نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

پیشبر Rd29A به وسیله واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی از گیاه Arabidopsis thaliana همسانه­سازی شد. ناقل دوگانه بیانی pBI-RD-GUS با اتصال توالی RD29A به ژن gus ساخته شد. سازه اخیر به همراه pBI121 با استفاده از Agrobacterium tumefaciens برای تراریختی گیاه توتون مورد استفاده قرار گرفت. ارزیابیهای مولکولی گیاهان تراریخته توتون حضور و فعالیت ژن gus تحت پیشبرهای Rd29A و CamV35S را تأیید نمود. تأثیر تیمارهای مختلف تنشی مانند شوری (NaCl)، خشکی (PEG) و آبسزیک اسید (ABA) نشان داد که این پیشبر Rd29A برخلاف پیشبر همیشه فعال CaMV35S تنها تحت اثر تنشهای غیرزیستی القاء می­شود. القاء پذیری پیشبر Rd29A توسط ABA نشان دهنده نقش سیگنالی این ماده در مسیر ترارسانی علامتی تنشهای غیرزیستی می­باشد. با توجه به اینکه بیان دائمی ژنهای مقاومت به تنش تحت کنترل پیشبر CaMV35S در بسیاری از موارد مانع رشد طبیعی گیاهان تراریخته می­شود، بنابراین پیشبر القایی Rd29A می­تواند جایگزینی مناسب برای تراریختی گیاهان متحمل به تنش باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Cloning and functional analysis of inducible promoter Rd29A in transgenic tobacco plants

چکیده [English]

Stress inducible promoters are key elements in development of transgenic abiotic resistant plants. Abiotic stress inducible promoter Rd29A was cloned by Polymerase chain reaction (PCR) from Arabidopsis thaliana genomic DNA. pBI-RD-GUS binary vector constructed by replacing CaMV35S promoter of vector pBI121 by Rd29A. The new recombinant vector pBI-RD-GUS as well as pBI121 was transferred to tobacco by Agrobacterium tumefaciencs system. PCR and GUS histochemical assay of transgenic tobacco plants confirmed transformation events. Stress induciblity of the promoters studied by histochemical GUS assay of transgenic leaves under stress conditions. The assay showed that promoter Rd29A, in contrast of CaMV35S, induced by dehydration, NaCl and ABA. Rd29A induction by ABA confirmed the signaling role of it in stress signal transduction pathways. Therefore, if abiotic stress resistance genes are driven by rd29A in the transformed plant, the disadvantage, like small figure, low growth rate etc, to transgenic plant due to the over-expression of exogenous genes can be greatly reduced.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Abiotic stress
  • Inducible Promoter
  • Nicotiana tabbacum
  • Rd29A
  • Transformation

همسانه­سازی و ارزیابی فعالیت پیشبر القایی Rd29A در گیاهان تراریخت  توتون

حسن رهنما* و حقیقت وکیلیان

کرج، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران

تاریخ دریافت: 3/11/90               تاریخ پذیرش: 15/5/91 

چکیده

پیشبر Rd29A به وسیله واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی از گیاه Arabidopsis thaliana همسانه­سازی شد. ناقل دوگانه بیانی pBI-RD-GUS با اتصال توالی RD29A به ژن gus ساخته شد. سازه اخیر به همراه pBI121 با استفاده از Agrobacterium tumefaciens برای تراریختی گیاه توتون مورد استفاده قرار گرفت. ارزیابیهای مولکولی گیاهان تراریخته توتون حضور و فعالیت ژن gus تحت پیشبرهای Rd29A و CamV35S را تأیید نمود. تأثیر تیمارهای مختلف تنشی مانند شوری (NaCl)، خشکی (PEG) و آبسزیک اسید (ABA) نشان داد که این پیشبر Rd29A برخلاف پیشبر همیشه فعال CaMV35S تنها تحت اثر تنشهای غیرزیستی القاء می­شود. القاء پذیری پیشبر Rd29A توسط ABA نشان دهنده نقش سیگنالی این ماده در مسیر ترارسانی علامتی تنشهای غیرزیستی می­باشد. با توجه به اینکه بیان دائمی ژنهای مقاومت به تنش تحت کنترل پیشبر CaMV35S در بسیاری از موارد مانع رشد طبیعی گیاهان تراریخته می­شود، بنابراین پیشبر القایی Rd29A می­تواند جایگزینی مناسب برای تراریختی گیاهان متحمل به تنش باشد.

واژه های کلیدی: پیشبر القایی، تراریختی، تنش غیر زیستی، توتون،Rd29A

* نویسنده مسئول، تلفن: 2703536-026 ، پست الکترونیکی:  hrahnama@abrii.ac.ir

مقدمه

 

خشکی، شوری و دمای پایین سه عامل محیطی مهمی هستند که رشد و نمو و تولید گیاه را محدود می­نماید. به طور کلی تنشهای غیرزیستی مجموعه­ای از پاسخهای بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و نموی را در گیاه القاء می­نمایند که باعث کاهش خسارت به گیاه می­شوند (1، 2، 10).

