تولید و بهینه سازی پلی‌هیدروکسی آلکانوات

(poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate))

به وسیله جدایه Aeromonas sp. EBA118 جدا شده از خاک به روش تک متغیره

زمزم جوادی، معصومه بحرینی^* و محمدرضا شریف مقدم

ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 16/06/1397          تاریخ پذیرش: 25/10/1397

چکیده

در این پژوهش با هدف جداسازی ‌باکتریهای بومی تولیدکننده پلی‌هیدروکسی آلکانوات، خاک چندین منطقه کشاورزی اطراف مشهد مورد بررسی قرار گرفت. نمونه‌ها خالص سازی و سپس با استفاده از روشهای رنگ آمیزی سودان سیاه B و آکریدین اورنج نمونه های تولید کننده PHAs جدا شدند. از میان 31 سویه جداسازی شده 2 گونه به‌عنوان تولیدکننده پلیمرهای پلی‌هیدروکسی آلکانوات شناسایی شدند. جدایه 118EBA با داشتن بیشترین میزان تولید پلی‌هیدروکسی آلکانوات به عنوان سویه منتخب برگزیده و تولید پلیمر در آن بهینه گردید. به‌منظور افزایش تولید، بهینه‌سازی دومرحله‌ای انجام شد. ابتدا برای افزایش توده سلولی مقادیر غلظت منبع نیتروژن و نوع آن، غلظت گلوکز،pH ، دما و میزان هوادهی در محیط اولیه بهینه‌سازی شدند. در مرحله دوم بهینه‌سازی که به‌منظور افزایش تولید پلی‌هیدروکسی آلکانوات انجام شد از محیط ثانویه‌ که دارای مقادیر بیشتری از گلوکز بود استفاده شد. در این تحقیق فاکتورهای نسبت کربن به نیتروژن، pH، دما و میزان هوادهی بهینه و تأثیر آنها در تولید پلی‌هیدروکسی آلکانوات بررسی گردید. عصاره مخمر با غلظت g/l7 ، گلوکز با غلظت g/l 5 ، 8= pH ، دمای 20 درجه سانتی گراد و میزان هوادهی 75 درصد شرایط حاصل‌شده از بهینه‌سازی مرحله اول بودند؛ در مرحله دوم بهینه‌‌‌سازی که با هدف افزایش تولید پلیمر انجام شد نسبت کربن به نیتروژن با مقدار 3:1، 7 pH=، دمای 37 درجه سانتی گراد و هوادهی 80 درصد به ترتیب به‌عنوان بهترین شرایط انتخاب شدند. نتایج طیف سنجی نشان داد پلیمر پلی‌هیدروکسی آلکانوات تولید شده توسط جدایه 118EBA Aeromonas sp. از نوع هموپلیمر پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات خالص نیست و احتمالاً نوعی کوپلی استر PHBHHx است.

واژه های‌کلیدی: بهینه‌سازی، پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات، آئروموناس هیدروفیلا

* نویسنده مسئول، تلفن: 05138805502، پست الکترونیکی: mbahreini@um.ac.ir

مقدمه

پلاستیک یکی از مهم‌ترین ساخته‌های دست بشر است که نقش مهمی را در زندگی انسان بازی می کند و تحول بسیار زیاد و شگرفی را در جوامع انسانی به وجود آورده است که ناشی از تنوع‌پذیری فوق‌العاده و قابلیت تولید فراوان آنها می باشد. از نیمه دوم قرن بیستم به بعد پلاستیکها به مهم‌ترین ابزار مورد استفاده در سرتاسر جهان تبدیل شدند، اما  استفاده بیش از حد و عدم قابلیت تجزیه پذیری آنها، باعث آسیبهای جدی به طبیعت و کاهش ذخایر سوختهای فسیلی شده است. برای مقابله با این عواقب نامناسب دانشمندان به دنبال پیدا کردن منابع و راه کارهای جدیدی برای تولید پلاستیکهایی هستند که دارای قابلیت تجزیه‌پذیری زیستی باشند (7، 27).

پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات ((P(3HB) معمول‌ترین نوع پلیمرهای تجزیه‌پذیر زیستی است که به‌وسیله میکرو ارگانیسم‌ها در طبیعت تولید می شود (38). این پلیمر P(3HB)  ناپایدار است و این باعث محدودیت در به کارگیری آن‌ در کارهای مختلف شده است (31)، برای حل این مشکل آن را همراه با دیگر ترکیبات استفاده می کنند. پلی هیدروکسی آلکانواتها ( PHAs ) یکی از این ترکیبات جدید است که توسط باکتریها تولید می شوند. کو‌پلیمرهای هیدروکسی‌آلکانواتها حاوی  انواع  واحدهای هیدروکسی‌آلکانوات(HA)  همراه با هیدروکسی بوتیرات می باشند. از جمله این کو‌پلیمرها می توان به PHBV ( یک کوپلی استر خطی آلیفاتیک است)، P(3HB co 3HHx) (دارای زنجیره جانبی پروپیل است) و ترپلیمرها (دارای سه نوع متفاوت از مونومرها می باشند) اشاره کرد (17).

