نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

جنس Crocus شامل تقریبا هشتاد گونه است که عمدتاً توسط گونه زراعی آن Crocus sativus  شناخته می شود. تنوع ژنتیکی میان 16 نژادگان جنس فوق در ایران برای اولین بار توسط نشانگر ISSR  مورد مطالعه قرار گرفت. چهارده نشانگر، در مجموع 208 قطعه قابل تشخیص و تکرار پذیر تولید کردند که تمام قطعات چند شکل بودند.  قطعات ایجاد شده بر اساس وجود و عدم وجود امتیاز دهی شدند و از داده های فوق برای محاسبه ضرایب شباهت دایس، جاکارد و تطابق ساده استفاده گردید. دندروگرام مربوطه توسط نرم افزار NTSYSpc (نسخه 02/2) و بر اساس الگوریتم  Complete Linkageو UPGMA   ترسیم گردید. تجزیه و تحلیل خوشه ای، نژادگان را به پنج گروه اصلی تقسیم نمود. علاوه بر این، نمودارهای به دست آمده از تحلیل PCoA نیز نژادگان را به پنج گروه تفکیک می نماید. قدرت تفکیک تجمعی برابر با 134، میزان کمینه  قدرت تفکیک برابر با 87/4 در آغازگر  UBC872 و میزان بیشینه برابر با 5/15 در آغازگر  UBC851و متوسط قدرت تفکیک برابر با 6/9 می باشد. نتایج به دست آمده سودمندی  بالای نشانگر های  ISSR را برای گروه بندی گونه های  Crocus و تحلیل روابط زنتیکی آنها را نشان می دهد. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Genetic Diversity of Cultivated and Wild Crocus genus in Iran with ISSR Markers

چکیده [English]

The Crocus genus, which comprehends approximately 80 species, is known mainly for the cultivated species Crocus sativus. Genetic variability among 16 genotype of Crocus genus originating from Iran was examined for the first time with Inter Simple Sequence Repeat (ISSR). Fourteen primers generated a total of 208 discernible and reproducible bands across the analyzed populations, that all of these showed polymorphism. The fragment scored for presence/absence and used to generate Dice, Jaccard and Simple Maching similarity coefficients and to construct a dendrogram by means of UPGMA and Complete Linkage in NTSYS-pc 2.02 computer program. Cluster analysis revealed primarily five major groups. Furthermore, dimensional graph derived from Principal Coordinate Analysis (PCoA) of ISSR data also revealed a pattern in which the genotypes were assigned into five separate groups. Estimation of Resolving Power (RP) values exhibited a collective rate of 134.08 and varied from 4.87 for UBC 872 to 15.5 for UBC 851 with a mean of 9.6. The results showed the high effectiveness of ISSR markers in grouping of Crocus species under study, and analysis of their genetic relationships. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Fingerprinting
  • Genetic diversity
  • Saffron
  • Resolving power
  • ISSR

بررسی تنوع وراثتی ارقام زراعی و گونه های خودروی جنس  Crocusبا استفاده از نشانگر  ISSR در ایران 

امیرحسین بیکی*،1،  ناهید عباسپور2، جواد مظفری3 

1 قم، دانشگاه قم، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی 

2 قزوین، دانشگاه بین المللی امام خمینی(ره)، گروه بیوتکنولوژی

3 کرج، موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر

تاریخ دریافت: 16/4/89               تاریخ پذیرش: 8/5/90 

چکیده

جنس Crocus شامل تقریبا هشتاد گونه است که عمدتاً توسط گونه زراعی آن Crocus sativus  شناخته می شود. تنوع ژنتیکی میان 16 نژادگان جنس فوق در ایران برای اولین بار توسط نشانگر ISSR  مورد مطالعه قرار گرفت. چهارده نشانگر، در مجموع 208 قطعه قابل تشخیص و تکرار پذیر تولید کردند که تمام قطعات چند شکل بودند.  قطعات ایجاد شده بر اساس وجود و عدم وجود امتیاز دهی شدند و از داده های فوق برای محاسبه ضرایب شباهت دایس، جاکارد و تطابق ساده استفاده گردید. دندروگرام مربوطه توسط نرم افزار NTSYSpc (نسخه 02/2) و بر اساس الگوریتم  Complete Linkageو UPGMA   ترسیم گردید. تجزیه و تحلیل خوشه ای، نژادگان را به پنج گروه اصلی تقسیم نمود. علاوه بر این، نمودارهای به دست آمده از تحلیل PCoA نیز نژادگان را به پنج گروه تفکیک می نماید. قدرت تفکیک تجمعی برابر با 134، میزان کمینه  قدرت تفکیک برابر با 87/4 در آغازگر  UBC872 و میزان بیشینه برابر با 5/15 در آغازگر  UBC851و متوسط قدرت تفکیک برابر با 6/9 می باشد. نتایج به دست آمده سودمندی  بالای نشانگر های  ISSR را برای گروه بندی گونه های  Crocus و تحلیل روابط زنتیکی آنها را نشان می دهد.