با پیشرفت زیست­فناوری و به ویژه مهندسی ژنتیک، امکان افزایش مقاومت گیاهان به تنشهای غیرزیستی چشم اندازی امید بخش به همراه داشته است. یکی از جنبه­های مهم فناوری تراریختی گیاهان بیان کنترل شده تراژنها می­باشد. پیشبرها بخشی از توالی DNA در بالادست ژنها هستند که نقش مستقیمی در کارآیی و چگونگی بیان آنها دارند. پیشبرها را می­توان به طور کلی در سه دسته دائمی، القایی و اختصاصی بافت قرار داد.

از جمله مهم ترین پیشبرهایی که برای تولید گیاهان تراریخته متحمل به تنشهای غیرزیستی استفاده شده است می­توان به پیشبر CaMV35S، یوبی­کوتین1، و اکتین اشاره نمود. این پیشبرها همیشه فعال بوده و در تمامی بافتها و شرایط با قدرت بالایی باعث بیان ژن می­شوند. به عنوان مثال، در مواردی که ضروری است میزان بیان تراژن بالا باشد (مانند LEA3A) استفاده از یک پیشبر قوی مانند CaMV35S اجتناب ناپذیر خواهد بود.

با این وجود، تولید دائمی مولکولهایی مانند ترهالوز (17) یا پلی آمین­ها (4) باعث رشد غیرطبیعی گیاه در شرایط طبیعی می­شود. همچنین، تولید این دسته از ترکیبات می تواند از نظر متابولیکی برای گیاه هزینه­بر و گران باشد. در چنین شرایطی، استفاده از یک پیشبر القاء شونده با تنش بسیار مطلوب خواهد بود. مطالعات انجام شده در گیاهان نشان داده است که ژنهای متعددی با این تنشها ارتباط دارند. برخی از این ژنها تحت شرایط تنشی القاء می شوند. بنابراین استفاده از پیشبر این ژنها می­­تواند در تنظیم بیان ژن در گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گیرد. آنچه مسلم است، یک پیشبر القایی ایده­آل نه تنها باید در غیاب عامل القایی هیچ گونه بیان ژنی را سبب نشود بلکه این بیان باید برگشت­پذیر و وابسته به دز هم باشد.

به منظور شناسایی عناصر فعال سیس و ترانس دخیل در بیان ژن، ناحیه تنظیم رونویسی ژنهای القاء شونده توسط سرما و خشکی مورد بررسی قرار گرفته است (19). بیشتر پیشبرهای القاء شونده توسط تنش دارای یک عنصر فعال سیس اختصاصی تنش هستند که توسط یک عامل رونویسی مناسب شناسایی می­شود. برای مثال، rd29A و rd29B از جمله ژنهای حساس به تنش هستند اما تحت شرایط تنشی به صورت محتلفی القاء می­شوند. پیشبر Rd29A شامل دو عنصر DRE و ABRE است. خشکی، شوری بالا و دمای پایین باعث القای این پیشبر می­شود (21). در حالی که پیشبر Rd29B تنها دارای عنصر ABRE بوده و القای آن وابسته به هورمون ABA می­باشد. فرابیان عامل رونویسی DREB1A تحت کنترل پیشبر القایی Rd29A نسبت به پیشبر CaMV35S باعث شد که گیاه رشد و فنوتیپ ظاهری بهتری داشته باشد (10).  

پیشبر القایی Rd29A نه تنها در Arabidopsis thaliana، توتون و گندم مورد مطالعه قرار گرفته است (7، 20) بلکه به صورت متصل به ژن گزارشگر gus به سیب زمینی هم منتقل شده است (24). در این پژوهش، فعالیت القایی پیشبر Rd29A پس از همسانه­سازی از گیاه آرابیدوپسیس در گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفته است. 

مواد و روشها

ساخت ناقل پلاسمید pBI-RD-GUS : توالی DNA پیشبر Rd29A از بانک ژن (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi ) و با شماره دسترسی Ay577523 مربوط به گیاه آرابیدوپسیس به دست آمد. براساس این توالی آغازگرهای اختصاصی این پیشبر (F-Rd: 5´-AAG CTT GCC ATA GAG CAT TTC AA-3´  و R-Rd: 5´-TCC AGA TTC CAA AGA TTT TTC T-3´) برای تکثیر قطعه ای به طول 910 جفت باز طراحی و ساخته شد. برای استخراج DNA ژنومی به روش دلاپورتا (6) از برگهای گیاه آرابیدوپسیس استفاده شد. از DNA استخراج شده به عنوان الگو جهت جداسازی پیشبر Rd29A به وسیله واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی استفاده شد. برای انجام PCR از دمای 94 درجه سانتی گراد برای واسرشت­سازی اولیه به مدت 4 دقیقه استفاده گردید. در ادامه 35 چرخه با شرایط زیر انتخاب شد: واسرشت­سازی یک دقیقه در دمای 94 درجه سانتی گراد؛ اتصال یک دقیقه در دمای 53 درجه سانتی گراد و بسط دو دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد؛ در پایان 4 دقیقه اضافه برای بسط نهایی در 72 درجه سانتی گراد در نظر گرفته شد. 

