نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

2 گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه ارومیه

چکیده

به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات ارتفاع بوته، میزان کلروفیل، وزن تر کل، وزن خشک کل، وزن تر برگ، وزن خشک برگ، وزن تر ساقه، وزن خشک ساقه، تعداد برگ، تعداد ساقه، تعداد برگ به تعداد ساقه، وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه و وزن خشک کل به وزن تر کل در جمعیت‌های مختلف یونجه زراعی، از نشانگرهای ISSR (Inter simple sequence repeat) استفاده شد. 16 آغازگر مورد استفاده، 117 مکان در 80 ژنوتیپ یونجه تولید کرد. میانگین تعداد مکان‌ها 3/7 مکان برای هر آغازگر بود. میانگین میزان اطلاعات چند شکل (Polymorphism information content) (PIC) برای آغازگرها 77/0 و از 65/0 (UBC849) تا 93/0 (443) متغیر بود.‌ برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط با صفات مورفولوژیک، تجزیه رگرسیون گام به گام بین داده‌های ملکولی به عنوان متغیرهای مستقل و صفات مورفولوژیک به عنوان متغیرهای وابسته انجام گرفت. نشانگرهای مرتبط با صفات وزن خشک کل و وزن خشک برگ یکسان بودند. نشانگرهای مرتبط با صفات تعداد برگ و نسبت وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه به ترتیب Kourda و UBC849 بودند. بیشترین تغییرات مربوط به صفت میزان کلروفیل (82 درصد) توسط نشانگرهای A12، UBC812، UBC808، UBC849، 425، 456 و 848 تبیین شد، در حالیکه آغازگرهای 425 و UBC808، 15 درصد از تغییرات مربوط به صفت وزن تر برگ را تبیین کردند. اکثر آغازگرهای مورد استفاده روی صفات مورد مطالعه مؤثر بودند، بنابراین می‌توان از این آغازگرها همراه با اطلاعات صفات مورفولوژیک در اصلاح یونجه زراعی جهت شناسایی والدین مناسب برای تهیه جمعیت‌های نقشه‌یابی و تولید ارقام هیبرید استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Identification of ISSR markers associated with morphological traits in cultivated alfalfa (Medicago sativa L.) populations

نویسندگان [English]

  • Babak Abdollahi Mandoulakani 1
  • Heidar Azizi 2

1 Plant Breeding and Biotechnology Dept., Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, I.R. of Iran

2 Plant Breeding and Biotechnology Dept., Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, I.R. of Iran

چکیده [English]

ISSR markers were used to identify informative markers associated with traits plant high, chlorophyll content, total wet weight, total dry weight, leaf wet weight, leaf dry weight, stem wet weight, stem dry weight, number of leaves, number of stems and their ratio, ratio of leaf dry weight to stem dry weight and total dry weight to total wet weight in alfalfa populations. Sixteen ISSR primers amplified 117 loci among 80 alfalfa genotypes, with an average of 7.3 loci per primer. Polymorphic information content (PIC) ranged from 0.65 (UBC849) to 0.93 (443), with an average of 0.77. Stepwise regression analysis between molecular data as independent variables, and morphological data as dependent variables was performed to identify informative markers associated with the studied traits. ISSR loci associated with total dry weight and leaf dry weight were the same. ISSR markers, Kourd and UBC849, were associated with number of leaves and leaf dry weight to stem dry weight, respectively. The maximum variation of chlorophyll content (82%) was accounted by UBC808, UBC812, UBC849, A12, 848, 425 and 456 markers while UBC808 and 425 markers accounted for 15% of the variation of the leaf wet weight. Since most of the used ISSR primers showed significant association with the studied traits, therefore, it is possible to use these markers along with morphological traits in alfalfa breeding programs for identification of suitable parents to produce mapping populations and hybrid varieties.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Alfalfa
  • Informative markers
  • morphological traits

شناسایی نشانگرهای ISSR پیوسته با صفات مورفولوژیک در جمعیتهای یونجه زراعی (Medicago sativa L.) 

