نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

وجود یک سری مزایای کلیدی در باکتریوفاژ لامبدا باعث شده است که این فاژ به عنوان یک حامل ژنی ایده­آل به سلولهای یوکاریوتی مطرح شود. این مزیتها هم در ساختار و هم در بیولوژی آن نهفته است ازجمله اینکه مطالعات اخیر داشتن اجداد مشترک با ویروسهای یوکاریوتی DNA دار را نشان داده­­اند. با توجه به این واقعیات و نیز دورشته­ای بودن ژنوم آن، فاژ لامبدا می­تواند مزیت بزرگی در انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی داشته باشد. لذا با وارد کردن توالی یک ژن گزارشگر (GFP‌)، فاژ لامبدای نوترکیبی طراحی و برای انتقال ژن به سلولهای رده AGS مورد استفاده قرار گرفت. بیان ژن GFP در پی انتقال با ذرات λ-GFP‌ و همین طور کارآیی ورود این ذرات به سلولهای رده AGS ارزیابی شد.  

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Designing a phage-derived gene nanocarrier and examination of its capacity for delivering and expression of transgene in human cell line

چکیده [English]

Bacteriophage lambda comprises critical advantages that have made it as an ideal gene delivery vehicle into the eukaryotic cells. These advantages reside in both the structure and biology of the lambda phage, for example, recent investigations have revealed common ancestry for the tailed phages and eukaryotic DNA viruses. Considering these features as well as the double-stranded nature of its genome, bacteriophage lambda might comprise a great advantage for phage-mediated gene delivery into eukaryotic cells. A phage lambda-derived gene nanocarrier bearing reporter gene GFP (λ-GFP) was constructed and utilized to transfect AGS cell line. λ-GFP particle-mediated gene delivery and expression as well as its internalization by AGS cell line was investigated.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bacteriophage lambda
  • λ-GFP
  • phage-mediated gene transfer

طراحی نانوحامل­ژنی فاژی و ارزیابی توانایی آن در انتقال و بیان ژن در رده سلولی انسانی

محمد خلج­کندری، مجید صادقی­زاده* و مهرداد بهمنش

تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 3/10/89               تاریخ پذیرش: 2/12/89 

چکیده

وجود یک سری مزایای کلیدی در باکتریوفاژ لامبدا باعث شده است که این فاژ به عنوان یک حامل ژنی ایده­آل به سلولهای یوکاریوتی مطرح شود. این مزیتها هم در ساختار و هم در بیولوژی آن نهفته است ازجمله اینکه مطالعات اخیر داشتن اجداد مشترک با ویروسهای یوکاریوتی DNA دار را نشان داده­­اند. با توجه به این واقعیات و نیز دورشته­ای بودن ژنوم آن، فاژ لامبدا می­تواند مزیت بزرگی در انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی داشته باشد. لذا با وارد کردن توالی یک ژن گزارشگر (GFP‌)، فاژ لامبدای نوترکیبی طراحی و برای انتقال ژن به سلولهای رده AGS مورد استفاده قرار گرفت. بیان ژن GFP در پی انتقال با ذرات λ-GFP‌ و همین طور کارآیی ورود این ذرات به سلولهای رده AGS ارزیابی شد.  

واژه های کلیدی: باکتریوفاژ لامبدا، λ-GFP‌، انتقال ژن با واسطه فاژ

* نویسنده مسئول، تلفن: 82884409  ، پست الکترونیکی:  sadeghma@modares.ac.ir

مقدمه

 

