نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تهران

2 دانشیار گروه میکروبیولوژی پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی و قطب تبار زایی موجودات زنده، دانشگاه تهران، تهران، ایران

3 3. دانشیار گروه بیوشیمی دانشکده علوم زیستی دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده

لاکازها به دلیل توانایی اکسیداسیون طیف گسترده‌ای از ترکیبات فنولی کاربردهای بیوتکنولوژیکی گوناگونی دارند. در این مطالعه سویه بومی QZA2 که از خاک‌های ایران جدا شده است مورد استفاده قرار گرفت. این سویه بر اساس توالی SrRNA 16دارای بیش‌ترین شباهت به باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه ATCC 14578 بود. ژن کد کننده آنزیم لاکاز از سویه QZA2 به وسیله پرایمرهای کلونینگ تکثیر شد و سپس محصول PCR در ناقل بیانی (pET21a) کلون شد و آنالیز توالی انجام گرفت. این ژن سپس در باکتری اشریشیا‌کلی سویه BL21(DE3) تحت کنترل فاژ T7 بیان شد. ژن مولتی کوپر اکسیداز در سویه QZA2 یک قالب باز خواندن دارد که دارای 1656 نوکلئوتید بوده و 551 اسید آمینه را کد می‌کند و شامل 4 دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس بود. توالی آمینواسیدی مولتی کوپراکسیداز سویه QZA2 دارای 16% همسانی به توالی آمینو اسیدی پروتئین CotAدر باکتری باسیلوس سوبتیلیس و 57% شباهت را به توالی مولتی کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس هالودورانس نشان داد. بیان تحت شرایط میکروآئروفیلیک به منظور دست‌یابی به مقادیر بیشتر پروتئین محلول انجام گرفت. بیان آنزیم با استفاده از سوبسترای معمول لاکاز ABTS سنجیده شد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Cloning and Expression of Laccase Enzyme from Bacillus anthracis strain QZA2

نویسندگان [English]

  • parvin zamani 1
  • mohammad Ali amoozegar 2
  • khosro khajeh 3

1 university of Tehran/ student

2 Associated professor of Microbiology department, School of Biology and Center of Excellence in Phylogeny of Living Organisms, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran

3 Associated professor of Biochemistry department, University of Tarbiatmodares, Tehran, Iran

چکیده [English]

Laccases have many biotechnological applications due to their oxidation ability towards a wide range of phenolic compounds. In this study, the strain QZA2 isolated from Iran soils was used. This strain showed high similarity to Bacillus anthracis strain ATCC 14578 according to 16S rRNA gene sequence. Laccase gene was amplified by cloning primers.then PCR product cloned in the expression vector (pET21a) and transferred to BL21(DE3) strain of E. coli under the control phage T7 and sequence analysis carried out. The gene of the QZA2 has an open reading frame composed of 1656 bases, which encodes 551 amino acid residues and contain four histidine rich copper-binding domains. The laccase gene from QZA2 showed 16% similarity with CotA from B. subtilis and 57% similarity with multicopper oxidase B. halodurans . The expression was performed under microaerobic condition in order to obtain high amounts of soluble protein. Biochemical properties were investigated using common laccase substrates ABTS.

کلیدواژه‌ها [English]

  • laccase
  • multicopper oxidase
  • cloning
  • Bacillus anthracis

`کلونینگ و بیان ژن کد کننده آنزیم لاکاز از باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2 

پروین زمانی1، محمدعلی آموزگار1* و خسرو خواجه2 

1 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی، بخش میکروبیولوژی 

2 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوشیمی 

تاریخ دریافت: 15/1/92               تاریخ پذیرش: 28/2/93 

چکیده

لاکازها به دلیل توانایی اکسیداسیون طیف گسترده‌ای از ترکیبات فنولی کاربردهای بیوتکنولوژیکی گوناگونی دارند. در این مطالعه سویه بومی QZA2 که از خاکهای ایران جدا شده است مورد استفاده قرار گرفت. این سویه بر اساس توالی SrRNA 16دارای بیش­ترین شباهت به باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه ATCC 14578 بود. ژن کد کننده آنزیم لاکاز از سویه QZA2 به وسیله پرایمرهای کلونینگ تکثیر شد و سپس محصول PCR در ناقل بیانی (pET21a) کلون شد و آنالیز توالی انجام گرفت. این ژن سپس در باکتری اشریشیا­کلی سویه BL21(DE3) تحت کنترل فاژ T7 بیان شد. ژن مولتی کوپر اکسیداز در سویه QZA2 یک قالب باز خواندن دارد که دارای 1656 نوکلئوتید بوده و 551 اسید آمینه را کد می‌کند و شامل 4 دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس بود. توالی آمینواسیدی مولتی کوپراکسیداز سویه QZA2 دارای 16 درصد همسانی به توالی آمینو اسیدی پروتئین  CotAدر باکتری باسیلوس سوبتیلیس و 57 درصد شباهت را به توالی مولتی کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس هالودورانس نشان داد. بیان تحت شرایط میکروآئروفیلیک به منظور دست­یابی به مقادیر بیشتر پروتئین محلول انجام گرفت. بیان آنزیم با استفاده از سوبسترای معمول لاکاز ABTS سنجیده شد.