بابک عبدالهی مندولکانی* و حیدر عزیزی

ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی 

تاریخ دریافت: 10/7/90               تاریخ پذیرش: 25/4/91 

چکیده 

به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات ارتفاع بوته، میزان کلروفیل، وزن تر کل، وزن خشک کل، وزن تر برگ، وزن خشک برگ، وزن تر ساقه، وزن خشک ساقه، تعداد برگ، تعداد ساقه، تعداد برگ به تعداد ساقه، وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه و وزن خشک کل به وزن تر کل در جمعیتهای مختلف یونجه زراعی، از نشانگرهای ISSR (Inter simple sequence repeat) استفاده شد. 16 آغازگر مورد استفاده، 117 مکان در 80 ژنوتیپ یونجه تولید کرد. میانگین تعداد مکانها 3/7 مکان برای هر آغازگر بود. میانگین میزان اطلاعات چند شکل (Polymorphism information content) (PIC) برای آغازگرها 77/0 و از 65/0 (UBC849) تا 93/0 (443) متغیر بود.­ برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط با صفات مورفولوژیک، تجزیه رگرسیون گام به گام بین داده­های ملکولی به عنوان متغیرهای مستقل و صفات مورفولوژیک به عنوان متغیرهای وابسته انجام گرفت. نشانگرهای مرتبط با صفات وزن خشک کل و وزن خشک برگ یکسان بودند. نشانگرهای مرتبط با صفات تعداد برگ و نسبت وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه به ترتیب Kourda و UBC849 بودند. بیشترین تغییرات مربوط به صفت میزان کلروفیل (82 درصد) توسط نشانگرهای A12، UBC812، UBC808، UBC849، 425، 456 و 848 تبیین شد، در حالی که آغازگرهای 425 و UBC808، 15 درصد از تغییرات مربوط به صفت وزن تر برگ را تبیین کردند. اکثر آغازگرهای مورد استفاده روی صفات مورد مطالعه مؤثر بودند، بنابراین می­توان از این آغازگرها همراه با اطلاعات صفات مورفولوژیک در اصلاح یونجه زراعی جهت شناسایی والدین مناسب برای تهیه جمعیتهای نقشه­یابی و تولید ارقام هیبرید استفاده کرد.

واژه های کلیدی: یونجه، نشانگرهای مثبت، صفات مورفولوژیک

* نویسنده مسئول، تلفن: 09122386990 ، پست الکترونیکی: b.abdollahi@urmia.ac.ir

مقدمه 

 

یونجه (Medicago sativa L.) به عنوان یک گیاه دائمی از خانواده لگومینوز، مهم ترین گیاه علوفه­ای برای تغذیه دام است که پس از غلات، مهم ترین محصول اقتصادی در دنیا محسوب می­شود. جنس Medicago دارای 56 گونه بوده که 22 گونه چند­ساله دگرگشن (از جمله گونه زراعی M. sativa) و 34 گونه یکساله خودگشن می­باشد. اکثر گونه­های چند­ساله تتراپلوئید (2n=4x=32) بوده ولی تعدادی از آنها دیپلوئید (2n=2x=16) می­باشند ­(1، 9 و 11).