واژه های کلیدی: انگشت نگاری، تنوع ژنتیکی، زعفران، قدرت تفکیک،ISSR

* نویسنده مسئول، تلفن: 02532103591 ، پست الکترونیکی: amirbeiki@gmail.com

مقدمه

 

در طی دوره های طولانی توانایی یک جمعیت برای سازگار شدن با شرایط متفاوت محیطی به سطح تنوع ژنتیکی آن بستگی دارد (5). بنابراین آگاهی از تنوع ژنتیکی جمعیتها و ساختار جمعیتهای درون یک  گونه نه تنها فرآیندهای تکامل و مکانیسم آن را بررسی می کند، بلکه اطلاعات مفیدی را در مورد حفاظتهای بیولوژیکی فراهم می نماید (2 و 21).

روشهای مختلفی جهت ارزیابی تنوع ژنتیکی درون جوامع گیاهی وجود دارد. امروزه برای بررسی تنوع ژنتیکی به صورت بسیار گسترده ای از نشانگرهای مولکولی  استفاده می شود. نشانگرهای مبتنی بر واکنشهای زنجیره ای پلیمراز به دلیل سادگی و نیاز به مقادیر کم DNA کاربرد زیادی دارند. انتخاب نوع نشانگرهای مولکولی به تکرارپذیری بالا، سادگی روش و هزینه پایین و قابلیت اعتماد بالای آن بستگی دارد. ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) نشانگر چند جایگاهی اختیاری است که علاوه بر داشتن این خصوصیات، محدودیت نشانگرهای دیگر مثل تکرار پذیری کم در  RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)، هزینه بالا و سختی کار در AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) را نداشته و به طور گسترده در سرتاسر ژنوم پراکنده هستند (13 و 18). نشانگرهای ISSR تکرارهای ریزماهواره ای 4 تا 12 واحدی هستند که از یک انتهایشان 2 تا 4 نوکلئوتید اختیاری دارند. آغازگرهای فوق امکان تکثیر قطعاتی از DNA را فراهم می آورند که بین دو ریزماهواره قرار داشته و به اندازه کافی به هم نزدیک هستند (15). وراثت پذیری بالای جایگاههای ISSR، توزیع گسترده آنها در سرتاسر ژنوم، شباهت آنها به وراثت مندلی، تکرارپذیری بالا، عدم نیاز به اطلاعات قبلی در مورد توالی ژنوم سبب استفاده روزافزون این نشانگر نسبتاً جدید شده است.ISSR  ها به خاطر طول بلند آغازگر های آن که اجازه انتخاب دمای واسرشته سازی بالاتر را می دهد، دارای تکرار پذیری بیشتری می باشند. این نشانگرها معمولاً به عنوان یک نشانگر غالب در نظر گرفته می شود (10 و 22). هر چند در بعضی از موارد بخاطر توانایی آنها در جداسازی هموزیگوت ها از هتروزیگوت ها به عنوان نشانگر همبارز دسته بندی می شوند (15 و 23).ISSR  ها انگشت نگاریهایی با چند شکلی بالا تولید می کنند (20 و 24). مطالعات اخیر بر روی جمعیتهای بومی، طبیعت فوق العاده متنوع این نشانگرها و نیز پتانسیل آنها را برای مطالعه سطوح مختلف جمعیتی نشان  می دهد (8). تا کنون مطالعه ای به وسیله نشانگر ISSR  برای بررسی تنوع ژنتیکی گونه های جنس  Crocus  در ایران انجام نشده است.

