همسانه سازی، شناسایی و جداسازی یک ژن گلوکز اکسیداز (GOX) از قارچ Penicillium funiculosum 

زهرا اسماعیل پور، قاسمعلی گروسی^*، رحیم حداد و رضا حیدری جاپلقی

قزوین، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، دانشکده فنی – مهندسی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخ دریافت: 9/6/91                 تاریخ پذیرش: 23/1/93

چکیده

گلوکز اکسیداز (β-D-گلوکز:اکسیژن 1-اکسیدوردوکتاز) با استفاده از اکسیژن مولکولی به عنوان پذیرنده الکترون، اکسیداسیون β-D-گلوکز را به گلوکونیک اسید کاتالیز نموده و منجر به تولید پراکسید هیدروژن می­شود. این آنزیم در دامنه وسیعی از قارچهای مختلف، عمدتاً جنسهای Aspergillus و Penicillium تولید شده و کاربردهای وسیعی در صنایع مختلف از قبیل شیمی، داروسازی، صنایع غذایی، بیوتکنولوژی و غیره دارد. در این مطالعه، ژن کدکننده گلوکز اکسیداز از قارچ Penicillium funiculosum با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (PCR) جداسازی و در ناقل pUC19 همسانه­سازی شده و ساختار مولکولی، ویژگیهای بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت. توالی نوکلئوتیدی این ژن، تحت عنوان PfGOX، به طول  bp1818 بوده و یک پروتئین با 605 آمینواسید را رمز می کند. وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه ایزوالکتریک پیش­بینی شده این پروتئین به ترتیب برابر 78/65 کیلو دالتون و 05/5 می­باشد. بررسی ساختارهای دوم و سوم توالی پروتئینی PfGOX نشان داد که این پروتئین از نظر ساختاری مشابه با توالیهای گلوکز اکسیداز گزارش شده از قارچهای دیگر می­باشد. توالی پروتئینی به دست آمده شباهت زیادی را با توالیهای گلوکز اکسیداز سایر قارچها از قبیل Penicillium amagasakiense، Talaromyces flavus، Talaromyces stipitatus و Talaromyces variabilis نشان داد. بررسی فیلوژنتیکی نیز مشخص کرد که این ژن به زیرگروه IA گلوکز اکسیدازهای قارچی تعلق دارد. 

واژه های کلیدی: همسانه­سازی، گلوکز اکسیداز، قارچ، Penicillium funiculosum، ساختار سه­بعدی.

* نویسنده مسئول، تلفن: :8371159-0281، پست الکترونیکی: ga.garoosi@ikiu.ac.ir

مقدمه

گلوکز اکسیداز (β-D-گلوکز:اکسیژن 1-اکسیدوردوکتاز، EC 1.1.2.3.4) فلاووپروتئینی با وزن مولکولی 175-130 کیلودالتون است که با استفاده از اکسیژن مولکولی به عنوان پذیرنده الکترون، اکسیداسیون β-D-گلوکز را به گلوکونیک اسید کاتالیز نموده و منجر به تولید پراکسید هیدروژن (H₂O₂) می­شود (4). این آنزیم در دامنه وسیعی از قارچهای مختلف، عمدتاً جنسهای Aspergillus و Penicillium تولید شده (7 و 12) و به دلیل کاربردهای وسیع در صنایع مختلف از قبیل شیمی، داروسازی، صنایع غذایی، بیوتکنولوژی و غیره، به تازگی توجه زیادی را به خود جلب نموده است (4 و 31). یکی از کاربردهای مهم آنزیم گلوکز اکسیداز در بخش بیوتکنولوژی کشاورزی، تولید گیاهان مقاوم در برابر عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی است (9، 20 و 32). گیاهان در برابر حمله عوامل بیماریزا، با فعال­سازی تعدادی از پاسخهای دفاعی از قبیل تقویت دیواره سلولی، سنتز فیتوالکسین­ها (Phytoalexin) و فعال­سازی برخی آنزیمهای هیدرولیتیک مانند کیتیناز و گلوکاناز، از خود محافظت می­کنند (1،2، 3 و 21). با این وجود، تولید گونه­های اکسیژن فعال (Reactive Oxygen Species, ROS) به ویژه پراکسید هیدروژن، جزء اولین پاسخهای دفاعی سلولهای گیاهی در برابر حمله عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی است، به طوری که آنها به عنوان یک مولکول هشدار دهنده ثانویه عمل کرده و آنزیمهای درگیر در استحکام دیواره سلولی و ساخت فیتوالکسین­ها را فعال می­سازند (32). بنابراین تولید پراکسید هیدروژن دستورزی شده با استفاده از یک ژن قارچی در گیاهان می­تواند روش مفیدی در جهت افزایش مقاومت گیاهان در برابر عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی باشد (15).