با توجه به اینکه تنوع گیاهان زراعی همبستگی مثبتی با پراکندگی جغرافیایی آنها دارد و گیاهان زراعی طی سالها زیستن در شرایط محیطی متفاوت حاوی ژنهای متنوعی شده­اند­ (16) بنابراین تنوع ژنتیکی زیادی در گیاهان داخل یک توده یونجه که در اقلیمهای مختلف جغرافیایی رشد می­کنند وجود دارد ­(4 و 11). وجود چنین اختلاف ژنتیکی گسترده در بین افراد جمعیت یونجه، مطالعات مربوط به ژنتیک جمعیت این محصول را پیچیده­تر نموده است (10، 21 و 23). امروزه برخی برنامه­های اصلاح یونجه بر اساس گزینش فنوتیپی و مورفولوژیکی استوار است. با توجه به محدود بودن تعداد نشانگرهای مورفولوژیکی و متأثر بودن آنها از عوامل محیطی، کاربرد­ اینگونه نشانگرها محدود است (7 و 26). نشانگرهای مولکولی بویژه نشانگرهای مبتنی بر DNA با ایجاد تعداد نامحدودی نشانگر و با حذف اثرهای ناشی از عوامل محیطی، توانسته است بسیاری از مشکلات مربوط به نشانگرهای مورفولوژیک را برطرف کند (20 و 21).­ از این رو، تعیین ارتباط بین نشانگرهای مولکولی و صفات مورفولوژیک، می­تواند گامی مؤثر در استفاده از گزینش جمعیتی باشد. پیوستگی ژنتیکی بین نشانگرها و مکانهای ژنی صفات کمی، محتمل­ترین توجیه برای وجود رابطه بین نشانگرهای مولکولی و نمود صفات کمی است (24). استفاده از پیوستگی بین نشانگرهای مولکولی و ژنهای کنترل کننده صفات کمی، فرآیند اصلاح نباتات را تسریع کرده است به طوری که به جای ارزیابی صفات، گزینش غیر­مستقیم به کمک نشانگرهای پیوسته صورت می­گیرد. در بسیاری از  مطالعات، نشانگرهای پیوسته با صفات که با استفاده از مطالعات مبتنی بر تجزیه پیوستگی در گذشته انجام گرفته است فاصله ژنتیکی زیادی را با صفات مورد مطالعه داشته و برای گزینش به کمک نشانگر و همسانه­سازی بر اساس نقشه مفید نبودند. به علاوه در مطالعات مبتنی بر تجزیه پیوستگی، تعداد کمی از ژنوتیپها به عنوان والدین جمعیت در حال تفرق برای شناسایی چند شکلیهای مرتبط با صفات مورد مطالعه غربال می شوند که این خود محدودیت دیگری را ایجاد می­کند، زیرا ممکن است نشانگرهای شناسایی شده در این والدین برای گزینش به کمک نشانگر در زمینه­های ژنتیکی والدین و ارقام دیگر مفید نباشد. برای غلبه بر این محدودیتها در سالهای اخیر روش مکان یابی ارتباطی (Association mapping) یا تجزیه ارتباطی (Association analysis) معرفی شده است که نه تنها امکان مکان­یابی دقیق ژنها را فراهم می­کند، بلکه امکان شناسایی نواحی کروموزومی دیگری که در مطالعات مبتنی بر پیوستگی امکان پذیر نیستند را نیز میسر می­سازد. کارآیی این روش در انسان نیز برای شناسایی و مکان­یابی ژنهای کنترل کننده صفات مندلی نشان داده شده است. در علوم گیاهی نیز این روش رو به گسترش است (2، 3، 13 و 17). چنین بررسیهایی در ایران که به عنوان یکی از رستنگاههای اولیه یونجه منظور شده و توده­های محلی متنوعی دارد مهم است (7 و 8). تجزیه ارتباط در خزانه ژنی سیب زمینی با 600 رقم نشان داد که ارتباط معنی­داری بین نشانگرهای PCR مبتنی بر ژن R1 (یک ژن عمده دخیل در مقاومت به بلایت دیررس سیب زمینی) و رسیدگی وجود دارد ­(13). ایواندیک و همکاران (14) با استفاده از 33 نشانگر SSR و روش تجزیه ارتباط، نشانگرهای مرتبط با زمان گلدهی تحت رژیمهای مختلف رشدی را در جو شناسایی کردند. خدارحمی و همکاران (18) با استفاده از روش تجزیه ارتباط، 5 نشانگر SSR مرتبط با سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) و 4 نشانگر مرتبط با ضریب آلودگی نهایی را در گندم برای مقاومت به زنگ زرد معرفی کردند. با توجه به اینکه هنوز استفاده از تجزیه ارتباط در یونجه برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط با صفات مورفولوژیک گزارش نشده است، هدف از این آزمایش شناسایی نشانگرهای مثبت و آگاهی بخش مرتبط و پیوسته با صفات مورفولوژیک در یونجه با استفاده از نشانگرهای ISSR و رگرسیون گام به گام بود.  

مواد و روشها

مواد گیاهی مورد مطالعه در این تحقیق شامل 80 ژنوتیپ مربوط به 8 جمعیت قره­یونجه ملک­کندی، قره­یونجه ارومیه­، محلی اصفهان، بغدادی، همدانی، آذربایجان اردوباد، الچی و ساکوئل (جدول 1) بودند. جمعیتها در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی در 3 تکرار روی خطوطی به طول یک متر کشت شده و صفات ارتفاع بوته (سانتیمتر)، میزان کلروفیل، وزن تر کل (گرم)، وزن خشک کل (گرم)، وزن تر برگ (گرم)، وزن خشک برگ (گرم)، وزن تر ساقه (گرم)، وزن خشک ساقه (گرم)، تعداد برگ، تعداد ساقه، تعداد برگ به تعداد ساقه، وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه و وزن خشک کل به وزن تر کل بر اساس 5 نمونه در هر تکرار اندازه­گیری و ثبت شدند.

