نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی دانشگاه مازندران

2 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه مازندران

چکیده

حضور انواع آلاینده‌های آلی از جمله بنزن و مشتقات آن در آب و فاضلاب به دلیل خطراتی که بر سلامت انسان و محیط ‌زیست دارند موجب نگرانی گسترده شده است. از روش‌های مفید برای شناسایی حضور آلاینده‌ها در محیط‌زیست، سنجش سمیت بر اساس مهار نورتابی باکتری‌های نورافشان می‌باشد. هدف پژوهش حاضر، شناسایی حضور برخی مشتقات بنزن به روش زیست‌سنجی بر پایه مهار نورتابی باکتری بومی نورافشان ویبریو MM1جدا شده از دریای مازندران بود. برای سنجش سمیت، غلظت های مختلف بنزن و برخی مشتقات آن با محیط رشد باکتری نورافشان مجاور شد. سمیت مشتقات بنزنی از طریق کاهش نورتابی ویبریو MM1 به کمک لومینومتر سنجیده شد. نتایج نشان داد نورتابی باکتری MM1 در حضور مشتقات بنزن کاهش چشمگیری داشت به طوریکه باکتری توانایی تشخیص غلظت‌های بسیار پایین تا 18-10 میلی‌گرم بر لیتر را داشت. همچنین مقادیر EC50 برای بنزن، اتیل‌بنزن، برمو‌بنزن، کلرو‌بنزن، آنیلین، کلرو‌فنل، نیترو‌بنزن، رزورسینول و پیروکتکول به ترتیب 14-10×41/3، 13-10×83/7، 8-10×29/1، 9-10×91/2، 5-10×82/1، 8-10×28/3، 3-10×9/2، 4-10×2 و 3-10×3/8 میلی‌گرم بر لیتر محاسبه شد. برای ارزیابی سمیت حاد و سمیت مزمن مشتقات بنزن، پارامتر T1/2 برای هر غلظت محاسبه شد. نتایج نشان داد اتیل‌بنزن با غلظت 10-10×7/1 میلی‌گرم بر لیتر دارای بیشترین سمیت حاد و نیترو‌بنزن با غلظت 10-8×9/1 میلی‌گرم بر لیتر دارای بیشترین سمیت مزمن با مقدار T1/2 به ترتیب 6/15 و 9/471 ثانیه بود. نتایج پژوهش حاضر نشان داد ویبریو MM1 بومی نورافشان می‌تواند برای شناسایی و سنجش سمیت آلاینده‌های زیست‌ محیطی شامل مشتقات بنزن مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Bioassay detection of some benzene derivatives using luminescent bacterium Vibrio sp. MM1 isolated from the Caspian Sea

نویسندگان [English]

  • Mojtaba Mohseni 1
  • Seyede Fariba Pourseyed 2
  • Mohammad Javad Chaichi 1

1 University of Mazandaran

2 MSc in Microbiology, University of Mazandaran

چکیده [English]

Presence of different organic pollutions including benzene and its derivatives in water and wastewater has become a major concern. Cytotoxicity assay based on bacterial luminescence inhibition is useful method for detection of pollutants in the environment. Purpose of this study was the detection of some benzene derivatives using cytotoxicity assay based on luminescence inhibition of native Vibrio MM1 isolated from the Caspian Sea. In order to conduct the toxicity test, different concentration of some benzene derivatives was added individually to the growth culture of Vibrio MM1. The cytotoxicity of benzene derivatives was measured by considering the reduction of Vibrio MM1 luminescence using a luminometer. The results showed that the luminescent intensity of MM1 was significant reduced in the presence of benzene derivatives, so that a very low concentrations of benzene derivatives until 10-18 mgL-1 were measured. In addition, the EC50 value were measured 3.4×10-14 , 7.83×10 -13, 1.29×10 -8, 2.91×10 -9, 1.82 ×10 -5, 3.82× 10-8, 2.9×10-3 , 2×10-4, and 8.3 ×10-3 mgL-1 for benzene, ethylbenzene, bromobenzen, chlorobenzen, aniline, chlorophenol, nitrobenzene, resorcinol and pyrocatechol, respectively. To evaluate the acute and chronic effects of benzene derivatives, T1/2 parameter was calculated for each concentration. These results demonstrated that the concentration of 1.7×10-7 mgL-1 ethylbenzene and 1.9×10-8 mgL-1 nitrobenzene had the highest acute and chronic toxicity with the T1/2 values of 15.6 and 471.9 seconds, respectively. The results of current study indicated that the native luminescent Vibrio sp. MM1 can be useful for detection and cytotoxicity assessment of environmental pollutants including benzene derivatives.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Benzene derivatives
  • toxicity assay
  • Bioluminescence
  • Vibrio sp. MM1

شناسایی برخی مشتقات بنزن به روش زیست سنجی توسط باکتری نورافشان ویبریو MM1 جدا شده از دریای مازندران

