نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی- دانشگاه فردوسی مشهد

2 دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی

چکیده

ایران بعنوان یکی از مراکز اولیه پیدایش گلرنگ شناخته شده است. بنابر این تشخیص تنوع ژنوتیپ های گلرنگ برای نگهداری منابع ژنتیکی و کاربرد علمی و عملی این مواد در برنامه¬های به¬نژادی برای اصلاحگران می‌تواند مفید باشد. این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 24 ژنوتیپ گلرنگ از ژرم پلاسم بین المللی، توده های بومی ایران و گلرنگ وحشی با استفاده از صفات مورفولوژیکی و نشانگر مولکولی RAPD انجام شد. نتایج نشان داد که تنوع بالایی برای صفات مورفولوژیک در ژنوتیپ های گلرنگ مود بررسی وجود دارد که می‌توان از این تنوع برای برنامه‌های اصلاحی گلرنگ جهت افزایش عملکرد دانه به نحو شایسته استفاده کرد. در بررسی توسط 11 نشانگر مولکولی RAPDاز میان 142 باند تکثیر یافته، تعداد 84 باند چندشکلی نشان دادند (7/57درصد). نتایج حاصل از تجزیه کلاستر نشانگر مولکولی نشان داد که این نشانگر قادر به تشخیص ژنوتیپ¬ها از یکدیکر است. توده¬های ایرانی در اکثر گروهها حضور داشتند که این امر دلیل بر تنوع بالا در توده‌های بومی ایران و همچنین کاندید بودن این منطقه به عنوان یکی از خاستگاه¬های اصلی برای ژرم¬پلاسم گلرنگ است. نتایج این تحقیق نشان داد که استفاده توام از نشانگر‌های مورفولوژیک و مولکولی جهت برنامه¬های اصلاحی گلرنگ بخصوص انتخاب والدین جهت تلاقی مفید می‌باشد و نشانگر مولکولی RAPD کارایی لازم را برای مطالعه تنوع ژنتیکی و مدیریت ژرم‌پلاسم گلرنگ دارد. همچنین توصیه می‌شود از توده‌های بومی گلرنگ زراعی و وحشی ایران بعنوان یک منبع غنی ژنتیکی در برنامه‌های به‌نژادی گلرنگ استفاده شود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Evaluation of Genetic diversity of Iranian populations and foreign cultivars of safflower (Carthamus tinctorios L.) Using morphological traits and RAPD molecular markers

نویسندگان [English]

  • Mahmoud Ghorbanzadeh Neghab 1
  • Rahim Afzal 2

1 Ferdowsi Universityo of Mashhad

2 Ferdowsi University of Mashhad

چکیده [English]

Iran is known as one of the early centers of Safflower. Therefore, the diagnosis diversity safflower genotypes for maintain genetic resources and scientific and practical applications of these materials may be useful in breeding programs for breeders. This study investigated the genetic diversity of 24 genotypes germplasm International, Iranian landraces and wild safflower using morphological traits and RAPD markers was conducted. The results showed that a high diversity of morphological traits in safflower genotypes, this diversity for safflower breeding programs that can appropriate manner be used to increase the yield. The study of molecular markers by 11, multiply in the 142 bands, 84 bands were polymorphic (57.7%). The results of cluster analysis showed that molecular markers are unable to detect the genotypes from one another. Iranian accessions were present in most of the groups that the reason for the high diversity within the population of Iran and Iran candidates one of the main origins and very likely is for safflower germplasm. The results of this study showed that the combined use of morphological and molecular markers for safflower breeding program is especially helpful for selecting parents for the hybridization and the performance RAPD molecular markers is to study genetic diversity and germplasm management safflower. Furthermore the Iranain local populations of safflower and wild safflower are a rich source of genetic for use in breeding programs safflower.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Genetic diversity
  • morphological traits
  • RAPD markers
  • Safflower

ارزیابی تنوع  ژنتیکی تودههای ایرانی و ژنوتیپهای خارجی  گلرنگ
( (Carthamus tinctorius با استفاده از صفات مورفولوژیکی و  نشانگر مولکولی RAPD 

محمود قربانزاده نقاب* و رحیم افضل

مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، مجتمع آموزش عالی شیروان

تاریخ دریافت: 12/10/91             تاریخ پذیرش: 4/9/93 

چکیده

ایران به عنوان یکی از مراکز اولیه پیدایش گلرنگ شناخته شده است. بنابر این تشخیص تنوع ژنوتیپهای گلرنگ برای نگهداری منابع ژنتیکی و کاربرد علمی و عملی این مواد در برنامه­های به­نژادی برای اصلاحگران می‌تواند مفید باشد. این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 24 ژنوتیپ گلرنگ از ژرم پلاسم بین المللی، توده های بومی ایران و گلرنگ وحشی با استفاده از صفات مورفولوژیکی و نشانگر مولکولی RAPD انجام شد. نتایج نشان داد که تنوع بالایی برای صفات مورفولوژیک در ژنوتیپهای گلرنگ مورد بررسی وجود دارد که می‌توان از این تنوع برای برنامه‌های اصلاحی گلرنگ جهت افزایش عملکرد دانه به نحو شایسته استفاده کرد. در بررسی توسط 11 نشانگر مولکولی  RAPDاز میان 142 باند تکثیر یافته، تعداد 84 باند، چندشکلی نشان دادند (7/57درصد). نتایج حاصل از تجزیه کلاستر نشانگر مولکولی نشان داد که این نشانگر قادر به تشخیص ژنوتیپها از یکدیگر است. توده­های ایرانی در اکثر گروهها حضور داشتند که این امر دلیل بر تنوع بالا در توده‌های بومی  ایران و همچنین کاندید بودن این منطقه به عنوان یکی از خاستگاههای اصلی برای ژرم­پلاسم گلرنگ است. نتایج این تحقیق نشان داد که استفاده توأم از نشانگر‌های مورفولوژیک و مولکولی جهت برنامه­های اصلاحی گلرنگ به خصوص انتخاب والدین جهت تلاقی مفید می‌باشد و نشانگر  مولکولی RAPD  کارآیی لازم را برای مطالعه تنوع ژنتیکی و مدیریت ژرم‌پلاسم گلرنگ دارد. همچنین توصیه می‌شود از توده‌های بومی گلرنگ زراعی و وحشی ایران به عنوان یک منبع غنی ژنتیکی در برنامه‌های به‌نژادی گلرنگ استفاده شود.