 

جدول 1- جمعیتهای یونجه مطالعه شده و منشأ آنها

تعداد افراد مورد مطالعه از هر جمعیت

منشأ 

جمعیت

10

ایران- خوی 

قره یونجه ملک­ کندی

10

ایران- ارومیه

قره یونجه ارومیه

10

ایران- اصفهان 

محلی اصفهان

10

ایران- کرمان 

بغدادی

10

ایران- همدان

همدانی

10

آذربایجان 

آذربایجان اردوباد

10

ترکیه 

الچی

10

ترکیه 

ساکوئل

 

جدول 2- توالی آغازگرهای ISSR استفاده شده، تعداد کل مکانهای تکثیر شده، محتوای اطلاعات چند شکل (*PIC) و دامنه اندازه باندی (جفت باز)

آغازگر

توالی آغازگر

تعداد مکان­های تکثیر شده

تعداد مکان­های چند شکل

PIC

دامنه اندازه باندی (جفت باز)

425

(CA)10G

7

6

85/0

3000-800

426

(CAC)7T

3

0

81/0

2500-250

438

(AC)9G

5

5

92/0

4000-800

440

(AC)9C

4

3

88/0

3000-1500

443

(AC)9T

3

3

93/0

4500-1500

456

(ACC)6C

7

5

73/0

1500-800

459

(TGC)6C

3

2

89/0

1300-800

825

(AC)7T

12

11

74/0

2500-500

848

(CA)8G

10

9

76/0

3000-1500

A7

(AG)10T

6

2

69/0

2200-600

A12

(GA)6CC

7

4

77/0

2500-500

A13

(GT)6CC

9

6

66/0

2000-700

B1

(TC)10C

10

9

73/0

3500-1300

UBC808

(CA)7G

12

10

72/0

3000-1000

UBC812

(GA)8A

10

8

68/0

3000-600

UBC849

 

(GT)8CG

9

8

65/0

2200-600

میانگین

 

3/7

07/6

77/0

-

*: Polymorphic information content


استخراج DNA ژنومی و تجزیه داده­ها: بذور ابتدا در ظروف پتری جوانه­دار شده و سپس به گلدان منتقل شدند. پس از رشد گیاهچه­ها در گلخانه از هر جمعیت، 10 نمونه به طور تصادفی انتخاب و از برگهای سالم و سبز هر گیاه نمونه برداری شد. استخراج DNA به روش  CTAB(12) با تغییرات جزئی انجام گرفت. کیفیت و کمیت DNA استخراجی با روش اسپکتروفوتومتری و الکتروفورز ژل آگارز تعیین و سپس به غلظت 30 نانوگرم در میکرولیتر برای انجام واکنشهای PCR رقیق­سازی شد. 16 آغازگر ISSR انتخاب و مورد استفاده قرار گرفتند (جدول 2). واکنش زنجیره­ای پلیمراز در ترموسایکلر PerkinElmer–Applied Biosystems در حجم 20 میکرولیتر شامل 45 نانوگرم DNA ژنومی، بافر PCR یک برابر (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.3) ، 5/1 میلی­مول MgCl2، 2/0 میکرومول از هر dNTP، 5/0 واحد آنزیم تک پلیمراز و 10 پیکومول از هر آغازگر انجام گرفت. چرخه دمایی واکنش زنجیره­ای پلیمراز به صورت: 4 دقیقه واسرشت سازی اولیه در 94 درجه و 35 چرخه شامل 40 ثانیه در 94 درجه (جهت واسرشت سازی)، 40 ثانیه در 54 درجه (جهت اتصال آغازگرها) و 2 دقیقه در 72 درجه (جهت بسط) و بسط نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه بود. تفکیک محصولات تکثیری با استفاده از ژل آگارز 8/1 درصد ResoluteTm line Biozyme (شرکت بیوزایم) و بافر TBE نیم برابر (0.5 X) با  ولتاژ 90 انجام شد و رنگ­آمیزی با اتیدیوم بروماید صورت گرفت. برای تعیین اندازه نوارها نیز از نشانگر اندازه  O'GeneRulerTM (شرکت فرمنتاس) استفاده شد (شکل 1). پس از امتیازدهی الگوهای نواری به صورت یک و صفر و ارزیابی فنوتیپی صفات در مزرعه، برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط و پیوسته با صفات مورفولوژیک مورد مطالعه، تجزیه رگرسیون گام به گام با در نظر گرفتن مکانهای نشانگری به عنوان متغیرهای مستقل و صفات مورفولوژیک به عنوان متغیرهای وابسته انجام گرفت. تجزیه­های آماری با استفاده از نرم­افزارهای SPSS نسخه 15 (19) و Popgene نسخه 31/1 (25) انجام گرفت.