آنزیم گلوکز اکسیداز ابتدا توسط Muler (1928) از قارچ niger Aspergillus جداسازی (22) و اندک زمانی پس از آن مشخص شد که توسط باکتریها و قارچهای متعددی تولید می­شود. همسانه­سازی و تعیین توالی DNA ژن گلوکز اکسیداز قارچ A. niger NRRL-3، اولین بار توسط Kriechbaum و همکاران (1989) انجام شده (17) و ساختار آن توسط Wholfahrt و همکاران (1999) تعیین گردید (29). مقایسه mRNA و DNA ژن گلوکز اکسیداز نشان داد که هیچ اینترونی در توالی نوکلئوتیدی ژن کدکننده گلوکز اکسیداز قارچ A. niger وجود ندارد (17). این موضوع در مورد توالی نوکلئوتیدی ژن گلوکز اکسیداز قارچ Penicillium variable (25)، Talaromyces flavus (23) و P. amagasakiense (18) نیز ثابت شد. اولین بار Fravel و همکاران (1991) و سپس Wu و همکاران (1995) اظهار داشتند که بیان ژن گلوکز اکسیداز در گیاهان می­تواند مقاومت به آلودگی باکتریایی را فراهم کرده و در مهندسی ژنتیک گیاهی کاربرد داشته باشد (9 و 32)، به طوری که با افزایش ناگهانی H₂O₂ تحت یک پروموتور القایی، مرگ سلول و واکنش فوق حساسیت را ایجاد نموده و در نتیجه گیاه در برابر بیماری بادزدگی سیب زمینی مقاوم می­گردد (20).

با توجه به نقش این آنزیم در ایجاد مقاومت به عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی در گیاهان، جداسازی و همسانه­سازی ‍ژن عامل آنزیم گلوکز اکسیداز (GOX) برای اولین بار از قارچ پنی سیلیوم بومی ایران (Penicillium funiculosum PTCC 5301) انجام گردید تا زمینه و مقدمات لازم برای تولید گیاهان تراریخت متحمل فراهم گردد. همچنین، خصوصیات بیوشیمیایی و ساختارهای دوبعدی و سه­بعدی توالی پروتئینی به دست آمده با استفاده از نرم­افزارهای بیوانفورماتیکی پیش­بینی شده و با استفاده از بررسیهای همولوژی و فیلوژنتیکی با ژنهای گلوکز اکسیداز سایر قارچها نشان داده که ژن همسانه شده به زیرگروه IA تعلق دارد.

مواد و روشها

کشت قارچ و استخراج DNA ژنومی: قارچ
P. funiculosum با شماره دسترسی PTCC 5301 از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران خریداری و روی محیط کشت PDA (Potato Dextrose Agar) کشت داده شد. محیط کشت PDA به صورت آماده از شرکت پروتون شیمی، ایران تهیه و نمونه­های قارچی به مدت 7 روز در دمای 22 درجه سانتی گراد کشت داده شدند و هر ماه واکشت گردیدند. سپس DNA ژنومی قارچ با استفاده از روش Cubero و همکاران (1999) استخراج گردید (6).