حاملینی که در حال حاضر برای ژن­درمانی به کار می­روند در دو گروه اصلی حاملین ویروسی و حاملین غیر ویروسی قرار می­گیرند. به طور کلی حاملین ویروسی کارآیی انتقال و بیان بالا حتی تا 100 درصد را دارند با این­حال آنها نه تنها کاملاً بی­خطر و ایمن نیستند، بلکه تولید انبوه آنها هزینه بالایی می­طلبد(15). این عوامل باعث شده است علی­رغم قابلیتهای خوب آنها در انتقال و بیان ترانس­ژن، جستجو  برای یافتن حاملین ژنی مناسب بیش از پیش ادامه یابد. از طرف دیگر حاملین غیر ویروسی نسبتاً بی­خطر و ارزان می­باشند، با این­حال کارآیی ورود و انتقال آنها به سلولهای هدف بسیار پایین است.( 2، 6، 17 و 18)  فاژها مزایای زیادی دارند که باعث شده است به عنوان حاملین ژنی به سلولهای پستانداران مطرح و به عنوان جایگزینی برای حاملین ویروسی و حاملین غیر ویروسی در نظر گرفته شوند. به طور کلی این ذرات گرایشی برای ورود به سلولهای یوکاریوتی ندارند و لذا تا حد زیادی بی­خطر هستند. پوشش پروتئینی آنها از تخریب ژن مورد انتقال در لحظه ورود به سلولهای هدف ممانعت می­کند. این ویژگی در سامانه­های غیر ویروسی کمرنگ می­باشد و به همین علت DNA‌ مورد انتقال آنها در معرض تخریب توسط آنزیمهای برشگرقرار می­گیرد(15،16). از مزایای دیگر فاژها می­توان به مواردی از قبیل ارزانی تولید در حجم بالا، پایداری فیزیکی در محیطهای نامساعد، قابلیت تحمل و حمل توالیهای بزرگ، امکان هدف­گیری با استفاده از فناوری فاژنمایی (phage display) (16) و نیز روشهای اتصال شیمیایی(12)، عدم ورود به ژنوم سلولهای میزبان و در نتیجه عدم خطر از کاراندازی ژن­های دیگر(15) اشاره کرد.    

به طور کلی ویروسها سامانه­های زیستی پیچیده­ای هستند که در آنها ژنوم درون یک ساختار نانو مقیاس (میانگین10-500 نانومتر) به نام کپسید قرار گرفته اند (3 و 11). فاژها ویروسهایی هستند که منحصراً باکتریها را آلوده می­کنند. از جمله فاژهایی که برای انتفال ژن به سلولهای یوکاریوتی به کار رفته­اند می­توان به M13، T7، T4 و لامبدا اشاره کرد. بیشتر محققان M13 را برای انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی مورد استفاده قرار داده­اند در صورتی­که بعضی دیگر فاژ لامبدا را ترجیح می­دهند(20). فاژ لامبدا یک ذره با ساختار نانو­مقیاس با ژنومی حدود 48 کیلوباز است. این فاژ یک کپسید بیست­وجهی با قطر تقریبی 55 نانومتر دارد که ژنوم را احاطه کرده­است(13و20). گزارش شده است که فاژ لامبدا مزایایی نسبت به M13 دارد که می­توان به مواردی از قبیل اندازه و ویژگیهای فیزیکی ژنوم و نیز اندازه و ابعاد خود ذرات فاژ لامبدا اشاره کرد. ذرات فاژ لامبدا ابعادی مشابه با ویروسهای یوکاریوتی دارند، به گونه­ای­که مطالعات ساختاری اخیر نشان داده­اند باکتریوفاژهای دم­دار و ویروسهای یوکاریوتی که ژنوم آنها DNA‌ است دارای اجداد مشترک هستند(1). این ویژگیها می­تواند بیان ژن مورد انتقال را در مقایسه با M13 که ژنومی کوچک و تک­رشته­ای دارد و لازم است پس از ورود به سلولها به حالت دورشته­ای تبدیل شود، تسهیل ­کنند. روی­هم­رفته، این اطلاعات بیانگر آن هستند که فاژ لامبدا می­تواند یک حامل ژنی کارآ به سلولهای یوکاریوت در مقایسه با فاژ M13 باشد(20،21).

در مطالعه حاضر توالی رمزکننده پروتئین سبز فلورسانس(GFP) تحت کنترل آغازگر رونویسی ویروس سیتومگال(CMV) در ژنوم فاژ لامبدا به منظور دستیابی به سازه پایه­ای از لامبدا که حاوی کاست بیانی GFP (λ-GFP) باشد، وارد شد. این سازه دارای قابلیت بیان GFP در سلولهای پستانداران می­باشد و به عنوان چارچوب پایه­ای ارزشمندی است که می­تواند با استفاده از اتصال مولکولهای هدف­گیری مختلف با روشهای شیمیایی و فیزیکی موجود به سمت سلولهای مورد نظر هدف­گیری و ارسال شود. می­توان با اتصال لیگاندهای هدف­گیری مختلف به سطح ذرات فاژی  λ-GFP نانوحامل­ژنی هدفمند به دست آورد. برای مثال هم­اکنون اتصال مولکول هدف­گیری ترانسفرین به سطح این نانوزیست ذرات و استفاده از آنها برای بررسی کارآیی انتقال ژن GFP به سلولهای پستانداران تحت بررسی است. در این نوشتار طراحی و ساخت نانوحامل­ژنی فاژی(λ-GFP) و کارآیی آن در انتقال و بیان ژن GFP و نیز ورود این نانوحامل به سلولهای رده AGS انسانی مورد ارزیابی قرار می­گیرد.

