نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسنده
عضو هیات علمی گروه زیست شناسی دانشگاه پیام نور
چکیده
پنیرک از قدیمیترین گیاهان دارویی میباشد که در طب کاربرد فراوان دارد. استخراج DNAبه روش CTAB برای 19 ژنوتیپ پنیرک از مناطق جغرافیایی مختلف ایران انجام گرفت و با استفاده از 15 نشانگر مولکولی SCoT تنوع ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. نشانگر SCoT در بین ژنوتیپها چندشکلی مطلوبی نشان داد و اکثر آغازگرها برای بررسیهای این گونه مناسب بودند. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 83 باند تولید کنند، که 76 باند چند شکل مشاهده شد. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 19 ژنوتیپ برابر 36/4 بود که آغازگرهای SC36، SC11 و SC5 بیشترین تعداد باند (8) و آغازگرهای SC26 و SC15 کمترین تعداد باند (3) را نشان دادند. نتایج نشان داد که بیشترین تشابه را ژنوتیپهای 18G و 19G و کمترین تشابه را ژنوتیپ 15G با ژنوتیپ 3G داشتند. گروهبندی حاصل از تجزیه خوشهای نشان داد که ژنوتیپها در سه گروه قرار گرفته و تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تطابق نداشت. نتایج حاصل از گروهبندی تجزیه خوشه-ای با استفاده از تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) تایید گردید.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Genetic variation among Iranian genotypes of Malva (Malva neglecta) using Start codon targeted (SCoT)
نویسنده [English]
Department of Biology, Payame Noor University, Iran
چکیده [English]
Malva is one of the well-known medicinal and aromatic plants. The juice is one of the oldest herbs that is widely used in medicine. DNA extraction was carried out using CTAB method for 19 genotypes of different regions of Iran. Using SCoT molecular markers, genetic diversity was investigated. The SCoT marker showed favorable polymorphism among genotypes and most primers were suitable for this species. SCoT primers were able to produce 83 strips in total, with 76 multidimensional bands. The average number of bars produced by each primer for 19 genotypes was 4.36, with SC36, SC11 and SC5 primers having the highest number of bands (8), and the SC26 and SC15 primers showed the least number of bands (3). The results showed that the most similarities were genotypes G18 and G19 and the least similarity was genotypes G15 with G3 genotype. The cluster analysis showed that the genotypes were classified into three groups and genetic variation was not consistent with geographical variation. The results of cluster analysis were grouped using molecular variance analysis (AMOVA).
کلیدواژهها [English]
بررسی تنوع ژنتیکی در بین ژنوتیپهای ایرانی گیاه پنیرک (Malva neglecta) با استفاده از کدونهای آغاز هدف واقع شده (SCoT)
عبدالمهدی نوریان*
ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 5/12/96 تاریخ پذیرش: 25/2/97
چکیده
پنیرک از قدیمیترین گیاهان دارویی میباشد که در طب کاربرد فراوان دارد. استخراج DNAبه روش CTAB برای 19 ژنوتیپ پنیرک از مناطق جغرافیایی مختلف ایران انجام گرفت و با استفاده از 15 نشانگر مولکولی SCoT تنوع ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. نشانگر SCoT در بین ژنوتیپها چندشکلی مطلوبی نشان داد و اکثر آغازگرها برای بررسیهای این گونه مناسب بودند. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 83 باند تولید کنند، که 76 باند چند شکل مشاهده شد. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 19 ژنوتیپ برابر 36/4 بود که آغازگرهای SC36، SC11 و SC5 بیشترین تعداد باند (8) و آغازگرهای SC26 و SC15 کمترین تعداد باند (3) را نشان دادند. نتایج نشان داد که بیشترین تشابه را ژنوتیپهای 18G و 19G و کمترین تشابه را ژنوتیپ 15G با ژنوتیپ 3G داشتند. گروهبندی حاصل از تجزیه خوشهای نشان داد که ژنوتیپها در سه گروه قرار گرفته و تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تطابق نداشت. نتایج حاصل از گروهبندی تجزیه خوشهای با استفاده از تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) تأیید گردید.
