced drug delivery reviews, 23(1):3-25.

31- Mun J, Jabbar AA, Devi NS, Liu Y, Van Meir EG, Goodman MM.(2012) Structure-activity relationship of 2,2-dimethyl-2H-chromene based arylsulfonamide analogs of 3,4-dimethoxy-N-[(2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)methyl]-N-phenylbenzenesulfonamide , a novel small molecule hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) pathway inhibitor and anti-cancer agent. Bioorganic & medicinal chemistry, 20(14):4590-4597.

32- Mur Blanch N, Chabot GG, Quentin L, Scherman D, Bourg S, Dauzonne D.(2012) In vitro and in vivo biological evaluation of new 4,5-disubstituted 1,2,3-triazoles as cis-constrained analogs of combretastatin A4. European journal of medicinal chemistry, 54:22-32.

33- Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, Ferrin TE.(2004) UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry, 25(13):1605-1612.

34- Pinney KG, Arthasary P, Shirali A, Edvardsen K, Chaplin DJ: (2008) Translator, Chromene-containing compounds with anti-tubulin and vascular targeting activity,

35- Sanner MF.(1999) Python: a programming language for software integration and development. Journal of molecular graphics & modelling, 17(1):57-61.

36- Trott O, Olson AJ.(2010) AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. Journal of computational chemistry, 31(2):455-461.

37- van Dijk M, Wassenaar TA, Bonvin AM.(2012) A flexible, Grid-enabled web portal for GROMACS molecular dynamics simulations. Journal of Chemical theory and Computation, 8(10):3463-3472.

38- Wallace AC, Laskowski RA, Thornton JM.(1995) LIGPLOT: a program to generate schematic diagrams of protein-ligand interactions. Protein engineering, 8(2):127-134.

39- Wassenaar TA, van Dijk M, Loureiro-Ferreira N, van der Schot G, de Vries SJ, Schmitz C, van der Zwan J, Boelens R, Giachetti A, Ferella L.(2012) WeNMR: structural biology on the grid. Journal of Grid Computing, 10(4):743-767.

40- Wu J, Wang J, Li M, Yang Y, Wang B, Zheng YG.(2011) Small molecule inhibitors of histone acetyltransferase Tip60. Bioorganic chemistry, 39(1):53-58.

41- Young DC, (2009) Computational drug design: A guide for computational and medicinal chemists, 344

42- Zoete V, Cuendet MA, Grosdidier A, Michielin O.(2011) SwissParam: a fast force field generation tool for small organic molecules. Journal of computational chemistry, 32(11):2359-2368.