مواد و روشها

مواد: در این پژوهش از ناقل لامبدا ZAP-CMV‌ شرکت استراتاژن (Stratagene, USA) برای ساخت سازه نوترکیب استفاده شد. این ناقل حاوی توالی فاژمیدی pCMV-Script EX می­باشد که با دارا بودن توالی آغازگر رونویسی ویروس سیتومگال (CMV) امکان رونویسی و بیان ژن کلون شده را در سلولهای پستانداران مهیا می­کند. همچنین برای تکثیر ذرات فاژی نوترکیب از باکتری XL1-Blue MRF'استفاده شد. این سویه ־RecA و حاوی اپی­زوم F' است که تولید پیلی را رمزدهی می­کند. با توجه به اینکه ناقل فاژمیدی pCMV-Script EX به ژنوتیپ supF نیازی ندارد، لذا با کارآیی بالایی در سویه XL1-Blue MRF'تکثیر می­یابد. پلاسمید pEGFP-N1 محصول شرکت Clontech آمریکا به عنوان الگو در واکنش PCR برای تکثیر توالی ژن GFP استفاده شد. آنزیمهای برشگر XhoI و EcoRI از شرکت Fermentas لیتوانی تهیه شدند. بقیه مواد همراه با شرکت سازنده آنها در قسمت روشها و در مرحله مورد استفاده در این پژوهش ذکر شده­اند.  

طراحی و ساخت سازه  λ-GFP  : برای رسیدن به سازه  λ-GFPاز ناقل فاژی لامبدای ZAP-CMV محصول شرکت استراتاژن استفاده شد. بدین منظور توالی ژن EGFP با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی با توالی رفت؛‌ 5'-GTAGAATTCCGCCACCATGGTGAGCA -3' و برگشت؛  5'-GACCTCGAGTTACTTGTACAGTTCGTCCATGC-3' که دارای جایگاههای شناسایی و برش با آنزیمهای EcoRI در پرایمر رفت و XhoI  در پرایمر برگشت (توالی خط کشیده شده) می­باشند و نیز پلاسمید pEGFP-N1 به عنوان الگو توسط PCR تکثیر شد. برای اجتناب از خطای احتمالی تکثیر، از پلیمراز LA Taq  شرکت تاکارا که دارای خاصیت تصحیح اشتباهات است استفاده شد. شرایط انجام PCR عبارت است از: واسرشت­سازی اولیه در دمای 94 درجه به مدت 3 دقیقه، تکرار 30 چرخه با واسرشت­سازی در دمای 94 درجه به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمرها در 57 درجه به ­مدت 30 ثانیه و تکثیر در دمای 72 درجه به ­مدت 45 ثانیه و بالاخره گسترش نهایی در دمای 72 درجه به ­مدت 5 دقیقه. محصولات PCR‌ پس از هضم با آنزیمهای EcoRI و XhoI، به ­وسیله کیت استخراج از ژل Gene JETTM Gel Extraction kit‌ شرکت Fermentas‌ از ژل خالص­سازی شدند. این قطعات سپس به محل مناسب خود در ناقل فاژ لامبدا ZAP-CMV ساب­کلون شدند.

اتصال قطعات حاصل از PCR با ناقل لامبدا ZAP-CMV : نسبتهای مولی یکسان از قطعات حاصل از PCR و ناقل لامبدا ZAP-CMV با 2 واحد آنزیم T4 DNA لیگاز ، 10 mM rATP و بافر در حجم نهایی 5 میکرولیتر با هم مخلوط و به مدت 16 ساعت در یخچال 4 درجه سانتی گراد انکوبه شد. واکنش اتصال در نهایت منجر به تشکیل سازه λ-GFP می­گردد که در آن توالی GFP‌ تحت کنترل آغازگر CMV قرار دارد و بنابراین قابلیت رونویسی و بیان در سلولهای پستانداران را خواهد داشت.