گریلی و همکاران (11) تنوع ژنتیکی شش نژادگان زعفران زراعی و هفت گونه وابسته را با کمک نشانگر های مولکولی ارزیابی کردند. نتایج به دست آمده از بررسی داده های مولکولی نشان داد  که C. cartwrightianus گونه وابسته زعفران زراعی و گونه C. thomasii مشابه با آن است. سیک و همکاران (22) از نشانگر های RAPD و ISSR برای تعیین تنوع و روابط ژنتیکی 56 نژادگان زراعی در ترکیه استفاده کردند و توانستند نمونه های فوق را با کمک نشانگر های فوق به هفت گروه دسته بندی کنند. آنها سطح بسیار بالایی از تنوع ژنتیکی را در نمونه های خویش گزارش نمودند که از آن به عنوان شاهد این مدعی که ترکیه مرکز تنوع زعفران است استفاده نمودند. علوی کیا و همکاران(4) از 28 ترکیب آغازگر رتروترنسپوزون حاصل از جو به بررسی تنوع ژنتیکی و روابط فیلوژنتیکی زعفران زراعی ایران پرداختند. نتایج این بررسی نشان دهنده هتروژنی بالا بین جمعیتهای مختلف جنس  Crocus و مشخص کننده همولوژی نسبی زعفران زراعی با جو بود. بیکی و همکاران (6) با استفاده از نشانگر RAPD تنوع و روابط ژنتیکی 30 نژادگانهای مختلف جنس Crocus را بررسی کردند. نتایج حاصل نشان داد نژادگانهای زعفران زراعی همگی در یک زیر شاخه قرار داشته و بیشترین شباهت را با C. haussknechii نشان می دهند.

در تحقیقی که توسط روبیو موراگا و همکاران (19) بر روی زعفران زراعی جمع آوری شده از 11 کشور مختلف با استفاده از سه نشانگر RAPD،  ISSRو SSR (Simple seguence repeat) انجام شد نشان داده شد که زعفران زراعی یک گونه منومورف می باشد. این نتایج با بررسیهای قبلی(4، 6، 11و 22) مطابقت ندارد. در سال 2010 روبیو موراگا (21) و همکاران با استفاده از نشانگر ISSR گزارش نمودند که بین C. sativus و C. oreocreticus تفاوتی وجود ندارد اما در تحلیلهای  HPLC  برای میزان کارتنوئید ها تفاوت کمی گزارش نمودند که با نتایج به دست آمده توسط گریلی و همکاران (12) مطابقت داشت.  

گیاه زعفران یکی از اعضای خانواده زنبق (Iridaceae) و متعلق به جنس زعفران می باشد. گیاهان این خانواده دارای ریزوم، بنه و پیاز هستند. خانواده زنبق شامل 60 جنس و 1500 گونه می باشد. جنس زعفران شامل گونه های بومی از اروپا، شمال آفریقا، آسیا و به خصوص در کشورهایی از جنوب شرق، غرب و مرکز آسیا می شود. جنس زعفران عموماً به خاطر گونه زراعی آن شناخته شده است. این جنس دارای گونه های دیگری نیز می باشد که به خاطر رنگ بسیار زیبای گلهای آن با ارزش بوده و به طور وسیعی در باغبانی استفاده می شود (9).

چون گونه های خودرو هر منطقه در معرض خطر فرسایش ژنتیکی و حتی انهدام هستند و از طرفی  بعلت عدم وجود تنوع کافی در کلکسیونهای ژرم پلاسم، شناسایی، جمع آوری و نگهداری آنها شایان توجه بیشتری است (17). شناسایی ژرم پلاسم زعفران و خویشاوندان آن و بررسی میزان خویشاوندی بین آنها می تواند در برنامه های اصلاحی و حفظ ذخایر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرد.