پس از تکثیر، همسانه­سازی پیشبر Rd29Aً در ناقل T/A (ناقل pTZ57R/T) (InsTAcloneTM PCR Cloning Kit# K1214, Fermentas) صورت گرفت. به منظور همسانه سازی پیشبر Rd29A در پلاسمید pBI121، ابتدا با استفاده از آنزیمهای برشی XbaI و HindIII پیشبر Rd29A از ناقل کلونینگ جدا شده و جایگزین پیشبر CaMV35S در بالادست ژن gus پلاسمید pBI121 قرار گفت (18). جهت تأیید الحاق پیشبر در پلاسمید pBI121 آزمون­ PCR با آغازگرهای اختصاصی Rd29A و هضم آنزیمی توسط آنزیمهای برشی XbaI وHindIII  انجام شد. پس از تأیید نهایی سازه نوترکیب حاصل که pBI-RD-GUS نامگذاری شد (شکل 1)، انتقال این پلاسمید به باکتری Agrobacterium tumefaciens انجام گرفت. سلولهای مستعد سویه AGLO1 باکتری A. tumefaciens به روش ذوب و انجماد تراریخت گردیدند (18) و در محیط کشت جامد حاوی کانامایسین (50 mg/l) و ریفامپسین (75 mg/l) در دمای 28 درجه سانتی گراد به مدت 2 تا 3 روز کلنیها ظاهر شدند. تأیید تراریختی اگروباکتریوم با استفاده از آزمونهای PCR با آغازگرهای اختصاصی Rd29A انجام گردید. از اگروباکتریوم حاوی پلاسمید pBI121 به عنوان کنترل در تراریختی استفاده شد.

تراریختی گیاه توتون : جهت ارزیابی کارآیی پیشبر Rd29A کاست ژنی pBI-RD-GUS برای تراریختی گیاه توتون (رقم Xanti) مورد استفاده قرار گرفت. به منظور مقایسه پیشبر القایی Rd29A با پیشبر دائمی CaMV35S از ناقل دوگانه pBI121 به عنوان کنترل استفاده شد. تراریختی گیاه توتون با روش Horch و همکاران (8) انجام شد. بدین منظور قطعات جداکشت برگی گیاه توتون با کشت سوسپانسیون سلولی شبانه سویه های اگروباکتریومی حاوی پلاسمیدهای pBI-RD-GUS و pBI121 آلوده شد. قطعات جداکشت برگی آلوده شده به محیط MS جامد (14) حاوی 2 میلی گرم/لیتر BAP، 1/0 میلی گرم در لیتر NAA، 30 گرم/لیتر ساکارز کشت شد. بعد از 48 ساعت هم کشتی نمونه ها به محیط کشت MS حاوی هورمونهای فوق و عامل گزینش گر کانامایسین 100 میلی گرم/ لیتر و آنتی بیوتیک سفوتاکسیم 250 میلی گرم/ لیتر (برای حذف آلودگی اگروباکتریومی) منتقل شدند. نمونه­ها در شرایط نوری 4000 لوکس، دمای 25 درجه سانتی گراد و دوره نوری 16 ساعت به مدت 3 هفته قرار گرفتند. پس از ظهور اندامهای هوایی، ساقه­هایی که به اندازه کافی رشد کرده بودند به محیط ریشه­زایی شامل محیط 1/2 MS به همراه 2 میلی­گرم در لیتر اندول بوتیریک اسید (IBA) و آنتی­بیوتیکهای کانامایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند.

نمونه‌های ریشه­دار شده در محیط حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین به گلدان (با ترکیب خاکی ماسه، پرلیت، پیت و ورمیکولیت به نسبتهای 40 درصد، 40 درصد،  5 درصد و 15 درصد) منتقل شدند.

آنالیز مولکولی گیاهان تراریخته: آنالیز PCR: برای اثبات حضور ژنهای منتقل شده به گیاه توتون پس از استخراج DNA از گیاهان (18) از روش PCR به کمک آغازگرهای اختصاصی پیشبر Rd29A (قبلا ذکر شد)، ژنهای gus (F-gus: 5´-GGT GGG AAA GCG AGA CGA-3´ وR-gus: 5´-ACC TAA GGC CGT ATC AAT-3´) و nptII (F-nptII:5´-GAA CAA GAT GGA TTG CAC GC-3´ و R-nptII:5´-GAA GAA CTC GTC AAG AAG GC-3´) استفاده شد. انجام PCR در همه نمونه­ها در شرایط دمای 94 درجه سانتی گراد برای واسرشت­سازی اولیه به مدت 4 دقیقه، و 35 چرخه شامل مرحله واسرشت­سازی یک دقیقه در دمای 94 درجه سانتی گراد، مرحله اتصال یک دقیقه در دمای 60 درجه سانتی گراد و مرحله بسط یک دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد و در پایان 4 دقیقه اضافه برای بسط نهایی در 72 درجه سانتی گراد در نظر گرفته شد. در نهایت نمونه­های تکثیر شده بر روی ژل آگارز الکتروفورز شده و آنالیز باندها پس از عکسبرداری انجام شد.

