مطالعه تأثیر خاک آلوده به نفت خام بر فعالیت آنزیم آلکالن فسفاتاز در گیاه عدس (Lens culinaris) 

سعید مینویی¹، داریوش مینایی تهرانی^2،*، میترا جمشیدی²، زینب یوسفی²، مجید طالبی²، بابک کاوند¹، زهرا غفاری²، سحر شادمان²

¹ تهران، دانشگاه شهید بهشتی، پژوهشکده علوم محیطی

² تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم زیستی

تاریخ دریافت: 14/9/89               تاریخ پذیرش: 8/5/90

چکیده

آلودگی نفتی در خاک همواره سبب آسیب به محیط زیست شده و زندگی گیاهان و جانوران خاک را تحت تأثیر قرار می دهد. آلودگی نفتی به نشت نفت به هنگام استخراج، پالایش و حمل نفت مربوط می شود. نفت می تواند از طریق خاک آلوده وارد آبهای زیرزمینی شده و مزارع کشاورزی و گیاهان مورد استفاده انسان را تحت تأثیر قرار دهد که مستقیماً سلامت غذایی انسان را تهدید می کند.  عدس یکی از گیاهانی که بسیار مورد استفاده غذایی انسان است، بنابراین تحقیق بر روی این گیاه دارای اهمیت می باشد. در این مطالعه تأثیر آلودگی نفتی خاک بر رشد و جوانه زنی گیاه عدس و فعالیت آنزیم آلکالن فسفاتاز مورد مطالعه قرار گرفت و سپس تأثیر آلودگی بر فعالیت آنزیم آلکالن فسفاتاز گیاه بررسی شد. نتایج نشان داد که غلظت 5 درصد آلاینده در خاک سبب تأخیر در جوانه زنی، تغییر در تعداد جوانه ها ، کاهش زیست توده ساقه و ریشه و کاهش طول برگها در گیاه می شود. بنابراین غلظت 5 درصد، مقدار مناسبی برای بررسی تأثیر آلودگی بر آنزیم می باشد. مشخص شد که فعالیت آنزیم در ریشه گیاه شاهد و آلوده با یکدیگر تفاوت معنی داری را نشان می دهد( 05/0  (p<. همچنین محاسبه فاکتورهای کینتیکی Km و Vmax  نیز در دو نمونه اختلاف معنی داری را نشان داد. با بررسی نتایج پیشنهاد شد که ممکن است ایزوآنزیم آلکالن فسفاتاز در ریشه آلوده گیاه بیان شده باشد که مسئول تفاوتهای مشاهده شده بین نمونه های شاهد و آلوده است.

واژه های کلیدی: آنزیم، گیاه، آلودگی، نفت خام

* نویسنده مسئول، تلفن: 29903144 ، پست الکترونیکی:D_MTehrani@sbu.ac.ir

مقدمه

آلودگیهای خاک توسط فلزات سنگین و مواد آلی می تواند سبب تغییر خواص فیزیکو شیمیایی خاک شود. در کشورهای تولید کننده نفت، آلودگی خاک توسط نفت خام می تواند در حین حمل، پالایش و استخراج رخ بدهد. نفت می تواند از خاک به آبهای سطحی و زیر سطحی نفوذ کرده و وارد زمینهای کشاورزی شده و سبب آسیب به گیاهان زراعی و موجودات خاک شود. مطالعات زیادی در رابطه با تأثیر نفت بر روی گیاهان انجام شده است. حضور نفت خام در خاک می تواند سبب تأخیر در جوانه زنی، کاهش تعداد جوانه ها، تأثیر در رشد گیاه شود (11 و 15). برخی از گیاهان قادرند غلظتهای بالای نفت را در خاک تحمل کرده و رشد کنند. این گیاهان معمولاً جهت گیاه درمانی خاک آلوده به نفت خام استفاده می شوند (5، 6 و 10). گونه های گرامینه و بقولات جزء گیاهانی هستند که توانایی خوبی در گیاه پالایی خاک دارند (4، 8 و 12)،  گرامینه ها دارای ریشه افشان بوده که به خوبی در خاک نفوذ کرده و آلودگی خاک را کاهش می دهند (4) از طرف دیگر بقولات به خاطر قابلیت تثبیت نیتروژن خاک، گونه های مناسبی برای گیاه پالایی می باشند (7). در این گیاهان رقابتی بین گیاه با جمعیت میکروبی برای به دست آوردن نیتروژن خاک صورت نگرفته که نتیجه آن همکاری مناسبی بین باکتریها و گیاه در جهت حذف و کاهش آلودگی نفتی خاک است (7). با آنکه مطالعات زیادی در مورد تأثیر نفت بر روی گیاهان مختلف صورت گرفته ولی تاکنون گزارشات اندکی از تأثیر آلودگی نفتی بر روی فعالیت آنزیمهای گیاهی اعلام شده است(3). در این مطالعه از گیاه عدس که جزء بقولات است استفاده شد و تأثیر نفت بر رشد گیاه و تأثیر آن بر فعالیت آلکالن فسفاتاز گیاه مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

آلوده سازی خاک به نفت خام: نفت خام سبک از ناحیه سرکان در غرب ایران تهیه شد. نفت با غلظتهای 1، 3 و 5 در صد به خاک اضافه و به خوبی مخلوط گشت تا کاملاً یکنواخت شود (12) . سپس خاک به گلدانهای 1 کیلویی انتقال داده شد. از هر غلظت 5 تکرار آماده کشت و 5 نمونه نیز بدون آلودگی و به عنوان شاهد تهیه شد. در هر گلدان تعداد 10 دانه عدس کاشته شد و مقدار 5/0 گرم کود حیوانی نیز به گلدانها اضافه شد. سپس آب لازم (در حدود 75 درصد ظرفیت زراعی) برای رشد گیاه به گلدانها داده شد.