 

جدول 3- نتایج رگرسیون گام به گام بین صفات مورفولوژیک و داده های مولکولی برای شناسایی نشانگرهای مثبت در جمعیتهای یونجه مورد مطالعه

سطح معنی داری

R2  تصحیح شده

مکان ژنی

صفات گیاهی

041/0

43/0

425, 456, 848, UBC812

ارتفاع بوته

038/0

82/0

UBC808, UBC849, UBC812, A12, 848, 425, 456

میزان کلروفیل

134/0

41/0

425, 848, UBC808, A13

وزن تر کل

006/0

40/0

UBC812, UBC849, A13, 425

وزن خشک کل

028/0

15/0

425, UBC808

وزن تر برگ

012/0

36/0

UBC812, UBC849, A13, 425

وزن خشک برگ

031/0

45/0

425, 848, 456, UBC808, A13

وزن تر ساقه

006/0

42/0

425, 848, UBC808, A13

وزن خشک ساقه

112/0

19/0

Kourda

تعداد برگ

121/0

79/0

443, 440, 825, Kourda, UBC808, UBC812, A13

تعداد ساقه

009/0

43/0

438, 440, 825, UBC849

تعداد برگ به تعداد ساقه

018/0

37/0

UBC849

وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه

042/0

44/0

825, Kourda, UBC849

وزن خشک کل به وزن تر کل

500  جفت ‌باز

 

 

1500  جفت ‌باز

 

 

شکل 1 - الگوی باندی آغازگر UBC808 روی جمعیتهای محلی اصفهان ( 10 فرد اول از سمت راست) و آذربایجان اردوباد ( 10 فرد دوم از سمت راست)، نشانگر اندازه O'GeneRulerTM (شرکت فرمنتاس)  یک کیلوباز می­باشد 

 


نتایج و بحث 

از 16 آغازگر ISSR مورد استفاده، 15 آغازگر الگوی باندی مشخص و چندشکل و یک آغازگر (426) الگوی باندی مشخص ولی مونومورف تولید کردند­ (جدول 2). 117 مکان توسط 16 آغازگر تکثیر شد که از این تعداد 91 مکان چند شکل (78 درصد) بودند. متوسط مکانهای چندشکل برای هر آغازگر 07/6 بود. چندشکلی بالای حاصل در پژوهش حاضر را می­توان به کارآیی بالای روش ISSR، وسعت مناطق جغرافیایی نمونه برداری شده، هتروزیگوسیتی و دگرگشنی یونجه و به تعداد زیاد ژنوتیپهای مورد بررسی نسبت داد (23 و 26). همچنین از آنجایی که در روش ISSR، آغازگرها مکمل نواحی ریز ماهواره­ای می­باشند که در یوکاریوت­ها با فراوانی بالا در سراسر ژنوم پراکنده­اند بنابراین استفاده از این روش می تواند سطح بالایی از چندشکلی را آشکار سازد (5 و 27). جبارزاده و همکاران (2010) نیز در مطالعه گونه­های مختلف رز، چندشکلی بالای نشانگرهای ISSR را گزارش نمودند (15). لی و همکاران (2008) در مطالعه برخی والدین سیب زمینی شیرین در چین گزارش نمودند که نشانگرهای ISSR قادرند نمونه­های مورد مطالعه را با کارآیی بالایی از همدیگر متمایز سازند (20). تعداد مکانها از سه برای آغازگرهای 443 و 459 تا 12 برای آغازگرهای 825 و UBC808 متغیر بود. میانگین تعداد مکانها برای آغازگرهای مورد استفاده، 6/7 مکان به ازای هر آغازگر بود. دامنه اندازه مکانها از 500 (آغازگرهای 825 و A12) تا 4500 جفت باز (آغازگر 443) متغیر بود. میزان اطلاعات چند شکل (PIC) از 65/0 تا 93/0 به ترتیب برای آغازگرهای UBC849 و 443 متغیر بود. میانگین PIC برای مکانهای مورد مطالعه 77/0 بود (جدول 2) که بیانگر کارآیی نشانگرهای ISSR در تمایز جمعیتهای یونجه می باشد. همچنین تعداد زیاد مکانهای تکثیر شده در این آزمایش نشان می­دهد که تعداد کمی از آغازگرهای ISSR با میزان اطلاعات چندشکل بالا، می­تواند تعداد زیادی نمونه و جمعیتهای مختلف یونجه را تفکیک کند. قبلا نیز تحقیقات مختلفی کارایی بالای نشانگرهای ISSR را در مطالعات مرتبط با تعیین تنوع ژنتیکی و روابط تکاملی در گونه­های گیاهی مختلف نشان داده است (4، 15 و 20). شکل یک الگوی باندی آغازگر UBC808 را روی جمعیتهای محلی اصفهان و آذربایجان اردوباد نشان می دهد.  