طراحی آغازگرها و واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR): تکثیر ژن PfGOX با استفاده از آنزیم Pfu (Fermentas) و آغازگرهای اولیگونوکلئوتیدی طراحی شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن گلوکز اکسیداز از قارچهای P. adametzii و P. amagasakiense (موجود در پایگاه NCBI GenBank با شماره­های دستیابی EF137913 و AF012277) با استفاده از نرم­افزار Oligo نسخه 7 انجام شد (26). آغازگرهای اختصاصی شامل سه نوکلئوتید اضافی و جایگاه شناسایی آنزیم برشی SacI در انتهای ′5 بودند که توسط شرکت Metabion آلمان سنتز شدند. مخلوط واکنش در حجم نهایی µl 50 حاوی (8.8 pH) mM Tris-HCl 20، mM (NH₄)₂SO₄ 10، mM KCl 10، mM MgSO₄ 2، Triton X-100 0.1%، mg/ml BSA 0.1، µM 500 از هر dNTP، pM 50 از هر آغازگر (رفت و برگشت)، ng 100 DNA الگو و 1.25 واحد از آنزیم Pfu DNA polymerase مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR با استفاده از یک دستگاه ترموسایکلر (Techne-TC512، انگلستان) قابل برنامه­ریزی در 35 چرخه دمایی انجام شد که شرایط دمایی و زمانی هر چرخه شامل: مرحله واسرشتگی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال در دمای 50 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه و مرحله تکثیر در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت دو دقیقه بود. همچنین مرحله واسرشتگی اولیه در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و مرحله تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انجام گرفت. آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده شامل آغازگر رفت با توالی 5'-ATAGAGCTCATGGTGTCTGTATTTCTC-3' و آغازگر برگشت با توالی 5'-ATAGAGCTCCTAGGCACTTTTGGCATAG-3' بود.

همسانه سازی و توالی­یابی DNA ژنومی PfGOX : پس از خالص­سازی محصول PCR با اندازه مورد نظر از روی ژل با استفاده از کیت استخراج اسید نوکلئیک (GF-1 PCR Clean Up Kit-Vivantis)، ژن مورد نظر و ناقل پلاسمیدی pUC19 (Fermentas) توسط آنزیم برشی SacI (Fermentas) تیمار گردیده و مجدداً خالص­سازی شدند. سپس واکنش اتصال با استفاده از آنزیم DNA لیگاز T4 (Fermentas) انجام گرفته و محلول اتصال به روش شوک حرارتی به سلولهای مستعد اشریشیاکلی (Escherichia coli) سویه DH5α، انتقال داده شد (27). با انجام آزمون سفید- آبی، تعدادی کلونی به عنوان کلونیهای نوترکیب انتخاب شده و پلاسمیدهای نوترکیب با روش تحلیل قلیایی با SDS استخراج گردیده و با استفاده از دو تکنیک PCR و برش آنزیمی مورد بررسی دقیق­تر قرار گرفتند (27). توالی­یابی DNA پلاسمید نوترکیب با استفاده از آغازگرهای راه­انداز باکتریوفاژ T7 در دو جهت رفت و برگشت  توسط شرکت Seqlab آلمان، انجام شد.

بررسی توالی و پیش­بینی ساختارهای دوم و سوم پروتئین به دست آمده از PfGOX : توالی نوکلئوتیدی حاصل از توالی­یابی با استفاده از برنامه Translate (http://www.expasy.ch/tools/dna.html) مورد ترجمه قرار گرفته و خصوصیات بیوشیمیایی توالی آمینواسیدی به دست آمده، شامل شاخصهای آلیفاتیک، آب­گریزی و ناپایداری با استفاده از برنامه­های ProtParam (11)، ProtScale (http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/hydropathy/index.html) و TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk /services/) مورد بررسی قرار گرفت. همچنین پیش­بینی موقعیت زیرسلولی ژن PfGOX با استفاده از برنامه YLOC (5) انجام گرفت. ساختار دوم توالی پروتئینی PfGOX با استفاده از برنامه SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/) تعیین گردیده و ساختار سوم توسط برنامه I-TASSER (33) مورد پیش­بینی قرار گرفت.

