نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیئت علمی- سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران

2 عضوهیئت علمی- پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک

3 عضو هیئت علمی- پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک

4 سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران

چکیده

در این تحقیق بیان پروتئین هسته ای بالغ ویروس هپاتیت C (HCVC173) منطبق با ایزوتیپ a ویروسی موجود در ایران در اشرشیا کلی بررسی گردید. پروتئین مزبور با وزن ملکولی 20 کیلودالتون به مقدار قابل توجه تا 18% پروتئین میزبانی بیان گردید. که به طور عمده به صورت نامحلول (به صورت اینکلوژن بادی) در سیتوزول باکتری مشاهده شد. تمایل به تجمع شدن به هنگام انجام فرآیند بازتاخوردگی پروتئین محلول شده پدیده غالب غیر قابل انتظار بود. ارزیابی نرم افزاری پروتئین هسته ای دو ناحیه مستعد بی نظمی در پروتئین HCVC173 را پیش بینی کرد که ممکن است از دلایل مجتمع شدن آن باشد. بنابراین پروتئین هدف دارای وِیژگی های انواع پروتئین های بدون ساختار است. این یافته می تواند تمایل قابل توجه این پروتئین را به تجمع حین بازتاخوردگی توجیه کند. به علاوه راهکار ارائه شده در این پژوهش حداقل راه حلی بر غلبه بر محدودیت بیان فرم بالغ این پروتئین است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Lab and In silico study of expression and aggregation of recombinant core protein of Hepatitis C virus in Escherichia coli

نویسندگان [English]

  • Jafar Hemmat 1
  • Bagher Yakhchali 2
  • َAliashgar karkhaneh 3
  • mahnaz mazaheri asadi 1
  • soodabeh karimi 4

1 Faculty- Iranian Research Organization for Science and Technology

چکیده [English]

In this study, expression of mature Hepatitis C virus core protein (HCVC173), consistent with a viral isotype isolated in Iran, was studied in E. coli. The 20 kDa- HCVC173 protein was expressed while it contains 18% of total expressed proteins in which a part was partially soluble but the main part was expressed in insoluble inclusion body. However, the produced inclusion body has not shown the expected purity and HCVC173 has been aggregated with the host proteins. Moreover, during refolding of insoluble HCVC173, notable aggregation of the protein was undesirable phenomena. Intramolecular evaluation of target expressed protein predicted two irregularity area in the HCVC173 which may aggregate the expressed protein. Consequently, HCVC173 has the features of the intrinsically unstructured proteins. This character may justify its aggregation during refolding. Moreover, the approach presented in this paper is an alternative solution to overcome the expression limitation of mature form of the HCVC protein.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "Hepatitis C Virus"
  • "core protein"
  • "Inclusion body"
  • "Aggregation"

مطالعه آزمایشگاهی و نرم افزاری  بیان و مجتمع شدن درون سلولی پروتئین هسته ای نوترکیب هپاتیت C در اشرشیا کلی

جعفر همت1*، باقر یخچالی2، علی اصغر کارخانه2، مهناز مظاهری اسدی1 و سودابه کریمی1 

1 تهران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده زیست فناوری 

2 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری صنعت و محیط زیست 

تاریخ دریافت: 31/2/91               تاریخ پذیرش: 1/8/91

چکیده

در این تحقیق بیان پروتئین هسته ای بالغ ویروس هپاتیت C (HCVC173) منطبق با ایزوتیپ a ویروسی موجود در ایران در اشرشیا کلی بررسی گردید. پروتئین مزبور با وزن مولکولی 20 کیلودالتون به مقدار قابل توجه تا 18 درصد پروتئین میزبانی بیان گردید. که به طور عمده به صورت نامحلول (به صورت اینکلوژن بادی) در سیتوزول باکتری مشاهده شد. تمایل به تجمع شدن به هنگام انجام فرآیند بازتاخوردگی پروتئین محلول شده پدیده غالب غیر قابل انتظار بود. ارزیابی نرم افزاری پروتئین هسته ای دو ناحیه مستعد بی نظمی در پروتئین HCVC173 را پیش بینی کرد که ممکن است از دلایل مجتمع شدن آن باشد. بنابراین پروتئین هدف دارای ویژگیهای انواع پروتئینهای بدون ساختار است. این یافته می تواند تمایل قابل توجه این پروتئین را به تجمع حین بازتاخوردگی توجیه کند. به علاوه راهکار ارائه شده در این پژوهش حداقل راه حلی برای غلبه بر محدودیت بیان فرم بالغ این پروتئین است.