واژه های کلیدی: گیاه دارویی، تجزیه خوشهای، تجزیه به مختصات اصلی، تنوع ژنتیکی
* نویسنده مسئول، تلفن: 09184630902، پست الکترونیکی: Mehdi_Noorian@yahoo.com
مقدمه
طی سالیان متمادی داروهای طبیعی خصوصاً گیاهان دارویی، در برخی موارد تنها راه درمان محسوب میشد و در عین حال مواد اولیه در آنها در صنعت داروسازی مورد استفاده قرار میگرفت. توجه به گیاهان دارویی که بخش عمدهای از طب سنتی ایران را تشکیل میدهد و ارائه اطلاعات درست و علمی درباره پرورش، نگهداری و استفاده از آنها بر پایه یافتههای جدید روز به روز اهمیت ویژهای مییابد (21). پنیرک (Malva) گیاهی علفی یک ساله، دوساله یا پایا با خواص شناخته شده دارویی است. گونـههـای مختلـف پنیـرک هماننـد M. neglecta در کشـــورهای مختلف دنیا کشت میگردد یا به طور خودرو رشد میکند (4). خـواص آنتـی اکسیدانی گونههای مختلف پنیرک در نقاط دیگر دنیا توسـط برخـی محققین گزارش شده است (19). نتایج مطالعات انجام شده بر روی خواص ضد میکروبی پنیرک حاکی از آن است که این گیاه دارای فعالیت ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد ویروسی علیه بسیاری از پاتوژنهای انسان است (22). تنوع گونههای گیاهی در یک محیط موجب پایداری و افزایش قابلیت تولید آن اکوسیستم میگردد، اما تنوع داخل گونهها میتواند نقش مهمی را در میزان تولید یک اکوسیستم ایفاء کند (15). آگاهی از سطح تنوع ژنتیکی و برآورد دقیق آن در ژرمپلاسمهای گیاهی و تعیین روابط ژنتیکی بین مواد اصلاحی، پایه و اساس بسیاری از برنامههای اصلاحی است. اهمیت تنوع ژنتیکی در گیاهان از دو دیدگاه مورد توجهاست: نخست تنوع ژنتیکی شرط لازم برای رسیدن به محصول بیشتر و پایداری عملکرد است. از سوی دیگر تنوع ژنتیکی، منابع ژنتیکی مفید برای برنامههای اصلاحی را شناسایی کرده و باعث حفظ آنها میشود (7). انواع مختلفی از نشانگرها در عرصه علوم ژنتیک، ردهبندی و بهنژادی به کار رفتهاند که اصولاً کاربرد آنها تفاوت چندانی با یکدیگر ندارد ولی هر کدام از این نشانگرها دارای مزایا و معایب خاص خود میباشند، مطالعات در سطح جمعیتها نشان میدهد که نشانگر DNA کارآیی بالایی در تشخیص تنوع دارد (23). نشانگرهای مولکولی ابزارهای بسیار مفید و قوی در ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیکی، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت یا تفاوت بین نمونههای مختلف میباشد. نشانگرهای مولکولی وابسته به DNA تحت تأثیر شرایط محیط قرار نمیگیرند و تعداد زیادی از این نشانگرها را میتوان به راحتی در کل ژنوم جستجو نمود (13). نشانگر مولکولی SCoT یا در ترجمه فارسی، کدونهای آغاز هدف واقع شده، روشی است که در آن پرایمرها بر اساس توالیهای آغاز (ATG) طراحی شده و نواحی بین کدونهای آغاز طی واکنش زنجیرهای پلیمراز تکثیر، و تفاوتها آشکار میشود. پرایمرهای SCoT معمولاً 24-18 نوکلئوتیدی هستند و محتوای C و G آنها 50 تا 72 درصد است (12). مبنای عملکرد این نشانگر غالبیت است. دو پرایمر تک رشتهای در واکنش زنجیرهای پلیمراز به رشتههای مخالف DNA الگو، در جهت عکس هم متصل میشوند. چنانچه جهشهای حذف یا اضافه در محل اتصال پرایمر رخ دهد، عدم اتصال پرایمر و عدم سنتز قطعهDNA به وجود خواهد آمد (6). طول پرایمرها