بررسی فیلوژنتیکی: توالی آمینواسیدی به دست آمده به منظور یافتن پروتئینهای مشابه در بانکهای اطلاعاتی با استفاده از الگوریتم BLASTp در مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI) مورد جستجو قرار گرفته و تعدادی توالی پروتئینی از منابع مختلف که بیشترین شباهت را با توالی مورد نظر داشتند، انتخاب شدند. همردیف­سازی چندگانه توالی پروتئینی PfGOX و توالیهای به دست آمده به منظور شناسایی نواحی حفظ شده در طی تکامل با استفاده از نرم­افزار ClustalX انجام شد. یک درخت فیلوژنتیکی به روش Neighbor Joining و با استفاده از نرم­افزار MEGA4.1 Beta 2 (28) ساخته شده و بررسی Bootstrap با 1000 تکرار به منظور بدست آمدن حدود اطمینان برای شاخه­ها نیز انجام گردید (8). شماره دستیابی توالیهای پروتئینی موجود در پایگاه اطلاعات توالی NCBI مورد استفاده جهت بررسیهای همردیف­سازی چندگانه و روابط فیلوژنتیکی، در جدول 1 آمده است.

جدول 1- مشخصات توالیهای پروتئینی مورد استفاده برای تهیه همردیف­سازی چندگانه و ترسیم درخت فیلوژنتیکی به همراه شماره دستیابی موجود در پایگاه اطلاعات توالی NCBI GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).

الف) 

ب)

شکل 1- ساختار و الکتروفورز نتیجه برش آنزیمی ناقل نوترکیب pUC19-PfGOX. الف) ساختار ناقل نوترکیب pUC19-PfGOX حاوی ژن PfGOX در جهت معمولی روی جایگاه چندگانه برای همسانه­سازی (MCS). توالی مسئول رونوشت­برداری ناقل نوترکیب (pMB1)، ژنهای lacZ و مقاومت به آمپی­سیلین (Amp^R) روی ناقل نوترکیب نشان داده شده­اند. ب) برش آنزیمی ناقل نوترکیب pUC19-PfGOX با آنزیم برشی SacI و الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد. M) نشانگر وزن مولکولی Kb1، 1) پلاسمید حلقوی pUC19 فاقد ژن PfGOX و هضم نشده، 2) پلاسمید pUC19 فاقد ژن PfGOX و هضم شده با آنزیم برشی SacI، 3) پلاسمید نوترکیب pUC19-PfGOX هضم نشده، 4) پلاسمید نوترکیب pUC19-PfGOX هضم شده با آنزیم برشی SacI.

نتایج و بحث

همسانه­سازی و بررسی توالی نوکلئوتیدی ژن PfGOX و خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین به دست آمده: ژن کدکننده  PfGOX با استفاده از تکنیک PCR از قارچ پنی سیلیوم بومی ایران (P. funiculosum )، جداسازی و در ناقل پلاسمیدی pUC19 همسانه­سازی شده و نتایج توالی­یابی و بررسی با برنامه BLAST نشان داد که قطعه همسانه­سازی شده در جهت معمولی، یک ژن گلوکز اکسیداز می باشد (شکل 1). توالی DNA ژنومی PfGOX، ثبت شده در پایگاه توالی نوکلئوتیدی GenBank NCBI با شماره دستیابی HQ529689، به طول bp 1818 بوده که با کدون ATG آغاز شده و با کدون TAG خاتمه یافته و یک پروتئین با 605 آمینواسید را کد می­نماید (شکل 2). بررسی خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین به دست آمده با استفاده از برنامه ProtParam نشان داد که وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه آیزوالکتریک پیش­بینی شده توالی پروتئینی ژن PfGOX با فرمول مولکولی C₂₉₄₂H₄₅₅₆N₇₈₂O₈₉₃S₁₉، به ترتیب برابر 78/65 کیلودالتون و 05/5 می­باشد. همچنین برنامه ProtParam نشان داد که شاخص آلیفاتیک پروتئین PfGOX، به عنوان یک عامل مهم به منظور برآورد مقاومت پروتئینها در برابر حرارت، 28/86 بوده که نشان دهنده مقاوم بودن پروتئینهای گلوکز اکسیداز در برابر حرارت می­باشد (31). شاخص ناپایداری پروتئینها بیان گر میزان پایداری آنها در لوله آزمایش می باشد، و پروتئینهایی با شاخص کمتر از 40 جزء پروتئینهای پایدار تقسیم بندی می شوند. شاخص ناپایداری پروتئین مورد نظر در حدود 38/26 محاسبه گردید به علاوه شاخص ناپایداری آن در لوله آزمایش در حدود 38/26 بوده و لذا در رسته پروتئینهای پایدار تقسیم­بندی می­شود (4).

