بررسی خاصیت ضد باکتریایی و پروبیوتیکی یک سویه لاکتوباسیلوس سالیواریوس 02NK ، جدا شده از دهان بر روی Aggregatibacter actinomycetemcomitans ، باکتری شایع در بیماران با التهاب لثه 

ندا ساجدی نژاد^1*، حکیمه شرفی^3*، مژگان پاک نژاد¹، یداالله سلیمانی شایسته¹، بهزاد هوشمند²، سیما مدیری³، حسین شهبانی ظهیری³ و کامبیز اکبری نوقابی^3*

¹ تهران، دانشگاه علوم پزشکی تهران، دانشکده دندانپزشکی

² تهران، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، دانشکده دندانپزشکی

³ تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 8/10/91               تاریخ پذیرش: 25/9/92 

چکیده

بیماریهای لثه به دلیل مجموعه ای از شرایطی ایجاد می گردد که موجب التهاب لثه و دیگر ساختارهای نگهدارنده دندان می شود. هدف این مطالعه بررسی خاصیت ضد باکتریایی لاکتوباسیلوس های بومی با خصوصیات پروبیوتیک بر روی باکتری بیماری زای شاخص در بیماریهای التهاب لثه، Aggregatibacter actinomycetemcomitans می باشد. از میان 40 سویه لاکتوباسیلوس جداسازی شده از نمونه های گرفته شده ازدهان افراد سالم و بیمار، سویه منتخب با بالاترین خاصیت ضد باکتریایی انتخاب، با استفاده از تستهای بیوشیمیایی و مولکولی (rRNA S16) تعیین هویت و تحت عنوان لاکتو باسیلوس سالیواریوس NK02 نامگذاری گردید. در ادامه خصوصیات پروبیوتیکی باکتری منتخب مورد مطالعه دقیق قرار گرفت. بررسی خصوصیات پروبیوتیکی باکتری مذکور نشان داد که لاکتو باسیلوس جداشده به میزان 92.34 درصد به لیزوریم مقاوم بوده و توانایی رشد در حضور نمکهای صفراوی به میزان 79.23 درصد را دارا می باشد. درصد زنده ماندن جدایه منتخب در شرایط شبیه سازی شده شیره معده قابل توجه بود. پس از 90 دقیقه میزان بقای جدایه مورد نظر7 logs CFU ml^-1,  تعیین گردید. لاکتوباسیلوس جداشده به اکثر آنتی بیوتیکها حساس بوده و خاصیت ضد باکتریایی قابل توجه ای علیه تعدادی از باکتریهای بیماری زای مورد استفاده در این مطالعه نشان داد. حداقل غلظت مهاری (MIC) و حداقل غلظت باکتریسیدال ((MBC سویه NK02 برعلیه Aggregatibacter actinomycetemcomitans معادل AUml^-1512: MIC،MBC: 1250 AUml^-1 تعیین گردید که در مقایسه با سایر لاکتوباسیلوس های جداسازی شده قابل توجه بود. سویه NK02 به عنوان کاندید مناسبی برای درمان بیماریهای لثه و پس از آزمایشات تأییدی بیشتر در آینده می تواند مورد استفاده قرار گیرد.

واژه های کلیدی: لاکتوباسیلوس پروبیوتیک، Aggregatibacter actinomycetemcomitans ، بیماریهای لثه، حداقل غلظت مهاری رشد

* نویسنده مسئول، تلفن:  02144787352 ، پست الکترونیکی: Akbari@nigeb.ac.ir

* نویسنده اول و دوم در تحقیق حاضر مشارکت یکسان داشته اند.

مقدمه

بیماریهای پریودونتال بیماریهای شایع در جوامع با اتیولوژی چند عاملی هستند. یکی از فاکتورهای مهم در ایجاد این بیماریها عدم توازن در فلور میکروبی و بر هم خوردن بالانس میکروبی دهان است. با توجه به اینکه در انواع مختلف بیماریهای التهاب لثه از بین بردن سوشهای پاتوژن اهمیت زیادی دارد روشهای درمانی کنونی شامل آنتی بیوتیک تراپی و جراحیهای معمول می باشد. آنتی بیوتیک تراپی علی رغم مزایای مختلف سبب ایجاد سوشهای مقاوم شده و در صورت انتخاب آنتی بیوتیک نامناسب عود بیماری دور ازانتظار نخواهد بود. روشهای جراحی نیز علی رغم مزایای مشخص هزینه بر بوده و موفقیت آنها بستگی به کنترل باکتریهای پاتوژن و عوامل محیطی دارد. باتوجه به معایب درمانهای رایج و از سوی دیگر کاربرد روزافزون پروبیوتیکها در درمان بیماریهای مختلف پیش از پیش احساس می شود.