در تکرارپذیری این نشانگر اثر مستقیم دارد. هو و وییک (11) با مقایسه پرایمرهای 12 و 18 نوکلئوتیدی و بررسی قابلیت تکرارپذیری آنها به این نتیجه رسیدند که پرایمرهای 18 نوکلئوتیدی قابلیت تکرارپذیری بالایی دارند. از نشانگر مولکولی SCoT در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی مانند جاتروفا (Jatropha curcas) و کاکوتی (Ziziphora tenuior) استفاده شده است که در مقایسه با نشانگرهای RAPD و ISSR تنوع بیشتری را نشان داده است (16 و 24). از آنجایی که نشانگر مولکولی SCoT تنوع را براساس مناطق ژنی نشان میدهد (تکثیر نواحی با کدون آغاز)، استفاده از نتایج این تحقیق برای تلاقی نمونههای با فواصل زیاد ژنتیکی در جهت هتروزیس به منظور اصلاح و افزایش ترکیبات میتواند مفید باشد، در نهایت میتوان از این اطلاعات نیز جهت حفاظت در محل رویشگاه نمونهها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و ایجاد بانک ژرم پلاسم استفاده نمود.
مواد و روشها
در تحقیق انجام شده بذرهای 19 ژنوتیپ از گیاه دارویی پنیرک بهمنظور ارزیابی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT از بانک ژن مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. مشخصات مواد ژنتیکی مورد مطالعه، با ذکر کد ژنوتیپ و محل دریافت یا جمعآوری در جدول 1 نشان داده شده است.
استخراج DNA به روش CTAB تغییر یافته (9) برای هر ژنوتیپ انجام گرفت. برای بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از ژل آگارز ۸/۰ درصد و روش اسپکتروفوتومتری استفاده شد. واکنش زنجیرهای پلیمراز طبق اطلاعات جدول ۲ انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد، به مدت ۵ دقیقه و ۳۵ چرخه حرارتی بود که در هر چرخه، زمان و دمای واسرشتسازی به ترتیب ۳۰ ثانیه و ۹۵ درجه سانتیگراد، زمان اتصال آغازگر ۳۰ ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود.
جدول 1- مشخصات ژنوتیپهای مورد استفاده در این تحقیق
کد بانک ژن |
شهرستان |
استان |
ژنوتیپ |
کد بانک ژن |
شهرستان |
استان |
ژنوتیپ |
22521 |
بندر عباس |
هرمزگان |
G11 |
10534 |
یزد |
یزد |
G1 |
22900 |
قشم |
هرمزگان |
G12 |
12926 |
گنبد |
گستان |
G2 |
22903 |
میناب |
هرمزگان |
G13 |
14342 |
نهاوند |
همدان |
G3 |
26408 |
کرمان |
کرمان |
G14 |
15504 |
شاهدیه |
یزد |
G4 |
30789 |
دامغان |
سمنان |
G15 |
15843 |
تفت |
یزد |
G5 |
33487 |
طبس |
یزد |
G16 |
15922 |
صدوق |
یزد |
G6 |
34327 |
دهلران |
ایلام |
G17 |
20011 |
هریس |
آذربایجان شرقی |
G7 |
34338 |
دهلران |
ایلام |
G18 |
21113 |
صدوق |
یزد |
G8 |
34808 |
بندر عباس |
هرمزگان |
G19 |
21122 |
بافق |
یزد |
G9 |
|
|
|
|
21601 |
سمنان |
سمنان |
G10 |
جدول ۲- اجزای مخلوط واکنش SCoTبهینه سازی شده
اجزا یک نمونه |
جهت تهیه ۲۰میکرولیتر |
آب دوبار تقطیر |
3/۱۲ میکرولیتر |
بافر PCR (10x) |
۲ میکرولیتر |
MgCl2 (50 میلیمولار ) |
۵/۱ میکرولیتر |
مخلوط نوکلئوتیدی (10 میلیمولار) |
۴/۰ میکرولیتر |
آغازگر (10 میکرومولار) |
5/۱ میکرولیترهر یک |
Taq پلیمراز (5 واحد در میکرولیتر) |
۳/۰ میکرولیتر |
DNA (ng 10) |
۲ میکرولیتر |
جمع |
۲۰ میکرولیتر |
همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتیگراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد با بافر واکنش TBE یک درصد استفاده شد. به منظور بارگذاری نمونه در ژل، ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونهگذاری به DNAهای تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه به درون چاهکهای ایجاد شده در ژل آگارز بارگذاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت. پس از حرکت ژل، جهت رنگآمیزی آن را در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرولیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت مشاهده نوارهای DNA استفاده گردید. محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) از طریق فرمول محاسبه شد، در اینجا p برابر با مجموع نوارهای هر لوکوس برای کلیه ژنوتیپها است (10). در پایان نیز با استفاده از نرم افزارهای Ntsys، DARwin 6 و GenAlEx 6.2 ماتریس تشابه، تجزیه خوشهای، تجزیه به مختصات اصلی و تجزیه واریانس مولکولی مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج
تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای پنیرک مورد مطالعه با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت. شکل 1 الگوی باندی ژنوتیپها با استفاده از آغازگر SC28 را برای 19 ژنوتیپ نشان میدهد. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 83 مکان را تکثیر کنند که از این تعداد 7 باند یک شکل مشاهده شد و سایر باندها چند شکل بودند، که آغازگرهای SC36، SC11 و SC5 بیشترین تعداد باند (8) و آغازگرهای SC26 و SC15 کمترین تعداد باند (3) را نشان دادند. میانگین درصد چند شکلی برابر 78/92 درصد بود که کمترین میزان درصد چند شکلی را آغازگرهای SC40 (67/66 درصد) و SC36، SC11 و SC13 (75 درصد) داشتند و درصد چند شکلی برای سایر آغازگرها 100 درصد میباشد. همچنین متوسط تعداد باندهای تولید شده توسط هر آغازگر برای 19 ژنوتیپ برابر 36/4 به دست آمد. بیشترین میزان محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) مربوط به آغازگرهای SC11، SC40 و SC44 بود که این آغازگرها بهتر از سایر آغازگرها توانستند فاصله ژنتیکی ژنوتیپها را مشخص کنند. آغازگر SC26 و SC15 با کمترین میزان محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشتند نتایج به دست آمده برای آغازگرهای استفاده شده در جدول 3 نشان داده شده است.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 L |
شکل 1- الگوی باندی 19 ژنوتیپ پنیرک با استفاده از آغازگر SC28 و ژل آگارز 2 درصد با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید
جدول 3- درصد چند شکلی، تعداد کل باند و محتوای اطلاعات چند شکلی در آغازگرهای مورد استفاده
کد آغازگر |
توالی آغازگر |
دما |
درصدG و C |
تعداد مکانهای تکثیر شده |
تعداد مکانهای چند شکل |
درصد چند شکلی |
PIC |
منبع |
SC36 |
5'-GCAACAATGGCTACCAC-3' |
52 |
94/52% |
8 |
6 |
75 |
31/0 |
|
SC35 |
5'-CATGGCTACCACCGGCC-3' |
58 |
58/70% |
5 |
5 |
100 |
42/0 |
|
SC40 |
5'-CAATGGCTACCACTACAG-3' |
54 |
50% |
6 |
4 |
67/66 |
45/0 |
|
SC59 |
5'-ACAATGGCTACCACCATC-3' |
54 |
50% |
7 |
7 |
100 |
36/0 |
|
SC44 |
5'-CAATGGCTACCATTAGCC-3' |