 

 

جدول 1- نام و محل جمع آوری نژادگان های مورد استفاده

گونه 

محل جمع آوری 

کد نژادگان 

 

گونه 

محل جمع آوری 

کد  نژادگان 

C.sativus

خراسان رضوی- قائن

saKrGn

 

C.cancellatuse

فارس- استهبان

cnFaEs

C.sativus

گلستان- آزادشهر

saGoAz

 

C.cancellatuse

کرمانشاه - سراب قنبر

cnKeS1

C.speciosus

گیلان- رودبار

spGiRd

 

C.cancellatuse

کرمانشاه - سراب قنبر

cnKeS2

C.speciosus

گیلان- دیلمان

spGiDi

 

C.cancellatuse

کرمانشاه- بیستون

cnKeBi

C.speciosus

مرکزی- الوند

spMaA1

 

C.cancellatuse

کردستان- دیواندره

cnKoDi

C.speciosus

مرکزی- الوند

spMaA2

 

C.caspius

گیلان- رستم آباد

csGiRs

C.speciosus

کرمانشاه- کوژان

spKeKj

 

C.haussknechii

کرمانشاه-اسلام آباد

haKeEs

C.speciosus

کرمانشاه- گهواره

spKeGa

 

C.haussknechii

کردستان- سارال

haKoSa

جدول2-  نام و توالی آغازگرها، تعداد کل باند، تعداد باند های چند شکل ، Tm ، Ta و RP هر آغازگر 

نام پرایمر 

توالی آغازگر 

تعداد کل باندها 

تعداد باندهای چند شکل 

Tm

Ta

Rp

UBC807

AG)8T

18

18

50

5/52

00/11

UBC808

(AG)8C

21

21

52

6/51

25/13

UBC812

(GA)8A

10

10

50

5/52

60/12

UBC827

(AC)8G

18

18

52

6/53

25/10

UBC834

(AG)8CT

17

17

54

4/53

75/10

UBC835

(AG)8CC

19

19

56

6/59

12/13

UBC836

(AG)8CA

12

12

54

5/53

50/10

UBC840

(GA)8CT

10

10

54

4/53

50/5

UBC841

(GA)8CC

13

13

56

6/59

50/5

UBC851

(GT)8CG

25

25

56

4/58

50/15

UBC868

(GAA)6

11

11

47

0/47

37/5

UBC872

(GATA)4

8

8

38

1/37

87/4

UBC876

(GATA)2(GACA)2

10

10

43

9/43

12/6

UBC880

(GGAGA)3

16

16

49

5/53

75/9

 

 

شکل 1- تاثیر 4 دمای واسرشته سازی مختلف بر روی الگوی بانددهی آغازگر های UBC835 و UBC841 باc  °56Tm= (سمت راست) و بررسی غلظت های مختلف DNA با استفاده از آغازگر UBC835  در زعفران زراعی (سمت چپ)

 

 

در پژوهش حاضر گوناگونی ژنتیکی و انگشت نگاری گونه های خودرو و زراعی جنس زعفران با استفاده از نشانگرISSR  بررسی و مورد مقایسه قرار گرفتند. همچنین اثرات مختلف مؤثر بر فرآیند PCR مثل دمای واسرشت، تعداد جرخه های PCR و غلظت  DNA در جهت افزایش ویژگیهای اختصاصی و بهینه سازی نشانگر ISSR جهت گزینش و شناسایی گونه ها و تصمیم گیری در مورد به نژادی زعفران بررسی گردید.

مواد و روشها

مواد گیاهی : نمونه برگی 16 نژادگان زعفران زراعی و خودروی ایران که توسط بانک ژن ملی گیاهی ایران از رویشگاههای مختلف طبیعی جمع آوری و در محل مؤسسه اصلاح و تهیه نهال و بذرمشهد کاشته شده بود، در زمستان و بهار تهیه گردید (جدول1). نمونه های برگی جمع آوری شده در ازت مایع منجمد و تا پیش از استخراج DNA در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شد.. 

با توجه به دشواری و بازدهی نامناسب استخراج DNA به روشهای معمولی، از روش تغییر یافته مورای و تامپسون استفاده گردید (14). در این روش ابتدا 100 میلی گرم نمونه برگی توسط نیتروژن مایع درون هاون چینی پودر شد و پس از افزودن 1میلی لیتر بافر استخراج [شامل Tris-HCL (100 میلی مولار)، EDTA  (20 میلی مولار)، NaCl (2مولار)، CTAB (2 درصد) ، PVP (2 درصد) و بتا مرکاپتو اتانول (1 درصد)[ ، به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم 65 درجه سانتی گراد قرار گرفت. سپس 700 میکرولیترکلروفرم-ایزوآمیل الکل افزوده و به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد و با 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژشد (این عمل دو بار انجام گرفت). پس از آن مایع بالایی برداشته شد و پس از افزودن 1میلی لیتر ایزوپروپانل سرد به مدت 30 دقیقه در دمای 20- در جه سانتی گراد قرار داده شد. بعد از10 دقیقه سانتریفیوژ با 12000 دور در دقیقه در دمای اتاق، ایزوپروپانل دور ریخته شد و رسوب DNA توسط الکل 70 درصد شستشو و پس از خشک شدن ، 50 میکرولیتر بافر  TEافزوده و به فریزر 20- درجه سانتی گراد انتقال داده شد. کمیت و کیفیت DNA با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز8/0 و همچنین به منظور تأیید نتایج با اسپکتروفتومتر در طول موج 280/260 نانومتر اندازه گیری گردید. برای آزمایشهای واکنشهای زنجیره ای پلیمراز ازکلیه نمونه های استخراجی، غلظتهای یکسان (ng/µl50) تهیه و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