بسته­بندی برون­سلولی سازه  λ-GFP : 5/2 میکرولیتر از محصول واکنش اتصال که حاوی تقریباً یک میکروگرم سازه λ-GFP‌ است به یک ویال حاوی عصاره بسته­بندی (پروتئینهای بسته­بندی کننده­ فا‍ژ لامبدا) اضافه و پس از مخلوط کردن آرام محتویات به ­مدت 2 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد تا سازه حاصل درون پروتئینهای پوشش فاژ بسته­بندی و ذرات فاژی تشکیل شوند. پس از 2 ساعت 500 میکرولیتر بافر SM  (5.8g NaCl, 2.0g MgSO4 . 7H20, 50.0 ml of 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of 2% (w/v) gelatin, dH2O up to 1 lit ) به آن افزوده شد تا واکنش متوقف شود. سپس 20 میکرولیتر به آن کلروفرم اضافه و پس ورتکس آرام محتویات ویال در g 1000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی حاوی ذرات فاژی است که برای تعیین تیتر آماده هستند.

تکثیر و تیتراسیون ذرات فاژی بسته­بندی شده: رقتهای 1:10 و 1:1 از محصول بسته­بندی شده در بافر SM‌ تهیه و با 200 میکرولیتر باکتری اشرشیاکلی سویه  XL1-Blue MRF' با OD600 = 0.5 رقیق شد و در دو ویال جداگانه در محلول 10 mM MgSO4 مخلوط شدند. مخلوط فاژ-باکتری به­ مدت 15 دقیقه در 37 درجه بدون تکان انکوبه شد تا فاژها به باکتریها متصل شوند.  سپس محتویات آنها با ml 3 آگار NZY رویی مذاب اما خنک شده تا دمای 48 درجه مخلوط و بلافاصله روی پلیتهایNZY آگار از پیش گرم شده پخش گردید. پلیتها پس از 10 دقیقه به صورت وارونه در انکوباتور 37 درجه قرار داده شد و تا ظاهر شدن پلاکها (8-12ساعت) انکوبه شدند.

تایید وجود توالی GFP در سازه λ-GFP : برای تأیید کلون شدن GFP در ناقل لامبدا ZAP-CMV و دستیابی به سازه λ-GFP از روش Plaque-PCR استفاده شد. بدین منظور مخلوط PCR‌ حاوی تمام اجزا به جز DNA الگو آماده و در حجم کل 25 میکرولیتر در ویالهای PCR توزیع شد. در این واکنش به جای DNA الگو نوک تیپهای استریل آغشته به پلاکهای ظاهر شده در سطح پلیت با مخلوط­های PCR تماس و پیپتاژ شد تا ذرات فاژی موجود در پلاک در مخلوط حل شود. تکثیر توالی GFP با استفاده از پرایمرهای GFP انجام شد. شرایط انجام PCR مشابه با شرایط قبل بود، به جز اینکه مرحله واسرشت­سازی اولیه 7 دقیقه در 94 درجه به منظور اطمینان از متلاشی شدن ذرات فاژی انجام گرفت. محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز و پس رنگ آمیزی با اتیدیم­برومید باندهای حاصل مشاهده شدند.

آلوده کردن سلولهای رده AGS انسانی با نانوحامل­ژنی فاژی : سلولهای رده AGS به تعداد 105×2 سلول در هر چاهک پلیت شش­خانه در محیط RPMI  همراه با 10 درصد سرم وμg/ml 10 آنتی­بیوتیک کشت داده شد و 24 ساعت در دمای 37 درجه و شرایط 5% CO2  انکوبه شد. سلولها با ضریب عفونت یا MOI (MOI; Multiplicity of Infection) برابر با 106 از ذرات فاژی λ-GFP به مدت 12 ساعت تیمار و پس از تعویض محیط با محیط تازه تا 36 ساعت دیگر انکوبه شدند. به عنوان کنترل مثبت DNA  استخراج و تخلیص شده از ذرات فاژی λ-GFP،  توسط لیپوفکتامین 2000 شرکت Invitrogene   به سلولهای AGS ترانسفکت شد. در نهایت سلولها برای مشاهده بیان GFP توسط میکروسکوپ معکوس فلورسانس بررسی شدند.