54 |
50% |
4 |
4 |
100 |
48/0 |
|
SC63 |
5'-ACCATGGCTACCACGGG-3' |
56 |
70/64% |
6 |
6 |
100 |
34/0 |
|
SC28 |
5'-CCATGGCTACCACCGCC-3' |
58 |
58/70% |
6 |
6 |
100 |
39/0 |
|
SC26 |
5'-CACCATGGCTACCACCAT-3' |
56 |
70/64% |
3 |
3 |
100 |
27/0 |
|
SC20 |
5'-ACCATGGCTACCACCGC-3' |
54 |
70/64% |
5 |
5 |
100 |
35/0 |
|
SC15 |
5'-CCATGGCTACCACCGGC-3' |
58 |
58/70% |
3 |
3 |
100 |
22/0 |
|
SC11 |
5'-AAGCAATGGCTACCACCA-3' |
54 |
50% |
8 |
6 |
75/0 |
47/0 |
|
SC5 |
5'-AAGCAATGGCTACCACCA-3' |
54 |
50% |
8 |
8 |
100 |
33/0 |
|
SC13 |
5'-ACGACATGGCGACCATC-3' |
58 |
58/70% |
4 |
3 |
75/0 |
36/0 |
|
SC21 |
5'-AACCATGGCTACCACCG-3' |
54 |
70/64% |
5 |
5 |
100 |
30/0 |
|
SC10 |
5'-CAACAATGGCTACCAGC-3' |
52 |
94/52% |
5 |
5 |
100 |
33/0 |
|
میانگین |
|
|
|
53/5 |
07/5 |
78/92 |
36/0 |
|
ماتریس تشابه: تشابه ژنتیکی ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه جاکارد از 685/0 تا 97/0 متغیر بود، میانگین تشابه بین ژنوتیپها برابر 820/0 بود. بیشترین تشابه را ژنوتیپهای 18G و 19G از گروه 3 و کمترین تشابه را ژنوتیپ 15G از گروه 2 و ژنوتیپ 3G از گروه 3 داشتند (جدول 5).
گروه اول |
گروه دوم |
گروه سوم |
شکل 2- دندروگرام حاصل از دادههای نشانگر SCoT برای ژنوتیپهای مورد مطالعه
تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA): تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروهبندی تجزیه خوشهای انجام شد (جدول 4)، که ژنوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند. بر اساس آماره PhiPT در بین گروهها در سطح 5 درصد اختلاف معنیدار وجود داشت به عبارت دیگر گروهبندی به صورت صحیح انجام گرفته است. نتایج به دست آمده نشان داد که در میان گروهها تنوع بیشتر از بین گروهها میباشد. بر این اساس تنوع در درون گروهها برابر 82 درصد و در بین گروهها تنوع برابر 18 درصد مشاهده گردید.
جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروهبندی ژنوتیپها با استفاده از نشانگر SCoT
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
مجموع مربعات |
میانگین مربعات |
واریانس برآورد شده |
درصد از واریانس |
PhiPT |
بین گروه |
2 |
521/22 |
261/11 |
104/1 |
18% |
*185/0 |
درون گروه |
16 |
900/17 |
869/4 |
869/4 |
82% |
|
کل |
18 |
421/100 |
|
973/5 |
100% |
|
* اختلاف در سطح 5% معنیدار |
تجزیه خوشهای: نمودار خوشهای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد در شکل 2 آمده است. که بر اساس آن ژنوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل ژنوتیپهای 3G، 5G، 8G و 17G بود. میانگین تشابه ژنوتیپهای این گروه برابر 801/0 میباشد که در بین ژنوتیپهای این گروه، ژنوتیپهای 8G و 17G دارای بیشترین تشابه بودند. در گروه دوم ژنوتیپهای 1G، 4G، 10G، 11G و 14G قرار گرفتند. میانگین تشابه این گروه 865/0، که ژنوتیپهای11G و 14G بیشترین تشابه را با یکدیگر داشتند. گروه سوم شامل ژنوتیپهای 5G، 2G، 7G، 9G، 12G، 13G، 15G، 16G، 18G و 19G است. میانگین تشابه در این گروه 875/0 بود که ژنوتیپهای 19G و 18G دارای بیشترین تشابه میباشند.