PHA یک پلی‌استر خطی فعال نوری با خواصی مشابه پلی‌اتیلن است و از واحدهای مونومری ۳ هیدروکسی‌آلکانوات (3HA) تشکیل شده است (27 و 38)، و تاکنون حدود 150 واحد مونومری PHA شناسایی‌شده است (24 و 37). بر طبق ساختار، منومرها PHA  به سه نوع دسته بندی می شود: PHA با زنجیره کوتاه (SCL)، PHA با زنجیره متوسط (MCL) و PHA با هر دو نوع زنجیره. با تغییر در ساختار منومرهای سازنده PHA می توان طیف وسیعی از پلی استرها را تولید کرد که دارای خواص متفاوتی می باشند (25، 38 و 40).

یکی از خواص منحصربه‌فرد PHAs توانایی تجزیه زیستی آنها در محیطهای متفاوت است (38). از جمله خواص دیگری که برای پلی‌هیدروکسی‌آلکانواتها ذکر شده است می توان به  ترموپلاستیک بودن، سازگاری زیستی و غیر سمی بودن، ایزو تاکتیک و خاصیت نوری، غیر محلول در آب و دانسیته بالا، میزان تبلور بالا، غیرقابل نفوذ بودن نسبت به گازها، پیزوالکتریک بودن، قابلیت تجزیه‌پذیری و داشتن گروههای فعال‌ اشاره کرد (9 و 40). بیوپلاستیکها تاکنون در صنایع مختلفی به کار گرفته شده اند که از جمله آنها می توان به صنایع پزشکی(تولید ستهای بخیه جراحی، پینهای ارتوپدی، استنتها)، کشاورزی (حمل‌کننده آفت‌کشها و بذرها )، داروسازی (انتقال‌دهنده‌های داروها) و صنایع بسته‌بندی اشاره کرد (9 و 39). باوجود مزایای بسیار زیاد این بیوپلیمر، به علت هزینه بالای تولید هنوز نتوانسته اند آنها را جایگزین کامل پلاستیکهای سنتزی نمایند. بنابراین تلاشهایی برای یافتن منابع کربنی ارزان، تجدید‌پذیر و قابل دسترس صورت گرفته است که ازجمله این منابع کربنی می توان به ضایعات کشاورزی، دانه‌های روغنی، آب‌پنیر، CO2، کاغذهای باطله، ملاس چغندرقند، زیلوز وغیره اشاره کرد (7، 19، 26 و 30).

PHA یک گرانول ذخیره‌ای است که در شرایط نامساعد غذایی در باکتری تولید می شود. البته هر شرایط نامساعدی موجب تولید این ترکیبات نمی شود فقط درصورتی‌که ازدیاد منابع کربنی را در کنار محدودیت عناصر ضروری مثل نیتروژن، فسفر، منیزیم و غیره را داشته باشد متابولیسم مرکزی سلول به سمت تولید PHA متمایل می شود.  باکتریهای زیادی توانایی تولید PHA را دارا هستند که می توان از آرکی باکتریها، انواع باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت و سیانوباکتریها نام برد (3 و 7).

در کارهایی که باهدف جداسازی و شناسایی تولیدکنندگان PHA تاکنون توسط سایرین انجام‌شده است گروههای مختلفی از باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی شناسایی شده اند که بیشتر سویه‌هایی از جنس Bacillus  می باشند (5، 32 و 33). اما باکتریهای دیگری مثل , Ralostenia Azotobacter chroococcum ، Staphylococcus cohnii ، Micrococcus luteus ،  Methylobacterium spp. و Aeromonas hydrophila  نیز جداسازی شده‌اند (6، 23، 25، 32، 36 و 42). بسیاری از باکتریهای شناسایی شده قادر به سنتز PHB هستند و فقط تعداد کمی قادر به تولید کوپلی استر  PHBHHx می باشند که  Aeromonas hydrophila  و Aeromonas caviae بهترین سویه های شناخته شده در این مورد هستند (15). Aeromonas hydrophila اولین بار توسط Kobayashi و همکاران به عنوان تولید کننده PHA مطرح گردید و نشان داده شد که این باکتری با استفاده از اسیدهای چرب زنجیره بلند قادر به تولید کوپلی استر PHBHHx به صورت تصادفی با منومرهای 3-hydroxybutyrate (HB) و 3-hydroxyhexanoate (HHx) می باشد (20) و از این جهت از لحاظ تولید پلی استرهای قابل کاربرد در صنعت اهمیت پیدا کرد.