به منظور تعیین ارتباط بین صفات یادداشت شده و داده­های مولکولی و شناسایی نشانگرهایی که بالقوه قابلیت پیوستگی با این صفات را دارند از روش رگرسیون گام به گام استفاده شد. نتایج نشان داد که مکانهای تکثیری توسط آغازگر 425 با بیشترین تعداد صفت مرتبط است (جدول 3). این آغازگر 7 مکان را در جمعیتهای مورد مطالعه نشان داد­. کمترین تعداد نشانگر موثر برای صفات تعداد برگ (آغازگر Kourda) و وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه (UBC849) شناسایی شد. محمدی و همکاران (1389) کمترین تعداد نشانگر SSR مؤثر (یک نشانگر) را برای صفت وزن خشک برگ در یونجه گزارش نمودند (8). آغازگر 440 با تغییرات دو صفت تعداد ساقه و نسبت تعداد برگ به تعداد ساقه ارتباط داشت. این آغازگر 4 مکان را در جمعیتهای مورد مطالعه نشان داد. نشانگرهای مرتبط با دو صفت وزن خشک کل و وزن خشک برگ یکسان بودند (UBC812، UBC849، A13 و 425). محمدی و همکاران (1389) همبستگی مثبت و معنی داری را بین این دو صفت گزارش نمودند (8). شناسایی نشانگرهای مشترک برای برخی صفات در این آزمایش می­تواند ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی مکانهای مربوطه باشد (3، 6 و 17).  بیشترین تعداد نشانگر مثبت برای صفات میزان کلروفیل و تعداد ساقه شناسایی شد تعدادی از نشانگرهای مؤثر در این دو صفت نیز یکسان بود. بیشترین تغییرات مربوط به صفت میزان کلروفیل (82 درصد) توسط آغازگرهای 425، 456، 848، A12، UBC808، UBC812 و UBC849 تبیین شد، در حالی که آغازگرهای 425 و UBC808 فقط 15 درصد از تغییرات مربوط به صفت وزن تر برگ را تبیین کردند. عزیزی و همکاران (1390) با استفاده از تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) و تجزیه کلاستر گزارش نمودند که نشانگرهای تولیدی توسط آغازگرهای ISSR مورد استفاده در این مطالعه همبستگی کمتری با همدیگر دارند و قادرند جمعیت­های مختلف یونجه را متمایز سازند (4). بنابراین می­توان گفت نشانگرهای مورد بررسی توزیع یکنواختی در ژنوم یونجه­های زراعی مورد مطالعه دارند و شاید این مورد دلیلی بر پیوستگی تعداد بیشتری از نشانگرهای ISSR تولیدی در این مطالعه با صفات زراعی مورد مطالعه باشد. توالی­یابی نشانگرهای تولیدی توسط آغازگرهای دارای R2 بالا و مقایسه آنها با توالیهای موجود در بانکهای اطلاعاتی به اطمینان استفاده از آنها در برنامه­های انتخاب به کمک نشانگر و همسانه­سازی ژن بر اساس نقشه می­افزاید. محمدی و همکاران (1389) با استفاده از نشانگرهای SSR و رگرسیون گام به گام 17 نشانگر را در یونجه شناسایی نمودند که رابطه معنی­داری با حداقل یکی از 11 صفت مورفولوژیک مطالعه شده نشان دادند (8). رشیدی و همکاران (1387) با استفاده از نشانگرهای SSAP، 32 نشانگر را در گندم شناسایی نمودند که حداقل با یکی از صفات زراعی مورد بررسی رابطه معنی­داری داشت (2). اسکات و همکاران (2005) از نشانگرهای AFLP برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مهم زراعی در چاودار استفاده کردند. آنها 3 نشانگر پیوسته با صفت تاریخ خوشه­دهی را شناسایی نمودند که با مکانهای کنترل کننده این صفت در کروموزوم 7 پیوستگی نشان دادند و گزارش نمودند که نشانگرهای AFLP و رگرسیون گام به گام برای شناسایی نشانگرهای آگاهی بخش برای صفات زراعی مفید می­باشند (22). عبدالهی مندولکانی و همکاران (1389) برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط با صفات مورفولوژیک در بادام زمینی از تجزیه ارتباط با استفاده از نشانگرهای SSR استفاده نمودند و بیان کردند که این روش برای شناسایی مکانهای آگاهی بخش مرتبط با صفات مورفولوژیک مفید و مطمئن بوده و نشانگرهای مؤثر حاصل از این مطالعات می­تواند در برنامه­های گزینش به کمک نشانگر و تهیه جمعیتهای نقشه­یابی استفاده شوند (3). نتایج مطالعه حاضر و تحقیقات یاد شده نشان می­دهد که چنانچه از آغازگرهای بیشتری استفاده شود می­توان به شناسایی نشانگرهایی که دارای همبستگی بالا با صفات مرتبط با عملکرد و اجزای عملکرد باشند امید داشت و از آنها در پژوهشهای دیگر استفاده نمود. البته لازم است نشانگرهای شناسایی شده در چنین مطالعاتی در جمعیتهای بزرگ و همچنین در جمعیتهای در حال تفرق مورد آزمون قرار گیرد تا از پیوستگی آنها با صفات مربوطه اطمینان به عمل آید و بدین ترتیب کارآیی استفاده از این نشانگرها در برنامه­های اصلاحی افزایش یابد. همچنین با توجه به اینکه اکثر نشانگرهای تولیدی توسط آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق بر روی صفات مورد مطالعه مؤثر بودند بنابراین احتمال دارد بتوان از این آغازگرهای ISSR در برنامه­های اصلاحی یونجه برای شناسایی والدین مناسب برای تهیه جمعیتهای نقشه­یابی و تولید ارقام هیبرید استفاده کرد.