پروبیوتیکها باکتریهای زنده ای هستند که با بهبود بالانس میکروبی داخل بدن بر روی میزبان تأثیر دارند. بر اساس اعلام سازمان غذای آمریکا، پروبیوتیکها میکروارگانیسم های زنده ای هستند که وقتی در میزان کافی استفاده شوند فواید بهبود سلامتی برای میزبان دارند (14).

Koll-Kiais و همکاران در سال 2005 در سوئد در مطالعه ای به بررسی مقایسه ای لاکتوباسیل های دهان در افراد سالم و بیماران پریودنتیت مزمن پرداختند. در این مطالعه میزان 238 لاکتوباسیل از بزاق و نواحی زیر لثه 20 بیمار پریودنتیت مزمن و 15 فرد سالم جدا شد. از بین  238 لاکتوباسیل جداشده آنها به بررسی فعالیت ضد میکروبی 115 جدایه بر علیه Porphyromonas gingivalis و Streptococcus mutans پرداختند. از بین 115 جدایه، 10 گونه لاکتو باسیل شناسایی شدند. گونه شایع در افراد سالم Lactobacillus gasseri و Lactobacillus fermentum و در افراد با پریودنتیت مزمنLactobacillus plantarum بود. همچنین گونه L. gasseri در افراد با پریودنتیت مزمن بسیار کم بود. لاکتوباسیل های مورد آزمایش مانع رشد 69 درصد P. intermediate شدند. بیشترین میزان فعالیت ضد میکروبی بهpararcasei, L. plantarum  L. salivarius, L. rhamuoesus .L مربوط بود. گونه های جدا شده از افراد سالم کمترین فعالیت ضد میکروبی را دارا بودند (4).

Manjunath و همکاران در مطالعه ای در سال 2011 به بررسی اثرات مفید پروبیوتیکها در سلامت پریودونتال پرداختند. در این مطالعه پیشنهاد شده که پروبیوتیکها برای پیشگیری از بیماریهای پریودونتال 3 مکانیسم دارند: اثر مستقیم ، اثر رقابتی و تغییر سیستم ایمنی میزبان، پروبیوتیکها باعث کاهش pH، جلوگیری از تولید آنتی اکسیدان ها وجلوگیری از شکل گیری پلاک با خنثی کردن الکترونهای آزاد در شکل گیری مواد معدنی می گردند. پروبیوتیکها به صورت سنتی برای پیشگیری از سرطان کولون، پایین آوردن کلسترول، پایین آوردن فشار خون، بهبود عملکرد سیستم ایمنی، کاهش التهاب و....نیز استفاده می شوند (6).

 Teughelو همکاران در سال 2011 در مطالعه ای به بررسی نقش پروبیوتیکها در فلور میکروبی دهان پرداختند. نتایج مشاهدات و مطالعات موجود نشان دهنده اثر مشخص پروبیوتیکها بر روی فلورمیکروبی دهان و اثر آن بر روی پارامترهای کلینیکی پریودونتال می باشد. به هر حال نیاز به تحقیقات جدیدی که در آن استفاده از پروبیوتیکها به عنوان درمان مکمل در کنار درمانهای اصلی استاندارد پریودونتال، برای بررسی اثر آنها احساس می شود (11). در تحقیق حاضر از میان سویه های متعدد لاکتوباسیلوس جداسازی شده از نمونه های گرفته شده از دهان افراد سالم و بیماران با التهاب و عفونت لثه، یک سویه از لاکتو باسیلوس سالیواریوس با پتانسیل بالای ضد باکتریایی بر علیه یکی از شایعترین عوامل ایجاد کننده التهابات لثه یعنی باکتری Aggregatibacter actinomycetemcomitans انتخاب و پس از شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی ، ویژگیهای پروبیوتیکی آن به دقت مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد و روشها