شکل 2- توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژن PfGOX. توالی پپتید راهنما به صورت زیرخط، آمینواسیدهای Cys و آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون به ترتیب با علامت مربع و دایره و آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به صورت ضخیم نشان داده شده­اند. همچنین شماره­های بازها و آمینواسیدها به ترتیب در سمت چپ و راست آورده شده است.

شاخص آب­گریزی (Hydropathy) محاسبه شده با استفاده از برنامه ProtScale به روش Kyte & Doolittle (1982) نشان داد که توالی پروتئینی ژن PfGOX به میزان زیادی آب گریز بوده (19) و از مجموع کل آمینواسیدها، 59 آمینواسید با بار منفی (Asp+Glu) داشته، در حالی که تعداد کل آمینواسیدهای با بار مثبت آن (Arg+Lys) برابر 44 می باشد.

بررسی توالی آمینواسیدی و موتیفهای ساختاری توالی پروتئینی ژن PfGOX : بررسی توالی آمینواسیدی نشان داد که ژن PfGOX با bp 1818 طول، یک پروتئین اولیه با 605 آمینواسید را کد می­کند که مانند آنزیمهای کیتیناز و گلوکاناز، می­تواند در جهت تولید گیاهان مقاوم در برابر عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی مورد استفاده قرار بگیرد (1، 2 و 3). ژن PfGOX همانند سایر ژنهای گلوکز اکسیداز از A. niger (10)، P. amagasakiense (16) و
P. variabile (25) دارای یک توالی پپتید راهنما به طول 18 آمینواسید با ترادف MVSVFLSTLLLSAATVQA در انتهای آمینی خود می­باشد که پس از جداسازی، یک پروتئین بالغ و فعال به طول 587 آمینواسید را تولید می کند. توالی گلوکز اکسیداز از A. niger با داشتن یک پپتید راهنما به طول 22 آمینواسید، دارای یک آمینواسید بازی (Arg) در موقعیت 1- می­باشد که موجب برش پیوند پپتیدی بین آمینواسیدهای Arg و Ser و نهایتاً جداسازی توالی پپتید راهنما می­شود (17). در حالی که آمینواسید موقعیت 1- در توالی پپتیدی ژن PfGOX یک آمینواسید آب گریز (Ala) بوده و نشان دهنده سازوکار متفاوت در جداسازی توالی پپتید راهنما می باشد.

پروتئین بالغ PfGOX مشابه با توالی پروتئینی ژنهای گلوکز اکسیداز از A. niger (10)، P. amagasakiense (16) و
P. variabile (25) دارای سه آمینواسید Cys در موقعیتهای حفظ شده Cys₁₆₈، Cys₂₁₀ و Cys₅₂₅ و یک جایگاه فعال با 7 آمینواسید Tyr₇₃، Phe₄₁₈، Trp₄₃₀، Arg₅₁₆، Asn₅₁₈، His₅₂₀ و His₅₆₃ می­باشد. Arg₅₁₆ مهم­ترین آمینواسید جهت اتصال مؤثر آنزیم گلوکز اکسیداز به β-D-گلوکز می­باشد، در حالی که Asn₅₁₈ به میزان کمتری در این واکنش شرکت می­کند (30). آمینواسیدهای آروماتیک Tyr₇₃، Phe₄₁₈ و Trp₄₃₀ به منظور جهت­گیری صحیح سوبسترای و نیز جهت اکسیداسیون سریع گلوکز حائز اهمیت می­باشند (4). همچنین آمینواسیدهای His₅₂₀ و His₅₆₃ در طی واکنش با OH₁ گلوکز پیوندهای هیدروژنی تشکیل می­دهند (4). همچنین، مقایسه توالی آمینواسیدی ژن PfGOX با ژنهای گلوکز اکسیداز از A. niger (10)،
P. amagasakiense (16) و P. variabile (25)، 4 جایگاه N-گلیکوزیلاسیون را در موقعیتهای حفظ شده Asn₉₃، Asn₁₆₅، Asn₁₇₂ و Asn₃₉₂ نشان داد. در حالی که در توالی آمینواسیدی ژنهای گلوکز اکسیداز از A. niger (13)،
P. amagasakiense (16) به ترتیب 6 و 5 جایگاه N-گلیکوزیلاسیون شناسایی شده است.