مجتبی محسنی1*، سیده فریبا پورسید1‌ و محمدجواد چایچی2

1 ایران، بابلسر، دانشگاه مازندران، گروه میکروبیولوژی

2 ایران، بابلسر، دانشگاه مازندران، گروه شیمی تجزیه

تاریخ دریافت: 14/10/98              تاریخ پذیرش: 22/5/99

چکیده

حضور انواع آلاینده‌های آلی از جمله بنزن و مشتقات آن در آب و فاضلاب به دلیل خطراتی که بر سلامت انسان و محیط ‌زیست دارند موجب نگرانی گسترده شده است. از روش‌های مفید برای شناسایی حضور آلاینده‌ها در محیط‌زیست، سنجش سمیت بر اساس مهار نورتابی باکتری‌های نورافشان می‌باشد. هدف پژوهش حاضر، شناسایی حضور برخی مشتقات بنزن به روش زیست‌سنجی بر پایه مهار نورتابی باکتری بومی نورافشان ویبریو  MM1جدا شده از دریای مازندران بود. برای سنجش سمیت، غلظت های مختلف بنزن و برخی مشتقات آن با محیط رشد باکتری نورافشان مجاور شد. سمیت مشتقات بنزنی از طریق کاهش نورتابی ویبریو MM1 به کمک لومینومتر سنجیده شد. نتایج نشان داد نورتابی باکتری MM1 در حضور مشتقات بنزن کاهش چشمگیری داشت به طوریکه باکتری توانایی تشخیص غلظت‌های بسیار پایین تا 18-10 میلی‌گرم بر لیتر را داشت. همچنین مقادیر EC50برای بنزن، اتیل‌بنزن، برمو‌بنزن، کلرو‌بنزن، آنیلین، کلرو‌فنل، نیترو‌بنزن، رزورسینول و پیروکتکول بترتیب 14-10×41/
13-10×83/8-10×29/9‑10×91/5-10×82/8-10×28/3،  3-10×9/4-10× 2 و 3-10×3/8 میلی‌گرم بر لیتر محاسبه شد. برای ارزیابی سمیت حاد و سمیت مزمن مشتقات بنزن، پارامتر T1/2 برای هر غلظت محاسبه شد. نتایج نشان داد اتیل‌بنزن با غلظت 10-10×7/1 میلی­گرم بر لیتر دارای بیشترین سمیت حاد و نیترو‌بنزن با غلظت 8-10×9/1 میلی­گرم بر لیتر دارای بیشترین سمیت مزمن با مقدار T1/2 بترتیب 6/15 و 9/471 ثانیه بود. نتایج پژوهش حاضر نشان داد ویبریو MM1 بومی نورافشان می‌تواند برای شناسایی و سنجش سمیت آلاینده‌های زیست‌ محیطی شامل مشتقات بنزن مورد استفاده قرار گیرد.

واژه‌های کلیدی: مشتقات بنزن، سنجش سمیت، بیولومینسانس، ویبریو MM1

* نویسنده مسئول، تلفن: 01135302497، پست الکترونیکی: M.Mohseni@umz.ac.ir

مقدمه

 

رشد جمعیت و صنعتی شدن به میزان قابل توجهی، آلودگی آب و خاک را افزایش داده است. آلاینده‌های مختلف شامل ترکیبات آلی و معدنی در حجم زیاد و به طور دائم وارد محیط زیست می­شود. در میان آلاینده‌های آلی، انواع هیدروکربن‌های آلیفاتیک، آروماتیک تک حلقه و چند حلقه، ترکیبات نیترو آروماتیک و کلرو آروماتیک سهم زیادی از آلودگی محیط زیست را به خود اختصاص داده است. آب‌های سطحی و زیرزمینی در معرض آلودگی به انواع آلاینده‌های آلی قرار دارند و یکی از علل اصلی ابتلا به بیماری‌ها و مرگ و میر در جهان به شمار می‌آید (23). حضور انواع آلاینده‌های آلی از جمله بنزن و مشتقات آن در آب و فاضلاب به دلیل خطراتی که روی سلامت انسان و محیط زیست دارند، موجب نگرانی گسترده شده است. به طوری که مواجه بیش از حد مجاز با این مواد موجب بروز انواع بیماری‌ها به ویژه سرطان خون می‌گردد (24).

برای ارزیابی سمیت و خطرات زیست محیطی آلاینده‌ها، می‌توان از روش‌های آنالیز دستگاهی مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و یا کروماتوگرافی گازی- طیف سنجی (GC-MS) استفاده کرد. این روش‌ها به دلیل هزینه بالا، زمان طولانی آنالیز و نیاز به اپراتور با تجربه، محدودیت‌هایی ایجاد می‌کنند (6). برای غلبه بر این محدودیت‌ها، روش‌های زیست‌سنجی و ساخت بیوسنسور‌ها جایگزین شده است که به دلیل پاسخ سریع، حساسیت بالا، هزینه کم و عدم نیاز به اپراتور متخصص، ابزار کارآمدی برای تشخیص آلاینده‌ها به شمار می­آید (8).