واژه های کلیدی: لاکاز، مولتی کوپر اکسیداز، کلونینگ، باسیلوس آنتراسیس

* نویسنده مسئول، تلفن : 02161113557 ، پست الکترونیکی: amoozegar@ut.ac.ir

مقدمه

 

پروتئینهای آبی چند مسی ( MCBP) از معروف‌ترین گروههای پروتئین حاوی مس، دارای گروه متغیری از پروتئینها با 6-2 یون مس هستند (12). اکسیدازهای چند مسی یک گروه از MCBP هستند که آنزیمهای متعددی مانند لاکازها (EC 1.10.3.2)، آسکوربات اکسیدازها (EC 1.10.3.3.)، سرولوپلاسمین (EC 1.16.3.1) و فرواکسیداز (EC 1.16.3.1) در این گروه قرار دارند (21).

لاکازها (بنزن‌دیول‌اکسیژن‌اکسیدوردوکتاز) پلی فنول اکسیدازهایی هستند که طیف گسترده‌ای از ترکیبات فنولی را اکسید کرده و به طور گسترده‌ای در گیاهان، باکتریها، قارچها و حشرات توزیع شده‌اند (4). این آنزیمها دارای 4 دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس هستند. اتمهای مس کوئوردینه شده در این پروتئین بر اساس خصوصیات اسپکتروسکوپی به سه نوع I، II و III دسته‌بندی می‌شوند. ویژگی اسپکتروسکوپی مس نوع I اساساً مشابه پروتئینهای انتقال دهنده الکترون است و بیشترین جذب را در طول موج 610 نانومتر دارد، مس نوع II جذب ضعیف‌تری در این طول موج دارد و مس نوع III بیشترین جذب را در طول موج 330 نانومتر نشان می‌دهد. مس نوع I و II به وسیله EPR قابل تشخیص بوده و دارای یک اتم مس هستند، در حالی که مس نوع III دارای یک جفت اتم مس است که به وسیله EPR قابل تشخیص نیست (22). لاکازها به دلیل توانایی اکسیداسیون سوبستراهای گوناگون در سالهای اخیر از لحاظ کاربردهای بیوتکنولوژیکی اهمیت زیادی پیدا کرده‌اند و در صنایع مختلفی مانند: صنایع کاغذسازی، نساجی، غذایی، دارویی و همچنین در حذف زیستی ترکیبات فنولی کاربرد دارند (15).

تا کنون لاکازها به طور وسیعی از قارچها جدا شده­اند و در حال حاضر دارای کاربردهای بیوتکنولوژیکی هستند (8). با وجود اینکه لاکازها به طور گسترده­ای در باکتریها وجود دارند اما تاکنون تعداد کمی از لاکازهای باکتریایی شناسایی شده است. لاکازهای باکتریایی تاکنون از باکتریهایی مانند آزوسپیریلوم لیپوفروم (اولین لاکاز پروکاریوتی گزارش شده) (11)، مارینوموناس مدیترانه­ای (20)، باسیلوس هالودورانس (17)، باسیلوس لیکنیفورمیس (13)، باسیلوس سوبتیلیس (25) و باسیلوس اسفاریکوس گزارش شده است (5) . مهم‌ترین لاکاز باکتریایی که تاکنون به خوبی بررسی شده و خصوصیات ساختاری و بیوشیمیایی آن تعیین شده، پروتئین CotA اندوسپور باکتری باسیلوس سوبتیلیس است که به نظر می­رسد این پروتئین در محافظت در برابر نور uv و پراکسید هیدروژن نقش دارد (25). از جمله بررسیهای دیگری که در مورد جداسازی این آنزیم از باکتریها در ایران انجام شده است مربوط به جداسازی یک سویه ملانوژنیک (HR03) متعلق به جنس باسیلوس است که توانایی بالایی برای تولید انواع پلی­فنول اکسیدازها مانند: کرزولازها (EC1.14.18.1)، کتکولازها  (EC1.10.3.1) و لاکاز (EC.1.10.3.2) را دارد (2). آنزیم لاکاز این سویه کلون و بیان شده و ویژگیهای بیوشیمیایی آن تعیین شده است (16). بررسیهای انجام شده در تجزیه و تحلیل کل ژنوم مشخص کرده که این آنزیمها در باکتریها به طور گسترده­ای توزیع شده­اند، با وجود این اطلاعات در مورد لاکازهای باکتریایی کم است (19). با توجه به توسعه روشهای مولکولی و ابزارهای ژنتیکی گوناگون امکان بررسی ژنوم باکتریایی بیشتر شده و از آنجایی که فرآیندهای بیوتکنولوژیکی به خوبی شناسایی شده­اند، توسعه لاکازهای باکتریایی با توجه به مزایایی آنها از جمله پایداری بالا و تولید در مدت زمان کوتاه در محیطهای ارزان، اهمیت قابل ملاحظه­ای دارد. در این پژوهش ژنهای جدید دارای فعالیت بالقوه لاکاز با جستجو در پایگاه داده­های پروتئینی و نوکلئوتیدی، با الگو قرار دادن توالی ژن­ لاکازهای باکتریهایی که تاکنون شناسایی و توالی یابی شده­اند، مورد بررسی قرار گرفت. از بین ژنهای کاندید، ژن کد کننده آنزیم لاکاز از سویه QZA2، که از خاکهای بومی ایران جدا شده بود برای شناسایی، کلون و بیان ژن استفاده شد.