پیش­بینی موقعیت زیرسلولی این پروتئین با استفاده از برنامه YLOC نشان داد که این آنزیم همانند سایر آنزیمهای گلوکز اکسیداز در مسیرهای متابولیکی فعال بوده و محل فعالیت آن خارج از اندامکهای سلولی از قبیل میتوکندری و پراکسیزوم می­باشد. همچنین بررسیها با برنامه TMHMM نشان داد که PfGOX با داشتن یک دومین غشایی در انتهای آمینوی خود، به عنوان یک پروتئین خارج سلولی شناخته شده و قادر به خروج از سلول می­باشد. این پیش­بینیها با نتایج Petruccioli و همکاران (1997) مشابه می­باشد (24). به طوری که آنها نشان دادند که آنزیم گلوکز اکسیداز به طور طبیعی از درون سلولهای قارچی P. variabile به درون محیط کشت ترشح می­کند. به هر حال این فعالیت منحصر به فرد نیاز به بررسی­های دقیق­تری دارد.

بررسی ساختار دوم و سوم توالی پروتئینی ژن PfGOX : بررسی ساختار دوم توالی پروتئینی ژن PfGOX با استفاده از برنامه SOPMA نشان داد که این پروتئین حاوی 208 آمینواسید درگیر در مارپیچ α (38/34 درصد)، 114 آمینواسید تشکیل دهنده صفحه β (84/18 درصد)، 48 آمینواسید موجود در پیچ β (93/7 درصد) و 235 آمینواسید درگیر در مارپیچ تصادفی (86/39 درصد) می­باشد (شکل 3). این نتایج با ساختار دوم توالی پلی­پپتیدی ژن­های گلوکز اکسیداز از قبیل PaGOX (P. amagasakiense) که حاوی 206 مارپیچ α (05/34 درصد)، 99 صفحه β (36/16 درصد) متصل شده توسط 37 پیچ β (12/6 درصد) و 263 مارپیچ تصادفی (47/43 درصد)، AnGOX (A. niger) با 185 مارپیچ α (58/30 درصد)، 110 صفحه β (18/18 درصد) متصل شده توسط 59 پیچ β (75/9 درصد) و 251 مارپیچ تصادفی (49/41 درصد) و PvGOX (P. variabile) شامل 182 مارپیچ α (08/30 درصد)، 102 صفحه β (86/16 درصد) متصل شده توسط 39 پیچ β (45/6 درصد) و 282 مارپیچ تصادفی (61/46 درصد) تشابه زیادی را نشان داد (10، 16 و 25) (شکل 3).

شکل 3- ساختار دوم توالی پروتئینی PfGOX با استفاده از برنامه SOPMA و مقایسه آن با توالی پلی­پپتیدی ژنهای گلوکز اکسیداز از قبیل PaGOX (P. amagasakiense)، AnGOX (A. niger) و PvGOX (P. variabile). مارپیچهای α، صفحات β، پیچهای β و مارپیچهای تصادفی به ترتیب با خطوط آبی، قرمز، سبز و بنفش نشان داده شده­اند.