واژه­های کلیدی: گلرنگ،صفات مورفولوژیکی،تنوع ژنتیکی و  RAPD

* نویسنده مسئول، تلفن 05836353660 ، پست الکترونیکی: ghorbanzadeh@um.ac.ir

مقدمه

 

گلرنگ با نام علمی (Carthamus tinctorius L.) یکی از گیاهان دانه روغنی است که دارای  24 2n=  کروموزوم می‌باشد (45). این گیاه یکی از قدیمی­ترین گیاهان شناخته شده نزد انسان است و سالیان درازی است که به طور گسترده در خاور میانه مورد کشت و کار قرار می­گیرد. ایران به عنوان یکی از مراکز اولیه پیدایش گلرنگ شناخته شده است، بنابر این به نظر می‌رسد که در کشور ایران ذخیره ژرم پلاسم قوی و غنی، از این گیاه وجود داشته باشد(18). تنوع ژنتیکی  پایه و اساس گزینش فنوتیپی، ژنوتیپی و اصلاح کمی وکیفی گونه‌های گیاهی است (20). بررسی تنوع ژنتیکی در گونه‌های زراعی و وحشی از جمله کارهایی است که برای شناسایی ظرفیت ژنتیکی صفات مرتبط با اهداف اصلاحی و حفاظت از منابع ژنتیکی، توسط متخصصین اصلاح نباتات انجام می­گیرد(27). آگاهی از تنوع ژنتیکی و مدیریت منابع ژنتیکی ضمن حفاظت ذخایر ژنتیکی، قابلیت استفاده از آنها را در برنامه اصلاحی ممکن می‌سازد(13و27). از بین رفتن توده‌های بومی و تولید ارقام یکنواخت، باعث کاهش تنوع ژنتیکی و افزایش فرسایش ژنتیکی می‌شود. بنابر این ارزیابی تنوع گونه‌های گیاهی برای نگهداری منابع ژنتیکی و کاربرد علمی و عملی این مواد در برنامه­های به­نژادی برای اصلاحگران امری حیاتی است. تخمین تنوع ژنتیکی لاینهای مناطق مختلف جغرافیایی اطلاعات با ارزشی را درباره نگهداری و استفاده از ژرم پلاسم دست نخورده موجود در هر منطقه در اختیار اصلاحگران قرار می­دهد تا از این تنوع جهت افزایش کارآیی صفات کیفی و کمی و افزایش عملکرد استفاده کنند(24و40).

عمده‌ترین هدف تحقیق در گلرنگ، اصلاح برای عملکرد دانه و پایداری آن در مناطق زیر کشت آن است(43). اولین گام در اصلاح گلرنگ داشتن جمعیتی با تنوع بالا است، تا بتوان از داخل آن انتخاب مناسبی انجام داد. انتخاب ارقام مطلوب و تعیین روابط مابین صفات و میزان وراثت‌پذیری صفات از جمله مواردی هستند که به اصلاحگر این توانایی را می‌دهد که مناسب‌ترین و منطقی‌ترین نسبت بین اجزاء را که منتهی به عملکرد بیشتر می‌گردد، انتخاب نماید. اصلاحگران معمولاً از صفات مورفولوژیکی به عنوان معیارهای گزینش جهت بهبود عملکرد استفاده می نمایند(18و45). 

سعیدی و همکاران(6) گزارش نمودند که صفات عملکرد دانه، تعداد دانه در طبق دارای بیشترین تنوع و صفات تعداد روز تا 50 درصد گلدهی و تعداد روز تا رسیدگی دارای کمترین تنوع هستند. خان و همکاران (23) تنوع ژنتیکی گسترده‌ای برای صفات مختلف از جمله عملکرد دانه ، ارتفاع بوته، تعداد روز تا رسیدگی و همچنین سایر اجزای عملکرد مشاهده کردند. جارادات و شهیدی (21) میزان تنوع ژنتیکی هفت صفت مورفولوژیکی را در ارقام گلرنگ را بین 50-14 درصد گزارش نمودند. الفدل و همکاران (19) در بررسی 200 ژنوتیپ گلرنگ نشان دادند که ضریب تنوع برای 12 صفت فنوتیپی اندازه‌گیری شده بین 2/9 تا 91 درصد بود. قابلیت توارث صفات بین 10 درصد و 86 درصد اندازه‌گیری شد. پژوهشهای دیگر(2، 31، 32 و 39) نیز مشخص نمود که توده‌های مختلف گلرنگ از لحاظ اجزای عملکرد دانه دارای تنوع ژنتیکی بالایی هستند.  

جهت مطالعه تنوع ژنتیکی ارقام گیاهی روشهای مختلفی وجود دارد که استفاده از صفات مورفولوژیکی، آیزوزایمی، سیتولوژیکی و نشانگرهای مولکولی نظیر RAPD از روشهای متداول می‌باشند. هر یک از این تکنیکها دارای مزایا و معایب خاص خود بوده و برای بررسی تنوع ژنتیکی، می‌توان همزمان از دو یا چند نشانگر استفاده نمود(28و44). در روشهای به نژادی کلاسیک ، گزینش والدین برای تلاقی بر اساس صفات مورفولوژیکی ممکن است از کارآیی زیادی برخوردار نباشد، چنانچه بتوان گزینش ژنوتیپها را از طریق نشانگرهای DNA انجام داد، کارآیی گزینش والدین افزایش قابل ملاحظه‌ای خواهد داشت(43). با وجود گستردگی نشانگرهای مختلف DNA و ابداع روشها و تکنیکهای جدید‏تر، نشانگر RAPD به علت مزایایی چون تولید تعداد زیادی باند، چند شکلی زیاد، عدم استفاده از مواد رادیو اکتیو، کم هزینه و پیچیدگی کمتر آن، هنوز در بررسی تنوع ژنتیکی مخازن ژنی، نسبت به سایر نشانگرها بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد(10و12). تنوع ژنتیکی در گلرنگ با استفاده از صفات مورفولوژیک توسط اشری و همکاران( 16)، خان و همکاران( 23 )، سنگام و همکاران( 40 ) ، سعیدی و همکاران(6 )،صفوی و همکاران(37) و سگال و همکاران(42) مورد بررسی قرار گرفته است.