زیست‌سنجی روشی برای تجزیه و تحلیل اثرات سمی و تعیین غلظت آلاینده­ها بر اساس تاثیرات آن روی موجودات زنده است که برای تشخیص خطرات زیست محیطی، شناسایی سمیت مواد شیمیایی یا محصولات تجاری، ارزیابی کیفیت آب و فاضلاب و تاثیر آن بر محیط زیست مورد استفاده قرار می‌گیرد (13). در میان انواع روش­ها، زیست‌سنجی بر اساس مهار نورتابی باکتری به دلیل سرعت و حساسیت بالا و هزینه کم، اغلب به عنوان اولین روش غربالگری انتخاب می‌شود. در شرایط بهینه، باکتری نورافشان توانایی ساطع کردن نور سبز-آبی را دارد اما در حضور آلاینده‌ها و مواد سمی نظیر یون فلزات سنگین، هیدروکربن‌های آروماتیک، حشره‌کش‌ها و... نورتابی باکتری کاهش یافته و یا از بین می­رود (17).

مهم ترین پارامتر سمیت‌شناسی در زیست‌سنجی مهار بیولومینسانس، EC50 (Effective concentration) است یعنی غلظتی از آلاینده که نورتابی باکتری را حدود 50 درصد کاهش می‌دهد (4).

در پژوهش حاضر سنجش آلاینده‌های هیدروکربنی شامل برخی مشتقات بنزنی به روش زیست‌سنجی بر پایه مهار نورتابی کشت تازه باکتری ویبریو MM1 جدا شده از دریای مازندران بررسی شد. همچنین سمیت حاد و مزمن آلاینده‌های بنزنی بر سیستم نورتابی زیستی باکتری نورافشان به کمک رسم منحنی لومینومتری مطالعه گردید.

مواد و روشها

کشت باکتری نورافشان ویبریو MM1: در پژوهش حاضر از باکتری نورافشان ویبریو MM1 که قبلا در آزمایشگاه تحقیقاتی میکروبیولوژی محیطی و تنوع زیستی دانشگاه مازندران از آب دریای مازندران جدا شده بود، استفاده شد (18). برای کشت باکتری، محیط کشت اختصاصی مایع SWB (Sea water broth) تهیه شد. محیط کشت SWB با مخلوط کردن پپتون 5/0 گرم، عصاره مخمر 5/0 گرم، عصاره گوشت 3/0 گرم، سدیم کلراید 4/2 گرم، پتاسیم کلراید 07/0 گرم، منیزیم کلراید 53/0 گرم، منیزیم سولفات 7 آبه 7/0 گرم، کلسیم کلراید 01/0، گرم در 100 میلی‌لیتر آب دیونیزه تهیه شد (2/0±0/7=pH). همچنین برای مشاهده نورافشانی کلنی باکتری از محیط کشت آگاردار SWA استفاده شد. این محیط کشت با افزودن 5/1 درصد آگار به محیط کشت مایع SWB تهیه شد (19). پس از تلقیح باکتری در محیط کشت، گرمخانه گذاری به مدت 24 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‌گراد انجام شد.

بررسی رشد و نورافشانی ویبریو MM1 : برای بررسی رشد و نورافشانی باکتری بترتیب از روش‌های اسپکتروفتومتری و لومینومتری استفاده شد. پس از شستشوی سلولی از کشت 24 ساعته سویه MM1، سوسپانسیون رسوب سلولی در محیط کشت استریل تهیه شد و با غلظت یک درصد به محیط کشت تازهSWB  تلقیح و در دمای 28 درجه سانتی­گراد گرمخانه گذاری شد. برای سنجش رشد باکتری، میزان جذب نوری محیط رشد در زمان‌های مختلف در طول موج 600 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر  (CT-Chrom Tech 2200)اندازه گیری شد. همزمان با بررسی رشد ویبریو MM1، شدت نسبی نورتابی باکتری به کمک لومینومتر (Berthold) ثبت گردید (9). شدت نورتابی با واحد نسبی لومینسانس یا RLU (Relative Luminescence Unit)  اندازه‌گیری می‌شود و متناسب با شدت نور بر حسب فوتون بر ثانیه محاسبه می‌گردد (11).

سنجش سمیت مشتقات بنزن توسط ویبریو MM1 : برای سنجش سمیت مشتقات بنزن، از سویه نورافشان MM1 استفاده شد. محیط کشت SWB تلقیح شده با باکتری در دمای 28 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‎گذاری شد. پس از 16 ساعت رشد، ارلن به مدت یک ساعت در گرمخانه شیکردار و 100 دور در دقیقه قرار داده شد تا محیط رشد باکتری یکنواخت شود. محلول ذخیره مشتقات بنزن با غلظت مناسب در آب دیونیزه تهیه گردید. برای حل شدن بهتر مشتقات بنزن، محلول ذخیره به مدت یک شبانه روز در تاریکی (جلوگیری از تخریب نوری مشتقات بنزن) و دمای اتاق نگهداری شد (16). بنزن و مشتقات آن شامل آنیلین، اتیل­بنزن، نیتروبنزن، کلروبنزن، کلروفنل، برموبنزن، رزورسینول و پیروکتکول بود. سپس به کمک محلول ذخیره، غلظت 2-10 تا 18-10 از مشتقات بنزن تهیه شد. پس از سنجش اولیه میزان نورتابی محیط رشد 14-16 ساعت ویبریو MM1، سنجش سمیت مشتقات بنزن انجام شد. حجم یک میلی‌لیتر از محیط رشد MM1با یک میلی‌لیتر از غلظت‌های مختلف مشتقات بنزن به طور جداگانه در لوله مخصوص لومینومتر (Berthold) مخلوط و به مدت 15 دقیقه مجاور‌سازی شد (5). نورتابی لوله­های حاوی غلظت‌های مختلف مشتقات بنزن و سوسپانسیون باکتری هر 5 ثانیه و به مدت 140 ثانیه به صورت RLU یا شدت نسبی نورتابی توسط لومینومتر ثبت شد.