واژه های کلیدی: هپاتیت C، پروتئین هسته ای، مجتمع شدن پروتئین

* نویسنده مسئول، تلفن: 02156276636، پست الکترونیکی: j.hemmat@gmail.com 

مقدمه 

 

ویروس هپاتیت C (HCV) به عنوان یکی از شایع ترین عفونتهای مزمن خون و عامل آلودگی ویروسی 3 درصد جمعیت جهانی است که با بیماری فرصت طلب ایدز همراه شده است. این ویروس باعث آلودگی تمام عمرکبد و بیماری سیروز کبدی، سرطان کبدی  (HCC) و نهایتاً مرگ می شود (8، 10 و 15). به دلیل مشکلات تولید پروتئین هسته ای بالغ نوترکیب (HCVC) به عنوان تنها پروتئین با ثبات و تنها پروتئین کاندید واکسن این ویروس، و وجود اطلاعات اندک از آن، وجود محدودیت و معضلات فرآیند های پایین دستی بیان آن هنوز واکسنی برای این بیماری تهیه نشده است. عدم وجود سیستم بیانی مناسب جهت بیان مورد انتظار فرم بالغ پروتئین هسته ای از جمله این محدودیتهاست. پس از آنکه مسجل شد این پروتئین گلیوزیله نمی شود، برخی محققین تلاش کردند از سیستم اشرشیا کلی جهت بیان استفاده کنند. با وجودی که این پروتئین ابتدا به شکل نابالغ -191 اسید آمینه ای- بیان می شود و سپس به صورت بالغ 173 اسیدآمینه ای در می آید اما اکثر گزارشات به بیان پروتئین در حالت کوتاه شده معطوف گشته است (19، 20، 21 و 22) (جدول 3). در حالات محدودی نیز که پروتئین کامل، هدف بوده است، عدم بیان و یا بیان ناچیز پدیده غالب بوده است و در مواردی نیز که بیان گزارش شده، عمدتاً پروتئین به صورت متصل به پپتید یا پروتئین دیگری (GST وMBP) بوده است(جدول 3). همچنین در سیستم بیانی اشرشیا کلی پروتئین بیانی در اغلب موارد حالت غیر محلول بوده است (2). در سیستم بیانی مخمری یا رده سلولی بیان ناچیز شکل بالغ اما محلول، گزارش شده است (14).

پروتئین HCVC ، پروتئین نوکلئوکپسیدی واکنش دهنده با پروتئینهای پوششیE1  و E2   ویروس همچنین با پروتئینهای همتای خود در حضور ساختار های RNA است(3 ). در ابتدا این پروتئین به صورت پلی پپتید همراه دیگر پروتئینهای ویروسی ترجمه می شود. سپس تحت اثر پپتیدازهای میزبانی از بقیه پروتئینها در قسمت E1،  به صورت پلی پپتید 191 اسید آمینه ای جدا می شود که از طریق 22 اسید آمینه انتهای کربوکسیلی به غشای اندو-پلاسم رتیکولومی متصل می باشد. سپس تحت اثر پپتیداز دیگری سیگنال پپتید خود را از دست می دهد و به صورت بالغ173 اسید آمینه ای (HCVC173 ) درمی آید (13). در هر حال پروتئین هسته یک پروتئین هیدروفیل با بار مثبت با حدود 20 درصد لیزین و آرژنین است که از طریق این اسید آمینه‌های مثبت به ژنوم که دارای بار منفی است متصل می‌‌گردد. برای این پروتئین نقشهای متفاوت شناخته شده است (1، 8 و 18).