جداسازی لاکتوباسیلوس ها و شناسایی اولیه: نمونه های جمع آوری از دهان پس از انتقال به آزمایشگاه رقت سازی و در محیط اختصاصی MRS کشت داده شد و در 30 درجه سانتی گراد به مدت 48-72 ساعت تحت شرایط هوازی قرار داده شد. سپس کلنیهای شیری رنگ گرم مثبت و کاتالاز منفی، به عنوان لاکتوباسیلوس انتخاب و به صورت کلنی تک، کشت و نگهداری شدند.

انتخاب سویه منتخب: سویه منتخب جداشده از دهان فرد سالم براساس خاصیت ضد باکتریایی علیه باکتری
A. actinomycetemcomitan انتخاب گردید. در این تست پس از رشد لاکتو باسیلوس ها در شرایط هوازی از روش deferred antagonism استفاده شد (8). محیطی که به عنوان محیط لایه زیرین انتخاب شد   MRS آگار 4/1 درصد فاقد سدیم استات و تری آمونیوم سولفات با pH:7.1 بود .محیط استفاده شده در لایه بالایی هم شامل Brain Heart Infusion(BHI) حاوی 7/0 درصد آگار بود که با 5/0 درصد عصاره مخمر و 0005/0 همین برای رشد اختصاصی باکتری sactinomycetemcomitan  A. به محیط اضافه گردید. برای انجام تست ابتدا لاکتوباسیلوس ها بر روی محیط زیرین تلقیح شده و به مدت 24 ساعت در 37 درجه قرار داده شده تا رشد کنند. باکتری بیماری زای دهانی مذکور در محیط غنی شده اشاره شده در بالا با کدورت 2/0 – 1/0 تلقیح و سپس بر روی محیط MRS که باکتری لاکتوباسیلوس بر روی آن رشد داده شده بود ریخته شد. پلیتها در 37 درجه برای مدت 24 ساعت قرار داده شدند. خاصیت ضد باکتریایی لاکتوباسیلوس ها علیه A. actinomycetemcomitnas براساس ایجاد هاله عدم رشد بررسی شد (1).

تعیین هویت مولکولی: برای شناسایی مولکولی سویه برگزیده، از روش توالی یابی ژن S rRNA16 استفاده گردید. بدین ترتیب که نخست (DNA) دی.ان.آ باکتریایی از دو میلی لیتر کشت تازه باکتری (فاز نیمه لگاریتمی رشد) با استفاده از کیت اختصاصی شرکت روشه استخراج و سپس ناحیه ژنی مربوطه به طول تقریبی 1500 جفت­باز با استفاده از دو سری پرایمر یونیورسال 27F و 1492R تکثیر گردید.

بررسی خصوصیات پروبیوتیکی جدایه منتخب): بررسی حضور ژن bsh با واکنش زنجیره ای پلیمراز: واکنش زنجیره ای پلیمراز جهت بررسی وجود ژن bsh که کد کننده فعالیت هیدرولیز نمکهای صفراوی می باشد در لاکتوباسیلوس های جداسازی شده انجام شد (جدول 2). پرایمرهای مورد نظر بر اساس توالی ژن bsh موجود در بانک ژنی تهیه شد. توالی پرایمر های استفاده شده در جدول 1 نشان داده شده است :

جدول 1- توالی پرایمر های استفاده شده

برای بررسی نتایج، 4 میکرولیتر از محصول PCR به همراه 2 میکرولیتر بافر سنگین کننده مخلوط شده و در چاهکهای ژل آگاروز لود شد و الکتروفورز انجام گرفت (1).

جدول 2- برنامه واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) استفاده شده در این مرحله

سنجش تحمل pH اسیدی: برای بررسی این تست لاکتوباسیلوس جداشده درMRS broth اسیدی شده از pH 9-2 در دمای 37 درجه به مدت 120 دقیقه قرار داده می شوند سپس درصد زنده ماندن آنها با کنترل مقایسه گردید (5).