بررسی ورود نانوحامل­ژنی فاژی به سلولهای AGS : سلولهای رده AGS به تعداد 105×2 سلول در هر چاهک پلیت شش­خانه در محیط RPMI  همراه با 10 درصد سرم وμg/ml10 آنتی­بیوتیک کشت و به­مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه و شرایط 5% CO2  انکوبه شدند. ذرات فاژی λ-GFP در دو MOI 105 و 106 به چاهکها اضافه و 12 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. سپس محیط کشت تعویض و چاهکها با PBS (Phosphate Buffered Saline) شستشو داده شدند. ذرات فاژی چسبیده به سلولها توسط شستشو با بافر گلیسین (50 mM Glycine pH 2.8, 500mM Nacl) آزاد و از محیط حذف شدند. سلولها پس از تیمار با تریپسین از چاهکها جمع آوری و DNA تام آنها توسط کیت Gene JET™ Genomic DNA Purification Kit   ساخت شرکت Fermentas   استخراج شد. DNA حاصل به عنوان الگو در واکنش زنجیره­ای پلیمراز جهت تکثیر و آشکارسازی توالی GFPبا استفاده از پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR مانند قبل انجام شد.  محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز و آشکارسازی شدند.  

نتایج

ساخت سازه λ-GFP : توالی ژن GFP با روش PCR تکثیر و پس از هضم و تخلیص تحت کنترل آغازگر رونویسی CMV‌ در توالی ناقل لامبدای ZAP-CMV کلون شد. سازه به دست آمده برای تولید ذرات فاژی نوترکیب λ-GFP به روش بسته­بندی برون­سلولی (In vitro packaging) بسته­بندی شد. آلوده کردن سلولهای باکتری XL1-Blue MRF' توسط محصول بسته­بندی نشان داد که ذرات فاژی λ-GFP تولید شده است. تشکیل پلاکهای متعدد (شکل1) در سطح کشت چمنی باکتری XL1-Blue MRF'نشان دهنده دستیابی به ذرات فاژی نوترکیب است.   

وجود توالی GFP در سازه λ-GFP و نانوحامل فاژی: وجود توالی GFP در سازه λ-GFP  با روش Plaque-PCR  و استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن GFP مورد بررسی قرار گرفت. محصولات حاصل از PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شد. وجود باند 700 جفت بازی نشان دهنده وجود توالی GFP در سازه می­باشد (شکل2).

آلوده کردن سلولهای رده AGS انسانی با نانوحامل­ژنی فاژی : سلولهای رده AGS انسانی پس از کشت در پلیتهای شش­خانه توسط ذرات λ-GFP با ضریب عفونت 106 به مدت 12 ساعت تیمار شدند. سلولها پس از تعویض محیط، 36 ساعت دیگر نیز انکوبه و در نهایت با میکروسکوپ فلورسانس معکوس برای بررسی بیان GFP مشاهده شدند (شکل3). شمارش سلولهای بیان کننده GFP نشان داد که در حدود 0.02% از سلولها در اثر تیمار با ذرات فاژی GFP مثبت هستند. این آزمایش همچنین تأیید کرد که سازه حاصل فعال بوده و فرآیند ساخت سازه با موفقیت انجام شده است.

 

 

شکل1- تیتراسیون محصول بسته­بندی. پلاکهای ظاهر شده در کشت چمنی باکتری  XL1-Blue MRF' در اثر آلوده ­سازی با رقت  A)  10: 1 و B) 1:1 از محصول بسته­بندی

 

 

شکل2- الکتروفورز محصولات حاصل از فرآیند Plaque-PCR. در این واکنش از 50 نانوگرم DNA پلاسمیدی pEGFP-N1 به عنوان کنترل مثبت (P.C) و از نمونه بدون DNA الگو به عنوان کنترل منفی (N.C) استفاده شد. ستون M نمایانگر نردبان اندازه مولکولی و ستونهای P3, P2, P1 سه پلاک مختلف مورد استفاده در PCR هستند.