امروزه با توجه به مشکلات زیست محیطی، تولید بیوپلاستیک اهمیت زیادی دارد ولی هنوز به دلیل گران بودن ماده خام نمی توانند به صورت انبوه تولید کنند. هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی سویه‌های بومی جدید تولید کننده PHA با استفاده از منبع کربن گلوکز از خاکهای اطراف مشهد بود تا بتوان از آنها در تولید بیوپلاستیک از یک منبع ارزان قیمت مثل گلوکز حاصل از هیدرولیز کاغذهای باطله بهره برد.

مواد و روشها

نمونه‌برداری و جداسازی: از خاکهای مختلف کشاورزی در شهر مشهد و اطراف آن نمونه‌برداری از عمق 5 سانتیمتری از سطح انجام شد و به آزمایشگاه منتقل و در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. نمونه ها پس از رقت سازی بر روی محیط نوترینت آگار (NA) کشت و در دمای 30 درجه سانتی گراد انکوبه شد و سپس کلنیهای غیرمشابه تشکیل شده به لحاظ شکل ظاهری جدا و در محیط NA خالص‌سازی گردید.

کلنیهای خالص شده جهت شناسایی توانایی تولیدPHA  در پلیتهای محتوی محیط NA + 1 درصد گلوکز کشت و به مدت 24 ساعت در انکوباتور 30 درجه گرما‌گذاری شد. سپس برای تشخیص باکتریهای تولیدکننده، محلول الکلی سودان سیاه B به کلنیهای باکتریایی اضافه و پلیتها برای 30 دقیقه به همان شکل حفظ شد. بعد از خروج رنگ اضافی، پلیتها با اتانول خالص شسته و کلنیهایی که اطراف آنها سیاه رنگ شده بود به عنوان تولید کننده PHA شناخته شد (34 و 41).

از کلنیهایی که بهترین نتیجه را در رنگ آمیزی سودان سیاه داشت کشت 48 ساعته تهیه شد و  µl10 از آن را به یک لوله اپندورف که محتوی µl 50 آکریدین اورنج بود اضافه و به مدت 30 دقیقه در حمام آب 30 درجه قرار داده شد و سپس به مدت 5 دقیقه در 4000 دور سانتریفیوژ گردید؛ رسوبات حاصل جمع‌آوری و در آب مقطر حل گردید و از آنها گسترش تهیه و با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت (  BX51,Olympus ,Japan ) در طول‌ موج nm460  بررسی شد. حضور گرانولهای زردرنگ در داخل سلولها نشان‌دهنده حضور PHA بود (18 و 22).

شناسایی جدایه: برای شناسایی جدایه از روشهای بیوشیمیایی و مولکولی استفاده شد. بررسی مشخصات فنوتیپی و انجام آزمونهای تشخیص اولیه، شامل رنگ آمیزی گرم و تست کاتالاز بر روی جدایه انجام گردید و سپس DNA جدایه به روش جوشاندن استخراج شد (28). DNA ژنومی استخراج ‌شده از کشت شبانه با استفاده از آغازگرهای عمومیF 27 وR 1492 که مربوط به ژن 16s rRNA است به روش PCR تکثیر شد. µl 50 محلول واکنش PCR (GeNet Bio -Macrogen, South Korea) شامل: بافر(X 10)µl 5 ،  MgCl₂(mM25)µl 6،  dNTPs (mM10) µl1 ،آغازگر ها (pmol 10)  هر یک ‌‌µl‌43/3‌،‌ آنزیم تک‌ ‌پلی‌مراز (U‌5) µl 571/0 ،DNA  µl‌2 و مابقی تا µl 50 آب اضافه شد.

