نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه شیمی آلی ودارویی/پژوهشکده فناوریهای شیمیایی/سازمان پژوهشهای علمی وصنعتی ایران/تهران/ایران

2 عضو هیئت علمی گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس،تهران، ایران

چکیده

ترکیبات ارگانوفسفره نظیردیازینون بدلیل ویژگیهای منحصربفردخود بطوروسیعی بعنوان آفت کش وحشره کش درکشاورزی مورداستفاده قرارمی گیرند. آنزیم ارگانوفسفات هیدرولاز(OPH) بطور موثری طیف وسیعی از ترکیبات استری ارگانوفسفاتهارا هیدرولیز می نماید. دراین تحقیق با استفاده ازدو تکنیک غنی سازی محیط کشت و حداکثرتکرار دررقت سازی، میکروارگانیسم تجزیه کننده دیازینون از نمونه های تیمار شده بادیازینون (مزارع شالیکاری)، جداسازی وباانجام تستهای مورفولوژیکی وبیوشیمیایی شناسایی شد.سپس آنزیم ازسویه باکتریایی استخراج و بترتیب بااستفاده ازرسوب دهی باسولفات آمونیوم وکروماتوگرافی تعویض یونی تخلیص گردید. خلوص آنزیم بااستفاده ازالکتروفورزSDS-PAGE تاییدووزن مولکولی آن نیز توسط مارکرپروتئینی مشخص وخواص کینتیکی آن بررسی گردید.
بااستفاده ازتکنیک غنی سازی محیط کشت و افزایش عامل تجزیه زیستی نمونه های تیمارشده بادیازینون، زمان هیدرولیز آنزیمی باکاهش قابل توجهی به کمتراز10ساعت تقلیل یافت. متابولیت اصلی حاصل ازهیدرولیزآنزیمی دیازینون،-2 ایزو پروپیل--6 متیل-4-هیدروکسی پیریمیدین (IMHP) بااستفاده ازدوتکنیک کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و اسپکتروفتومتری شناسایی گردید. IMHP درمقایسه بادیازینونسمیت کمتری دارد. آنزیم OPH به میزان 48/57 مرتبه، بافعالیت ویژه 44/16 واحددر میلیگرم پروتئین ازمحلول عصاره آنزیمی وبازده4/11درصد ووزن مولکولی تقریبیKD40خالص سازی شد. دما وpH بهینه برای ماکزیمم فعالیت آنزیم بترتیب برابر Cͦ 37 و 5/8 بود. علاوه براین غلظت سوبسترا تاM05/0ویونهای فلزیCa+2, Co+2 به ترتیب 119و106درصد تاثیر مثبت برفعالیت آنزیم داشتند. پارامترهای ثابت میکائیلیس(Km) وحداکثر سرعت آنزیم(Vmax) برای دیازینون بعنوان سوبسترای واکنش بترتیب برابربا Mµ2/434 و Mµ3/107 دردقیقه محاسبه گردید. نتیجه اینکه آنزیم OPH بافعالیت تدریجی و موثر خود علاوه بر سم زدایی، می تواند نقشی کلیدی درآزادسازی فسفات برای تولیدکودزیستی ایفاءکند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Performance evaluation of soil microorganism producing organophosphate hydrolase enzyme in detoxification of organophosphorus compounds (diazinon) and its kinetic properties assessment

نویسندگان [English]

  • mohammad haji abolhasani 1
  • Abbas Sahebghadam Lotfi 2

1 Organic chemistry and pharmaceutical department/ institute chemical technologies/Iranian research organization for science & technology

2 Department of Clinical Biochemistry, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.

چکیده [English]

Organophosphorus compounds, are widely used as pesticides in agriculture. Organophosphate Hydrolase (OPH) enzyme hydrolyses a wide variety of organophosphate esters. In the present study, by using both enrichment culture and maximum dilution frequency techniques, the diazinon degradation bacteria was isolated from treated samples and was identified by morphological and biochemical tests. The enzyme was extracted from its bacterial strain and then purified using ammonium sulfate and ion exchange chromatography. The purity of the enzyme was confirmed by electrophoresis (SDS-PAGE), then its molecular weight was determined by specific marker proteins and its kinetic properties was evaluated.
Using enrichment culture technique and the increasing factor of the biodegradability diazinon, enzymatic hydrolysis time decreased significantly with less than 10 hours. The main metabolite produced from diazinon hydrolysis was identified as 2-isopropyl-6-methyl-4-Hydroxy pyrimidine (IMHP, with less toxicity) through both thin layer chromatography (TLC) and spectrophotometry techniques. Purified OPH enzyme specific activity was found to be 57.48 fold of 16.44 U/mg of protein with a yield of 11.4 percent and approximate molecular weight of 40 KD. Maximum activity enzyme was at optimum pH 8.5 and temperature of 37 ͦ C. Substrate concentration up to 0.05 M and Co+2, Ca+2 metal ions had positive effects on activity enzyme. Michaelis constant (Km) and maximal velocity (Vmax) values were calculated as 434.2 μM and 107.3 μM/min, respectively. The results showed that OPH enzyme with its activity gradual and effective in addition to detoxification, could be played a key role in recovery of phosphate for the production of biofertilizer.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Organophosphate Hydrolase (OPH)
  • Diazinon
  • 2-isopropyl-6-methyl-4-Hydroxy pyrimidine (IMHP)
  • enzymatic hydrolysis