آنالیز داده‌های سنجش سمیت: پس از رسم منحنی کاهش نورتابی ویبریو MM1 بر اساس غلظت مشتقات بنزن و شدت نسبی نورتابی (RLU)، معادله خط منحنی‌ها بدست آمد و پارامتر EC50 برای هر ترکیب محاسبه شد. سمیت مشتقات بنزنی به کمک پارامتر EC50 یا غلظت موثر هر ترکیب که باعث کاهش 50 درصد شدت نورتابی باکتری می‌شود، مورد ارزیابی قرار گرفت (3). همچنین پارامتر R2 یا ضریب همبستگی در منحنی کاهش نورتابی باکتری در حضور غلظت‌های مختلف مشتقات بنزن بدست آمد (21). علاوه بر آن، لگاریتم نپرین شدت نسبی نورتابی باکتری (RLU) در حضور غلظت‌های مختلف مشتقات بنزن محاسبه شد و لومینومتری سیستم نورتابی زیستی MM1 (بر اساس لگاریتم نپرین RLU نسبت به زمان) انجام شد. پس از رسم منحنی و تعیین معادله خط، پارامترهای T1/2 و T3/4 محاسبه گردید. مطابق تعریف زمان مورد نیاز برای کاهش 50 درصد و 75 درصد نورتابی باکتری را بترتیب T1/2 و T3/4 گویند (22).

نتایج

رشد و نورتابی ویبریو MM1: پس از کشت سویه نورافشان MM1 در محیط کشت اختصاصی SWB، منحنی رشد باکتری به کمک سنجش جذب نوری محیط رشد در طول موج 600 نانومتر و در فواصل زمانی مشخص رسم شد. به طور همزمان میزان نورتابی ویبریو MM1 در محیط رشد بررسی و منحنی شدت نسبی نورتابی باکتری بر حسب زمان رسم شد. نتایج در شکل 1 نشان می‌دهد رشد باکتری پس از 4 ساعت آغاز شد و با گذشت زمان میزان جذب نوری محیط رشد افزایش یافت. به طوری که جذب نوری محیط رشد پس از 14 ساعت گرمخانه گذاری، به بیش از 6 برابر رسید. همچنین نتایج بررسی شدت نسبی نورتابی باکتری نشان می‌دهد که نورتابی باکتری متناسب با رشد باکتری افزایش یافت. این نتایج نشان می­دهد شدت نورتابی پس از 16 ساعت رشد از کمتر از RLU 100 به RLU 832760 رسید. نتایج شکل 1 نشان می­دهد شدت نورتابی پس از 18 ساعت گرمخانه گذاری روند کاهشی داشت به طوری که پس از 22 ساعت به RLU 117301 رسید.

 

 

شکل 1- رشد() و شدت نورتابی (n) ویبریو  MM1در محیط کشت مایع SWB.


سنجش سمیت مشتقات بنزن در آب توسط ویبریو MM1 : برای بررسی سنجش سمیت، سویه MM1 با غلظت­های مختلف مشتقات بنزن به طور مجزا مجاور شد و نورتابی باکتری به کمک لومینومتر سنجیده شد. سپس منحنی کاهش نورتابی باکتری در حضور هر یک از مشتقات بنزن رسم شد. نتایج سنجش سمیت نیتروبنزن (از طریق رسم منحنی کاهش نورتابی باکتری) نشان می‌دهد کاهش نورتابی از غلظت 13-10×9/1 میلی­گرم بر لیتر آغاز شد، به طوری که شدت نورتابی در غلظت 11-10×9/1 میلی­گرم بر لیتر حدود یک میلیون RLU کاهش یافت (شکل 2). همچنین نتایج نشان می­دهد نورتابی باکتری در حضور نیتروبنزن با غلظت 3-10×9/1 میلی­گرم بر لیتر، به نصف کاهش یافت (EC50). اگرچه با افزایش غلظت نیتروبنزن، کاهش نورتابی باکتری استمرار یافت.

همچنین تاثیر 8 ترکیب بنزنی دیگر بر نورتابی باکتری بررسی شد و منحنی کاهش نورتابی رسم شد (شکل 3). منحنی کاهش نورتابی در شکل 3 نشان داد با افزودن ‌غلظت‌های بسیار پایین از ترکیبات بنزن به سوسپانسیون باکتری، اثرات سمی آن با کاهش نورتابی ویبریو MM1 نمایان شد. این نتایج نشان دهنده حساسیت بسیار زیاد سویه MM1 به سمیت مشتقات بنزن است به طوری که افزایش غلظت ترکیبات بنزنی با کاهش شدت نورتابی باکتری، رابطه مستقیم داشت. همچنین نتایج سنجش پارامترهای EC50 و R2 و نیز معادله خط در جدول 1 خلاصه شده است. این نتایج نشان می­دهد بیشترین سمیت مربوط به برموبنزن و کمترین سمیت مربوط به اتیل­بنزن با مقدار EC50 بترتیب 8-10×29/1 و 13-10×83/7 میلی­گرم بر لیتر بود (جدول 1).