در مورد بیان فراتر پروتئین بالغ HCVC گزارشات اندک و اکثر گزارشات موجود در مورد فرم نابالغ و کوتاه شده این پروتئین می باشند. که عمدتاً با توجیه تمرکز وجود شاخصهای اپیتوپی این پروتئین در انتهای آمینی آن انجام شده اند. اما در واقع به دلیل اینکه بیان فرم بالغ پروتئین ویروس مشکلاتی را فراهم می آورد، محققین ترجیح می دهند که فرم کوتاه شده این پروتئین را بیان کنند. با توجه به اینکه بیشتر فرم کوتاه شده این پروتئین کلون و بیان گردیده است، در این تحقیق تلاش گردید تا فرم کامل پروتئین ویروس در E. coli بیان گردد. با توجه به خصوصیت تجمع شدن آن این ویژگی نیز از بعد مولکولی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

از محیط کشت  LB (Luria-Bertani) در تمامی مراحل کلونینگ و همچنین در مراحل بیانی و به منظور کشت سویه های متفاوت باکتری اشرشیا کلی استفاده شد. از باکتری  اشرشیا کلی سویه DH5α به عنوان میزبان در مراحل کلون سازی و نیز جهت تکثیر و نگهداری DNA پلاسمیدی واز سویه های بیانی اشرشیا کلی BL21(DE3)   و BL21(DE3)plysS در راستای یافتن میزبان بیانی مناسب جهت تولید میزان مناسبی از پروتئین نوترکیب استفاده شد. وکتور های pBluescript II KS (+)Apr lacZ و pET-26b(+) به ترتیب به عنوان ناقلهای کلونینگ و بیانی به کارگرفته شدند. آنزیمهای برشی عمدتاً از شرکتهای فرمنتاز و یا رش تهیه شدند.

دستورزی ژنتیکی: جهت بررسی بیان پروتئین نوترکیب HCVC173 ، پس ازالگوبرداری و تکثیر ژن از روی cDNA  (شماره AF512996 بانک ژن)، قطعات ژنی ntCore و PelB-Core و  His-Core در حامل کلونینگ pBluescript II KS (+) کلون سازی گردید. پس از تأیید صحت همسانه سازی، با روش تعیین توالی و برش آنزیمی آنها ژن هدف در پلاسمید بیانی pET26b(+)  همسانه سازی گردید. نتیجه عمل تهیه سه سازه بیانی واجد DNA هدف در موقعیتهای/HindIII  McsI(سازه های بیانیpelBcore ) یا NdeI/HindIII (سازه های بیانی Ntcore & Hiscore) پلاسمید بیانی pET26b(+)  بود. روشها و اعمال کنترلهای لازم طبق روشهای کتاب مرجع سمبروک انجام شد(17).

بیان پروتئین هسته ویروس هپاتیت C : سویه بیانی واجد سیگنال ترشحی pelB (سازه  pelbcore)، سویه واجد دنباله هسیتیدینی در ابتدای توالی پپتیدی (سازه hiscore) و سازه فاقد هرگونه قطعه اضافه (سازه ntcore) ساخته شده در بخش قبل جهت ارزیابی بیان پروتئین هسته ای استفاده شدند. کشت شبانه در محیط LBو در گرمخانه شیکردار با دمای 37 درجه سانتی گراد و با دور همزن rpm 200 تهیه شد. القای بیان پروتئین با افزودن IPTG به غلظت نهایی 0.4 mM به محیط انجام شد. پس ازآن در شرایط دمایی و دور همزن مناسب برای بیان (دمای 30 درجه سانتی گراد و دور همزن 150 rpm) انکوبه شد. در فواصل زمانی مشخص نمونه گیری صورت گرفته و توسط سانتریفیوژ 8000 rpm به مدت 5 دقیقه رسوب سلولی تهیه شد. رسوب سلولی حاصل از آنها در 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند. میزان بیان توسط ژل SDS-PAGE طبق روش قبلاً گزارش شده بررسی گردید (9).

استخراج پروتئین: سلولهای BL21(DE3) plysS  تراریخت شده با ساختار های نوترکیب ساخته شده فوق، در محیط کشت LB کشت داده شد. رسوب سلولهای بیانی القاء شده، در بافر لیزکننده به صورت سوسپانسیون در آمده و متعاقب آن محلول به دست آمده روی یخ با دستگاه التراسونیک با توان 75 وات و  به مدت 9 ×30 s با دورۀ استراحت 30 ثانیه ای لیزگردید ( 7).