مواد و روشها

مواد: ایزوپروپیلβ-D-1-­ تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)، آنزیمهای محدود کننده XhoI و NdeI از شرکت فرمنتاز (آلمان) و ABTS از شرکت سیگما-آلدریچ (آمریکا) و سایر مواد از شرکت مرک (آلمان) خریداری شد.

سویه­ها و محیط کشت: باکتری اشریشیا­کلی سویه XL1-Blue به عنوان سویه کلونینگ و باکتری اشریشیا­کلی سویه BL21(DE3) به عنوان سویه بیانی مورد استفاده قرار گرفت. انتخاب باکتری مورد نظر برای شناسایی تکمیلی بر اساس سویه بومی QZA2 انجام گرفت. این سویه از خاکهای ایران و از منطقه فیروز کوه تهران جدا شد. آزمونهای میکروسکوپی و فیزیولوژیک برای شناسایی سویه انجام شد. رنگ آمیزی گرم بر اساس روش هوکر انجام شد، و شکل میکروسکوپی سویه توسط میکروسکوپ نوری مشاهده شد. حرکت سلول با استفاده از روش لام مرطوب بررسی شد (10). برای مشاهده حرکت از میکروسکوپ نوری استفاده شد. برای بررسی فعالیت کاتالازی از کشت 24 ساعته سویه و پراکسید هیدروژن سه درصد به عنوان معرف استفاده شد و تولید حباب به عنوان واکنش مثبت در نظر گرفته شد. برای مشاهده اسپور باکتری از محیط اسپورزایی آگاردار استفاده شد، به علاوه جهت تأمین رشد و کاهش میزان آلودگی، کلرید سدیم به میزان 3 درصد حجم محیط اضافه گردید (1). ابتدا باکتری در محیط تولید اسپور کشت داده شد، و بعد از 4 روز رنگ آمیزی اندوسپورها با رنگ فوشین بازی بر اساس روش شافر و فولتون انجام گرفت (10). بررسی حساسیت سویه به پنی­سیلین به روش انتشار از دیسک پس از انجام کشت چمنی از سویه­ها در محیط نوترینت آگار انجام شد. وجود هاله عدم رشد نشان دهنده حساسیت سویه­ها به پنی­سیلین بود (3). فعالیت همولیتیکی باکتری در محیط کشت آگار خوندار حاوی 5 درصد خون گوسفند از لحاظ وجود و عدم وجود هاله شفاف اطراف کلنیها بررسی شد (9).

شناسایی تکمیلی سویه منتخب با تکثیر و تعیین توالی ژن S rRNA16 انجام شد. برای این منظورDNA ژنومی سویه QZA2 استخراج شد (24) و به عنوان الگو برای انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز مورد استفاده قرار گرفت (23) و با استفاده از پرایمرهای عمومی S16 rRNA، 27F با توالی (5¢-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3¢) و 1492R با توالی (5¢-GGTTACCTTGTTACGACTTCACC-3¢) تکثیر انجام شد. به منظور تکثیر ژنS S rRNA16 با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز، بافر با غلظت X1 در ترکیب نهایی، MgCl2 با غلظت نهایی 5/2 تا 5/0 میلی مول ، dNTP با غلظت 4/0 میلی مول از هر کدام، آنزیم Taq DNA پلیمراز به میزان 50U/2 میکرولیتر و پرایمرهای رفت و برگشت از هر کدام به میزان 5/0 تا 4/0 میلی مول و DNA الگو به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه با سایر نمونه­ها که در آن به جای DNA الگو از آب مقطر استفاده شده بود، به عنوان شاهد منفی استفاده شد. برای انجام این واکنش واسرشت سازی اولیه با دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و 30 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت سازی با دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه، اتصال پرایمرها در 57 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه گسترش در 72 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه و پس از اتمام 30 چرخه برای گسترش نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت 7 دقیقه انجام شد. محصول نهایی حاصل از واکنش تعیین توالی شد (شرکت ماکروژن کره جنوبی).

کلونینگ ژن مورد نظر: همان طور که گفته شد لاکازها جزء آنزیمهای مولتی کوپر اکسیداز هستند. سویه از جنس باسیلوس­ که توالی مولتی کوپر اکسیدازی با فعالیت لاکازی دارد و همچنین توالی آمینواسیدی و توالی نوکلئوتیدی و همچنین خصوصیات بیوشیمیایی آن به خوبی شناسایی شده، باکتری باسیلوس هالودورانس است. در نتیجه از توالی آمینواسیدی و توالی نوکلئوتیدی ژن مولتی کوپراکسیداز باکتری باسیلوس هالودورانس با شماره دسترسی  NP_242948 به عنوان الگوی جستجو درپایگاه اطلاعاتی بانک ژنی استفاده شد. به منظور به دست آوردن توالی نوکلئوتیدی کد کننده مالتی­کوپر اکسیدازهای باکتریایی که دارای فعالیت لاکاز باشند، از توالی نوکلئوتیدی مولتی کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس هالودورانس  به عنوان الگو استفاده شد و جستجو tBLASTn در پایگاه اطلاعاتی بانک ژنی، انجام شد.