واکنشISSR-PCR  : آزمایش ISSR، با استفاده از42 آغازگر مکمل با توالیهای ریزماهواره ای(AG)8 ، (GA)8، (AC)8، (AT)8،(TA)8، (CT)8، (GT)8، (TG)8، همرا ه با یک ، دو و سه نوکلئوتید اضافی در انتهای´3 و´5 و توالیهای ریز ماهواره ای (AGC)6، (GAA)6، (GATA)4، (TGCA)4، (GGAGA)3، بدون نوکلئوتید اضافی انجام گرفت. پس از بررسی آغازگر ها از نظر تکرارپذیری و چند شکلی، تعداد 14 آغازگر انتخاب شدند (جدول2). برای بهینه سازی شرایط تکثیر، غلظتهای مختلف DNA (25، 30، 35 و 50 نانوگرم بر میکرولیتر) و دمای متفاوت اتصال (Ta) (Annealig temperature) مورد ارزیابی قرار گرفتند.

آزمایشISSR-PCR  در حجمهای 20 میکرولیتری و با استفاده از  PCR Master Kit شرکت سیناژن و به کمک دستگاه ترموسایکلر انجام شد. برنامه حرارتی اعمال شده برای واکنشهای زنجیره ای پلیمراز شامل 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه به عنوان شروع واکنش، 35 چرخه در دماهای 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، 59-37 درجه سانتی گراد (بسته به آغازگرهای مختلف) به مدت 45 ثانیه و 70 درجه سانتی گراد به مدت دو دقیقه و در آخر واکنش یک مرحله بسط نهایی به مدت چهار دقیقه در 68 درجه سانتی گراد در نظر گرفته شد. به منظور مشاهده الگوی قطعهی، محصولات واکنشهای زنجیره ای پلیمراز بر روی ژل آگارز 2/1 درصد بارگذاری و با ولتاژ 85 به مدت 2 ساعت الکتروفورز شد (شکل 1 و 2).

امتیازدهی و تجزیه و تحلیل داده ها: به منظور تجزیه وتحلیل نتایج، قطعات چند شکل به دست آمده بر اساس وجود و عدم وجود قطعه به صورت صفر و یک امتیازدهی شدند. دندروگرام مربوطه بر اساس الگوریتم Complete Linkage وUPGMA  (Unweighted Pair Group Mathematical Average) و ضرایب تشابه دایس، تطابق ساده، و جاکارد، و تجزیه به مؤلفه های اصلی ((PCoA (Principle Coordinate Analysis) توسط برنامه NTSYSpc (نسخه 02/2) انجام شد (18). توانایی نشانگرها برای تمایز نژادگانها با استفاده از شاخص قدرت تفکیک  (Rp) (Resolving power) تعیین گردید. محاسبه این شاخص با استفاده از رابطه ارائه شده توسط پریوست و ویلکینسون انجام گرفت (15).

 

 

 

که در آن P برابر است با نسبت نژادگانهایی که در هر نشانگر دارای قطعه می باشند.

نتایج و بحث

بورنت و همکاران  معتقدند که اصلاح دمای واسرشته سازی، تأثیر زیادی بر وضوح قطعه ها ی ایجاد شده دارد (7) . به منظور بهینه سازی واکنشهای زنجیره ای پلیمراز، 4 دمای واسرشته سازی مختلف برای هر آغازگر مورد بررسی قرار گرفت (شکل 1 سمت راست)، که اکثر آغازگر های مورد مطالعه به جز آغازگرهای UBC835، UBC841 و UBC880 در دمای نزدیک به Tm (Melting Temperature) باند دهی مطلوبی داشتند (جدول 2). بررسی غلظتهای مختلف DNA نیز نشان داد که غلظت 50 نانو گرم بر میکرولیتر بهترین وضوح باندی را ایجاد می کند (شکل 1 سمت چپ).