بررسی رشد گیاه: پس از 15 روز از کشت گیاه، تعداد جوانه ها در هر گلدان شمارش شد. طول ساقه گیاه پس از یک ماه اندازه گیری شد سپس گیاه از خاک خارج شده و مقدار زیست توده ریشه و ساقه آن وزن گردید. با توجه به تأثیر غلظت 5 درصد آلودگی نفتی بر روی گیاه، نمونه های 5% برای مقایسه فعالیت آنزیمی ریشه و ساقه با شاهد انتخاب شد. ریشه و اندام هوایی نمونه های 5 درصد و شاهد در دمای 20- درجه برای تعیین فعالیت آنزیمی نگهداری شد.

تعیین فعالیت و بررسی کینتیکی آنزیم آلکالن فسفاتاز: ریشه و ساقه گیاه پس از خروج از دمای 20- درجه توسط هموژنایزر شکسته شد و سپس در دور  5000 x g و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید.  رسوب که شامل سلولهای شکسته نشده بود از مایع رویی جدا شد و سوپرناتنت به عنوان سوپ فاقد سلول برای فعالیت آنزیمی استفاده شد.

جهت تعیین فعالیت آنزیم مقدار 1/0 میلی لیتر از سوپ سلولی به 8/2 میلی لیتر بافر 1/0 مولار تریس با pH 5/8 اضافه شد و سپس مقدار 1/0 میلی لیتر نیز  محلول پارا نیترو فنیل فسفات (pNPP) به عنوان سوبسترای آنزیم اضافه شد و تغییرات جذب تولید محصول واکنش یعنی پارا نیتروفنل در طول موج 410 نانومتر ثبت گردید. جهت محاسبات کینتیکی سوبسترا با غلظتهای مختلف (3.5 تا 18 میلی مولار) به محلول آنزیم و بافر اضافه شد و جذب در زمانهای 1، 3، 5، 7، 10و 15 دقیقه ثبت شد. از اعداد به دست آمده منحنی عکس غلظت بر علیه عکس سرعت (Lineweaver- plot) رسم و سرعت ماکزیمم (Vmax)  و Km  آنزیم محاسبه شد.

فعالیت آنزیم نیز با توجه به اینکه ضریب خاموشی (Extinction coefficient) پارانیترو فنل مقدار 10³ * 8/18 لیتر بر مول است محاسبه شد.  

آنالیز آماری: داده های به دست آمده به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) در نظر گرفته شد. برای تعیین اختلاف معنی دار نتایج از آنالیز واریانس One Way ANOVA و تست مکمل Tukey  استفاده شد و مقدار P  کمتر از 5 درصد  (p< 0.05) معنی دار مشخص شد.

نتایج

شمارش تعداد جوانه ها در گیاه: شمارش تعداد جوانه ها در نمونه ها نشان داد که حضور نفت خام در گیاه تأثیری در جوانه زدن گیاه نداشته است به طوری که حتی در نمونه 5 درصد هیچ گونه تفاوت معنی داری با نمونه کنترل دیده نشد (شکل 1). با این حال حضور نفت سبب تأخیر در جوانه زدن شد.

شکل1 - شمارش تعداد جوانه ها در خاک . هیچگونه اختلاف معنی داری بین نمونه های آلوده و شاهد دیده نشد.

شکل2- اندازه گیری طول اندام هوایی در گیاه. در نمونه 5 درصد کوتاه ترین اندام هوایی دیده شد.

بررسی اندازه و طول اندام هوایی گیاه نشان داد که در نمونه 5 درصد از طول اندام هوایی کاسته شده ولی تفاوت معنی داری بین کنترل و نمونه های آلوده به نفت مشاهده نشد. به غیر از نمونه 5 درصد، حضور آلودگی تأثیری بر رشد و طول اندام هوایی گیاه نداشت ‌(شکل2). 