محصول سوسپانسیون سلولی طی مدت 20 دقیقه 18000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل که واجد پروتئین مورد نظر بود با بافر شستشو به مدت 30 دقیقه با همزن برقی هم زده شد. پس از سانتریفیوژ شستشو تکرار گردید سپس شتشو با بافرشستشو فاقد تریتون دو مرتبه تکرار شد. رسوب حاصل جهت مراحل بعدی در فریزر 20-  سانتی گراد نگهداری شد.

به منظور تهیه مقادیر بیشتر پروتئین مورد نظر همچنین افزایش بخش محلول پروتئین بیان شده، اثر دماهای مختلف (5/22، 25، 30و 37 درجه سانتی گراد) بر بیان پروتئین هسته ای بررسی شد. (15).

محلول سازی پروتئین: جهت بررسی محلولیت پروتئین نوترکیب رسوب سلولهایی که بیان پروتئین نوترکیب در آنها القاء شده بود در بافر لیز کننده به صورت سوسپانسیون در آورده شدند. برای جهت محلول سازی فرم تجموع یافته پروتئین مورد نظر از دترجنتهای غیر یونی تریتون X-100 ( 0.1% ) و توئین 20 ( 0.5%) استفاده شد و همچنین سوسپانسیون حاصل به مدت 6 ×30 s با دورۀ استراحت 30 ثانیه ای اولتراسونیک شد و در دمای 4 درجه سانتی گراد با دور 15000 rpm به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید (16). روشناور و رسوب حاصل از این سانتریفیوژ به ترتیب به عنوان پروتئینهای محلول و نامحلول در نظر گرفته شدند. از این دو قسمت نمونه هایی برای آنالیز  توسط SDS-PAGE تهیه شد.

مطالعات نرم افزاری: موقعیت AUG آغازین در ساختار ثانوی mRNA ، مکان اتصال ریبوزوم به mRNA ، ثبات ساختار mRNA، توالی ابتدایی سازه های ساخته شده توسط نرم افزار MFOLD(http://mfold.bioinfo.rpI.edu/) بررسی شد (23). نواحی مورد بررسی توالی 126 نوکلئیک اسید بود که کدون آغازین را در بر می گرفت. به منظور بررسی برخی عوامل مؤثر بر بیان در سطح ترجمه، پراکندگی توزیع کدونهای هریک از سازه ها در گروههای کیفی کدنی، توزیع فرکانس کاربری کدنی و شاخص تطابق کدنی(CAI)، همچنین درصدGC  سازه ها توسط نرم افزار Genscript (http://www.genscript.com/codon_opt.html) بررسی شد. جهت جستجوی توالی یا توالیهای احتمالی کاندید مجتمع شدن پروتئین با استفاده از نرم افزار DisEMBL (http://dis.embl.de) بررسی شد. 

نتایج

براساس مطالعات نرم افزاری و بررسی مقایسه ای میزان وفور کدونهای نادر، از بین سه سازه بیانی طراحی شده میزان بیان مورد انتظار سازه pelBcore  دوبرابر ntcore ( فرکانس بیان 16 درصد در مقابل 8 درصد) پیش بینی شد. اما طی مشاهدات، دو سازه hiscor  و ntcore بیان اندک اما سازه pelBcore   بیان فراتر نشان داد. با توجه با تفاوت اندک سه سازه و آن هم در توالیهای ابتدایی این مشاهدات نشان دهنده دخالت احتمالی عوامل دیگر در افزایش سطح بیان آن بود. لذا شاخصهای دیگر مؤثر بر بیان، مانند جایگاه محل اتصال ریبوزوم و موقعیت AUG آغازین در mRNA بررسی شدند. بدین منظور ساختار ثانویهmRNA  سه سازه بیانی (126 نوکلئوتید اول mRNA) توسط نرم افزار Mfold بررسی شد. همان طور که نتایج (جدول 1) نشان می دهد موقعیت کدون آغازین(قرار گرفتن درلوب بزرگ) سازه pelBcore نسبت به دو سازه دیگر، همچنین وجود کدونهای مناسب در سیگنال بهینه شده درپلاسمید بیانی pET26  درابتدای mRNA  سازه pelBcore، ممکن است شروع ترجمه بهتر وتسهیل شده تری را برای آن در مقایسه با دو سازه دیگر توجیه کند. همچنین لحاظ شاخص CAI و deltaG کاهش یافته، برپایداری بهتر mRNA  سازه pelBcore  دلالت کنند.