روش ارزیابی بیان ژن gus در گیاهان توتون تحت شرایط تنش: به منظور بررسی بیان ژن gus با استفاده از پیشبر القایی Rd29A و همچنین پیشبر دائمی CaMV35S و نقش این پیشبرها در شرایط مختلف تنشی، گیاهان تراریخته توتون حاوی سازه­های ژنی Rd29A-GUS و-GUS CaMV35S تحت تیمارهای تنشی مختلف قرار گرفتند. پس از انجام تیمارهای مختلف نمونه­های برگی به منظور ارزیابی هیستوشیمیایی ژن gus در تیوبهای حاوی محلول رنگ­آمیزی X-Gluc برای 38-36 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده گرفته و سپس در الکل 70 درصد  شسته شدند (9).

 

 

 


 

شکل 1-  سازه نوترکیب pBI-RD-GUS مورد استفاده در تراریختی گیاه توتون

 


تنش شوری NaCl : غلظتهای مختلف از) NaCl صفر، 100، 200و 300)  mMدر محیط پایه MS تهیه گردید و قسمتی از بافت برگی گیاه تراریخته و شاهد به مدت 6 ساعت در این محلول جهت اعمال تیمار شوری در دمای اتاق غوطه‌ور گردید. با آزمون هیستوشیمیایی GUS بیان ژن gus مورد بررسی قرار گرفت.

تیمار تنش خشکی PEG)): تیمارهای PEG (10، 20 و 30 درصد) در محیط پایه MS تهیه گردید و قسمتی از بافت برگی گیاهان تراریخته و شاهد به مدت 6 ساعت در این محلول جهت اعمال تیمار خشکی در دمای اتاق غوطه‌ور گردید. از آزمون هیستوشیمیایی GUS برای بررسی القاء پذیری پیشبرها استفاده شد.

تنش ABA : محلول پایه‌ای از محیط MS که حاوی 100 میکرومول M)µ ) ABA بود تهیه گردید سپس قطعات تازه برگی از گیاهان تراریخته با ژن Rd29A-GUS و CaMV35S-GUS در این محلول به مدت 6 ساعت غوطه­ور گردیده و سپس جهت بررسی القاء پذیری پیشبر آزمون هیستوشیمیایی GUS انجام شد.

نتایج

ساخت حامل پلاسمیدی pBI-RD-GUS : پیشبر Rd29A از ژنوم گیاه آرابیدوپسیس با استفاده از روش PCR جداسازی گردیده و در نهایت جایگزین پیشبر CaMV35S در ناقل دوگانه pBI121 وارد شد (شکل 1). با استفاده از آنالیزهای مختلف از جمله هضم آنزیمی با آنزیمهای HindIII - XbaI (جهت جداسازی پیشبر Rd29A) و  XbaI-EcoRI (جهت جداسازی ژن gus)، حضور پیشبر و ژن gus در سازه جدید نوترکیب pBI-RD-GUS تأیید شد (شکل 1 و 2).

 

 

 

 

 


شکل 2: همسانه­سازی و تأیید سازه ژنی pBI-RD-GUS. الف- تکثیر پیشبر 910 جفت بازی Rd29A از آرابیدوپسیس (1- نشانگر وزن مولکولی 1 kb ladder، 2-6 : قطعات تکثیرشده حاصل از چند محصول PCR). ب- هضم ناقل نوترکیب pBI-RD-GUS با استفاده از آنزیمهای محدود کننده (1- نشانگر وزن مولکولی 1 kb ladder، 2- پیشبر Rd29A جدا شده با دو آنزیم HindIII-XbaI، 3- ژن gus جدا شده با دو آنزیم XbaI-EcoRI).

تولید گیاهان تراریخته توتون: گیاه توتون به عنوان گیاه مدل با استفاده از آگروباکتریوم سویه AGLO1 حاوی وکتور pBI121 وpBI-RD-GUS تلقیح شد. پس از تلقیح ریزنمونه‌ها جهت باززایی به محیط MS حاوی هورمون‌های باززایی و عامل انتخابگر کانامایسین منتقل شدند (شکل 3- الف). نمونه‌های باززا شده پس از ریشه‌زایی در محیط ریشه‌زایی حاوی کانامایسین (شکل 3- ب) به گلدان منتقل شدند (شکل 3- ج).