استفاده توأم از صفات مورفولوژیکی و نشانگر مولکولی RAPD در بررسی تنوع ژنتیکی برخی از گیاهان ازجمله زیتون (1)، گیلاس(4)، گندم(5)، جو(22)،  نخود(8) و ژرم‌پلاسم­ گلرنگ (7، 11، 13، 14، 23 و 37) مورد استفاده قرار گرفته است. معالی امیری و همکاران(11)در بررسی تنوع ژنتیکی ارقام گلرنگ توسط صفات مورفولوژیک و نشانگر RAPD گزارش نمودند که تنوع ژنتیکی بالایی برای هر دو نشانگر وجود دارد و بین تنوع ژنتیکی با مناطق جغرافیایی تطابقی وجود ندارد.  امینی و همکاران (14) تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گلرنگ را با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیک وRAPD مورد ارزیابی قرار دادند و میــزان پلــی‌مورفیسم بالایی را برای هر دو نشانگر ‌به دست آوردند. همان طور که ذکر شد ایران از لحاظ ذخایر ژنتیکی گلرنگ یکی از غنی‌ترین مناطق جهان به شمار می­رود(16و24) بنابر این شناخت ویژگی ژنوتیپهای گلرنگ بومی ایران و مقایسه آنها با ارقام خارجی، امکان بهره‌گیری بهتر و بیشتر از این منابع متنوع ژنی در برنامه­های اصلاحی از اهمیت زیادی برخوردار است. با توجه به تحقیقات اندک در خصوص لاینهای موجود در ژرم‌پلاسم گلرنگ، در این مطالعه از نشانگرهای مورفولوژیکی و مولکولی RAPD برای ارزیابی تنوع ژنتیکی 24 ژنوتیپ گلرنگ از ژرم پلاسم بین المللی، توده‌های بومی ایران و گلرنگ وحشی جهت استفاده در برنامه‌ های آتی به‌نژادی گلرنگ استفاده شد.

مواد و روشها  

در این مطالعه 24 ژنوتیپ مختلف شامل7 توده ایرانی، 16 ژنوتیپ خارجی و یک توده وحشی گلرنگ انتخاب شدند(جدول1). ژنوتیپهای زراعی به صورت طرح بلوک کامل تصادفی در سه تکرار در مزرعه آموزشی _ پژوهشی دانشکده کشاورزی شیروان کشت شدند. از هر تیمار سه  خط به طول 5/3  متر کشت گردید. فاصله ردیفها از یکدیگر 50 سانتیمتر و فاصله بین بوته ها 10 سانتیمتر در نظر گرفته شد. صفات مورفولوژیک شامل تعداد روز تا شروع گلدهی، تعداد روز تا 50 درصد گلدهی، تعداد روز تا اتمام گرده افشانی، ارتفاع گیاه(سانتیمتر)، ارتفاع اولین شاخه فرعی(سانتیمتر)، تعداد شاخه های ثانویه، زاویه شاخه‌های فرعی(درجه)، تعداد طبق در گیاه، تعداد دانه در طبق، وزن صد دانه(گرم)، درصد روغن، درصد پوسته و عملکرد دانه(کیلوگرم در هکتار) اندازه گیری شد. میانگین 10 بوته در هر کرت برای هر صفت اندازه‌گیری و ثبت گردید (بذر کافی برای کاشت و ثبت اطلاعات مورفولوژیکی ژنوتیپ وحشی در دسترس نبود). روغن موجود در نمونه ها به روش سوکسله و با حلال هگزان بر اساس روش AOAC (15) استخراج شد.

استخراج DNA: بذور 24 ژنوتیپ در گلدانهای جداگانه در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی کشت شدند و برگهای گیاهچه­های 10-8  هفته‌ای برای استخراج ,DNA مورد استفاده قرار گرفتند.  استخراج DNA ژنومی ژنوتیپها با استفاده از روش سقایی معروف و همکاران (38) انجام شد.  به منظور ایجاد یکنواختی در DNAهای مورد بررسی، غلظت اولیه DNA الگو با استفاده از نانودراپ و الکتروفورز در ژل آگاروز یک درصد، تعیین و بهینه شدند. برای بررسی چند شکلی DNA  ژنوتیپهای گلرنگ 27 آغازگر تصادفی ده نوکلوتیدی RAPD استفاده شد. بعد از بررسی باند‌های تولید شده، در نهایت 11 آغازگر برای مطالعه همه ژنوتیپها انتخاب شدند. اجزای هر واکنش زنجیره پلیمراز شامل 2 میکرو لیتر DNA (30 نانو گرم)، 5/2 میکرو لیتر از PCR buffer 10X ، 25/1 میلی مول  MgCl2 ، 5/0 میکرولیتر dNTPs ، یک میکرولیتر آغازگر به غلظت 10 پیکومول و یک واحد آنزیم Taq DNA polymerase بود. حجم محلول واکنش جهت انجام PCR با آب مقطر استریل شده به 25 میکرولیتر رسانده شد. واکنش PCR در دستگاه ترمال سایکلر (Bio-Rad, USA) تحت برنامه­ای شامل، یک چرخه چهار دقیقه ای در دمای 94 درجه سانتی گراد برای واسرشت سازی اولیه و سپس تعداد 40 چرخه شامل واسرشت سازی در دمای 92 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه، اتصال  آغازگر در دمای مناسب (35 درجه سانتی گراد) به مدت یک دقیقه، مرحله گسترش در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت دو دقیقه و در نهایت یک چرخه10دقیقه‌ای در دمای 72 درجه سانتی گراد برای تکمیل گسترش نهایی انجام شد. محصولات تکثیر شده توسط ژل آگارز 2/1 درصد تفکیک و توسط دستگاه ژل داک عکس برداری شد. درصد ضریب تنوع فنوتیپی و وراثت‌پذیری عمومی از روابط ذیل محاسبه شد.

 

 

 وراثت پذیری عمومی،  واریانس ژنتیکی،  برآوردی از واریانس محیطی و r تعداد تکرار می‌باشد.