جدول 5- ماتریس تشابه ژنوتیپها برای پرایمرهای SCoT استفاده شده بر اساس ضریب جاکارد
ژنوتیپ |
G1 |
G2 |
G3 |
G4 |
G5 |
G6 |
G7 |
G8 |
G9 |
G10 |
G11 |
G12 |
G13 |
G14 |
G15 |
G16 |
G17 |
G18 |
G19 |
G1 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G2 |
872/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G3 |
851/0 |
846/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G4 |
863/0 |
916/0 |
857/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G5 |
816/0 |
851/0 |
826/0 |
857/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G6 |
785/0 |
885/0 |
754/0 |
851/0 |
779/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G7 |
792/0 |
931/0 |
840/0 |
851/0 |
807/0 |
843/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G8 |
863/0 |
833/0 |
761/0 |
818/0 |
857/0 |
851/0 |
808/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G9 |
836/0 |
900/0 |
769/0 |
851/0 |
736/0 |
857/0 |
806/0 |
808/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G10 |
888/0 |
897/0 |
744/0 |
844/0 |
739/0 |
823/0 |
846/0 |
800/0 |
880/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G11 |
867/0 |
862/0 |
760/0 |
888/0 |
807/0 |
857/0 |
838/0 |
844/0 |
806/0 |
880/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
G12 |
807/0 |
877/0 |
816/0 |
833/0 |
745/0 |
827/0 |
909/0 |
833/0 |
842/0 |
857/0 |
800/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
G13 |
763/0 |
866/0 |
769/0 |
826/0 |
807/0 |
906/0 |
870/0 |
782/0 |
838/0 |
857/0 |
870/0 |
842/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
G14 |
869/0 |
920/0 |
772/0 |
869/0 |
816/0 |
851/0 |
909/0 |
826/0 |
830/0 |
901/0 |
943/0 |
880/0 |
846/0 |
1 |
|
|
|
|
|
G15 |
705/0 |
821/0 |
685/0 |
714/0 |
800/0 |
807/0 |
851/0 |
761/0 |
821/0 |
790/0 |
778/0 |
754/0 |
857/0 |
818/0 |
1 |
|
|
|
|
G16 |
821/0 |
950/0 |
792/0 |
875/0 |
813/0 |
909/0 |
906/0 |
875/0 |
857/0 |
846/0 |
875/0 |
862/0 |
875/0 |
909/0 |
877/0 |
1 |
|
|
|
G17 |
823/0 |
821/0 |
750/0 |
809/0 |
777/0 |
852/0 |
745/0 |
904/0 |
881/0 |
739/0 |
779/0 |
716/0 |
779/0 |
734/0 |
769/0 |
852/0 |
1 |
|
|
G18 |
857/0 |
943/0 |
808/0 |
857/0 |
784/0 |
928/0 |
912/0 |
857/0 |
945/0 |
867/0 |
872/0 |
943/0 |
888/0 |
892/0 |
851/0 |
947/0 |
862/0 |
1 |
|
G19 |
857/0 |
943/0 |
808/0 |
857/0 |
807/0 |
912/0 |
931/0 |
857/0 |
928/0 |
851/0 |
892/0 |
943/0 |
872/0 |
912/0 |
851/0 |
931/0 |
846/0 |
970/0 |
1 |
شکل 3- بای پلات ژنوتیپها برای نشانگر SCoT بر اساس محور مختصات اصلی اول و دوم
تجزیه به مختصات اصلی (PCo): بر اساس دادههای حاصل از آغازگرهای مورد بررسی تجزیه به مختصات اصلی برای ژنوتیپها انجام شد، نتایج نشان داد محور مختصات اول و دوم به ترتیب 23/21 و 15/17 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 38/38 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی ژنوتیپها رسم گردید (شکل 3)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشهای مطابقت نداشت.