 

 

 

 

 

 


شکل 3- مراحل تولید گیاهان تراریخت توتون. الف- مرحله باززایی در محیط انتخابی ب- مرحله ریشه­زایی در محیط حاوی کانامایسین ج- مرحله انتقال به گلدان

 

 
   

 

 

 

 

 


شکل 4- آزمون مولکولی گیاهان توتون تراریخت احتمالی با روش PCR. الف- تأیید حضور ژن gus در گیاهان تراریخت (1- نشانگر وزن مولکولی، 2- کنترل منفی (آب)، 3- کنترل منفی (گیاه غیرتراریخت)، 4- کنترل مثبت (پلاسمید) ، 9-5 گیاه تراریخت احتمالی). ب- تأیید حضور ژن nptII (1- کنترل منفی (آب)، 2- کنترل مثبت (پلاسمید)، 3- کنترل منفی (گیاه غیرتراریخت)، 8-4- گیاهان تراریخت احتمالی، 9- نشانگر وزن مولکولی). ج- تأیید حضور پیشبر Rd29A (1- کنترل منفی (آب)، 2- کنترل منفی (گیاه تراریخت)، 3- کنترل مثبت (پلاسمید)، 6-4- گیاهان تراریخت احتمالی، 7- نشانگر وزن مولکولی 1 kb شرکت Roche آلمان)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 5- اثر تیمارهای شوری (NaCl) بر بیان ژن gus تحت کنترل پیشبرهای مختلف

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 6- اثر تیمارهای مختلف خشکی (PEG) بر نمونه­های برگی گیاهان تراریخت توتون

 
   

 

 

 

 

 

 

 


شکل 7- اثر تیمار ABA بر بیان ژن gus تحت کنترل پیشبرهای مختلف. تأثیر تیمار 100 میکرومولار ABA در گیاهان تراریخته حاوی پیشبر Rd29A (الف) و پیشبر CaMV35S (ب).


آنالیز مولکولی گیاهان تراریخت توتون: انجام آنالیزهای مولکولی بر روی گیاهان تراریخت توتون حاوی سازه­های ژنی RD-GUS و CaMV35S-GUS با استفاده از روش PCR و ظهور قطعاتی به طول 480 و 500 جفت باز به ترتیب حاکی از حضور ژنهای gus و nptII در تمامی لاینهای تراریخت بود (شکل 4- الف و ب). بررسی حضور پیشبر Rd29A در گیاهان تراریخت حاوی سازه Rd29A-GUS با استفاده از روش PCR و تولید قطعه ای به طول 910 جفت باز هم نشان داد که این پیشبر در گیاهان تراریخته مورد نظر وجود دارد (شکل 4- ج)

ارزیابی عملکر پیشبرها تحت تیمارهای تنشی: به منظور بررسی بیان ژن gus تحت پیشبر القایی Rd29A و همچنین پیشبر CaMV35S در گیاهان تراریخت توتون، این گیاهان تحت تیمارهای تنشی قرار گرفته و بیان ژن gus در آنها مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی تأثیر غلظتهای مختلف) NaCl 0، 100، 200و 300 میلی مولار) در گیاهان تراریخت و شاهد نشان داد که با افزایش میزان NaCl میزان بیان ژن gus در بافتهای حاوی Rd29A-GUS، افزایش یافت که نشان دهنده این موضوع می‌باشد که پیشبر Rd29A تحت شرایط تیمار شوری باعث افزایش بیان ژن gus یا القای بیشتر آن می‌شود و اینکه در گیاهان تراریخته GUS-CaMV35S با افزایش غلظت NaCl تغییری در میزان بیان ژن gus صورت نگرفت که نشان می­دهد پیشبر  CaMV35S تحت تیمار شوری در افزایش القاء و بیان ژن gus  نقشی ندارد (شکل 5).

همچنین آزمون هیستوشیمیایی GUS نشان داد که با افزایش غلظت PEG بعد از 6 ساعت تیمار در دمای 37 درجه سانتی گراد میزان بیان ژن gus (میزان رنگ‌پذیری) در بافتهایی که حاوی Rd29A-GUS بودند افزایش قابل ملاحظه‌ای دیده شد. در حالی که در گیاهان حاوی ژن CaMV35S-GUS با افزایش درصد PEG تغییر چندانی در بیان ژن gus اتفاق نمی‌افتد. می‌توان نتیجه گرفت تیمار خشکی یکی از عوامل تنشی مهم است که با القای پیشبر Rd29A  سبب بیان بیشتر ژن gus می‌شود (شکل 6).

تنش ABA : آبسزیک اسید به عنوان یک علامت در مسیر پیام رسانی خشکی عمل می کند (23). نتایج حاصل از بررسی تأثیر ABA بر القاپذیری و بیان ژن gus نشان داد که ABA به عنوان یک عامل باعث القای پیشبر Rd29A و در نتیجه بیان بیشتر ژن gus می‌شود. درصورتی که در بیان ژن gus تحت پیشبر CaMV35S تغییر چندانی ندارد (شکل 7).