گروه‌بندی داده‌های مورفولوژیکی بر اساس فاصله اقلیدسی و روش UPGMA با نرم افزارStatistica ver. 5.1  صورت گرفت. امتیاز‌دهی باندها و تجزیه و تحلیل اطلاعات DNA بر روی تصاویر تهیه شده از ژلهای رنگ آمیزی شده توسط نرم افزار Lab Work و ویرایش دستی انجام شد. وجود باند با (1) و فقدان آن با (0) امتیاز‌دهی شد. تجزیه خوشه‌ای بر اساس ضریب تشابه نی(29) و روش UPGMA توسط نرم افزار  ver. 2.02 NTSYS-pc انجام شد(34). تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) با استفاده از نرم افزار GenALEx 6.1 صورت گرفت(33).

 

جدول 1- اسامی و منشاء ژنوتیپهای گلرنگ مورد بررسی

شماره

ژنوتیپ

منشاء

شماره

ژنوتیپ

منشاء

1

Saffire

Canada1

13

Local Isfahan2

Iran4

2

Lesaf

Canada2

14

Local Marand

Iran5

3

Noroeste/84/3/CW

Cimmyt1

15

Local Arak

Iran6

4

CM-106

Cimmyt2

16

IL-111

Iran7

5

VF-18

Cimmyt3

17

Quiriego-masal-810

Mexic1

6

5150

Cimmyt4

18

Sahuaripa-88

Mexic2

7

CW-88

Cimmyt5

19

Bacum92

Mexic3

8

PI-250536

Eygpt1

20

Syrian

Syrian

9

PI-250537

Eygpt2

21

Hartman

USA1

10

Local Ghochan1

Iran1

22

Finch

USA2

11

Local Ghochan2

Iran2

23

Dincer

USA3

12

Local Isfahan1

Iran3

24

C. oxycantha

Wild (Iran)

 


نتایج و بحث

تجزیه داده‌های مورفولوژیکی: نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیکی نشان داد که تنوع بالایی برای صفات مورفولوژیک در ارقام گلرنگ مورد بررسی، به خصوص توده های ایرانی وجود دارد(داده ها آورده نشده‌اند).  بر اساس ضرایب تنوع فنوتیپی، صفات تعداد دانه در طبق، عملکرد دانه، تعداد طبق در گیاه، ارتفاع اولین شاخه فرعی، وزن صد دانه و درصد پوسته تنوع بالایی دارند و صفات ارتفاع بوته، تعداد شاخه‌های فرعی و درصد روغن دارای تنوع متوسطی هستند (جدول2). وجود دامنه وسیع و همچنین ضرایب تنوع فنوتیپی بالا برای صفات مختلف نشان دهنده تنوع بالا بین ژنوتیپهای مورد مطالعه (به ویژه توده‌های ایرانی) است که می‌تواند کارآیی روشهای اصلاحی را در بهبود این صفات افزایش دهد. وراثت پذیری عمومی بالای صفات وزن صد دانه، تعداد روز از کاشت تا 50 درصد گلدهی، ارتفاع اولین شاخه فرعی، تعداد دانه در طبق، درصد پوسته و درصد روغن  بیانگر این است که تنوع فنوتیپی در این صفات بیشتر تحت کنترل عوامل ژنتیکی است. وجود تنوع ژنتیکی و وراثت پذیری بالا برای  صفات سبب افزایش بازده ناشی از گزینش در بهبود این صفات خواهد شد. وراثت پذیری عمومی عملکرد دانه برابر با 8/37 درصد است. مقدار وراثت‌پذیری نسبتاً پایین عملکرد دانه نسبت به سایر صفات به دلیل ماهیت چند ‍ژنی این صفت، اثرات محیطی و اثرات متقابل ژنوتیپ با محیط بر روی این صفت است. اختلاف در میزان وراثت­پذیری در منابع و پژوهشهای مختلف مؤید این است که محاسبه وراثت پذیری هر مجموعه از ژنوتیپها باید جداگانه انجام شود.

همبستگی بین صفات مورد بررسی بین993/0 و 017/0 به دست آمد (جدول3 ).  عملکرد دانه مهم ترین صفت در برنامه‌های اصلاحی بوده و صفاتی که در ارتباط با عملکرد هستند، حائز اهمیت می‌باشند. عملکرد دانه با تعداد طبق در بوته همبستگی مثبت و معنی‌دار دارد در حالی که همبستگی عملکرد دانه با صفات تعداد روز تا شروع گلدهی،50 درصد گلدهی و رسیدگی منفی بود.  لذا با  گزینش برای افزایش صفت تعداد طبق در بوته و کاهش تعداد روز تا50 درصد گلدهی و رسیدگی می‌توان عملکرد دانه لاینها را افزایش داد. افزایش تعداد طبق در بوته، تعداد دانه در طبق، وزن صد دانه و تعداد شاخه فرعی در گیاه می‌تواند به عنوان شاخصهای گزینش برای افزایش عملکرد دانه گلرنگ مد نظر قرار گیرد (9و14). نتایج این بررسی نشان داد که تنوع بالایی برای صفات مورفولوژیک در ژرم پلاسم گلرنگ وجود دارد (جدول2). وجود تنوع بالا نشان دهنده بستر مناسب برای کارهای اصلاحی است و پیشنهاد می‌شود که جهت افزایش عملکرد دانه و اجزاء عملکرد دانه گلرنگ از این تنوع به نحو شایسته‌ای بهره برداری گردد.

 

 

جدول2-  حداقل، حداکثر، میانگین، درصد ضریب تغییرات فنوتیپی، واریانس ژنتیکی و وراثت پذیری عمومی 13 صفت ژنوتیپهای زراعی گلرنگ

صفت

حداقل

حداکثر

میانگین

درصد ضریب تغییرات فنوتیپی

 

واریانس ژنتیکی

σ2g

 

وراثت پذیری عمومی

B2h( درصد)

تعداد روز تا شروع گلدهی

8/82

7/87

7/85

5/1

96/0

3/54

تعداد روز تا 50 درصد گلدهی

2/86

7/91

2/89

4/1

63/1

2/76

تعداد روز تا اتمام گرده افشانی

7/96

7/103

101

6/1

58/1

4/68

ارتفاع گیاه(سانتی متر)

4/83

8/102

6/92

6/7

55/26

1/62

ارتفاع اولین شاخه فرعی(سانتی متر)

1/46

9/73

9/57

1/14

47/41

7/76

تعداد شاخه های ثانویه

8/4

9/6

8/5

9/8

14/0

5/36

زاویه شاخه های فرعی(درجه)