پس از بررسی 42 آغازگر از نظر تکرارپذیری و وضوح باندی، تعداد 14 آغازگر انتخاب شدند که در مجموع 208 باند قابل امتیازدهی تولید کردند. آغازگر UBC812 بیشترین وضوح باندی را نشان داد. بیشترین تعداد باند متعلق به آغازگر UBC851 و کمترین آن مربوط به آغازگر  UBC827 بود. 

 

 

شکل 2- قطعات تکثیر شده  با استفاده از آغازگر UBC812  برای 16 نمونه گیاهی جمع آوری شده از رویشگاه های مختلف طبیعی

 

 

شکل3- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه ای بر اساس الگوریتم Complete Linkage و ضریب تشابه دایس

 

میانگین تعداد باندها 9/14 برای هر نشانگر بود. تنها نشانگرهای با نوکلئوتید اضافی در انتهای '3 و نشانگرهای بدون نوکلئوتید اضافی باند دهی خوبی داشتند که با نتایج ردی و همکاران (16) مطابقت داشت.  این پژوهشگران عنوان نمودند که آغازگرهایی که دارای نوکلئوتید اضافی در انتهای'3 می باشند، شبیه آغازگرهای اختصاصی عمل کرده و به نقاط خاصی ازDNA  الگو متصل می شوند و الگوی باندی با وضوح بالاتر ولی تعداد باند کمتر تولید می کنند.

قدرت تفکیک نشانگرها در دامنه بین 5/15-87/4 قرارگرفت که میزان بالای آن نشانه کارآیی و کفایت این نشانگر در تمایز میان نژادگانهای به دست آمده است. بیشترین و کمترین میزان Rp به ترتیب متعلق به آغازگرهای UBC851 و UBC872 بود.

به منظور پیدا کردن بهترین روش خوشه بندی ضریب کوفنتیک بر اساس الگوریتمهای UPGMA و Complete Linkage و سه ضریب تشابه جاکارد، دایس و تطابق ساده محاسبه شد (جدول3)، که بر این اساس الگوریتم Complete Linkage و ضریب تشابه دایس با ضریب کوفنتیک یک بهترین روش خوشه بندی از میان روشهای فوق می باشد.

تجزیه خوشه ای، نژادگانهای مورد مطالعه را در پنج گروه قرار داد (شکل3). در گروه اول دو نمونه C.sativus از خراسان و گلستان به همراه یک نمونه C.cancellatus از فارس قرار گرفت. گروه بعدی شامل دو نمونه C.cancellatus هر دو از کرمانشاه، یک نمونه C.caspious از گیلان و یک نمونه C.haussknechii از کردستان بود. نمونه C.haussknechii از کرمانشاه به تنهایی در گروه سوم قرار گرفت. در گروه چهارم دو نمونه C.speciosus  از دو منطقه رودبار و دیلمان استان گیلان به همراه  C.cancellatusاز کردستان قرار داشتند و آخرین گروه نیز شامل یک نمونهC.cancellatus  از کرمانشاه و 4 نمونه C.speciosus از کرمانشاه و مرکزی بود. بر اساس این نتایج تجزیه خوشه ای توانست نژادگانهای مختلف به خصوص گونه C.haussknechii را بر اساس گونه و محل رویش از یکدیگر جدا کند.

با توجه به اینکه نمونه های ژنتیکی داخل یک گونه دارای بیشترین شباهت ژنتیکی بوده و اصولاً با یگدیگر گروه بندی می شوند، قرار گرفتن گونه های یکسان در داخل گروههای مختلف ممکن است در اثر جدایی میکروکلیمایی باشد که باعث روند تکاملی متفاوت در دو جهت مختلف است.