 

جدول 1- ‌مقادیر EC50، R2 و معادله خط برخی مشتقات بنزن براساس سنجش سمیت توسط ویبریو MM1.

مشتقات بنزن

معادله خط

R2

EC50 (mgL-1)

بنزن

Y=-0.0034X–2×10-5

6815/0

14-10 × 41/3

اتیل بنزن

Y=-0.0059X+0.017

7659/0

13-10 × 83/7

برمو بنزن

Y=-0.0073X+0.0164

9843/0

8-10 × 29/1

نیتروبنزن

Y=-0.2195X+2.6341

9523/0

3-10 × 9/2

کلرو بنزن

Y=-0.0843X+0.3311

8941/0

9-10 × 91/2

کلروفنل

Y=-0.2578X+1.1452

891/0

8-10 × 28/3

رزورسینول

Y=-0.3163X+4.9346

888/0

4-10 × 2

پیروکتکول

Y=-0.2209X+3.3616

8631/0

3-10 × 3/8

آنیلین

Y=-0.1191X+1.1952

8115/0

10-5 × 82/1

 

شکل 2- سنجش سمیت نیتروبنزن به روش زیست‌سنجی مهار نورتابی ویبریو MM1.

 

a)

   

 

 

 

شکل 3- سنجش سمیت ترکیبات بنزنی به روش زیست‌سنجی مهار نورتابی ویبریو MM1: بنزن (a)، آنیلین (b)، اتیل‌بنزن (c)، برمو‌بنزن (d)، کلرو‌بنزن (e)، پیروکتکول (f)، رزورسینول (g) و کلرو‌فنل (h).


تعیین بیشترین سمیت حاد و مزمن غلظت­های مختلف مشتقات بنزن بر سیستم نورتابی زیستی ویبریو MM1: نورتابی باکتری در حضور هر غلظت از مشتقات بنزن به طور مجزا و در هر 5 ثانیه طی مدت 140 ثانیه توسط لومینومتر ثبت شد. پس از رسم منحنی لومینومتری مشتقات بنزن (براساس شدت نسبی نورتابی باکتری و زمان) و به کمک معادله خط، پارامتر T1/2 و T3/4 هر منحنی محاسبه شد و در جدول 2 خلاصه شده است. بیشترین سمیت حاد و نیز بیشترین سمیت مزمن بترتیب بر اساس کمترین و بیشترین مقدار T1/2 محاسبه می­شود. با توجه به نتایج بدست آمده در جدول 2 از بین ترکیبات بنزنی، اتیل‌بنزن با غلظت 10-10 ×7/1 میلی­گرم بر لیتر دارای بیشترین سمیت حاد و نیترو‌بنزن با غلظت 8-10 ×9/1 میلی­گرم بر لیتر دارای بیشترین سمیت مزمن با مقدار T1/2 بترتیب 6/15 و 9/471 ثانیه بود. همچنین به عنوان نمونه منحنی لومینومتری اتیل‌بنزن در شکل 4 نشان داده شد. شیب منحنی نورتابی ویبریو MM1 در غلظت‌های
18-10×7/16-10×7/12-10×7/1 و 10-10×7/1 میلی­گرم بر لیتر اتیل بنزن کاهش شدید داشت و نورتابی باکتری با سرعت چشمگیری کاهش یافت.

 

 

شکل 4- منحنی لومینومتری سیستم نورتابی ویبریو  MM1 بر اساس شدت نور بر حسب زمان در حضور غلظت‌های مختلف اتیل‌بنزن.

 

جدول 2- مقادیر T1/2 و T3/4 غلظت‌های مختلف برخی مشتقات بنزن بر اساس سنجش سمیت توسط ویبریو MM1.

غلظت­ها (mgL-1)

مشتقات بنزن

18- 10

16- 10

14- 10

12- 10

10- 10

8- 10

6- 10

4- 10

نیتروبنزن

T1/2

9/72

3/38

5/44

4/90

5/67

9/471

4/290

72

T3/4

5/30

3/15

5/18

5/38

3/28

9/198

5/119

6/29

بنزن

T1/2

3/23

165

8/178

2/184

3/291

396

2/174

1/28

T3/4

4/5

1/51

2/74

1/81

7/135

3/161

6/71

3/12

پیروکتکول

T1/2

3/38

39/41

04/27

04/27

28/31

9/315

3/98

4/156

T3/4

2/31

12/33

89/11

89/11

57/11

134

56/40

8/65

اتیل بنزن

T1/2

7/16

6/20

2/28

5/20

6/15

8/58

4/73

8/100

T3/4

85/6

86/6

2/10

45/7

8/5

46/5

85/30

71/43

آنیلین

T1/2

266

01/208

8/348

0/144

133

2/175

9/66

2/141

T3/4

63

67/39

8/176

3/59

8/54

3/73

3/28

5/57

کلروفنل

T1/2

9/55

7/398

169

4/132

6/31

3/24

5/657

9/115

T3/4

4/22

9/161

4/72

2/55

8/12

21/10

7/278

49

برموبنزن

T1/2

3/25

1/64

9/28

1/41

5/81

5/98

6/89

3/20

T3/4

7/10

1/26

3/13

9/17

4/37

2/41

3/38

6/8

کلروبنزن

T1/2

15/57

19/19

295

4/61

57

85

2/126

3/43

T3/4

11/23

14/17

3/125

6/25

4/48

2/35

6/53

3/18

رزورسینول

T1/2

2/91

8/90

5/182

3/47

7/355

99/14

8/178

630

T3/4

2/37

2/38

7/76

9/18

9/131

39/15

74

3/266

 