سنجش تحمل نمک صفراوی: توانایی رشد باکتری جداشده در 5-3-1 درصد نمکهای صفراوی با تلقیح باکتری در محیطMRS  حاوی مقادیر مختلف نمکهای مذکور بعد از 24 ساعت در 37 درجه بررسی گردید (12).

فعالیت ضد باکتریایی: بررسی خاصیت ضدباکتریایی برعلیه پاتوژن اصلی در بیماران با التهاب و عفونت لثه (پریودنتیت) یعنیAggregatibacter actinomycetemcomitans و همچنین باکتریهای بیماری زای دیگر اشاره شده در جدول 3 با روش  Well diffusionassay سنجش گردید. همچنین MIC(Minimum Inhibitory Concentration) و Minimum Bactericidal Concentration))MBC آنها نیز تعیین گردید. میزان تولید ماده ضد باکتریایی تولید شده توسط لاکتوباسیلوس جدا شده به صورتarbitrary units (AU) محاسبه گردید. یک(AU) arbitrary units به صورت عکس بالاترین رقتی از ترکیب ضد باکتریایی، نشان دهنده هاله شفاف عدم رشد سویه شاخص یا اندیکاتور، تعیین و محاسبه می گردد (2).

سنجش فعالیت هیدرولیزی نمکهای صفراوی: برای انجام این تست، کشت 24 ساعته باکتری منتخب بر روی محیط MRS آگار حاویsodium salt of glycodeoxycholic acid  (MRS-GDCA) به میزان 5 درصد تلقیح و پلیتها به صورت بی هوازی در 37 درجه به مدت 72 ساعت نگهداری، سپس ایجاد هاله یا پلاکهای سفید موجود در اطراف کلنی باکتری مورد بررسی قرار گرفت(3).

تحمل شیره معده: برای انجام این تست کشت شبانه لاکتوباسیلوس منتخب را پس از سانتریفیوژ و جداسازی توده باکتری از سوپ رویی دو بار با بافر فسفات
(0.1 M, pH 7.0) شستشو داده و سپس در محلول الکترولیتی استریل SES)) حل و بلافاصله به محلول هم حجم شیره معده[0.6% (w/v) pepsin, 1% (w/v) NaCl] افزوده شد. سوسپانسون میکروبی حاصل بلافاصله در 37 درجه قرار داده شد و به آرامی اسیدی شده و در بازه زمانی 90 دقیقه pH آن از 5 به 2/2 رسانده شد (10). شمارش سلولهای زنده مانده پس از 90-80-70-60-30-0 دقیقه بر روی محیط MRS آگار بررسی شد.

سنجش مقاومت به لیزوزیم: برای انجام این تست کشت شبانه لاکتوباسیلوس منتخب را پس از سانتریفیوژ و جداسازی توده باکتری از سوپ رویی دو بار با بافر فسفات (0.1 M, pH 7.0)  شستشو و در 2 میلی لیتر محلول رینگر(Sigma Aldrich) حل گردید. سپس 10 درصد از سوسپانسیون باکتری حاصل در محلول الکترولیتی شامل مواد زیر تلقیح شد (CaCl₂; 6.2 g l^-1 NaCl, 2.2 g l^-1 KCl, 1.2 g l^-1 and 0.22 g l^-1NaHCO₃).

یکی از محلولهای الکترولیت به عنوان تست و حاویmg l^-1 100 لیزوزیم و دیگری در شرایط کاملاً مشابه و فاقد لیزوزیم به عنوان کنترل در 37 درجه انکوبه و مورد بررسی قرار داده شد. در بازه زمانی 120-30-0 دقیقه از نمونه های مورد آزمایش و کنترل نمونه برداری و بر روی محیط   MRSآگار شمارش کلنیها انجام شد (10).

مقاومت آنتی بیوتیکی: برای بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی سویه های جداشده از روش Standard disc diffusion استفاده گردید (9).