بحث و نتیجهگیری
با استفاده از آغازگرهای SCoT همان طور که مشاهده گردید تنوع قابل ملاحظهای در بین ژنوتیپهای پنیرک وجود داشت و چند شکلی مطلوبی بر اساس نشانگر SCoT در بین ژنوتیپها مشاهده شد. در بررسی Shabanian و همکاران (20) که بر روی جمعیتهای بلوط ایرانی با استفاده از 10 آغازگر SCoT انجام گردید گزارش شد که این آغازگرها تنوع ژنتیکی بالایی را آشکار کردند. از نشانگر مولکولی SCoT در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی مانند جاتروفا (Jatropha curcas) و کاکوتی (Ziziphora tenuior) استفاده شده است که در مقایسه با نشانگرهای RAPD و ISSR تنوع بیشتری را نشان داده است (16 و 24). در مطالعهای که توسط Hasani و همکاران (8) به منظور بررسی تنوع ژنتیکی در گیاه دارویی رازیانه با استفاده از نشانگر مولکولی انجام شد، نتایج به دست آمده نشان دادند که نشانگرهای مولکولی دارای توانایی بالایی در بررسی تنوع ژنتیکی میباشند. محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) در نشانگرهای غالب از صفر تا نیم متغیر است و هرچه این عدد بزرگتر باشد بیانگر فراوانی بیشتر چند شکلی برای آن جایگاه در ژنوتیپهای تحت بررسی میباشد با توجه به نتایج به دست آمده پیشنهاد میگردد از آغازگرهای SC36، SC11 و SC5 که شاخص محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) درصد چندشکلی بالایی را نشان دادند، برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم دیگر ژنوتیپهای پنیرک در تحقیقات بعدی استفاده گردد. نتایج حاصل از این بررسی با مطالعات دیگری که با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT بر روی انبه (Mangifera indica) و رمی (Boehmeria nivea) انجام گردیده شباهت داشت (14 و 18). میانگین تشابه بین ژنوتیپها برابر 820/0 بود که نشاندهنده وجود تنوع پایین در بین ژنوتیپهای پنیرک بر اساس آغازگرهای مورد بررسی میباشد. این موضوع میتواند به سبب طول بلند آغازگرهای SCoT و تکثیر انتخابیتر این نشانگر باشد. با توجه به نتایج، هیبریداسیون بین ژنوتیپها با فاصله ژنتیکی زیاد میتواند یک روش مناسب برای برنامههای اصلاحی در پنیرک باشد. از آنجایی که نشانگر مولکولی SCoT تنوع را براساس مناطق ژنی نشان میدهد (تکثیر نواحی با کدون آغاز)، استفاده از نتایج این تحقیق برای تلاقی نمونههای با فواصل زیاد ژنتیکی در جهت هتروزیس به منظور اصلاح و افزایش ترکیبات میتواند بسیار مؤثر باشد. با توجه به تنوع ژنتیکی پایین درون ژنوتیپهای پنیرک کشور، حفاظت در محل رویشگاه نمونهها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و ایجاد بانک ژرم پلاسم و استفاده از روشهای تکثیر مناسب این گیاه توصیه میشود. همچنین پیشنهاد میگردد از ژنوتیپهایی مانند 15G و 3G که حداکثر فاصله ژنتیکی بر اساس نشانگرهای مورد استفاده داشتند در جهت استفاده از حداکثر هتروزیس در برنامههای اصلاحی استفاده شود. فرشادفر و همکاران (3) در مطالعه تنوع ژنتیکی تودههایی از رازیانه با استفاده از نشانگرهای ریخت شناختی و مولکولی SCoT بر اساس نتایج حاصل از ماتریس تشابه نشانگر مولکولی گزارش کردند که تنوع قابل قبول در بین تودههای رازیانه بر اساس آغازگرهای مورد استفاده وجود دارد و