بحث

در سال‌های اخیر، آلودگی آب­های سطحی و زیرزمینی، دریاها و اقیانوس‌ها به دلیل اهمیتی که برای زندگی انسان و آبزیان دارند، به مسئله‌ای جدی در سطح جهان تبدیل شده است. یکی از مهم‌ترین آلاینده‌های منابع آب، هیدروکربن‌های نفتی می‌باشد که منشا آن ضایعات و پسماند صنایع مختلف، پالایشگاه‌های نفت و گاز، حمل و نقل دریایی و نیز آتشفشان است (10).

هیدروکربن‌های آروماتیک به ویژه مشتقات بنزن به واسطه سمیت زیاد و پایداری بالا در محیط زیست، و نیز داشتن اثرات حاد و مزمن از طریق ایجاد بیماری­هایی نظیر سرطان، ناهنجاری ژنتیکی، اختلال در تولید مثل، اختلالات عصبی و ... مورد توجه قرار می‌گیرند (25).

روش‌های مختلف آنالیز دستگاهی برای سنجش سمیت آلاینده‌های تخلیه شده به محیط زیست وجود دارد. برای غلبه بر محدودیت‌های سنجش سمیت به روش­های فیزیکی و ‌شیمیایی، سنجش زیستی معرفی شده است (1). از آن‌جا که روش­های سنجش آلاینده­ها مبتنی بر حیوانات، گیاهان و جلبک‌ها، وقت‌گیر و هزینه‌بر است سنجش زیستی بر پایه باکتری‌های نورافشان به دلیل پاسخ سریع آنها به سموم شیمیایی و یا زیستی، به عنوان روش‌های غربالگری اولیه به کار گرفته می‌‌شوند (12).

برای انجام سنجش سمیت توسط باکتری نورافشان، به باکتری‌هایی با توانایی نورتابی پایدار نیاز است. لذا در پژوهش حاضر از باکتری نورافشان ویبریو MM1 با قابلیت نورتابی مطلوب استفاده شد. آنالیز تطبیقی قبلی توالی ژن 16S rRNA ویبریو MM1 نشان داد این سویه بیش از 99% هومولوژی با باکتری نورافشان ویبریو کمپلی دارد (19). نتایج رشد و نورافشانی ویبریو MM1 نشان داد رشد باکتری از ساعت‌های اولیه تلقیح در محیط کشت SWB آغاز و با گذشت زمان افزایش یافت. در حالیکه شدت نورتابی باکتری تا 6 ساعت ابتدای رشد بسیار کم بود اما بعد از 14 ساعت گرمخانه گذاری افزایش پیدا کرد. این نتایج نشان می‌دهد نورتابی با پدیده حد نصاب احساس در باکتری ها قابل توجیه می‌باشد. آنتزبرگر و همکارانش نشان دادند ویبریو هارویی یکی از بهترین ارگانیسم‌های مشخص شده در پدیده حدنصاب احساس است. در این پژوهش آنالیز میزان نورتابی با فرآیند حدنصاب احساس در سویه وحشی ویبریو هارویی نشان داد در تراکم سلولی بالا، 69 % از سلول‌های باکتری توانایی نورافشانی دارند. در ساعات ابتدایی رشد، تراکم سلولی باکتری­ها و همچنین غلظت خود القاگرهای وارد شده به محیط رشد پایین است. با گذشت زمان و افزایش رشد و تراکم سلولی باکتری، غلظت خود القاگرهای مورد نیاز برای پدیده حدنصاب احساس به حد آستانه می­رسد و توسط رسپتورهای اختصاصی موجود در غشاء سیتوپلاسمی باکتری­ها شناسایی می­شود. شناسایی سیگنال‌ها توسط رسپتورها، علاوه بر بیان ژن‌های ضروری برای انجام عملکردهای گروهی مانند نورتابی، منجر به فعال‌سازی تولید مجدد سیگنال‌ها شده و در نتیجه نورافشانی باکتری در سطح مطلوب و پایدار ادامه می­یابد (2).