 

جدول1- بررسی مقایسه ای ساختار ثانویه سه سازه بیانی (126 نوکلئوتید اول mRNA) توسط نرم افزار Mfold اسید آمینه های اولیه مربوط به پروتئین کر در سه سازه به صورت خط کشی شده نشان داده شده است.

ΔG kcal/mol

موقعیت rbs

موقعیت AUG

اسید آمینه های آغازین

سازه

38/28-

Stem

Big loop

MKYLLPTAAAGLLLLAAQ

pelBcore

19/20-

Stem

Loop

MHHHHHHMSTNPKPQRKT

Hiscore

-20/19-

Loop-Stem(1+4)

loop

MSTNPKPQRKTKRNTSRR

Ntcore


بیان پروتئین: با هدف تأثیر شرایط محیطی بربیان پروتئین محلول مورد نظر، اثر عوامل مختلف بر بیان از قبیل دمای القاء بررسی شد (شکل 1)، و میزان پروتئین مورد نظر تا 18 درصد پروتئین تام میزبان افزایش یافت (شکل 1).

 

 
 

     1  2   3     4   5     6  .  7     8 ..    10 .. 9  

 
 


         

شکل 1- بررسی اینکلوژن بادی تولیدی و پروتئین محلول در دماهای متفاوت. 4ستون 1 تا 10 به ترتیب از چپ به راست: مارکروزن مولکولی، پروتئین محلول و اینکلوژن بادی استحصالی  تولیدی در دمای30 درجه، 25 و 5/22 ، دمای37 درجه سانتی گراد و پروتئین تام اولیه (37 درجه سانتی گراد)  همگی در غلظت IPTG   mM 4/0.


بررسی وجود توالیهای مستعد مجتمع شدن نوع بتا در سه سازه بیانی: با توجه به غالب بودن میزان مجتمع شدن پروتئین مورد نظر بیان شده به صورت اینکلوژن بادی همچنین طی فرآیند تاخوردگی (اطلاعات منتشر نشده) ، تلاش شد توالی یا توالیهای احتمالی کاندید مجتمع شدن آن با استفاده از نرم افزار DisEMBL بررسی شود. در این مطالعه توالی پروتئین نوترکیب  PelB::core از نظر وجود توالیهای مستعد بتا مجتمع شدن (تاخوردن غیر معمول پروتئین است که منجر به نامحلول شدن می شود) بررسی شدند و با توالیهای شکل نابالغHCV ((HCVcore191 و بالغ آن که با حذف 18 اسید آمینه انتهای آمینی قسمت سیگنالی((HCVcore173 حاصل می شود، مقایسه شد.

نکته قابل توجه در این بررسی وجود یک توالی شش اسیدآمینه ای در توالی 30-35 فرم بالغ است که در شکل پروتئین غیر بالغ نیز موجود و مستعد بتا مجتمع شدن است. علاوه براین توالی فرم نابالغ HCVcore191 در توالی 174-185 واجد این توالی است که احتمال بی نظمی نزدیک 100 درصد نشان می دهد. بنابراین بیان حالت غیر بالغ پروتئین با داشتن دو توالی مستعد مجتمع شدن  احتمال مجتمع شدن بیشتری باید داشته باشد. اما در شکل بالغ با حذف این توالی احتمال بی نظمی تا حد 50 درصد کاهش می یابد. در مورد پروتئین هیبرید PelB::core با افزوده شدن توالی اختصاصی مستعد مجتمع شدن مربوط به سیگنال AGLLLLAA)) به توالی مشترک بین سه سازه (IVGGVYL ) احتمال بی نظمی وآگریگه شدن تا بیش از 50 درصد افزایش می یابد. (جدول 2 و شکل2).  

 

 

جدول2- مقایسه توالیهای بی نظم و موقعیت آنها در سه توالی متفاوت مربوط به HCVC173،  HCVC191و PelBcore173.