پیشنهاد کردند از تودههایی که حداکثر فاصله ژنتیکی بر اساس نشانگرهای مورد استفاده را داشتند در جهت استفاده از حداکثر هتروزیس در برنامههای اصلاحی استفاده شود. بر اساس تجزیه خوشهای ژنوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند از روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد برای گروهبندی تودهها استفاده گردید چون این ضریب نسبت به ضریبهای تطابق ساده و دایس ضریب کوفنتیک (86 درصد) بالاتری داشت. نتایج حاصل از تجزیه به مختصات اصلی با نتایج تجزیه خوشهای مطابقت نداشت و تنها 38/38 درصد از واریانس با دو محور بیان گردید، این موضوع به نوبه خود مـیتــواند نشان دهنـده پراکــنش گستــرده آغــازگــرهای مختـلف بـــر روی ســطح ژنــوم و همه کروموزومهای پنیرک باشد. همچنین نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تطبیق ندارد که ممکن است علت این موضوع جدایی منشاء جغرافیایی ژنوتیپها یا ایجاد و تجمع جهشهای ژنتیکی مجزا در سطح ژنوم باشد که باعث ایجاد تنوع در آنها نسبت به یکدیگر شده است. در حالی که در تعداد دیگری از ژنوتیپها چنین تطابقی دیده نشده که این امر میتواند به دلیل منشاء مشترک، مهاجرت و انتقال باشد. نیککردار و همکارن (17) در بررسی تنوع ژنتیکی تودههای ایرانی رازیانه با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT از روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد برای گروهبندی تودهها استفاده کردند و گزارش نمودند که این ضریب نسبت به ضریبهای تطابق ساده و دایس ضریب کوفنتیک (91 درصد) بالاتری دارد. اسماعیلی و همکاران (1) با استفاده از نشانگرهای مولکولی نیمه تصادفی اقدام به گروه بندی گندم دیم نمودند که در تجزیه خوشهای ضرایب تشابه جاکارد و روش اتصال کامل و قطع دندروگرام ارقام و لاینهای گندم را در 7 گروه قرار دادند، همچنین تجزیه هماهنگ اصلی نیز توانست ژنوتیپهای گندم مورد مطالعه را به خوبی بر اساس فاصله فضائی گروهبندی کند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس مولکولی گروهبندی تجزیه خوشهای را تأیید نمود به نحوی که بر اساس آماره PhiPT در بین گروهها در سطح 5 درصد اختلاف معنیدار وجود داشت به عبارت دیگر گروهبندی به صورت صحیح انجام گرفته است. از کاربردهای تجزیه واریانس مولکولی میتوان در تعیین تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها و تعیین حد مطلوب خوشه در تجزیه خوشهای اشاره کرد، به این صورت که در هر گروه در نقطه برش دندروگرام به عنوان یک جمعیت و ژنوتیپها درون آن به عنوان افراد جمعیت در نظر گرفته میشود و برای هر نقطه برش یک تجزیه واریانس انجام گیرد. نقطهای که بیشترین تمایز بین گروهها به وجود آید، به عنوان نقطه مناسب برش دندروگرام انتخاب خواهد شد. زمانی و همکارن (2) در ارزیابی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیتهای گیاه خارمریم با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT گزارش کردند که سطح بیشتری از تنوع به درون جمعیتها (89 درصد) تعلق داشت، درحالی که تنها 11 درصد تنوع در بین جمعیتها مشاهده شد. در نهایت نتایج نشاندهنده تنوع زیاد در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از نشانگر SCoT بود.