8/34

8/48

7/39

3/7

69/1

21

تعداد طبق در گیاه

7

2/11

7/9

3/15

75/0

8/43

تعداد دانه در طبق

7/24

9/42

33

5/18

10/20

9/84

وزن صد دانه(گرم)

5/3

5

3/4

2/12

22/0

2/87

درصد روغن

5/23

4/37

4/30

9/8

33/5

7/77

درصد پوسته

3/31

55

8/42

6/12

11/22

5/91

عملکرد دانه(kg/ha)

 

1491

2656

2044

2/14

10598

9/37

 

جدول 3- ضرایب همبستگی  ساده 13 صفت مورد بررسی 23 ژنوتیپ زراعی گلرنگ

 

صفت 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

12 

13 

1

تعداد روز تا شروع گلدهی

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

تعداد روز  تا50% گلدهی

**996/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

تعداد روز تا اتمام گلدهی

**992/0

**993/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

ارتفاع گیاه(سانتیمتر)

**663/0

**667/0+

**661/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5

ارتفاع اولین شاخه(سانتیمتر) فرعی(cm)

**700/0

**776/0

**766/0

**816/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

6

تعداد شاخه های فرعی

021/0

022/0

025/0

149/0

063/0-

1

 

 

 

 

 

 

 

7

زاویه شاخه فرعی(درجه)

*300/0-

*295/0-

*306/0-

158/0-

166/0-

047/0-

1

 

 

 

 

 

 

8

تعداد طبق در گیاه

168/0-

167/0-

136/0-

028/0-

304/0-

**385/0

231/0-

1

 

 

 

 

 

9

تعداد دانه در طبق

**469/0

**474/0

**474/0

**435/0

**543/0-

030/0

128/0-

060/0

1

 

 

 

 

10

وزن صد دانه(گرم)

123/0-

133/0-

134/0-

*289/0-

*332/0-

019/0

090/0-

023/0

**401/0-

1

 

 

 

11

درصد روغن

078/0-

085/0-

041/0-

056/0

032/0-

219/0

065/0-

112/0

131/0

017/0-

1

 

 

12

درصد پوسته

**383/0

**386/0

250/0

107/0

**200/0

191/0-

20/0-

119/0-

131/0-

029/0

199/0-

1

 

13

عملکرد دانه (Kg/ha)

239/0-

243/0-

217/0-

140/0-

213/0-

095/0

029/0-

*286/0

017/0-

065/0

031/0-

187/0-

1

 ** و *بترتیب معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد و 1 درصد

 

شکل1- دندوگرام حاصل از 13 صفت مورفولوژیک 23 ژنوتیپ زراعی گلرنگ بر مبنای فاصله اقلیدسی به روش UPGMA

 

 

تجزیه خوشه‌ای براساس صفات مورفولوژیکی در فاصله اقلیدسی500 ، ژنوتیپها را به دو گروه کلی تقسیم‌بندی نمود (شکل 2). سه ژنوتیپ با منشاء امریکا در یک گروه قرار گرفتند و گروه دوم شامل 20 ژنوتیپ از مناطق مختلف بود.  با کاهش فاصله اقلیدسی از 500 به 180، ژنوتیپها به چهار گروه اصلی تقسیم بندی شدند.  سه ژنوتیپ از امریکا گروه اول را تشکیل دادند. دو توده محلی از ایران (توده محلی قوچان1 و اصفهان2) در گروه دوم حضور داشتند. گروه سوم شامل ژنوتیپهایی از ایران، مصر، سیمیت و ژنوتیپ Quiriego-masal از مکزیک بود.  در گروه چهارم سیزده ژنوتیپ مختلف از شش منطقه جغرافیایی متفاوت شامل مناطق کانادا، سیمیت، مصر، مکزیک، سوریه و ایران بودند. ژنوتیپهای ایرانی در داخل اکثر گروهها حضور داشتند. لذا توصیه می‌شود ضمن استفاده از ژنوتیپهای موجود در ژرم‌پلاسم گلرنگ، استفاده از توده‌های بومی کشور نیز در برنامه‌های به‌نژادی مد نظر قرار گیرد. گروه‌بندی ژنوتیپها براساس صفات مورفولوژیک نشان داد که صفات مورفولوژیک قادر به تفکیک ژنوتیپهای زراعی مورد مطالعه از یکدیگر نیستند. ابدالی و همکارن(1) نیز گزارش کردند که شناسایی ارقام توسط صفات مورفولوژیک امکان پذیر نیست. این نتایج با گزارشات سایر محققان(5،6،14و25 ) مطابقت دارد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 2-  ژل آغازگر UB79، M = سایز مارکر، 23-1 گلرنگهای زراعی و 24 گلرنگ وحشی(C. oxycantha)

 

گروه‌بندی ژنوتیپهای مناطق مختلف در خوشه‌های  متفاوت نشان داد که بین تنوع ژنتیکی و تنوع جغرافیای تطابق خوبی وجود ندارد علت آن را می‌توان به یکسان بودن منشا‌ء آنها و انتقال بذور گلرنگ به مناطق جغرافیایی مختلف نسبت داد. سایر محققان نیز گزارش نمودند که توزیع ژنوتیپها در داخل دسته‌ها با الگوی جغرافیایی مطابقت ندارد (14و25). 

تجزیه مولکولی: جهت بررسی چند شکلی مولکولی 24 ژنوتیپ گلرنگ از 11 آغازگر تصادفی ده نوکلئوتیدی دارای چند شکلی بالا استفاده شد. تعداد قطعات تکثیر شده توسط آغازگرها بین 8 تا 18 عدد متغیر بود. اندازه قطعات تکثیر شده توسط آغازگرها در محدوده 3500-250 جفت باز بود. 11 آغازگر مذکور مجموعا 142 باند تولید کردند که در این بین تعداد 82 جایگاه(7/57 درصد) چند شکلی نشان دادند. توانایی آغازگرهای مختلف در آشکارسازی چندشکلی در بین ژنوتیپها متغیر بود. در بین آغازگرها، آغازگر UB12 بیشترین چندشکلی(6/91 درصد) و آغازگر UB25و F189 کمترین چندشکلی(3/33 درصد) را نشان دادند (جدول4). نمونه­ای از باندهای تکثیر یافته با استفاده از آغازگرUB67 در شکل2 نشان داده شده است.