هیدروکربن‌های آروماتیک به خصوص مشتقات بنزن به واسطه فعالیت‌های صنعتی، به طور مستمر وارد محیط زیست می‌شوند و سمیت و پایداری زیادی در محیط طبیعی دارند. در پژوهش حاضر سنجش سمیت 9 ترکیب بنزنی شامل بنزن، آنیلین، اتیل‌بنزن، برموبنزن، نیتروبنزن، کلروبنزن، کلروفنل، رزورسینول و پیروکتکول به کمک باکتری ویبریو MM1 ارزیابی شد. در پژوهشی مشابه هارتنیک و نورلی در سال 2007، برای سنجش سمیت ترکیبات بنزنی در آب‌های زیرزمینی، از دستگاه‌های GC-MS و HPLC و نیز از باکتری ویبریو فیشری در کیت استاندارد Microtox استفاده کردند (7). مقایسه نتایج حاصل از سنجش سمیت به کمک ویبریو  MM1و ویبریو فیشری نشان داد مقدارEC50  برای بنزن بترتیب 14-10×41/3 و 78/102 میلی‌گرم بر لیتر و برای اتیل­بنزن بترتیب 13-10×83/7 و 69/9 میلی‌گرم بر لیتر بود. این نتایج نشان می‌دهد ویبریو MM1، در مقایسه با ویبریو فیشری لیوفیلیزه در کیت استاندارد Microtox، حساسیت بسیار بیشتری به دو آلاینده بنزن و اتیل بنزن دارد. علاوه بر آن، مقایسه مقادیر EC50 برگرفته از پژوهش پاروز و همکارانش به کمک ویبریو فیشری (20) و نیز نتایج ویبریو MM1 مطالعه حاضر برای آنیلین بترتیب 257 و
5-10×84/1 میلی‌گرم بر لیتر و برای اتیل­بنزن بترتیب 6 و 15-10×83/7 میلی‌گرم بر لیتر بود. این نتایج نشان از حساسیت بالا ویبریو MM1 به غلظت­های بسیار پایین مشتقات بنزنی نسبت به ویبریو فیشری دارد.

همچنین لی و همکارانش در سال 2013 مطالعه روی مهار بیولومینسانس باکتری ویبریو فیشری در حضور هیدروکربن‌های آروماتیک شامل بنزن و مشتقات آن و نیز هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه انجام دادند. نتایج این تحقیق، مهار بیولومینسانس در حضور این ترکیبات را تایید کرد و نشان داد، با افزایش غلظت این ترکیبات میزان سمیت بیشتر شده و مهار لومینسانس بیشتر می‌شود. همچنین مشخص شد مقدار EC50 ‌هر ماده از مقدار انحلال پذیری آن ماده در آب، کمتر است.  مقایسه نتایج حاصل از سنجش سمیت به کمک ویبریو  MM1و کشت تازه ویبریو فیشری نشان داد مقدارEC50  برای بنزن بترتیب 14-10×41/3 و 823/13 میلی‌گرم بر لیتر و برای اتیل‌بنزن بترتیب 13-10×83/7 و 637/2 میلی‌گرم بر لیتر بود. این نتایج نشان می‌دهد کشت تازه ویبریو MM1، در مقایسه با کشت تازه ویبریو فیشری، حساسیت بسیار بیشتری در سنجش دو آلاینده بنزن و اتیل بنزن دارد (15).

همچنین نتایج لومینومتری سیستم نورتابی ویبریو MM1 بر اساس محاسبه پارامتر T1/2 نشان داد این باکتری نورافشان توانایی تشخیص سمیت حاد و مزمن آلاینده‌ها را دارد. ترکیبات سمی و کشنده به طور گسترده به محیط زیست وارد می­شوند که علاوه بر زمان اثرگذاری بلند مدت و به صورت مزمن روی موجودات زنده، میزان سمیت و کشندگی بالایی نیز دارند. مقادیر زیاد پارامترهای T1/2 و T3/4 در سیستم‌های نورتابی نمایانگر اثرگذاری بلند مدت و مزمن ترکیبات آلاینده می‌باشد. در این سیستم‌ها این نگرانی وجود ندارد که برای سنجش سمیت، حتما از بیشینه شدت نورتابی باکتری استفاده شود. همچنین اندازه گیری سمیت در طی زمان و با خطای کمتری همراه است (14و22).

به طور کلی نتایج سنجش سمیت نشان می‌دهد باکتری ویبریو MM1، حساسیت بالایی در زیست‌سنجی و تشخیص غلظت بسیار پایین مشتقات بنزن را دارد. نتایج مطالعه حاضر نشان داد ویبریو MM1 گزینه مناسبی در زمینه زیست‌سنجی مهار نورتابی بوده و می‌تواند برای تشخیص سریع آلاینده‌های زیست‌ محیطی به ویژه مشتقات بنزن در نمونه‌های طبیعی آبی و نیز پساب صنایع مورد استفاده قرار گیرد.