ضریب تشابه دایس در دامنه بین 63/0 - 18/0 قرار گرفت. گونه C.sativus با ضریب تشابه 48/0 بیشترین مشابهت را با گونه C.cancellatus از فارس نشان داد، که بر این اساس می توان آن را یکی از نزدیک ترین خویشاوندان خودرو زعفران  زراعی به شمار آورد. علوی کیا و همکاران (4) با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزون دو گونهC.michelsoni  و C.almehensis و کافی و همکاران (3) نیز بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی C.haussknechii را نزدیک ترین خویشاوندان خودرو زعفران زراعی معرفی کردند. با توجه به این نتایج به نظر می رسد، استفاده از نشانگرهای اختصاصی بتواند اطلاعات دقیق تری درمورد اجداد خودرو این گونه زراعی فراهم نماید.

تجزیه به مؤلفه های اصلی تا حدودی نتایج تحلیل خوشه ای را تأیید کرد (شکل 4). سه مؤلفه اول 37 در صد از تغییرات را توجیه کردند که نشان دهنده نمونه برداری مطلوب نشانگرها از کل ژنوم می باشد. به این ترتیب که هر یک از نشانگرهای مورد استفاده از بخشهای متفاوت ژنوم بوده، بنابراین دارای همبستگی کمتر می باشند. این روش نیز توانست برخی از گونه ها را از لحاظ منطقه رویش، از یکدیگر جداسازی کند، به طوری که گروه 1 شامل گونه specious از استانهای مرکزی و کرمانشاه و گروه 3 شامل گونه sativus از استانهای خراسان رضوی و گلستان هستند. نمونه cnKeBi به تنهایی در گروه 5 قرار دارد.  سه نمونه از چهار نمونه cancellattuse در گروه 2 واقع شده اند. گروه 3 یعنی گروهی که فقط شامل گونه  sativus  است به گروه 2 که اکثریت آنها cancellattuse  می باشند بیشترین شباهت را دارد. با توجه به همگروهی نمونه های گونه sativus  با گونه cancellattuse در تحلیل خوشه ای (گروه 1-شکل 3) می توان چنین نتیجه گرفت که گونه زراعی sativus  بیشترین شباهت را با cancellattuse  دارد. گروه بندی نمونه ها بر حسب گونه بهتر  از گروه بندی بر حسب نواحی جغرافیایی است.

 

 

جدول 3-  ضریب کوفنتیک محاسبه شده برای  الگوریتم های Complete Linkage و UPGMA و  ضرایب تشابه تطابق ساده، دایس و جاکارد

الگوریتم                       ضریب تشابه

تطابق ساده

دایس

جاکارد

Complete Linkage

79/0

1

82/0

UPGMA

80/0

82/0

85/0

 

 

 

شکل 4- نمودار دو بعدی (بالا) و سه بعدی (پایین) تجزیه به مولفه های اصلی بر اساس فراوانی داده های نشانگر ISSR

 

به طور کلی نتایج پژوهش حاصل نشان دهنده وجود تنوع ژنتیکی بالا در نمونه های زعفران موجود در ایران می باشد که با توجه به عقیم بودن و تکثیر رویشی زعفران زراعی می توان با استفاده از روشهای مدرن اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی نسبت به انتقال صفات مفید از این گونه ها به گونه زراعی اقدام نمود. این مطالعه همچنین کارآیی نشانگرهای ISSR را در بررسی این تنوع نشان داد. با توجه به اینکه جد واقعی این گونه زراعی یکی از معماهایی است که هنوز به طور دقیق حل نشده است و نیز از آنجا که ایران یکی از مراکز  مهم پراکنش گیاهی (1) به خصوص  جنس Crocus می باشد، انجام مطالعات تکمیلی تر بر روی این گونه ها با استفاده از نشانگرهای اختصاصی به منظور دست یافتن به اطلاعات دقیق تر و کامل تر ضروری به نظر می رسد.

1-     آتشگاهی، ز , اجتهادی، ح  و زارع، ح . 1388.  معرفی فلور، شکل زیستی و پراکنش جغرافیایی گیاهان در جنگلهای شرق دودانگه ساری، استان مازندران.  مجله زیست شناسی ایران22(2): 193-203.

2-     فخرطباطبایی، م, ملکی، م, رحیمی نژاد، م, عطری، م, نقوی م, مردی م, پیرسیدی م, میرمعصومی م, نوجوان م   .1388. مقایسه کارایی نشانگرهای فلوریستیکی، فیتوشیمیایی و مولکولی در تعیین تنوع جمعیتهای گندم بوئتیکوم (Triticum boeoticum) در ایران. مجله زیست شناسی ایران: 21(5):816-806.