 به منظور طراحی پرایمر برای ژن مورد نظر در باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2 توالی ژنی مولتی کوپر اکسیداز در سویه‌های مختلف باکتری باسیلوس آنتراسیس انتخاب شد و در دو پایگاه clustalW2 و NCBI Blas مورد بررسی قرار گرفت. واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای ژن مورد نظر با استفاده از پرایمر رفت با توالی 5´-ATACATATGATGCGATATATATATTAACAGCGG-3´ دارای جایگاه برش آنزیم NdeI در طرف ¢5 و پرایمر برگشت با توالی 5´-GTGCTCGAGTTATTCTGGCTTATTAGGAATAATTTGGG-3¢ دارای جایگاه برش آنزیم XhoI در طرف ˊ5 انجام شد. DNA  ژنومی استخراج شده از سویه QZA2 به عنوان الگو مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از پرایمرهای طراحی شده ژن مورد نظر با واکنش زنجیره­ای   پلیمراز تکثیر شد. به منظور تکثیر ژن مورد نظر با واکنش زنجیره­های پلیمراز بافر با غلظت x1 در ترکیب نهایی، MgCl2 با غلظت نهایی 5/2 میلی مول، dNTP با غلظت 4/0 میلی مول از هر کدام، آنزیم Taq DNA پلیمراز 50U/2 میکرولیتر و پرایمرهای رفت و برگشت از هر کدام 8/0 تا 1 میلی مول و DNA الگو به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه با سایر نمونه­ها که در آن به جای DNA الگو از آب مقطر تزریقی استفاده شده بود، به عنوان شاهد منفی استفاده شد. برای انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز از واسرشت سازی اولیه با دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و 30 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت سازی با دمای 94 درجه سانتی گراد و اتصال با دمای بین 55-60 درجه سانتی گراد هر کدام به مدت 60 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 60 ثانیه و پس از اتمام 30 چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه سانتی گراد برای مدت 15 دقیقه در نظر گرفته شد. محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز با کیت خالص سازی محصول PCR ،Bioneer (AccuPrep, nano-plus Plasmid mini Extraction kit, korea) خالص شد.

محصول خالص شده و پلاسمید بیانی pET21a(+) توسط آنزیمهای محدود کننده به صورت جداگانه مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. به منظور هضم آنزیمی در واکنشهای جداگانه­ای، بافر تانگو با غلظت x2در حجم نهایی، آنزیم lμ NdeI 10U/ و lμXhoI 10U/ ، محصول خالص شده و پلاسمید بیانی و آب مقطر تزریقی به میزان مناسب افزوده شد و به مدت 4 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرما گذاری شد. محصولات هضم شده توسط کیت خالص سازی محصول PCR خالص شد و سپس با غلظت مناسب توسط آنزیم لیگاز به هم اتصال یافت. واکنش اتصال شامل، بافر ویژه آنزیم لیگاز با غلظت نهایی x1، آنزیم لیگاز (T4 DNA Ligase) lμU/5 و قطعات ژنی پلاسمید بیانی pET21a(+) و ژن خالص شده به میزان مناسب افزوده شد و به مدت یک ساعت در 22 درجه سانتی گراد و سپس 12 ساعت در 16 درجه سانتی گراد گرما گذاری شد. پلاسمید حاصل از اتصال قطعات ژنی در سویه  XL1-Blue به عنوان وکتور کلونینگ، با روش شوک حرارتی ترانسفورم گردید. محصول حاصل از انتقال پلاسمید به سلول میزبان بر روی محیط کشت جامد دارای آمپی‌سیلین کشت داده شد. کلنیهای مثبت دارای پلاسمید نوترکیب انتخاب و صحت حضور پلاسمید مورد نظر در این سویه با روش هضم دوگانه با آنزیمهای محدود کننده  NdeI و XhoI و همچنین روش کلنی PCR تأیید شد. پلاسمید نوترکیب pET21a از این سویه با استفاده از کیت استخراج پلاسمید Bioneer استخراج شد و برای اطمینان از صحت توالی مورد نظر با استفاده از پرایمرهای T7 promoter  وT7 terminator تعیین توالی گردید.