پیش­بینی ساختار سه­بعدی توالی پروتئینی ژن PfGOX بوسیله برنامه I-TASSER نشان داد که این آنزیم مشابه با ساختار سه بعدی ژنهای PaGOX (P. amagasakiense) (29) و AnGOX (A. niger) (14) حاوی 15 صفحه β و 22 مارپیچ α می­باشد (شکل 4). نحوه آرایش مارپیچهای α و صفحات β در ساختار سه­بعدی پروتئین PfGOX و به طور کلی آنزیمهای گلوکز اکسیداز به گونه­ای است که مارپیچ­های α در سطح خارجی پروتئین و صفحات β در داخل پروتئین قرار گرفته­اند. آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون در سطح خارجی پروتئین به گونه­ای واقع شده­اند تا بتوانند با کربوهیدراتهای غنی از قند مانوز پیوند برقرار نمایند (4). همچنین، آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال طوری در کنار یکدیگر آرایش یافته­اند تا بتوانند با کوفاکتور فلاوین آدنین دی­نوکلئوتید (FAD) پیوند غیرکووالان برقرار نمایند (29). شکل 4الف طرح روبانی آنزیم PfGOX و توزیع آمینواسیدهای Cys، آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون و آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال را نشان می­دهد. نمایش سطح جامد و طرح گوی و میله به همراه سطح واندروالس در پروتئین PfGOX به ترتیب در شکلهای 4ب و 4ج نشان داده شده­اند. همچنین شکل 4د موقعیت قرارگیری آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال را نشان می­دهد.

شکل 4- مدلهای سه­بعدی توالی پروتئینی ژن PfGOX. الف) مدل سه­بعدی روبان (Ribbon) توالی پروتئینی ژن PfGOX. مارپیچ­های α، صفحات β و نواحی مارپیچ پیچیده به طور مشخص در ساختار سه­بعدی قابل مشاهده می­باشند. آمینواسیدهای Cys و آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون به شکل کروی (Sphere) به ترتیب با رنگهای زرد و ارغوانی قابل مشاهده می­باشند. همچنین آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به شکل گوی- میله (Ball-stick) قرمز رنگ نشان داده شده­اند. ب) مدل سه­بعدی توالی پروتئینی ژن PfGOX با سطح جامد. ج) مدل سه­بعدی گوی- میله (Ball-stick) توالی پروتئینی ژن PfGOX به همراه سطح واندروالسی 10 درصد. آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به شکل گوی- میله (Ball-stick) قرمز رنگ نشان داده شده­اند. د) نحوه آرایش آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال در فضای سه­بعدی به منظور برقراری پیوند غیرکووالان با کوفاکتور FAD.

بررسیهای همولوژی و فیلوژنتیکی: توالی پروتئینی ژن PfGOX با سایر ژنهای گلوکز اکسیداز از قارچهای دیگر مورد مقایسه قرار گرفته و مشاهده شد که بالاترین تشابه را با ژنهای  PaGOXاز P. amagasakiense، TfGOX از
T. flavus، TsGOX از T. stipitatus و TvGOX از
T. variabilis به ترتیب به میزان 99 درصد (با 99 درصد یکسانی)، 99 درصد (با 99 درصد یکسانی)، 98 درصد (با 96 درصد یکسانی) و 94 درصد (با 89 درصد یکسانی) دارد (شکل 5). توالی پپتید راهنما، آمینواسیدهای Cys، آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون و آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به طور مشخص در شکل 5 نشان داده شده­اند.

شکل 5- همردیف­سازی چندگانه ژن PfGOX با توالیهای پروتئینی گلوکز اکسیداز از قارچهای دیگر با استفاده از نرم­افزار ClustalX. توالی پپتید راهنما، آمینواسیدهای Cys، آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون و آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به ترتیب با کادر­های آبی، زرد، ارغوانی رنگ و علامت مثلث نشان داده شده­اند. شماره دستیابی توالیهای پروتئینی مورد استفاده در تهیه همردیف­سازی چندگانه در جدول 1 آمده است.

شکل 6- بررسی فیلوژنتیکی ژن PfGOX با توالیهای پروتئینی گلوکز اکسیداز از قارچهای دیگر. درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرم­افزار MEGA4.1 Beta 2 به روش Neighbor Joining رسم گردید. شماره دستیابی توالیهای پروتئینی مورد استفاده در ساخت درخت فیلوژنتیکی در جدول 1 آمده است.