برای محاسبه میزان تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپها از تشابه ژنتیکی بر مبنای ضریب نی(30) استفاده شد. دو ژنوتیپ محلی قوچان(Iran1 و Iran2 ) بیشترین شباهت (88 درصد) را داشتند که این می‌تواند نشان از ایزولاین بودن این دو ژنوتیپ باشد. کمترین شباهت(51 درصد) بین ژنوتیپVF-18  (Cimmyt3) با گلرنگ وحشی(C. oxycantha)  به دست آمد.

تجزیه خوشه‌ای بر اساس شباهت ژنتیکی نشان داد که در ضریب تشابه 61/0 گونه‌وحشی گلرنگ از ژنوتیپهای زراعی قابل تفکیک است.  همان طور که انتظار می­رفت ژنوتیپ­ گونه وحشی اختلاف زیادی با ژنوتیپهای زراعی داشت که این امر نشان دهنده کارآبودن‌ نشانگر مولکولی RAPD در مطالعات تکاملی و همچنین برطرف نمودن مشکلات احتمالی مربوط به طبقه­بندی گونه­های جنس کارتاموس است(14و36). دندوگرام حاصله در حد تشابه 78/0، ژنوتیپها را در 9 گروه قرار داد، به طوری که پنج گروه تنها دارای یک ژنوتیپ و بقیه گروهها دارای چندین ژنوتیپ بودند (شکل 3). ژنوتیپهای ایرانی در اکثر گروهها مشاهده شدند که این امر دلیلی بر تنوع زیاد در بین ژنوتیپهای گلرنگ ایرانی می‌باشد. وجود این تنوع زیاد این موضوع را که ایران یکی از مراکز تنوع گلرنگ است را تأیید می‌کند (17و24).

 

 

جدول4- تعداد کل باندهاه، باندهای چندشکل و درصد چند شکلی 11 آغازگر RAPD برای 24 ژنوتیپ گلرنگ

درصد چند شکلی

(b/a×100)

باندهای چند شکل ( (b

 

کل باندها(a)

 

توالی

 

پرایمر

 

5/78

11

14

CCGGCCTTAG

UB30

6/91

11

12

CCTGGGTCCA

UB12

40

4

10

GGGGGCTTGG

UB89

47

8

17

GAGCTCGTGT

UB79

1/61

11

18

GGCGGCATGG

UB96

3/33

3

9

ACAGGGCTCA

UB25

5/87

7

8

GGGTGGTTGC

UB91

75

9

12

GGGCCGTTTA

UB18

7/35

5

14

TGCGCCCTTG

UB95

2/56

9

16

GAGCACCAGT

UB67

3/33

4

12

GTTTCGCTCC

F189

-

82

142

-

کل

7/57

5/7

9/12

-

میانگین

 

 

گروه‌بندی داده‌های مورفولوژیکی با داده‌هـای مولکــولی همخــوانی زیـادی نشــان نــداد، همبستگی بین دو  گروه بندی براساس آزمون مانتل (26) برابر با 05/0r = برآورد شد. ایــن موضوع بیانگر این واقعیت اسـت کـه نشـانگر‌هـای  RAPD مورد استفاده، ارتباط ژنتیکی و پیوستگی مناسب بــا مکانهای کنترل کننـده صـفات مورفولوژیکی مـورد مطالعه را ندارند، البته از آنجایی کـه نشـانگرهای RAPD عمدتاً در نواحی غیر کد کننده ژنوم قرار دارند، عدم ارتبـاط بین گـروه‌بندی داده‌های مولکولی بــا داده‌های مورفولوژیکی دوراز انتظار نیست. حاجی کرم و همکاران(3) نیز گزارش نمودند که نشانگر مولکولی مورد استفاده قادر به تفکیک نمونه‌های Aegilops tauchii از یکدیگر بر اساس مبداء جغرافیایی نیست. سایر محققان (14، 21، 25، 28، 35 و 41) نیز گزارش نمودند که توزیع ژنوتیپها در داخل دسته‌ها با الگوی جغرافیایی مطابقت ندارد. این نتایج نشان داد که از آغازگرهای این پروژه نمی­توان برای تفکیک و طبقه­بندی ارقام گلرنگ براساس مبداء جغرافیایی استفاده کرد.

 

 

شکل 3- دندروگرام حاصل از داده های نشانگرهای RAPD مربوط به 24 ژنوتیپ گلرنگ به روش UPGMA

 

 

دندروگرام حاصله (شکل3) نشان داد که نشانگر RAPD  قادر به تشخیص ژنوتیپها از یکدیگر است که این امر نشان دهنده کارآیی این نشانگر برای مطالعات تنوع ژنتیکی، تنوع درون گونه‌ای و تعیین فاصله بین ژنوتیپها است. در برنامه های اصلاحی ، باتوجه به گروه بندی انجام شده و برآورد میانگین صفات برای ارقام هر کلاستر و درصد انحراف میانگین هر کلاستر از میانگین کل می‌توان والدین مناسب را برای ایجاد تنوع انتخاب نمود. ازآنجایی که ژنوتیپهای موجود در هر یک از کلاسترها دارای قرابت ژنتیکی بیشتری نسبت به ژنوتیپهای موجود در کلاسترهای دیگر هستند ، بنابراین می‌توان برای ایجاد تنوع هر چه بیشتر و انجام تلاقیهای هدفمند از گروه‌بندی بر اساس داده‌های مولکولی استفاده نمود، چون در این گروه‌بندی اثر محیط حذف گردیده و می توان دسته‌بندی دقیق‌تری از ژنوتیپها به دست آورد.

تجزیه آنالیز واریانس مولکولی 22 ژنوتیپ گلرنگ نشان داد که سهم تنوع داخل جمعیتها خیلی بیشتر از تنوع بین جمعیتهاست (جدول5). این نتیجه، نتایج حاصل از گروه‌بندی ژنوتیپها (شکل1 و شکل3) و شباهت ژنتیکی بین جمعیتها را تأیید می‌کند. پایین بودن  واریانس بین جمعیتها نشان دهنده این است که افراد جمعیتهای مختلف از لحاظ ژنتیکی به هم نزدیک می‌باشند، به عبارت دیگر بین جمعیتها چندان تفاوتی از نظر تنوع وجود ندارد. نتایج این تجزیه نشان داد  که عمده تنوع موجود در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه در داخل خود جمعیتها است (جدول 5). بنابراین با انتخاب تعداد نمونه کافی از داخل یک جمعیت می­توان از تنوع موجود برای کارهای اصلاحی استفاده نمود. در چنین جمعیتی احتمال یافتن ژنوتیپهای خوب و مناسب از نظر مقاومت به بیماریها ، آفات و عوامل نامساعد محیطی (شوری و سرما و خشکی) وجود دارد. 