بعد از اطمینان از صحت توالی مورد نظر پلاسمید نوترکیب pET21a در سویه بیانی BL21(DE3) E. coli ترانسفورم شد و سپس بر روی محیط LB دارای آمپی‌سیلین کشت داده شد. یکی از کلنیهای BL21 مثبت دارای پلاسمید نوترکیب pET21a که بر روی محیط LB جامد دارای آمپی‌سیلین رشد کرده بود به محیط LB حاوی آمپی سیلین به عنوان پیش کشت تلقیح شد و در شیکر انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد با 220 دور در دقیقه به مدت 12 ساعت گرما گذاری شد. پس از این زمان از محیط پیش کشت به محیط TB حاوی آمپی­سیلین تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتی گراد با شیک 180 دور در دقیقه قرار داده شد تا به OD 6/0-5/0 برسد. بعد از این زمان IPTG با غلظت نهایی 1/0 میلی­مولار و CuSO4 با غلظت نهایی 2 میلی­مولار به عنوان القاء کننده به محیط افزوده شد. به طور همزمان به عنوان نمونه شاهد، محیط کشتی با شرایط مشابه با شرایط قبل از همان کلنی مثبت تهیه شد اما بعد از رسیدن به OD القاء نشد. یک کلنی از سلولهای BL21 فاقد پلاسمید نوترکیب با شرایط یکسان با کلنی مثبت حاوی پلاسمید نوترکیب، نیز به عنوان نمونه شاهد منفی به طور همزمان کشت داده شد. سپس محیطهای کشت القاء شده و القاء نشده (حاوی کلنیهایی با پلاسمیدهای نوترکیب و غیر نوترکیب) به مدت 4 ساعت در دمای 18 درجه سانتی گراد با 140 دور در دقیقه شیک شد و بعد از آن به مدت 20 ساعت بدون شیک در دمای 180 درجه سانتی گراد گرما گذاری شد. همچنین نمونه­های تهیه شد که بعد از القاء شدن به مدت 24 ساعت در دمای 18 درجه سانتی گراد با 140 دور در دقیقه (شرایط هوازی) قرار گرفتند.

از آنجایی که پروتئینهای بیان شده در داخل سلول مجتمع می­شوند، سلولها بعد از 20 ساعت گرما گذاری، با سانتریفیوژ در g4000  به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد جمع­آوری شدند. رسوب به دست آمده در بافر فسفات 50 میلی­مولار با 6/7pH  حاوی مهار کننده پروتئاز PMSF 1mM حل شد و سپس بر روی یخ سونیکیت شد. بقایای سلولهای شکسته شده با سانتریفیوژ با g13000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد رسوب داده شد. محلول رویی در 70 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه گرما گذاری شد و سپس برای حذف پروتئینهای دناتوره شده درg 13000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. عصاره سلولی به دست آمده برای هر دو نمونه کنترل و آزمون، به منظور سنجش بیان آنزیم و ارزیابی میزان فعالیت آنزیم بیان شده، مورد سنجش آنزیمی قرار گرفت.

سنجش بیان آنزیمی: فعالیت  آنزیمی در دمای اتاق در حضور سوبسترای معمول این آنزیم ABTS سنجیده شد. اکسیداسیون (mM 2) ABTS در بافر فسفات mM 100 با 4pH  توسط افزایش جذب در طول موج 420 نانومتر به مدت 5 دقیقه اندازه گیری شد.

نتایج

جستجوی tBLASTn در پایگاه اطلاعات ژنی با استفاده از توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی باکتری باسیلوس هالودورانس به عنوان الگو انجام شد. در نتیجه این جستجو توالیهای متعددی در باکتریهای گوناگون شناسایی شد. یکی از این توالیها، توالی مولتی­کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس آنتراسیس‌ بود که تاکنون نوع فعالیت و ویژگیهای این توالی شناسایی نشده بود. در نتیجه باکتری باسیلوس آنتراسیس به عنوان باکتری منتخب برای کلونینگ و بیان توالی مورد نظر در باکتری اشریشیاکلی انتخاب شد.

شناسایی سویه QZA2: نتایج بررسی صفات اولیه در سویه QZA2 نشان داد که این سویه، سویه­ای گرم مثبت، دارای اندوسپور و کاتالاز مثبت، فاقد حرکت و حساس به پنی­سیلین است و همچنین توانایی همولیز گلبولهای قرمز خون گوسفند را ندارد.

نتایج حاصل از تعیین توالی ژن S rRNA16 با استفاده از نرم افزار Chromas Pro (Technelysium Pty Ltd, Australia) ویرایش شد و با استفاده از ابزار BLAST در دو بانک اطلاعاتی NCBI و پایگاه اطلاعاتی EzTaxon-e server  (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim et al., 2012) مورد بررسی قرار گرفت. سویه­ QZA2 از نظر میزان شباهت در توالی ژن S rRNA16 بررسی شد و درخت فیلوژنتیک این سویه­ با الگوریتم Neighbor joining (18) و ضریب Boot Strap 1000 (7) و با  نرم افزار MEGA5 (Molecular evolutionary genetics analysis, version 5, Tokyo, Japan) (14) رسم شد. بررسی توالی ژن S rRNA16 سویه QZA2 نشان داد که این سویه دارای 100 درصد شباهت به باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه ATCC 14578T  است (شکل 1).

تکثیر اختصاصی ژن لاکاز: توالی ژن لاکاز در باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2 با استفاده از پرایمرهای طراحی شده اختصاصی ژن، تکثیر شد و صحت توالی آن مورد بررسی قرار گرفت.

پس از تأیید کلون شدن ژن مورد نظر در وکتور pET21a(+)، پلاسمیدهای نوترکیب تخلیص شد و با استفاده از پرایمرهای T7 promoter و T7 terminator تعیین توالی شد. نتیجه تعیین توالی ژن بررسی شد. توالی نوکلئوتیدی در پایگاه داده­هایExPASy (www.expasy.ch، مؤسسه بیوانفورماتیک سوئیس SIB) به توالی آمینواسیدی تبدیل و مشخص شد توالی بدون جهش بود.