3-     کافی،م .1381. زعفران، فن آوری تولید و فراوری .انتشارات زبان و ادب، مشهد.

 

4-     Alavi-Kia, S.S., Mohammadi, S.A., Aharizad, S., and Moghadam, M. (2008). Analysis of genetic diversity and phylogenetic relationships in crocus genus of Iran using inter-retrotransposon amplified polymorphism. Biotechnol & Biotechnol. Eq. 795-800.

5-     Ayla, F.J. and Kiger, J.A. (1984). Modern Genetics. Benjamin/Cumming, Menlo Park, USA.

6-     Beiki, A.H.,Keifi, F., and Mozafari, J.(2010). Genetic Differentiation of Crocus species by Random Amplified Polymorphic DNA. Genetic Engineering and Biotechnology Journal: GEBJ-18.

7-     Bornet, B. and Branchard, M. (2001). Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) marker: Reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Mol. Biol. Rep.19:209-215.

8-     Chen, J.M., Gituru, W.R., Wang, Y.H. and Wang, Q.F., (2006). The extent of clonality and genetic diversity in the rare Caldesia grandis (Alismataceae): comparative results for RAPD and ISSR markers. Aquat. Bot. 84, 301–307.

9-     Fernandez, J.A. (2004). Biology, biotechnology and biomedicine of saffron. Recent Res. Devel. Plant Sci. 2:127-159.

10-  Gupta, P.K. and Varshney, R.K. (2000). The development and use of microsatellite markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica 113: 163–185.

11-  Grilli-Caiolla, M., Caputo, P. and Zanier, R. (2004). RAPD analysis in crocus sativus l accessions and realated crocus species. biologia plantarum 48(3): 375-380.

12-  Grilli-Caiola, M., (1995). Study on pollen grains of Crocus cartwrightianus (Iridaceae). Plant Syst. Evol. 198, 155–166.

13-  Han, Y.C., Teng, C.Z. and Zhong, S. (2007). Genetic variation and clonal diversity in population of Nelumbo nucifera (Neloumbonaceae) in central China detected by ISSR markers. Aguatic Botany. 86:67-75.

14-  Murray, M. and Thompson, W. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acid Res.10:4321-4325.

15-  Prevost, A. and Wilkinson, M.J. (1999). A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theor. Appl. Genet. 98: 107-112.

16-  Reddy, M.P., Sarla, N. and Siddiq, E.A. (2002). Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica .128: 9–17.

17-  Ried, R. and Benet, S.J. (1999). Reason for collecting wild plants: In Benet, S.J. and Cocks, P.S. Genetic resources of Meditranean pasture and forage legumes. Pp: 32-40. Kluwer academic publishers. Netherland.

18-  Rohlp, F.J. (1992). NTSYS-pc (numerical taxonomy and multivariate analysis system).vesion 2.02.exeter publ.setauket.ny.

19-  Rubio-Moraga, A., Castillo-López, R., Gómez-Gómez, L. and Ahrazem, O. (2009). Saffron is a monomorphic species as revealed by RAPD, ISSR and microsatellite analyses BMC Research Notes.2:189.

20-  Rubio-Moraga, A. Trapero-Mozos, A., Gomez-Gomez, L., and Ahrazem, O. (2010). Intersimple sequence repeat markers for molecular characterization of Crocus cartwrightianus cv. Albus. Industrial Crops and Products 32: 147-151.

21-  Schaal, B.A., Leverich, W.J. and Rogstad, S.H. (1991). Comparison of methods for assessing genetic variation in plant conservation biology. In: Falk, D.A. and Holsinger, K.E. (Eds). Genetics and Conservation of Rare plant. Oxford University Press, New York, pp.123-134.

22-  Sik, L., Candan, F., Soya, S., Karamenderes, C., Kesercioglu, T. and Tanyyolc, B. (2008). Genetic variation among crocus L.species from western turkey as revealed by RAPD and ISSR marker.journal of applied biological science. 2:73-78.

23-  Tsumura, Y., Ohba, K. and Strauss, S.H. (1996). Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in Douglasfir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica). Theor Appl Genet 92: 40–45.

24-   Zietkiewicz, E., Rafalski, A. and Labuda, D. (1994). Genome fingerprinting by simple sequencerepeat (SSR) – anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176–183.