 

 

جدول 5- جدول آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA)

منابع تغییر

df

SS

MS

Est.Var †

Var%††

بین جمعیت ها

5

45/54

89/10

89/0

6

داخل جمعیت ها

16

32/228

27/14

93/13

94

کل

21

77/282

16/25

82/14

100

Est. Var † : واریانس محاسبه شده برای داخل و بین جمعیت ها

% var †† : درصد واریانس هر منبع تغییر به واریانس کل

 

 

نتایج این مطالعه نشان داد که ژنوتیپهای گلرنگ مورد بررسی (به خصوص توده‌های ایرانی) دارای تنوع بالایی در صفات مورفولوژیک بودند که می‌توان از این پتانسیل برای  اصلاح عملکرد دانه و اجزاء عملکرد دانه گلرنگ استفاده نمود. همچنین این مطالعه نشان داد که نشانگر  مولکولی RAPD ابزاری مناسب برای تشخیص تنوع بین گونه‌ای، درون گونه­ای و تعیین فاصله بین ژنوتیپهای گلرنگ است و می‌توان از آن در مدیریت ژرم پلاسم و برنامه­های اصلاحی گلرنگ به خصوص انتخاب والدین جهت تلاقی، استفاده نمود. گونه وحشی بیشترین فاصله را از گلرنگهای زراعی دارد. این گونه دارای بیشترین پراکنش، سازگاری و تنوع در ایران است بنابر این می‌توان از آن به عنوان یک منبع ژنی برای انتقال خصوصیات مطلوب در برنامه­های  به نژادی گلرنگ به خصوص انتخاب والدین جهت تلاقی، بهبود صفات کمی و کیفی و مقاومت به تنشها استفاده نمود.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از معاونت محترم پزوهشی دانشگاه فردوسی مشهد به خاطرتأمین هزینه‌های این طرح (طرح پژوهشی 16808) صمیمانه تشکر و قدردانی می‌گردد.

1- ابدالی، ن.، حسینی مزینانی، م.، عطایی، س.، حسینی، س.ع  و نقوی، م.ر. 1390. بررسی میزان تنوع در چهار رقم زیتون ایرانی با مطالعه صفات مورفولوژیک و نشانگرهای مولکولی  RAPD . مجله زیست شناسی ایران. جلد 24، شماره 6،  صفحه 868-879.

2- باقری، ا.، یزدی صمدی، ب.، تائب، م.، و احمدی، م.ر. 1380. بررسی همبستگی و روابط بین عملکرد وسایر صفات کمی و کیفی گلرنگ. مجله علوم کشاورزی. جلد 32، شماره 2،307- 295.

3- حاجی کرم، م.، نقوی، م.ر.، طالعی، ع.ر و آقایی،م.ج. 1390. بررسی تنوع ژنتیکی نمونه‌های   Aegilops taushii نواحی شمالی ایران با استفاده از نشانگر SSR. مجله زیست شناسی ایران. جلد 24، شماره3، 399-390.

4- خدیوی، ع.، زمانی، ذ.، بوذری، ن.، فتاحی مقدم، م.ر. 1388. ارزیابی گوناگونی ژنتیکی برخی از ارقام گیلاس ایرانی با استفاده از ویژگیهای مورفولوژیکی و نشانگر RAPD . مجله به نژادی نهال و بذر. جلد25 ، شماره1، 209-195 .

5- دریکوند، ر.، سلاحورزی، ا.، حسین پور، ط. و اسماعیلی، ا.1390. بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گندم دیم با استفاده ازنشانگر های RAPD و صفات مورفولوژیکی. فصلنامه دانش نوین کشاورزی پایدار.جلد7،شماره3، 17-9. 

6- سعیدی، ق.، طوفی، ح و میرلوحی، آ . 1383. تنوع ژنتیکی و روابط بین صفات در تعدادی از توده‌های بومی گلرنگ ایران. مجله علوم کشاورزی و منابع طبیعی. جلد22، شماره 11، 116-107.

7- شهبازی دورباش، ص.، علیزاده دیزج، خ.، صادق زاده، ب.، و فتحی رضایی،و. 1390. بررسی تنوع ژنتیکی لاینهای گلرنگ از طریق صفات زراعی و نشانگرهای مولکولی RAPD . مجله علوم گیاهان زراعی ایران.جلد42، شماره2، 231-221.

8- فاضلی، ف و چقامیرزا، ک.1390.  تنوع ژنتیکی نخود زراعی تیپ کابلی (Cicer arietinum L.) ایران بر اساس صفات زراعی و نشانگر .RAPD  مجله به نژادی نهال و بذر. جلد27 ، شماره4 .579-555.

9- قدرتی غ.ر. 1376. بررسی تنوع ژنتیکی و سیتوژنتیکی توده­های بهاره بومی گلرنگ ایرانی. پایان نامه کارشناسی ارشد دانشگاه تربیت مدرس.

10- محمدی، س. ا. 1385. تجزیه و تحلیل داده‌های مولکولی از دیدگاه بررسی تنوع ژنتیکی.  مجموعه مقالات کلیدی نهمین کنگره علوم زراعت و اصلاح نباتات. دانشگاه تهران.117-96.

11-  معالی امیری، ر. م.، یزدی صمدی، ب.، قنادها، م. و عبدمیشانی، س. 1380. بررسی تنوع ژنتیکی ارقام مختلف گلرنگ با استفاده از روش RAPD-PCR. مجله علوم کشاورزی ایران، جلد2 شماره4 ، 745-737.

12- نقوی م.ر.، قره یاضی، ب. و حسینی سالکده، ق.1386 .نشانگر های مولکولی. انتشارات دانشگاه تهران.

 

13- Ahmadzadeh, A. R. 2007. Analysis of genetic diversity in spring safflower (Carthamus tinctorius L.) cultivars using morphological characters and RAPD markers. Ph. D. thesis, Tehran Azad Islamic University.

14- Amini, F., Saeidi, G. and Arzani, A. 2008. Study of genetic diversity in safflower  genotypes using agro-morphological traits and RAPD markers. Euphytica. 163:21–30.