بحث

پیشبر ژن یکی از مهم ترین عناصر تنظیمی در سطح رونویسی است که بیان زمانی و مکانی ژن را تحت کنترل خود دارد. این عناصر از عوامل کلیدی در بیان ژنهای خارجی در گیاهان تراریخت محسوب می­شوند (21و 25). تحقیقات زیادی در زمینه تنظیم بیان ژن در گیاهان عالی بر روی ژنهای تنظیم شونده توسط نور، ژنهای القاء شونده توسط هورمونها و ژنهای حساس به تنش صورت گرفته است (11). در این میان پیشبر القاء شونده توسط تنشهای غیرزیستی (Rd29A) یکی از شاخص­ترین پیشبرها محسوب می­شود که توجه زیادی برای تولید گیاهان تراریخت مقاوم به تنشهای غیرزنده را به خود جلب نموده است. همان گونه که ذکر شد، در مورد بسیاری از فرآورده­های تراژنی مانند سنتز اسمولیت­ها (مانند ترهالوز، پلی آمین­ها، مانیتول، سوربیتول، گلیسین- بتایین و ...) که فشار متابولیکی و انرژیایی زیادی را به گیاه تحمیل می­کند، رشد گیاه در برخی از موارد دچار اختلال می­شود. این ترکیبات در اغلب موارد برای ارتقای تحمل گیاهان تراریخت با تنشهای غیرزیستی مورد استفاده قرار می­گیرند. بدیهی است زمانی که گیاه تحت تنش قرار ندارد سنتز این ترکیبات توسط گیاه چندان ضرورتی نخواهد داشت. القای سنتز آنها در زمان مواجه با تنش می­تواند ضمن کاهش هزینه انرژی گیاه و جلوگیری از اختلال در رشد طبیعی آن، شرایط لازم برای افزایش مقاومت به تنش را در گیاه فراهم آورد. در چنین مواردی بهتر است از یک پیشبر القایی مانند Rd29A استفاده شود (3).

در این مطالعه، همسانه­سازی و فعالیت پیشبر القایی Rd29A در گیاه توتون تراریخت مورد مطالعه قرار گرفت. وجود عناصر فعال سیس حساس به تنش یا ABA در پیشبر یکی از نشانه­های اصلی برای القاء پذیری آن تحت تنش است اما این امر لزوماً به این معنی نیست که وقتی این پیشبر به ناحیه رمزکننده یک ژن متصل می­شود باز هم عمل نماید (15). بنابراین لازم است ابتدا پیشبر همسانه­سازی شده به صورت متصل به یک ژن گزارشگر در یک گیاه مدل مورد آزمایش قرار گیرد. بدین منظور در این پژوهش پس از همسانه­سازی پیشبر Rd29A از گیاه آرابیدوپسیس، عملکرد آن در بیان القایی ژن گزارشگر gus در گیاهان تراریخت توتون مورد مطالعه قرار گرفت.

نتاج حاصل از مطالعه اخیر نشان داد که وقتی گیاهان تراریخت توتون تحت تنش شوری و خشکی قرار می­گیرند بیان ژن gus در آنها القاء می­شود. از طرف دیگر با افزایش میزان تنش، میزان بیان ژن gus هم تشدید می­گردد. در مقابل بیان ژن gus در گیاهان تراریخت توتونی که در آن از پیشبر دائمی CaMV35S برای کنترل بیان ژن استفاده شده چه در غیاب تنش و چه در حضور تنش همواره صورت می­گیرد. هرچند برای تأیید نهایی ضروری است که بیان ژن به صورت کمی بررسی شود ولی مطالعات چشمی هم نشان داد که با افزایش میزان تنش (غلظت نمک یا پلی اتیلن گلیکول) میزان بیان ژن هم افزایش می یابد. بنابراین ویژگی القاء پذیری وابسته به دز پیشبر Rd29A می­تواند اهمیت زیادی در تولید گیاهان تراریخت مقاوم به تنشهای غیرزیستی داشته باشد. نتایج حاصل از بررسی اثر تیمار هورمونی ABA بر بیان ژن gus در گیاهان تراریخت توتون نشان داد که تحت تأثیر هورمون ABA بیان ژن gus در گیاهان تراریخته حاوی پیشبر Rd29A القاء می­گردد.

همان گونه که ذکر شد ABA به عنوان یک علامت یا سیگنال در گیاهانی که تحت تنش خشکی قرار دارند عمل می­کند. نقش اصلی ABA در تنظیم بیان ژنهایی است که در داخل سلول تحت شرایط تنش اسمزی قرار می­گیرند و در نهایت باعث تنظیم شرایط اسمزی و تعادل آبی در سلولهای محافظ سلول می­شود (5).