سپاسگزاری

بدین وسیله نگارندگان مراتب تقدیر و تشکر خود را از دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه و پژوهشکده بیوتکنولوژی دانشگاه ارومیه که امکانات لازم را برای انجام این تحقیق فراهم نمودند، اعلام می­نمایند.

1. بهار، م.، قبادی، س.، عرفانی مقدم، و.، یامچی، ا.، طالبی بداف، م.، کابلی، م. م. و مختارزاده، ع. ا. (1385). ارزیابی تنوع ژنتیکی جمعیتهای بومی یونجه ایران با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره ESTs. مجله علوم و فنون کشاورزی و منابع طبیعی، 2: 141-153.

 2. رشیدی منفرد، س.، مردی، م.، حسین­زاده، ع.، نقوی، م. (1387). تجزیه ارتباطی بین صفات زراعی مهم و نشانگرهای رتروترانسپوزونی SSAP در نمونه­های گندم دوروم. مجله ژنتیک نوین، 3 (2): 29-36.

3. عبدالهی مندولکانی، ب.، اعلمی، ع.، اصفهانی، م. (1389). تجزیه ارتباط برای صفات مورفولوژیک در بادام زمینی (Arachis hypogea L.) با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره. مجله علوم زراعی ایران، 12(4):510-519.

4. عزیزی، ح.، برنوسی، ا.، عبدالهی مندولکانی، ب.، درویش زاده، ر. (1390). مطالعه ساختار و تنوع ژنتیکی جمعیت­های یونجه زراعی (Medicago sativa L.) با استفاده از نشانگرهای ISSR. مجله ژنتیک نوین، 6 (4): 61-69.

5. فابریکی اورنگ، ص.، شمس بخش، م.، جلالی جواران، م.، احمدی، ج. (1388). بررسی تنوع ژنتیکی توده­های بومی خربزه ایرانی (Cucumis melo L.) با استفاده از نشانگرهای ملکولی بین ریزماهواره­ای (ISSR). مجله زیست شناسی ایران، 22 (2): 271-281.

6. فتوکیان، م. ح.، ناجی، ا. م.، احمدی، ج.، امیری اوغان، ح.، سادات نوری، س. ا.، محمدی نژاد، ق.، محدثی، ع.، آگاهی، ک. (1389). شناسایی مکان­های ژنی ارتفاع بوته، تعداد پنجه، طول و عرض برگ پرچم در برنج با استفاده از نشانگرهای میکروستلایت. مجله زیست شناسی ایران، 23 (4): 488-497.

7. فرشادفر، م.، فارغی، ش.، فرشادفر، ع.، جعفری، ع. ا. (1387). ارزیابی تنوع ژنتیکی یونجه با استفاده از شاخص­های ریخت شناسی و شیمیایی. فصلنامه علمی-پژوهشی تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، 16: 1-13.

8. محمدی، ر.، نقوی، م. ر.، معالی امیری، ر.، رضایی، م. (1389). شناسایی نشانگرهای آگاهی بخش ریزماهواره در بخشی از یونجه­های زراعی (Medicago sativa L.) ایران. مجله ژنتیک نوین، 5 (2): 57-66.