15- AOCS. 1993. Official methods and recommended practices.The American Oil Chemists Society Champaign.

16- Ashri, A., Zimmer D.E., Urie A.L., and Marani A. 1974. Evaluation of the world Collection of safflower. IV. Yield and yield components and their relationships. Crop Science. 14:799-800.

17- Chapman, M.A., Hvala, J., Strever, J., and Burke, J.M. 2010. Population genetic analysis of safflower (Carthamus tinctorius; Asteraceae) reveals a Near Eastern origin and five centers of diversity. American Journal of  Botany. 97: 831-840 .

18- Daju, L., and Mundel, H.H. 1996. Safflower (Carthamus tinctorius L.). International Plant Genetic Resources Institute.

19- Elfadl, E., Reinbrecht, C., and Claupein, W. 2009. Evalution of phnotype varation in a world germplasm collection of safflower(Carthamus tinctorius L.) grown under organic farming conditions in Germany. Genetic Resources and Crop Evoulation. 57(2): 155-170.

20- Falconer, D., and Mackay, F.C. 1996. Intoduction to quantitative genetics. Longman Group Ltd,

21- Jaradat, A.A. and Shaid, M. 2006. Pattern of phenotypic varation in a germplasm collection of Carthamus tinctorius L. Form the Middle East. Euphytica. 53: 225-244.

22- Karim, K., A. Rawda, C. M. Hatem, B. N. Mbarek and T. Mokhtar. 2010. Analysis of genetic diversity and relationships in local Tunesian barley by RAPD and SSR analysis. Afr. J. Biotechnol.  9(44): 7429-7436.

23- Khan, M. A., Von Witzke-Ehbrecht, S., Maass, B. L. and Becker, H. C. 2009. Relationships among different geographical groups, agro-morphology, fatty acid composition and RAPD marker diversity in Safflower (Carthamus tinctorius L.).Genet Resource Crop Evol. 56: 19-30.

24- Knowles, P.1989. Centers of plant diversity and conservation of crop germplasm: safflower. Economic Botany. 23:324–329.

25- Mahasi, M. J. L., Wachira, F. N.., Pathak, R. S.. and Riungu, T. C. 2009. Genetic polymorphism in exotic safflower (Carthamus tinctorius L.) using RAPD markers. Journal of Plant Breeding and Crop Science. 1(1): 008-012.

26- Mantel, N. A. 1967. The detection of disease clustering and a generalized regression approach Cancer Research. 27:209-220.

27- McPherson, M.A., Good, A.G., Topinka, A.K.C., Hall, L.M. 2004. Theoretical hybridization potential of transgenic safflower (Carthamus tinctorius L.) weedy relatives in the New World. Canadian Journal of  Plant  Science. 84: 923-934.

28- Mohammadi, S. A. and Prasanna, B. M. 2003. Analysis of genetic diversity in crop plants-salient statistical tools and considerations. Crop Science. 43: 1235–1248.

29-  Nei, M. 1972. Genetic distance between population. Nature. 106: 283-292.

30- Nei, M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics. 89: 583-590.

31- Pahlavani, M.H. 2005. Some technological and morphologycal characteristics of safflower (Carthamu inctorius L.) from Iran. Asian Journal of Plant Sciences. 4(3): 234-237.

32- Pascual-Villalobos, M.J., and Alburquerque, N. 1996. Genetic varicition of safflower germplasm collection grown as a winter crop in southern Spain. Euphytica.92: 327-332.

33- Peakall, R. and Smouse, P.E. 2001. GenALEX Ver.5. Genetic Analysis in Excell. Population genetic software for teaching and research. Canberra. Australin National University.

34- Rohlf,  F.J. 2000. NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate analysis system. version 2.1. Exeter Software, New york.

35- Rolda´n-Ruiz, I., Van Eeuwijk, F. A., Gilliland, T. J., Dubreuil, P., Dillmann, C., Lallemand, J., De Loose, M. and Baril, C. P. 2001. A comparative study of molecular and morphological methods of describing relationships between perennial ryegrass (Lolium  perenne L.) varieties. Theoretical and Applied Genetics. 103: 1138–1150.

36- Sabzalian, M.R., Saeidi, G. and Mirlohi, A. 2008. Oil content and fatty acid composition in seeds of three safflower species. Euphytica. 85: 717-721.

37- Safavi, S. A., Pourdad, S. S., Taeb, M. and Khosroshahli,  M.2010. Assessment of genetic variation among safflower (Carthamus tinctorius L.) accessions using agro-morphological traits and molecular markers. Food Agriculture and Environment. 8(3- 4). 616-625.

38- Saghai Maroof, M. A., Biyashev, R. M., Yang, G. P., Zhang, Q. & Allard, R. W. 1994. Extra ordinarily polymorphic micro satellite DNA in barley: species diversity, chromosomal Locations, and population dynamics. Proc Natl  Acad  Science USA, 7: 5466-5470.

39- Salamati, M., Zeinali, H. and Yousefi, E. 2011. Investigation of Genetic Variation in Carthamus tinctorius L. Genotypes Using Agro-Morphological Traits. Journal of Research in Agricultural Science. 7(2): 101- 108.

40- Sangam, L.D., Upadhyaya, H.D., and Hegde, D.M. 2005. Development of core collection using geographic information and morphological descriptors in safflower (Carthamus tinctorius L.) germplasm. Genetic Resources and Crop Evolution. 52: 821-830.

41- Sehgal, D. and Raina, S.N. 2005. Genotyping safflower (Carthamus tinctorius L.) cultivars by DNA fingerprints. Euphytica. 146:67–76.

42- Sehgal, D., Rajpal, V.R., Raina, S.N., Sasanuma, T. and Sasakuma, T. 2009. Assaying polymorphism at DNA level for genetic diversity diagnostics of the safflower (Carthamus tinctorius L.) world germplasm resources. Genetica. 135(3):457-70.

43- Smith, J.S.C. and Smith, O.S. 1992. Fingerprinting crop varieties. Adv. Agron. 47: 85-89.

44- Staub, J. E., Serquen, F. C.  and Gupta, P. K.  1996. Genetic marker, map construction and their application in plant breeding. Hort. Sci. 31: 729-740.

45- Weiss, E.A. 2000. Oil seed crops. 2nd ed. Black Well Scince Oxford.