پیشبر Rd29A حاوی حداقل دو نوع از عناصر فعال cis می­باشد که در مسیر القای ژن rd29A توسط کم­آبی، شوری بالا و دمای پایین درگیر است. یکی از این عناصر DRE است که در شرایط تنش دمای پایین شوری و خشکی عمل می­کند. پیشبر Rd29A حاوی سه موتیف  DREعملکردی است. تظاهر ژن وابسته به DREB1 به وسیله دمای پایین و تجمع پروتئینهایDREB1  در شروع القاء تظاهر ژن وابسته به DRE، rd29A نقش دارد (13). DRE هم­چنین در اولین فرصت (20 دقیقه) روی پاسخ دهی به تنش کم­آبی و شوری در rd29A تأثیر می گذارد.

پروتئینهای DREB2 تحت شرایط شوری بالا و خشکی فعال شده سپس باعث فعال شدن ژن rd29A وابسته به DRE می­شوند. ABA در این فرآیند سریع، هیچ نقشی ندارد به طوری که بیوسنتز ABA در یک ساعت اولیه کم آبی مشاهده نشده است. دیگر عنصر cis فعال ABRE می باشد. این عنصر در القای آهسته و ثانویه rd29A بعد از تجمع ABA تحت شرایط تنش کم­آبی و شوری بالا نقش ایفاء می‌کند. بیوسنتز ABA تحت شرایط تنش شوری بالا و کم آبی بعد از 2 ساعت اتفاق می‌افتد و تجمع ABA باعث القای بیان ژن rd29A می­شود (12). تظاهر ژنهای ABRE به وسیله تنشهای شوری و خشکی القاء می­شود و سپس پروتئینها AREB تجمع یافته مانند فعال کننده­های نسخه­بردار در تظاهر ژنهای rd29A وابسته به ABA عمل می‌کنند. به علاوه برهمکنش بین سیستمهای تنظیمی DREB/DRE و AREB/ABRE برای تظاهر آرام rd29A در شرایط خشک و شوری بالا و ABA خارجی ضروری می باشد. این ترکیبات عمومی ممکن است به عنوان عوامل هم­افزایشی واسطه باشند که بین تنشهای اسمزی و پاسخ به ABA عمل کنند. این مطالعات پیشنهاد می‌کند که بر همکنش DREB با AREB در تظاهر ژنهایی که با ABA القاء می­شوند در بافتهای رویشی تحت تنش نقش ایفاء می­کند (22). بنابراین با توجه به حضور عنصر ABRE در پیشبر Rd29A به نظر می­رسد تنش خشکی و شوری به احتمال زیاد با استفاده از این سیگنال در القای پیشبر عمل می­کنند.

در آزمایشهای انجام شده توسط Xiong و همکاران (22) تأثیر همزمان تنشهای غیرزیستی بر روی بیان ژن luc مورد بررسی قرار گرفت. این محققان با انتقال ژن luc تحت کنترل پیشبر Rd29A به گیاه آرابیدوپسیس مشاهده کردند که در شرایط دمای طبیعی (22 درجه سانتی­گراد) تنش اسمزی و ABA اثر هم افزایی بر بیان ژن luc دارد. همچنین، جایگزینی پیشبر CaMV35S با Rd29A در بیان ژن DREB1A نشان داد که این پیشبر ضمن اینکه اثرات منفی بر رشد گیاه را تا حد زیادی کاهش می­دهد باعث القای بیان ژن DREB1A در شرایط تنشی نیز می­شود (10، 11).   

Wu و همکاران (21) با انتقال ژن gfp تحت کنترل پیشبر Rd29A به گیاه نیشکر نشان دادند که تحت تیمار حشکی بیان ژن gfp در این گیاه القاء می­شود. جفرسون و همکاران (9) نشان دادند که بیان ژن gus تحت پیشبر CaMV35S تحت هر شرایطی القاء می‌شود که این نتیجه در طی پژوهش حاضر هم به دست آمد. Renying و همکاران (16) از ژن BADH تحت پیشبر Rd29A جهت انتقال به گیاه عنبر سائل (Liqudambar formosana L.) استفاده کردند. نتایج به دست آمده نشان دادند که ژن  BADH تحت پیشبر Rd29A در شرایط تنش شوری بیان می­شوند. همچنین در گیاهانی که با ژن BADH و پیشبر Rd29A تراریخت شدند فعالیت SOD (سوپراکسید دیسموتاز) و POD (پراکسیدازها) تحت تنش شوری افزایش پیدا می‌کند.

براساس نتایج حاصل از این پژوهش پیشبر Rd29A همسانه­سازی شده از گیاه آرابیدوپسیس تحت شرایط تنشی القاء می­شود. بنابراین،  اگر ژنهای مؤثر در تحمل به تنشهای غیرزیستی تحت کنترل این پیشبر جهت افزایش مقاومت گیاهان به این تنشها مورد استفاده قرار گیرند اثرات سوء ناشی از فرابیان دائمی ژنها را می­توان تا حد زیاد مرتفع کرد.  