نام سازه

موقعیت

توالی های بی نظم

HCVC173

35-30

IVGGVYL

PelBcore

58-52 و 17-10

AGLLLLAA,IVGGVYL

HCVC191

185-174و 35-30

IVGGVYL,FSIFLLALLSCL

 

الف

ب)

شکل2- بررسی میزان وجود احتمالی توالیهای مستعد بتا مجتمع شدن در دو توالی متفاوت مربوط به  HCVcore به وسیله نرم افزار DisEMBL الف) توالیهای احتمالی مربوط به  توالی نابالغ (HCVcore191)، و ب) توالی بالغ واجد سیگنال PelBcore173))، احتمال بی نظمی و موقعیت توالی مستعد بتا مجتمع شدن با منحنی نارنجی نشان داده شده است که در داخل دایره محیط گشته است.


بحث

مقایسه کیفی وکمی بیان پروتئین هسته ویروس هپاتیت C نشان می دهد(جدول 3) که اکثر پژوهشها به بیان پروتئین در حالت کوتاه شده معطوف گشته است. در حالات محدودی نیز که پروتئین بالغ، هدف بوده، بیان یا ناچیز بوده یا اساساً منفی بوده است. نقطه مشترک اغلب موارد بیان گزارش شده، بیان پروتئین به صورت متصل به پپتید یا پروتئین دیگری (GST وMBP) بوده است. در سیستم بیانی اشرشیا کلی حالت غیر محلول بودن پروتئین در موارد بیانی حاکم بوده است (2). در مواردی که سیستم بیانی مخمری یا رده سلولی بوده گرچه بیان ناچیز بوده اما حالت محلول، گزارش شده است (13)( جدول 3). در این پژوهش پروتئین هسته ای بالغ ویروس هپاتیت C ایزوتیپ ایرانی بخشی محلول و بخشی نامحلول اما به صورت قابل ملاحظه در اشرشیا کلی بیان گردید. بنابراین راهکار ارائه شده در این پژوهش حداقل راه حلی برای غلبه بر محدودیت بیان فرم کامل این پروتئین است.

حالت غیر معمول اینکلوژن بادی تولیدی HCVC173 از جنبه خلوص مورد انتطار و همراهی غیر منتظره پروتئینهای میزبانی با آن از دو جنبه متفاوت قابل بحث است: یک جنبه نقش محوری این پروتئین در تشکیل ساختار نوکلئوکپسیدی ویروس و از جنبه دیگر ویژگیهای تعریف شده برای پروتئینهای ذاتاً بی نظم(IUP)  (5) با توجه به عملکرد محوری و نقش این پروتئین در پایه گذاری ساختار نوکلئوکپسید ویروس، از یکسو به نظر می رسید که قابلیت اتصال به واحد های مشابه خود را داشته باشد و از سویی می بایست توانایی برهمکنش با دیگر پروتئینهای ساختاری از جمله E1 , E2  همچنین ژنوم را داشته باشد تا بتواند در مجموع نوکلوکپسید ویروس را تشکیل دهد. علاوه بر این در گزارشهای متعددی نشان داده شده که HCVC با چندین پروتئین میزبانی ارتباط برقرارمی کند از آن جمله: پایانه C پروتئینp53 ، و پروتئین هلیکاز DEAD-box (DBX) (12). علاوه بر این، کریستوفر و همکارانش پروتئین کامل HCVC همچنین فرمهای کوتاه شده آن در پایانه C را چاپرونهای قوی اسید نوکلئیک معرفی کرده اند (4). براین اساس تمایل شدید برهمکنش پروتئین HCVC173 با خود و دیگر پروتئینهای پیرامونی و در شرایط آزمایشگاهی قابل توجیه و انتظار است. طی پژوهشی اثبات شده که در رده سلولی پستانداران که HCVC  بیان می شود در بیشتر موارد DBX در فرمهای مجتمع شده در غشای شبکه اندوپلاسمی قرار می گیرد (12). 