 

 

 Strain QZA2

 Bacillus anthracis ATCC 14578(T) (AB190217)

 Bacillus anthracis Ames (AE016879)

 Bacillus cereus ATCC 14579(T) (AE016877)

 Bacillus thuringiensis ATCC 10792(T) (ACNF01000156)

 Bacillus gaemokensis BL3-6 KCTC 13318(T) (FJ416489)

 Bacillus mycoides DSM 2048(T) (ACMU01000002)

 Bacillus weihenstephanensis KBAB4 (CP000903)

Bacillus weihenstephanensis WSBC 10204(T) (Z84578)

 Bacillus mycoides ATCC 6462(T) (AF155956)

 Bacillus pseudomycoides DSM 12442(T) (ACMX01000133)

Bacillus manliponensis BL4-6(T) (FJ416490)

 Bacillus cytotoxicus NVH 391-98(T) (CP000764)

 Bacillus marisflavi TF-11(T) (AF483624)

 Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610(T) (ABQL01000001)

 Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049(T) (CP002905)

 Bacillus atrophaeus JCM 9070(T) (AB021181)

  Bacillus niabensis 4T19(T) (AY998119)

 Bacillus herbersteinensis D-1-5a(T) (AJ781029)

 Bacillus persicus B48(T) (HQ433471)

 Bacillus flexus IFO 15715(T) (AB021185)

 Bacillus megaterium IAM 13418(T) (D16273)

 Viridibacillus arenosi LMG 22166(T) (AJ627212)

 Viridibacillus arvi LMG 22165(T) (AJ627211)

100

86

100

100

98

39

41

47

56

100

72

100

100

39

90

35

36

41

61

44

0.01

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: درخت فیلوژنتیک سویهQZA2  با روش Neighbor-joining  و با استفاده از معیار Boot strap 1000


سنجش بیان آنزیم لاکاز: فعالیت آنزیمی لاکاز در دمای اتاق در حضور سوبسترای معمول این آنزیم ABTS انجام شد. از بین کلنیهای بررسی شده تنها کلنی دارای پلاسمید نوترکیب pET21a که تحت شرایط القاء با IPTG و CuSO4 قرار گرفته بود فعالیت آنزیمی نشان داد. سنجش فعالیت آنزیمی شامل اکسیداسیون ABTS (2میلی مولار( در بافر فسفات 100 میلی مولار با 4pH  با افزایش جذب در 420 نانومتر مشاهده شد، همچنین در اثر اکسیداسیون ABTS با آنزیم لاکاز در مخلوط واکنش رنگ سبز ایجاد شد، که نشانگر حضور آنزیم لاکاز در مخلوط واکنش بود (شکل 2).

 

 

الف

 

 

                       (ب)                                                                     ( ج)

شکل 2- الف) افزایش جذب در اثر اکسیداسیون ABTS در طول موج 420 نانومتر، بعد از زمان 5 دقیقه میزان جذب به 7/0 رسید. نمونه شاهد 1/0 افزایش جذب به علت شکستن خودبه خودی ABTS نشان می­دهد. ب) ایجاد رنگ سبز در اثر اکسیداسیون ABTS با آنزیم لاکاز برای نمونه لاکاز مثبت ج) نمونه کنترل که عدم تغییر رنگ را نشان می­دهد.

 


بحث

بیان ژن لاکاز در شرایط معمول یعنی کشت سلول تحت شرایط هوازی جواب مطلوبی نداشت. همان طور که قبلاً گزارش شده است در شرایط هوازی تنها بخش کمی از آنزیم بیان شده به صورت فعال باقی ‌مانده و بیشتر محصول بیان به فرم جسم توده­ای می­باشد که این اتفاق احتمالاً به دلیل جایگزینی ناقص یون مس در ساختار آنزیم می­باشد (10). همان‌طور که دورائو (Durao) و همکاران به این نکته اشاره کرده‌اند که محتوای مس CotA وابسته به غنی سازی محیط کشت با یون مس و وجود اکسیژن  در محیط کشت است (6). تغییر شرایط آئروبیک به میکروآئروبیک محتوای داخل سلولی مس را افزایش می‌دهد. افزایش یون مس داخل سلولی و همچنین وجود شرایط میکروآئروبیک منجر به ایجاد وضعیتی مناسب برای تاخوردگی و تشکیل هولوآنزیم می‌گردد. با توجه به این نتایج، القاء با IPTG و در محیط غنی شده با CuSO4 انجام گرفت و بعد با خاموش کردن شیکر میزان دسترسی به اکسیژن در کشت کاهش یافت. توالی آمینواسیدی مولتی کوپراکسیداز سویه QZA2 بررسی شده در NCBI Blast نشان داد که این توالی دارای 16 درصد همسانی و 24 درصد شباهت به توالی آمینو اسیدی باکتری باسیلوس سوبتیلیس است. از طرف دیگر توالی آمینواسیدی مولتی کوپراکسیداز سویه QZA2 دارای 40 درصد همسانی و 57 درصد شباهت به توالی آمینواسیدی لاکاز باکتری باسیلوس هالودورانس است.