 

شکل3- انتقال ژن با نانوحامل­ژنی فاژی. سلولهای رده AGS انسانی توسط نانوحامل فاژی با ضریب عفونت 106 تیمار شده و پس از 48 ساعت سلولها به وسیله میکروسکوپ فلورسانس معکوس بررسی شدند. A) سلولهای تیمار شده با نانوحامل فاژی B) سلولهای آلوده شده با 500 نانوگرم DNA استخراج شده از ذرات فاژی λ-GFP‌ با کمک لیپوفکتامین 2000 C) کنترل منفی

 

شکل4- بررسی ورود نانوحامل­ژنی فاژی به سلولهای AGS. سلولهای AGS پس از 12 ساعت تیمار با ذرات فاژی λ-GFP‌ در ضریب عفونتهای 105 (ستون1) و  106(ستون2) با PBS شستشو و ذرات فاژی چسبیده به سطح سلولها با بافر گلیسین جدا شده و حذف شدند. DNA تام از سلولها استخراج و به عنوان الگو در PCR جهت تکثیر توالی GFP با پرایمرهای اختصاصی به کار رفت. همچنین از10 نانوگرم DNA استخراج شده از ذرات فاژی به عنوان کنترل مثبت PCR و جهت مقایسه استفاده شد(ستون3).

ورود نانوحامل­ژنی فاژی به سلولهای  AGS : توانایی ورود ذرات نانوحامل فاژی به سلول­های AGS با تیمار سلولها توسط دو MOI متفاوت از ذرات فاژی و متعاقب آن استخراج DNA از سلولهای تیمار شده و آشکارسازی وجود DNA ترانس­ژن در سلولها با استفاده از PCR بررسی شد. نتایج حاصل از PCR نمونه­های DNA استخراج شده از سلولهای تیمار شده با ذرات فاژی λ-GFP در شکل4 نشان داده شده است. این نتایج نشان داد که ورود ذرات فاژی به سلولها وابسته به دُز می­باشد.

بحث

اخیراً باکتریوفاژها – به ویژه فاژ لامبدا- به علت مزایایی که دارند به عنوان حاملی بالقوه مناسب برای انتقال ژنها به سلولهای پستاندار مورد توجه قرار گرفته­اند. استفاده از باکتریوفاژ نه تنها در مطالعات انتقال ژن با اهداف ژن­درمانی(5، 7، 8 و 15) بلکه با اهداف دیگری از قبیل واکسینه کردن(4 و 14) به صورت روزافزون در حال افزایش است. با توجه به این واقعیتها و برای دستیابی به یک حامل پایه­ای مبتنی بر فاژ لامبدا که شایستگی لازم را برای مطالعات انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی را داشته باشد، ابتدا توالی ژن GFP در ناقلی از فاژ لامبدا به نام λZAP-CMV تحت کنترل آغازگر CMV وارد شد تا سازه λ-GFP به دست آید. بسته­بندی برون­سلولی سازه حاصل توسط عصاره بسته­بندی­ منجر به تولید ذرات فاژی حاوی توالی ژن گزارشگر GFP شد. برای تأیید تولید ذرات فاژی λ-GFP، سلولهای باکتری XL1-Blue MRF'توسط محصول بسته­بندی آلوده شدند و تشکیل پلاکهای متعدد (شکل1) در سطح کشت چمنی باکتریایی، به وجود آمدن ذرات فاژی λ-GFP را نشان داد. همچنین برای تایید حضور توالی GFP در ذرات فاژی حاصل تعدادی از پلاکهای فاژی ظاهر شده در سطح کشت چمنی به وسیله Plaque-PCR بررسی شدند. نتایج حاصل از Plaque-PCR (شکل2) نشان دهنده کلون شدن توالی GFP‌ در ناقل فاژی می­باشد و بدین ترتیب حاکی از دستیابی به نانوحامل­ژنی λ-GFPاست. در ادامه برای بررسی توانایی نانوحامل حاصل در انتقال و بیان ژن GFP، سلولهای AGS توسط این ذرات تیمار و بیان GFP در سلولها با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس معکوس ارزیابی شدند. شمارش سلولهای بیان کننده GFP نشان داد که علی­رغم استفاده از تعداد بالایی (1011×2 ذره) از ذرات فاژی برای آلوده کردن سلولهای AGS کارآیی انتقال و بیان به کمک نانوحامل­ژنی حاصل پایین و در حدود 0.02% می­باشد (شکل3). این نتیجه دلیل دیگری برای بی­خطر بودن و عدم گرایش ذرات فاژی به ورود به سلولهای یوکاریوتی­ می باشد. با این­حال این بررسیها نشان داد که سازه طراحی شده فعال می­باشد و قابلیت انتقال و بیان ژن به سلولهای یوکاریوتی را دارد. این یافته­ها با گزارشهای قبلی توسط گروههای مختلف مطابقت دارد. Poul  و Marks (16) در مطالعه خود علی­رغم استفاده از تعداد بسیار بالایی (cfu/ml 1013×4) از ذرات فاژی M13 دارای توالی GFP با بررسی میکروسکوپی تعداد سلولهای بیان کننده GFP را به قدر کافی ندیدند، با این­حال آنها تعداد سلولهای GFP مثبت را با بررسی FACS (Fluorescence activated cell sorting) حدود 0.04% گزارش کردند. آنها وقتی که از ذرات فاژی نمایش دهنده آنتی­بادی تک زنجیره­ای anti-ErbB2 در سطح پروتئین PIII استفاده کردند کارآیی انتقال و بیان را حدود 2 درصد گزارش کردند. مطالعات دیگر  نشان دهنده کارآیی بسیار پایین انتقال و بیان ژن با فاژهای طبیعی بوده است، در صورتی­که این گروهها با نمایش مولکولهای هدف­گیری در سطح ذرات فاژی توانستند کارآیی انتقال و بیان ژن را به مقدار زیادی افزایش دهند(5، 7، 8، 9، 10، 20 و 21).