جنبه دوم تأثیرگذار بر ویژگی غیر معمول رفتار پروتئین هسته ای HCVC173 ، تمایل به تجمع شدن و خصوصیت ذاتی آن در دارا بودن خصوصیات پروتئینهای IUPs است (5). IUPs خانواده مهمی از پروتئینها هستند که ممکن است تا 30 درصد از پروتئینهای ژنوم انسان را شامل شوند. مشخص شده است که IUPs با مولکولهای مختلف از جمله اسیدهای نوکلئیک، پروتئینهای دیگر و یا غشاها و یا دامنه وسیعی از لیگاندهای کوچک برهمکنش داده و بی شکلی و انعطاف پذیری از ویژگیهای مهم این پروتئینها هستند. با استفاده از نرم افزار  DisEMBLپیش بینی نواحی غیر معمول پروتئینها در خصوص پروتئینهای متعددی از جمله پروتئین هیستونی H1.2، پروتئین ریبوزومی 30S مطالعه شده است (11). در یک مطالعه ساختار 82 اسید آمینه اول HCV (C82) توسط داویگناد بررسی شد. شواهد تجربی بر این مطلب دلالت دارد که C82 در محلول آبی  دارای شکل بسیار بی نظم است و دلالت بر منتسب بودن این پروتئین یا نیمه ابتدای N آن به خانواده پروتئینهای بدون ساختار ذاتی است(5). بنابراین انتظار رفتار مشابه متناسب خصوصیت ذاتی پروتئین HCVC173 در میزبان بیانی نیز اجتناب ناپذیر است گرچه مطلوب تحقیقات نباشد. ولی به واسطه غیر محلول بودن راه حلی برای افزایش پایداری پروتئین در مقابل حساسیت به پروتئاز هاست که می تواند در شرایط درون شیشه ای در مقابل ناپایداری آن از آن بهره برد.

 

جدول3 - مقایسه کیفی و کمی بیان آنتی ژن HCVC در گزارشات قبلی به تفکیک طول قطعه، سیستم بیانی و میزان بیان.

Author

Expression

Expression form

Exp

Vector

HCVC

Form/Amino acid

 6

>1mg/3-4mg/ml

MBP/ GST inclusion body

prokaryotic expression

163/141

20

Cytoplas/Nucleus

monkey COS cells

SR alpHa promoter/

22kD/Truncate

18

IB/440mg/ 3.5L

 

tac  promoter

113

19

Exp-

Exp+

GST_fusion

pGEX-3X

 

Mature

Truncate123

21

low Exp                        Exp

GST

 

HCVC191

2

Low expression

His tag

pT7-7

HCV169/

124(1b)

14

Low expression

Fused sucrose invertase 2

AOXI

120 aa, 176 aa


سپاسگزاری

از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران  و پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری به خاطر پشتیبانی پژوهش سپاسگزاری می گردد.

یادبود: رحلت دانشمند فقید و استاد فرزانه دکتر فریدون ملکزاده که نقش بارزی در توسعه علوم میکروبیولوژی و بیوتکنولوژی میکروبی ایران داشتند به جامعه علمی کشور تسلیت عرض نموده و بدین وسیله یاد ایشان را گرامی می داریم. روحشان قرین رحمت الهی باشد.

  1. Alberstein, M., Zornitzki, T. Zick,. Knobler, Y H, (2012) Hepatitis C core protein impairs insulin downstream signalling and regulatory role of IGFBP-1 expression, J. Viral Hepatitis, Volume 19, Issue 1, pages 65–71,
  2. Boulant S, Vanbelle C, Ebel C, Penin F, Lavergne JP (2005) Hepatitis C virus core protein is a dimeric alpha-helical protein exhibiting membrane protein features. J Virol 79: 11353-65
  3. Counihan NA, Rawlinson SM, Lindenbach BD (2011) Trafficking of Hepatitis C Virus Core Protein during Virus Particle Assembly. PLoS Pathog 7(10):e1002302. doi:10.1371/journal.ppat.1002302.
  4. Cristofari G, Ivanyi-Nagy R, Gabus C, Boulant S, Lavergne JP, Penin F, Darlix JL (2004) The hepatitis C virus Core protein is a potent nucleic acid chaperone that directs dimerization of the viral(+) strand RNA in vitro. Nucleic Acids Research 32: 2623-263
  5. Duvignaud B, Savard C, Fromentin R, Majeau N, Leclerc D, Gagne SM (2009) Structure and dynamics of the N-terminal half of hepatitis C virus core protein: An intrinsically unstructured protein. Biochemical and Biophysical Research Communications 378: 27-31
  6. Hitomi Y, McDonnell WM, Baker JR, Jr., Askari FK (1995) High efficiency prokaryotic expression and purification of a portion of the hepatitis C core protein and analysis of the immune response to recombinant protein in BALB/c mice. Vira
  7. Hourioux C, Ait-Goughoulte M, Patient R, Fouquenet D, Arcanger-Doudet F, Brand D, Martin A, Roingeard P (2007) Core protein domains involved in hepatitis C virus-like particle assembly and budding at the endoplasmic reticulum membrane. Cell Microbiol 9: 1014-27.
  8. Irshad M, Dhar I (2006) Hepatitis C virus core protein: an update on its molecular biology, cellular functions and clinical implications. Med Princ Pract 15: 405-16
  9. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-5.