  1. جعفریه یزدی ا، مجد ا، فلاحیان ف، خاور نژاد ر، برنارد ف، جاویدفر ف (1385) بررسی اثر تنش خشکی و آبسزیک اسید برونزاد بر ساختار مریستم زایشی، دانه های گرده، صفات ریخت شناسی، عملکرد و اجزای عملکرد گیاه کلزا (Brassica napus). مجله زیست شناسی ایران، جلد 19، ص 125-135.
  2. دولت آبادیان آ، مدرس ثانوی س ع م، شریفی م (1388) اثر تنش کم آبی و محلول پاشی اسید آسکوربیک بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان و برخی تغییرات بیوشیمیایی در برگ ذرت دانه ای (Zea maize L.). مجله زیست شناسی ایران، جلد 22، ص 407-422.
    1. Bhatnagar-Mathur, P., Vadez, V. and Sharma, K. K. (2008) Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects. Plant Cell Reports, 27: 411-24.
    2. Capell, T., Escobar, C., Lui, H., Burtin, H., Lepri, O. and Christou, P. (1998) Overexpression of the oat arginine decarboxylase cDNA in transgenic rice (Oryza sativa L.) affects normal development patterns in vitro and results in putrescine accumulation in transgenic plants. Theoretical and Applied Genetics, 97: 246–254.
    3. Choi, H., Hong, J., Ha, J., Kang, J. and Kim, SY. (2000) ABFs, a family of ABA-responsive element binding factors. Journal of Biological Chemistry, 275: 1723–1730.
    4. Dellaporta, S. L, Wood, J. and Hicks J. B. (1983) A plant DNA miniprepration: version II. Plant Molecular Biology Reporter, 1: 19-21.
    5. Gao, S. Q., Chen, M. and Ma, Y. Z. (2005) Activity of rd29A promoter in wheat immature embryonic calli. Acta Agronomica Sinica, 31: 150-153.
    6. Horsch, R.B., Fry, J. E., Hoffman, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Fraley, R. T. (1985) A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227:1229- 1231.
    7. Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. and Bevan, M. W. (1987) Gus fusions: ß-glucuronidase as a sensitive and versatile gene marker in higher plants. EMBO Journal, 6: 3901-3907.

 

10.  Kasuga, M., Liu, Q., Miura, S., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. (1999) Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress inducible transcription factor. Nature Biotechnology, 17: 287–291.

11.  Kasuga, M., Miura, S., Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2004) A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress inducible rd29A promoter improved drought- and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiology, 45: 346–350.

12.  Kiyosue, T., Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki, K. (1994) Cloning of cDNA for genes that are early-responsive to dehydration stress (ERDs) in Arabidopsis thaliana L.: identification of three ERDs as HSP cognate genes. Plant Mol. Biol., 25: 791-798.

13.  Liu, Q., Kasuga, M., Sakuma, Y., Abe, H., Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki, K. (1998) Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391–1406.

14.  Murashig, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plantarum 15: 473-479.

15.  Rai M., He, C. and Wu, R. (2009) Comparative functional analysis of three abiotic stress-inducible promoters in transgenic rice. Transgenic Research, 18: 787–799.

16.  Renying, Z., Guirong, Q. and Zongxiu, S. (2007) Transgene expression in Chinese sweetgum driven by the salt induced expressed promoter. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 88:101–107.

17.  Romero, C., Belles, J.M., Vaya, J.L., Serrano, R. and Culianez-Macia, F.A. (1997) Expression of the yeast trehalose-6-phosphate synthase gene in transgenic tobacco plants: pleiotropic phenotypes include drought tolerance. Planta, 201: 293–297.

18.  Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001) Rapid isolation of yeast DNA. Molecular Cloning. A laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

19.  Shinwari, Z.K. (1999) Function and regulation of genes that are induced by dehydration stress. Bioscience Agric 5: 39–47.

20.  Sun, X. H. and Chen, M. J. (2002) A Brief Account of Promoter Cloning. Acta Edulis Fungi 9: 57-62.

21.  Wu, Y., Zhou, H., Que, Y. X., Chen, R. K. and Zhang, M. Q. (2008) Cloning and identification of promoter Prd29A and its application in sugarcane drought resistance. Sugar Tech., 101: 36-41.

22.  Xiong, L., Ishitani. M. and Zhu, J. K. (1999) Interaction of osmotic stress, temperature, and abscisic acid in the regulation of gene expression in Arabidopsis. Plant Physiology, 119:205–211.

23.  Zhang, J., Jia, W., Yang J. and Ismail, A. M. (2006) Role of ABA in integrating plant responses to drought and salt stresses. Field Crops Research, 97: 111–119.

24.  Zhang, N., Si, H. J. and Wang, D. (2005) Cloning of rd29A gene promoter from Arabidopsis thaliana and its application in stress-resistance transgenic potato. Acta Agronomica Sinica, 31:159-164.

25.  Zhu, X. Y., Jing, Y., Chen, G. C., Wang, S. M. and Zhang, C. L. (2003) Solute levels and osmoregulatory enzyme activities in reed plants adapted to drought and saline habitats. Plant Growth Regulation, 41: 165-172.