1- Abbas, M., Adil, M., Ehtisham-ul-Haque, S., Munir, B., Yameen, M., Ghaffar, A., ... & Iqbal, M. (2018). Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for ecotoxicity assessment: A review. Science of the Total Environment, 626, 1295-1309.
2- Anetzberger, C., Pirch, T., & Jung, K. (2009). Heterogeneity in quorum sensing‐regulated bioluminescence of Vibrio harveyi. Molecular microbiology, 73(2), 267-277.
3- Bundy, J. G., Wardell, J. L., Campbell, C. D., Killham, K., & Paton, G. I. (1997). Application of bioluminescence‐based microbial biosensors to the ecotoxicity assessment of organotins. Letters in Applied Microbiology, 25(5), 353-358.
4- Drzyzga, O., Gorontzy, T., Schmidt, A., & Blotevogel, K. H. (1995). Toxicity of explosives and related compounds to the luminescent bacterium Vibrio fischeri NRRL-B-11177. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 28(2), 229-235.
5- El-Alawi, Y. S., McConkey, B. J., Dixon, D. G., & Greenberg, B. M. (2002). Measurement of short-and long-term toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons using luminescent bacteria. Ecotoxicology and Environmental Safety, 51(1), 12-21.
6- Girotti, S., Ferri, E. N., Fumo, M. G., & Maiolini, E. (2008). Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria. Analytica Chimica Acta, 608(1), 2-29.
7- Hartnik, T., Norli, H. R., Eggen, T., & Breedveld, G. D. (2007). Bioassay-directed identification of toxic organic compounds in creosote-contaminated groundwater. Chemosphere, 66(3), 435-443.
8- Hoskins, W. M., & Craig, R. (1962). Uses of bioassay in entomology. Annual Review of Entomology, 7(1), 437-464.
9- Kahru, A., Tomson, K., Pall, T., & Külm, I. (1996). Study of toxicity of pesticides using luminescent bacteria Photobacterium phosphoreum. Water Science and Technology, 33(6), 147.
10- Kaksonen, A. H., Jussila, M. M., Lindström, K., & Suominen, L. (2006). Rhizosphere effect of Galega orientalis in oil-contaminated soil. Soil Biology and Biochemistry, 38(4), 817-827.
11- Kelly, C. J., Tumsaroj, N., & Lajoie, C. A. (2004). Assessing wastewater metal toxicity with bacterial bioluminescence in a bench-scale wastewater treatment system. Water Research, 38(2), 423-431.
12- Lakzian, A. (2009). Determination of toxicity threshold of zinc and copper for E. coli (as biosensor). Journal of Water and Soil. 23(1): 1-7 [Persian].
13- Laska, E. M., & Meisner, M. J. (1987). Statistical methods and applications of bioassay. Annual review of Pharmacology and Toxicology, 27(1), 385-397.
14- Laughlin, R., & Linden, O. (1983). Oil pollution and Baltic mysids: acute and chronic effects of the water soluble fractions of light fuel oil on the mysid shrimp Neomysis integer. Marine Ecology Progress Series, 12, 29-41.
15- Lee, S. Y., Kang, H. J., & Kwon, J. H. (2013). Toxicity cutoff of aromatic hydrocarbons for luminescence inhibition of Vibrio fischeri. Ecotoxicology and environmental safety, 94, 116-122.‏
16- Leme, D. M., Grummt, T., Heinze, R., Sehr, A., Renz, S., Reinel, S., ... & Zocolo, G. J. (2012). An overview of biodiesel soil pollution: data based on cytotoxicity and genotoxicity assessments. Journal of Hazardous Materials, 199, 343-349.
17- Medvedeva, S. E., Tyulkova, N. A., Kuznetsov, A. M., & Rodicheva, E. K. (2009). Bioluminescent bioassays based on luminous bacteria. Journal of Siberian Federal University, 4, 418-452.
18- Mohseni, M., Maghool, S. S. (2016). Toxicity assay of heavy metals Pb, Cd and Cu by luminescent bacterium isolated from the Caspian Sea. Journal of Cellular and Molecular Researches, 28(4), 588-598 [Persian].
19- Mohseni, M., Abbaszadeh, J., Maghool, S. S., & Chaichi, M. J. (2018). Heavy metals detection using biosensor cells of a novel marine luminescent bacterium Vibrio sp. MM1 isolated from the Caspian Sea. Ecotoxicology and Environmental Safety, 148, 555-560.
20- Parvez, S., Venkataraman, C., & Mukherji, S. (2006). A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environment International, 32(2), 265-268.
21- Parvez, S., Venkataraman, C., & Mukherji, S. (2008). Toxicity assessment of organic pollutants: reliability of bioluminescence inhibition assay and univariate QSAR models using freshly prepared Vibrio fischeri. Toxicology in vitro, 22(7), 1806-1813.
22- Shamsipur, M., Yeganeh-Faal, A., Chaichi, M. J., Tajbakhsh, M., & Parach, A. (2007). A study of chemiluminescence from reaction of bis (2, 4, 6-trichlorophenyl) oxalate, hydrogen peroxide and an optical brightener 5-(3-anilino-5-chloroanilino)-2-{(E)-2-[4-(3-anilino-5-chloroanilino)-2-sulfophenyl]-1-ethenyl}-1-benzenesulfonic acid. Dyes and Pigments, 72(1), 113-118.
23- Spengler, J. D., & Sexton, K. (1983). Indoor air pollution: a public health perspective. Science, 221(4605), 9-17.
24- Smith, M. T., Zhang, L., McHale, C. M., Skibola, C. F., & Rappaport, S. M. (2011). Benzene, the exposome and future investigations of leukemia etiology. Chemico-Biological Interactions, 192, 155-159.
25- Williams, P. L., & Burson, J. L. (1985). Industrial toxicology.Van Nostrand Reinhold Company, New York, pp. 230-259.