چهار دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس در آنزیمهای لاکاز وجود دارد. جایگاههای T1، T2 و T3 دارای ریشه­های آمینواسیدی حفاظت شده­ای هستند. همان طور که جدول 1 دیده می­شود، این جایگاه­های متصل شونده به مس در توالی آمینواسیدی ژن مولتی کوپر اکسیداز سویه QZA2  نیز وجود دارند و ژن مورد نظر در سویه QZA2 دارای 4 ناحیه غنی از هیستیدین متصل شونده به مس است و شباهت زیادی به پروتئینهای متصل شونده به مس دارد (جدول 1).

 

 

جدول 1- هم تراز سازی 4 دمین متصل شونده به مس در توالی آمینواسیدی برخی سویه­های باسیلوسی و سویه­های قارچی و مقایسه آنها با توالی مالتی­کوپراکسیداز باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2. ریشه­های آمینواسیدی متصل شونده به مس حفاظت شده برای مس نوع 1، 2 و 3 با سایه نشان داده شده است. اعداد داخل پرانتز شماره دسترسی پروتئین مربوطه است (9).

             313          1 

1      2   3           

3      3 

2    3           

نام و شماره دسترسی

470  NFLHCHIDW HL 

418 HPFHLHGHTFSVV

126 TFWYHSH

83      TIHWHG

Phlebia radiate ( Q01679)

489   NFLHCHIDF  HL 

415 HPFHLHGHAFAVV

125 TFWYHSH

82      SIHWHG

Trametes versicolor (AAL00887)

466   NFFHCHIEF   HL 

414 HPFHLHGHAFSVV

123 TFWYHSH

80      SIHWHG

Coprinus cinereus  (AAD30964)

480   NFLHCHIDWHL 

427 HPFHLHGHTFDVI

139 TFWYHSH

96      SIHWHG

Pleurotus ostreatus (Q12793)

47     NFLHCHIDF    HL 

425 HPFHLHGHTFSVV

128 TFWYHSH

85      TIHWHG

Trametes villosa (AAB477)

486 YVWHCHILE  HE 

419 HPIHLHLVSFRVI

14 9 ILWYHDH

103 VV HLHG

B. subtilis Cot A (NP_388511)

462   NMFHCHEF   HA 

413 HPMHLHGDFFHVI

143 TYWYHSH

103   ALHLHG

B. halodurance (NP_242948)

516 WMFHCHDL    HLA

461 HPMHLHGHFFQ

157 TYWYHSH

107    SIHWHG

QZA2

487 YVWHCHILE  HED

417 HPIHLHLVQFM

146 ALWYHDH

100   VVHLHG

B. licheniformis (YP_077905)

485 VYWHCHILE  HE

418 HPIHLHLVSFR

148   ILWYHDH

102   VVHLHG

HR03 (FJ663050)

 

جدول2- مقایسه همسانی ژن لاکاز در برخی از سویه­های قارچی و برخی از باسیلوسها که با ClustalW2 بررسی شده است. QZA2، Bs B. subtilis، Bh B. halodurans، Bl B. licheniformis، Bf: Botryotinia fuckeliana، Pr: Phlebia radiata، Tv: T. versicolor، Cc: C. cinereus، Tvi: T. villosa، Pleurotus ostreatus Po:

Identity (%) with multicopper oxidase from: 

Enzyme 

Po

Tvi

Cc

Tv

Pr

Bf

Bl

Bh

Bs

HR03

21 

20

20

20

20

20

13

41

16

16

QZA2

13

13

11

12

13

13

65

19

98

 

HR03

12 

13

11

12

12

12

65

19

 

 

B. subtilis CotA 

16 

16

14

17

17

20

18

 

 

 

B. halodurans 

10 

11

12

12

13

13

 

 

 

 

B. licheniformis 

31 

32

30

28

29

 

 

 

 

 

Botryotinia fuckeliana laccase (Lcc2)

64 

69

55

68

 

 

 

 

 

 

Phlebia radiate laccase

63 

69

57

 

 

 

 

 

 

 

T. versicolor laccase (Lcc1)

53 

54

 

 

 

 

 

 

 

 

C. cinereus laccase (Lcc1)

59 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

T. villosa laccase (Lcc5)

 

 

مقایسه توالی آمینو اسیدی مولتی کوپر اکسیداز سویه QZA2 با توالی آمینواسیدی برخی لاکازهای قارچی و لاکازهای باکتریایی که تاکنون شناسایی شده است، با ClustalW2 و BLAST پروتئینی در پایگاه اطلاعات بانک ژنی نشان داد که توالی آمینو اسیدی مولتی کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2 دارای بیشترین شباهت به لاکاز قارچی، بوتریوتینیا فوکلیانا با شماره دسترسی AAK77953 و با 28 درصد همسانی و 41 درصد شباهت است . گرچه شباهت کلی سویه QZA2 به لاکازهای قارچی خیلی بالا نیست اما نسبت به سایر لاکازهای باکتریایی که تاکنون بررسی شده­اند، بالاتر است (جدول 2(. اگرچه بیان آنزیم با افزودن مس به محیط کشت، کاهش دما و ایجاد شرایط میکروآئروبیک، نسبت به شرایط هوازی افزایش می­یافت، اما با این حال تنها بخش کمی از آنزیم بیان شده به صورت فعال بود.  بهینه سازی شرایط بیان برای تولید آنزیمی با فعالیت بیشتر، بررسی فعالیت و پایداری آنزیم در شرایط مختلف دما و pH، تعیین ویژگیهای آنزیمی، تعیین مکانیسم عمل آنزیم و تعیین ساختار آنزیمی برای ادامه کار پیشنهاد می­شود.