10. Levy M, T, Chen J, J, McGuinness P, H, Koorey D, Sheil  A, G & McCaughan G, W (1997) Liver transplantation for hepatitis C-associated cirrhosis in a single Australian centre: referral patterns and transplant outcomes. Journal of astroenterology and Hepatology 12, 453-459.

11. Linding R, Jensen LJ, Diella F, Bork P, Gibson TJ, Russell RB (2003) Protein disorder prediction: implications for structural proteomics. Structure 11:1453-9.

12. Mamiya N, Howard J. Worman H J, (1999) Hepatitis C Virus Core Protein Binds to a DEAD Box RNA Helicase J.  Biol Chemist 27422, 15751–15756.

13. Majeau N, Gagné V, Bolduc  M, and Leclerc D , (2005) Signal peptide peptidase promotes the formation of hepatitis C virus non-enveloped particles and is captured on the viral membrane during assembly J  Gen.l Virol 86, 3055–3064.

14. Martinez-Donato G, Acosta-Rivero N, Morales-Grillo J, Musacchio A, Vina A, Alvarez C, Figueroa N, Guerra I, Garcia J, Varas L, Muzio V, Duenas-Carrera S (2006) Expression and processing of hepatitis C virus structural proteins in Pichia pastoris yeast. Biochemical and Biophysical Research Communications 342: 625-631.

15. Park S, Lim J, Lim S, Tiwari I, Jang K, (2011)  Hepatitis C virus Core protein stimulates cell growth by down-regulating p16 expression via DNA methylation. Cancer Lett. 310: 61-8.

16. Rastgar Jazii F, Karkhane A A, Yakhchali B, Fatemi S A,  and Deezagi A, (2007) A simplified purification procedure for recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor from periplasmic space of Escherichia coli. J. Chromat B, 856: 214-221.

17. Sambrook J, Fritsch E. F., Maniatis T, (2001) Molecular cloning: a laboratory manual, Vol I, II, III, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

18. Seki M, Honda Y, Kondo J, Fukuda K, Ohta K, Sugimoto J, Yamada E (1995) Effective Production of the Hepatitis-C Virus Core Antigen Having High-Purity in Escherichia-Coli. Journal of Biotechnology 38: 229-241.

19. Songsivilai S, Dharakul T, Kunkitti R, Thepthai C (1996) Molecular cloning and expression of hepatitis C virus core protein and production of monoclonal antibodies to the recombinant protein. Asian Pac J Allergy Immunol 14: 31-4.

20. Suzuki R, Sakamoto S, Tsutsumi T, Rikimaru A, Tanaka K, Shimoike T, Moriishi K, Iwasaki T, Mizumoto K, Matsuura Y, Miyamura T, Suzuki T, (2005) Molecular determinants for subcellular localization of hepatitis C virus core protein. J Virol. . 79(2):1271-81.

21. Yang L, Zhu LX, Wang Y, Li GD (1999) Fusion Expression, Immunogenicity and Applications of C-terminally Truncated HCV Core Proteins. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai) 31: 61-66

22. Voisset C, Dubuisson J (2004) Functional hepatitis C virus envelope glycoproteins. Biology of the Cell 96: 413-420.

23. Zuker M, (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 13:3406-15.