نتایج  

جداسازی و غربالگری سویه منتخب براساس خصوصیت ضد باکتریایی: از بین 40 سویه لاکتوباسیلوس جداشده یک جدایه براساس بیشترین خاصیت ضد باکتریایی برعلیه A. actinomycetemcomitans انتخاب شد. این سویه بیشترینAUml^-1512: MIC و بیشترین  AUml^-11250  MBC: را در مقایسه با سایر لاکتوباسیلوس ها داشت. جدایه منتخب از روش توالی یابی ژنی
S rRNA16 استفاده شد. نتایج حاصل پس از مقایسه با توالیهای موجود در بانک ژن متعلق به مرکز ملی داده های زیست فناوری (NCBI) نشان داد که جدایه به جنس لاکتو باسیلوس تعلق دارد و بیش از 100 درصد با گونه سالیواریوس همسانی دارد. نهایتاً سویه مذکور تحت عنوان L. salivarius NK02 نامگذاری و با شماره دسترسی  JX129916 در NCBI ثبت گردید. در شکلهای 1 و 2 به ترتیب شکل ظاهری و فیلوژنتیک دندروگرام حاصل از آنالیز توالی  rRNAS16و ارتباط سویه NK02 با دیگر لاکتو باسیلوسها نشان داده شده است.

ویژگیهای پروبیوتیکی): تعیین پروفایل ژن bsh : به دلیل اهمیت وجود ژن bsh که کد کننده فعالیت هیدرولیز نمکهای صفراوی و موجب کاهش کلسترول سرم خون می شود و همچنین ارتباط ژن bsh با خواص پروبیوتیکی جدایه های لاکتوباسیلوس این تست با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن مورد نظر و با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز بر روی جدایه منتخب بررسی شد. نتایج به دست آمده نشان داد که جدایه منتخب ناقل ژن مورد نظر می باشد (شکل 3).

شکل1- شکل ظاهری باکتری لاکتوباسیلوس سالیواریوسNK02 توسط اسکنینگ میکروسکوپ الکترونی SEM))

شکل2- فیلوژنتیک دندروگرام حاصل از آنالیز توالی rRNA S16. ارتباط سویه NK02 با دیگر لاکتوباسیلوسها نشان داده شده است.

شکل3-  PCRژن bsh درلاکتوباسیلوس سالیواریوسNK02

مقاومت به لیزوزیم، نمکهای صفراوی و شیره شبیه سازی شده معده: لاکتوباسیلوس جداشده به میزان 34/92 درصد مقاومت به لیزوریم و شرایط شبیه سازی شده دهان نشان داد. همچنین توانایی رشد آن در مجاورت با نمکهای صفراوی به میزان 23/79 درصد مشاهده شد. مقاومت سویه منتخب در شرایط شبیه سازی شده شیره معده تغییر قابل توجه ای در 60 دقیقه اول با کاهش pH از 5 به 5/2 مشاهده نشد. شمار سلولهای لاکتو باسیلوس منتخب پس از 70 و 80 دقیقه در 5/2 و 4/2 pH به ترتیب
0.05 ± 9.76 و0.02  ± 9.50 بود. در پایان تست وقتی شرایط شبیه سازی شده معده به 2/2 pH پس از 90 دقیقه رسید، میزان بقای سویه مورد نظر7 logs CFU ml^-1,  تعیین گردید.

فعالیت هیدرولیزی نمکهای صفراوی: لاکتوباسیلوس جداشده توانایی هیدرولیز نمک سدیم گلایکودکسی اسید را به صورت هاله عدم رشد بر روی محیط  MRS-GDCA نشان داد.

خاصیت ضدباکتریایی: خاصیت ضد باکتریای لاکتو باسیلوس جداشده علاوه بر علیه
A. actinomycetemcomitan بر علیه باکتریهای بیماری زای دیگری نیز سنجیده شد. نتایج در جدول 3 ارائه شده است.

جدول 3

سنجش تحمل pH: تأثیر pH روی لاکتوب اسیلوس جداشده بررسی شد و شمار سلولهای زنده در pH های 2، 5، 7 و 9 به ترتیب 34/68، 23/93، 34/70 و 12/69 گزارش شد. میزان زنده ماندن لاکتو باسیلوس در 2 و 9pH  به میزان قابل توجهی کاهش یافت.

مقاومت آنتی بیوتیکی: لاکتو باسیلوس سالیواریوس سویه NK02 با توجه به نتایج به دست آمده (جدول 4) به اکثر آنتی بیوتیکهای ذکر شده حساس و تنها به استرپتومایسین مقاومت نشان داد.

جدول 4