اندازه گیری زیست توده گیاه:  بررسی مقدار زیست توده کل(ریشه و ساقه) نشان داد که هر چه غلظت نفت در نمونه بیشتر باشد از مقدار زیست توده کل کاسته می شود. بیشترین مقدار زیست توده در نمونه شاهد (فاقد نفت) و کمترین آن در نمونه 5 درصد مشاهده شد (شکل3). اختلاف معنی داری بین نمونه  کنترل و 5 درصد دیده شد. نفت نه تنها بر روی ساقه و اندام هوایی بلکه بر روی میزان رشد ریشه نیز مؤثر بود. اندازه گیری مقدار زیست توده ریشه در نمونه ها نشان داد که کمترین مقدار زیست توده گیاه در نمونه 5 درصد و بیشترین آن در نمونه کنترل مشاهده شد(شکل3). مشاهده ماکروسکوپی ریشه نشان داد هر چه بر غلظت نفت در خاک افزوده شود از پراکندگی ریشه در خاک کاسته شده و مقدار انشعابات ریشه نیز کم می شود. حضور نفت در خاک سبب تأخیر در جوانه زنی و تأثیر بر روی رشد گیاه شد. به طوری که هر چه بر  مقدار نفت در خاک افزوده شد از طول ساقه گیاه کاسته شد. همچنین حضور نفت باعث زردی زودرس برگهای گیاه شد.

بررسی فعالیت آلکالن فسفاتاز  در ریشه: با توجه به تغییرات ماکروسکوپی که در نمونه 5 درصد نسب به شاهد مشاهده شد، برای مطالعه تغییرات آنزیمی از نمونه های ریشه و ساقه در خاک آلوده به نفت با غلظت 5 درصد استفاده و با شاهد (خاک بدون نفت) مقایسه شد. بررسی فعالیت آلکالن فسفاتاز ریشه گیاه در حالت آلوده و شاهد نشان داد که هر دو فاکتور Km و Vmax آنزیم در نمونه آلوده نسبت به شاهد تفاوت کرده است به طوری که  هم Km و هم Vmax افزایش را نشان داد (شکل 4).  

بررسی فعالیت آلکالن فسفاتاز در اندام هوایی : مقایسه فعالیت آنزیم آلکالن فسفاتاز در ساقه گیاه آلوده و شاهد نشان داد که فاکتور  Km در نمونه آلوده افزایش یافته و Vmax  نیز افزایش نشان داده است. مقایسه Km نمونه آلوده و شاهد اختلاف معنی داری بین آنها نشان نداد (شکل5).

مقایسه فعالیت ویژه آنزیم در ریشه و ساقه: محاسبه فعالت ویژه آنزیم آلکالن فسفاتاز در ریشه گیاه شاهد و آلوده نشان داد که فعالت ویژه در ریشه گیاه شاهد در حدود    U/mg protein2 ± 10 و در نمونه آلوده در حدود   U/mg protein 2/1±9/5 بوده ا ست در حالی که در ساقه گیاه فعالیت ویژه برای شاهد در حدود  U/mg protein 9/0 ± 65/4 و برای نمونه آلوده در حدود U/mg protein 8/0±25/4  محاسبه گشت.  اختلاف معنی داری بین فعالیت ویژه آنزیم در ریشه گیاه شاهد و آلوده مشاهده می شود که این اختلاف در اندام هوایی گیاه به چشم نمی خورد.

شکل 3- مقایسه مقدار زیست توده کل( ریشه وساقه) و زیست توده ریشه در نمونه های آلوده و شاهد

شکل 4- رسم منحنی لینوویر و بورک ومحاسبه تغییرات سرعت ماکزیمم و Km در آنزیم آلکالن فسفاتاز نمونه ریشه شاهد و آلوده. اختلاف معنی داری بین مقدار Km نمونه شاهد و کنترل دیده شده در حالی که اختلاف معنی داری بین سرعت ماکزیمم نمونه شاهد و کنترل دیده نشد.

بحث

آلودگی خاک می تواند تأثیرات مهمی بر فیزیولوژی سلولهای گیاهی اعمال کند که نتیجه آن تغییر مرفولوژی و ماکروسکوپی در گیاه است(17). نفت خام یکی از مهم ترین آلوده کننده های خاک در کشور محسوب می شود که از طریق نشت نفت به هنگام انتقال، استخراج و پالایش به خاک نفوذ کرده و توسط آبهای زیرزمینی و یا سطحی به زمینهای کشاورزی منتقل شده و بر روی گیاهان تأثیر می گذارد. معمولاً ریشه گیاه که در مجاورت خاک قرار دارد جذب آلودگی را انجام داده و بیشتر تحت تأثیر آلودگی قرار می گیرد و ساقه گیاه این تغییرات را با شدت کمتری نشان می دهد (1، 2، 13، 16). یکی از مهم ترین تأثیرات آلودگی بر روی آنزیمهای گیاهی می باشد. از آنزیمهای مهمی که در شرایط استرس فعالیت متفاوتی را از خود نشان می دهد شامل پراکسیدازها، کاتالاز و آلکالن فسفاتاز است. گزارشهای زیادی در مورد تغییر فعالیت آنزیمهای پراکسیداز تحت شرایط استرس ارائه شده است (9) آلودگی خاک توسط فلزات سنگین می تواند برروی فعالیت آنزیمهای خاک مؤثر باشد (14).

شکل5- رسم منحنی لینوویر و بورک برای محاسبه سرعت ماکزیمم و Km در ساقه گیاه عدس. هیچگونه اختلاف معنی داری بین نمونه شاهد و آلوده برای دو فاکتور Km و سرعت ماکزیمم دیده نشد.