  1. Atlas, R. M., Bartha, R., 1998. Microbial Ecology: Fundamentals and Applications. 4th Edition. Addison-Wesley.
  2. Badoei Dalfard, A., Khajeh, Kh., Soudi, M., Naderi-manesh, H., Banjbar, B., 2006. Isolation and biochemical characterization of laccase and tyrosinase activities in a novel melanogenic soil bacterium. Enzyme and Microbial Technology. 39(7):1409–1416.
  3. Bauer, A.W., Kirby, W.M.M., Sherris, J.C., and Turck, M., 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology. 45(44):493-496.
  4. Claus, H., 2003. laccases and their occurrence in prokaryotes. Archive of Microbiology. 179(3): 145-150.
  5. Claus, H., Filip, Z., 1997. The evidence of a laccase-like activity in a Bacillus sphaericus strain. Micribiological Research. 152(2):209-215.
  6. Durao, P., Chen, Z., Fernandes, AT., Hildebrandt, P., Murgida, DH., Todorovic, S., Pereira, MM., Melo, EP., Martins, LO., 2008. Copper incorporation into recombinant CotA laccase from Bacillus subtilis: characterization of fully copper loaded enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 13(2):183–193.
  7. Felsenstein, J., 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach
    using the bootstrap. Evolution. 39(4): 783-791.
  8. Feng, X.u., Damhus, T, Danielsen, S, Ostergaard, L.H., 2007. Modern biooxidation: Enzyme, Reaction and Application. Edited by Rolf D. Schmid, Valada B. urlacher. Weinheim , Wiley.
  9. Forbes, B. A., Sahm, D. F., Weissfeld,  A. S., 2002. Bailey & Scotts  Diagnostic Microbiology. 11th ed. St. Louis: Missouri Mosby.
  10. Gerhardt, P., Murray R. G. E., 1994. Methods for general and molecular bacteriology. 3rd Edition. Washington. D. C: American Society for Microbiology.
  11. Givaudan,  A., Effosse. A., Faure. D., Potier, P., Bouillant, M.L. & Bally, R., 1993. Polyphenol oxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere : evidence for laccase activity in nonmotile strains of Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiology Letters. 108(2):205-210.
  12. Komori, H., Higuchi,Y., 2010. Structure and molecular evolution of multicopper blue proteins. BioMolecular Concepts. 1(1): 31–40.
  13. Koschorreck, K., Richter, S. M., Ene, A.B., Roduner, E., Schmid, R.D. Urlacher, V.B., 2008. Cloning and characterization of a new laccase from Bacillus licheniformis catalyzing dimerization of phenolic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 79(2):217-224.
  14. Kumar, S., Stecher, G., Peterson, D., and Tamura, K., 2012. MEGA-CC: Computing Core of Molecular Evolutionary Genetics Analysis Program for Automated and Iterative Data Analysis. Bioinformatics. 28(20):2685-2686.
  15. Mayer, A.M., Staples, R.C., 2002. Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry. 60(6):551–565.
  16. Mohammadian, M.,  Fathi-Roudsari, M., Mollania, N., Badoei-Dalfard, A., Khajeh, K., 2010. Enhanced expression of a recombinant bacterial laccase at low temperature and microaerobic conditions: purification and biochemical characterization. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37(8):863–869.
  17. Ruijssenaars, H., J., Hartmans, S., 2004. A cloned Bacillus halodurans multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity. Applied Microbiology and Biotechnology. 65(2): 177–182.
  18. Saitou, N., Nei, M., 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology Evolution. 4(4): 406-425.
  19. Sharma, P., Goel, R., Capalash, N., 2007. Bacterial laccases. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 23(6):823–832
  20. Solano, F., Garcia, E., Perez de Egea, E., & Sanchez-Amat, A., 1997. Isolation and characterization of strain MMB-1 a novel melanogenic marine bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 63(9): 3499–3506.
  21. Solomon, E.I., Augustine, A.J., & Yoon, J., 2008. O2 reduction to HO by the multicopper oxidases. Dalton Transaction. 30: 3921-3932.
  22. solomon, E.I., Sundaram, U.M., Machonkin, T.E., 1996. Multicopper Oxidases and Oxygenases. Chemical Reviews. 96(7): 2563-2606.
  23. Spencer, J., 2004. Environmental microbiology: methods and protocols. US; Humana Press Inc.
  24. Wilson, K., 1987. Preparation of genomic DNA from bacteria. Current Protocols in Molecular Biology, B.R. Ausubel FM, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, editor., New York; John Wiley & Sons.
  25. Yang, S. Sh., Liu, Z. W., Yi, X.P. & Zhang, A. L., 2012. Isolation of laccase gene from Bacillus subtilis and analysis of its physicochemical properties. Gene. 491(1), 49–52.