 

9. Barcaccia, G., Albertin, E., Tavoletti, S., Falcinelli, M. And Veronesi, F. (1999). AFLP fingerprinting in Medicago spp: its development and application in linkage mapping. Plant Breeding, 118: 335-341.

10. Barcaccia, G., Tosti, N., Falistocco, E. And Veronesi, F. (1995) Cytological, morphological and molecular analysis of controlled progenies from meiotic mutants of alfalfa producing unreduced gametes. Theoretical and Applied Genetics, 91: 1008-1015.

11. Diwan, N., Bhagwat, A.A., Bauchan, G.B. And Cregan, P.B. (1997) Simple sequence repeat DNA markers in alfalfa and perennial and annual medicago species. Genome, 40: 887-895.

12. Doyle, J.J. And Doyle, J.L. (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 13-15.

13. Gebhardt, C., Ballvora, A., Walkemeier, B., Oberhagemann, P. And Schuler, K. (2004) Assessing genetic potential in germplasm collections of crop plants by marker-trait association: a case study for potatoes with quantitative variation of resistance to late blight and maturity type. Molecular Breeding, 13: 93–102.

14. Ivandic, V., Hackett, C.A., Nevo, E., Keith, R., Thomas, W.T.B. And Forster, B.P. (2002) Analysis of simple sequence repeats (SSRs) in wild barley from the Fertile Crescent: associations with ecology, geography and flowering time. Plant Molecular Biology, 48: 511–527.

15. Jabbarzadeh, Z., khosh-khui, M., Salehi, H. And Saberivand, A. (2010) Inter simple sequence repeat (ISSR) markers as reproducible and specific tools for genetic analysis of rose species. African Journal of Biotechnology, 37: 6091-6095.

16. Julier, B., Huyghe, C.H. And Ecall, C.H. (2000) Within and among cultivar genetic variation in alfalfa: forage quality, morphology and yield. Crop Science, 4:362-365.

17. Jun, T.H., Van, K., Kim, M.Y., Lee, S.H. And Walker, D.R. (2008) Association analysis using SSR markers to find QTL for seed protein content in soybean. Euphytica, 62: 179–191.

18. Khodarahmi, M., Mohammadi, S.A. And Jalal-kamali, M.R. (2009) Identification of informative marker for yellow rust resistant related cultivars. The 6th national biotechnology congress of Iran. 13-15 Aug, Milad tower conference hall, Tehran, Iran.

19. Levesque, R. (2007) SPSS programming and data management: A guide for SPSS and SAS Users, Fourth Edition. SPSS Inc. Chicago.

20. Li, Q., Liu, Q.C., Zhai, H., Ma, D.F., Wang, X., Li, X.Q. And Wang, Y.P. (2008) Genetic diversity in main parents of sweet potato in china as revealed by ISSR Markers. Acta Agronomica Sinicia, 34 (6): 972-977.

21. Mengoni, A., Gori, A. And Bazzicalupo, M. (2000) Use of RAPD and microsatellite (SSR) variation to assess genetic relationships among populations of tetraploid alfalfa, Medicago sativa. Plant Breeding, 119: 113-117.

22. Skot, L., Humphreys, M.O., Armstead, I.P., Heywood, S., Skot, K.P., Sanderson, R., Thomas, I.D., Chorlton, K.H. And Sackville-Hamilton, N.R. (2005) An association mapping approach to identify flowering time genes in natural populations of Lolium perenne L. Molecular Breeding, 15: 233-245.

23. Veronesi, F., Charles, B. And Huyghe, C. (2010) Alfalfa. Springer Sci. 395-436.

24. Virk, P.S., Ford-Lioyd, B.V., Jackson, M.T., Pooni, H.S., Clemeno, T.P. And Newbury, H.J. (1996) Marker-assisted prediction of agronomic traits using diverse rice germplasm. Third International Rice Genetics Symposium, Manilla, Philippines. 307-316.

25. Yeh, F.C., Boyle, T., Rongcai, Y., Ye, Z. And Xian, J.M. (1999) POPGENE version 3.1. http://www.ualberta.ca/- fyeh/fyeh.

26. Zaccardelli, M., Gnocchi, S., Carelli, M. And Scotti, C. (2003) Variation among and within Italian alfalfa ecotypes by means of bio-agronomic characters and amplified fragment length polymorphism analyses. Plant Breeding, 122: 61-65.

27. Zietkiewicz, E., Rafalski, A., Labuda, D. (1994) Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase reaction amplification. Genomics, 20:176-183.