بررسی ورود نانوحامل به سلولهای AGS با استفاده از MOI ‌های مختلف نشان داد که ورود ذرات به سلولها وابسته به دُز می­باشد (شکل4). مقایسه ساده باندهای حاصل از تکثیر 10 نانوگرم DNA استخراج شده از ذرات فاژی که معادل با مقدار DNA موجود در108×‌2 ذره از آن فاژ است(16) با باندهای حاصل از DNA تام سلولهای تیمارشده با نانوحامل حاکی از ورود تعداد بالایی از ذرات به سلولها در مقایسه با تعداد سلولهای GFP مثبت مشاهده شده با بررسی میکروسکوپی است. با این­حال باید توجه داشت که سلولهای GFP‌ مثبت مشاهده شده با میکروسکوپ ناشی از تعداد اندک کپیهای ژنوم ترانس­ژن است که توانسته­اند از سدهای مختلف داخل سلول عبور و به هسته وارد شوند. انتقال و بیان ژن با واسطه فاژ می­تواند به وسیله یک یا چند رخداد پس از ورود به داخل سلول از قبیل تخریب فاژ برای آزاد شدن DNA، فرار از اندوزوم، انتقال به هسته و رونویسی محدود شود(19). برای افزایش کارآیی انتقال و بیان ژن با کمک فاژ می­توان از دو راهبرد استفاده کرد: راهبرد اول استفاده از مولکولهای هدف­گیری مسیرهای داخل سلولی از قبیل اتصال پپتیدهای دارای نشانه انتقال به هسته یا فرار از اندوزوم و دوم راهبردهایی که هدف آنها رخدادهای خارج سلولی از قبیل افزایش احتمال برهمکنش بین فاژ و سلول است. افزایش برهمکنش­های سلول و فاژ هم با روش فاژنمایی(phage display) (5،7،9،10،15،20،21) و هم با روشهای مختلف اتصال شیمیایی لیگاند هدف­گیری به سطح ذرات فاژی طبیعی قابل حصول است (12). گفتنی است که راهکار دوم به عنوان یک روش نوین توسط گروه پژوهشی تحقیق حاضر برای اتصال ترانسفرین به عنوان مولکول هدف­گیری به سطح ذرات فاژی λ-GFP در حال اجراست.

تشکر و قدردانی

هزینه اجرای این پژوهش توسط معاونت پژوهشی دانشگاه تربیت مدرس و همینطور بخشی از آن توسط ستاد توسعه فناوری نانو تأمین شده است. 

  1. Baker, M. L., Jiang, W., Rixon, F. J., Chiu, W. (2005), Common ancestry of herpesviruses and tailed DNA bacteriophage. J. Virol. 79, 14967–14970
  2. Chen, D., Murphy, B., Sung, R., Bromberg, I. (2003), Adaptive and innate immune responses to gene transfer vectors: role of cytokines and chemokines in vector function. Gene. Ther. 10, 991–998
  3. Chiu, W., Burnett, R. M., Garcea, R. L. (1997), Structural Biology of Viruses. University Press, Oxford,
  4. Delmastro, P., Meola, A., Monaci, P., Cortese, R., Galfre, G. (1997), Immunogenicity of filamentous phage displaying peptide mimotopes after oral administration. Vaccine, 15, 1276-1285.
  5. Eguchi, A., Akuta, H., Senda, T., Yokoi, H., Inokuchi, H., Fujita, S., Hayakawa, T., Takeda, K., Hasegawa, M., Nakanishi, M. (2001), Protein transduction domain of HIV-1 Tat protein promotes efficient delivery of DNA into mammalian cells. J. Biol. Chem. 276, 26204–26210
  6. Herweijer, H., Wolff, J. (2003), Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy. Gene Ther. 10, 453–458
  7. Ivanenkov, V.V., Felici, F., Menon, A.G. (1999), Targeted delivery of multivalent phage display vectors into mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta, 1448, 463– 472
  8. Ivanenkov, V.V., Felici, F., Menon, A.G. (1999), Uptake and intracellular fate of phage display vectors in mammalian cells. Biochem. Biophys Acta, 1448, 450-462
  9. Jane, D., Samoylova, M.,  Tatiana, I.,  Morrison N. E., Nancy R. C. (2004), Cell targeted phagemid rescued by preselected landscape phage. Gene, 341,b59–65
  10. Lankes, H.A., Zanghi, C.N., Santos, K., Capella, C., Duke, C.M.P., Dewhurst, S. (2007), In vivo gene delivery and expression by bacteriophage lambda vectors, J. Appl. Microbiol. 102, 1337–1349
  11. Kaiser, A. D., (1966), On the internal structure of bacteriophage lambda. J. Gen. Physiol. 49, 171-178 
  12. Li, k.,  Chen, Y.,  Li, S., Nguyen, H.G., Niu, Z., You, S.,  Mello, M., Lu, X.,  Wang, Q. (2010), Chemical Modification of M13 Bacteriophage and Its Application in Cancer Cell Imaging. Bioconjugate Chem. 21, 1369–1377
  13. Liu, C., Chung, S-H., Jin, Q., Sutton, A., Yan, F., Hoffmann, A., Kay, B.K., Bader, S.D., Makowski, L., Chen, L. (2006), Magnetic viruses via nano-capsid templates. J. Magn. Magn. Mater. 302, 47–51
  14. March, J., Clark, J. (2004), Genetic immunization against hepatitis B using whole bacteriophage lambda particles. Vaccine, 22, 1666-1671
  15. Piersanti, S., Cherubini, G., Martina, Y., Salone, B., Avitabile, D., Grosso, F.,  Cundari, E., Di Zenzo, G., and Saggio, I. (2004), Mammalian cell transduction and internalization properties of lambda phage displaying the full-length adenoviral penton base or its central domain. J. Mol. Med. 82, 467–476
  16. Poul,  M. A., Marks, J. D. (1999), Targeted gene delivery to mammalian cells by filamentous Bacteriophage. J. Mol. Biol. 288, 203-211
  17. Schmidt-Wolf, G., Schmidt-Wolf, I. (2003), Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update. Trends Mol. Med. 9, 67–72
  18. Thomas, C., Ehrhardt, A., Kay, M. (2003), Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346–358
  19. Volcy, K., Dewhurst, S. (2009), Proteasome inhibitors enhance bacteriophage lambda (λ) mediated gene transfer in mammalian cells. Virology, 384, 77–87
  20. Zanghi, C. N., Lankes, H. A., Bradel-Tretheway, B., Wegman, J., Dewhurst, S. (2005), A simple method for displaying recalcitrant proteins on the surface of bacteriophage lambda. Nucleic Acids Res, 33, No. 18
  21. Zanghi, C. N., Sapinoro, R., Bradel-Tretheway, B., Dewhurs, S. (2007), A tractable method for simultaneous modifications to the head and tail of bacteriophage lambda and its application to enhancing phage-mediated gene delivery.  Nucleic Acids Res, Vol. 35, No. 8