برنامه دمایی واکنش PCR که شامل، واسرشت سازی اولیه در دمای 95 درجه به مدت 4 دقیقه برای یک سیکل ، واسرشت سازی در دمای 94 درجه به  مدت 1 دقیقه، اتصال آغازگرها در دمای 55 درجه به مدت 30 ثانیه، سنتز قطعه در دمای 72 درجه به مدت 1 دقیقه برای 30 سیکل وگسترش نهایی در دمای 72 درجه به مدت 10 دقیقه برای یک سیکل در برنامه PCR گنجانده و توسط دستگاه ترمال سایکلر Bio RAD t100 thermal cycler,.USA)) انجام شد. پس از پایان یافتن PCR جهت اطمینان از تکثیر قطعه مورد نظر 5 میکرولیتر از محصول PCR با استفاده از ژل آگاروز 1 درصد در کنار ladder الکتروفورز گردید. محصول PCR، جهت تعیین توالی به شرکت  Macrogenکره جنوبی ارسال گردید. قرابت فیلوژنتیکی جدایه با سویه­های موجود در پایگاه‌های اطلاعاتی NCBI و Ez-Taxon مورد بررسی قرار گرفت. آنالیز داده­های به‌دست‌آمده با استفاده از نرم‌افزار MEGA (Version7) انجام شد. همچنین با استفاده از الگوی Neighbour-joining دسته‌بندی توالیها صورت گرفت و درخت فیلوژنی آن رسم گردید.

محیط کشت: رشد سلولی بر روی تولید پلیمر PHA اثر منفی می‌گذارد که برای حذف این تأثیر از دو نوع محیط کشت در دو مرحله استفاده شد. 1syn در مرحله اول برای ایجاد توده سلولی مورد استفاده قرار گرفت و محیط 2 Syn که به لحاظ منبع نیتروژن دارای محدودیت است برای مرحله دوم به کار گرفته شد (8). ترکیبات محیط syn1 عبارت بودند از گلوکز (g/l 10)، عصاره مخمر (g/l1)، آمونیوم کلرید (g/l2)، پتاسیم فسفات (g/l2)، دی سدیم فسفات (g/l6/0)، منیزیم سولفات (g/l2/0)، کلسیم کلرید (g/l00020/0) و عوامل تریس (ml/l10). عوامل تریس شامل سولفات روی (mg/l3/1)، سولفات آهن (mg/l2/0)، هیدرات آمونیوم مولیبدات (mg/l6/0) و بوریک اسید (mg/l6/0) بود. محیط 2syn فقط در مقدار گلوکز (g/l40) با محیط 1syn متفاوت بود.

بهینه سازی تولید توده سلولی: برای بهینه‌سازی تولید توده‌ سلولی عوامل زیر مورد بررسی قرار گرفتند که عبارت بودند از: نوع منبع نیتروژن (عصاره مخمر، نیترات آمونیوم و اوره)، غلظت منبع نیتروژن (5 و 7 l/g)، غلظت گلوکز (10،5 و 15l/g)، pH (6، 7، 5/7 و 8)، دما (15، 20، 30 و 37 درجه سانتی‌گراد) و میزان هوادهی (50، 75 و 80 درصد). برای تعیین میزان رشد سلولی جذب نمونه‌ها در طول موجnm600 مورد بررسی قرار گرفت.

بهینه سازی تولید پلی‌‌هیدروکسی‌آلکانوات: محیط 1Syn  بهینه‌ شده بعد از رشد 24 ساعته در دور rpm 10000 برای مدت  min 10 تحت سانتریفیوژ قرار گرفت و رسوبات حاصل از آن به محیط 2Syn  انتقال و سپس به مدت 48 ساعت گرما گذاری شدند. نتایج فاکتور‌های بهینه‌سازی شده در پایان هر مرحله با محاسبه وزن خشک رسوب پلیمر بعد از استخراج کامل پلیمر ارزیابی شد. عواملی که برای این مرحله مورد بهینه‌سازی قرار گرفتند شامل نسبت منبع کربن به نیتروژن (1:1، 1.5:1، 2:1، 3:1، 4:1، 10:1)، pH (6 ، 7 ، 8 و 9)، دما (20 ، 30 و 37 درجه سانتی‌گراد) و میزان هوادهی(50، 75 و 80 درصد) بود.

استخراج پلیمر PHA از سلولهای باکتری: استخراج پلیمر به روش Hahn ( حلالهای کلروفرم و سدیم هیپوکلریت) انجام شد. ابتدا محیط تولید 2Syn در دورrpm 10000 به مدت 10 دقیقه تحت سانتریفیوژ قرار گرفت و بعد از حذف محلول رویی و شستشو رسوب با آب مقطر مجدداً تحت سانتریفیوژ با شرایط قبلی قرار گرفت (13). به ازای هر گرم رسوب سلولی به‌دست‌آمده 50 میلی‌لیتر کلروفرم و 50 میلی‌لیتر سدیم هیپوکلریت 30 درصد (نسبت 1:1) اضافه و به مدت 90 دقیقه در حمام آب 30 درجه قرار داده شد. سپس محلول به ‌خوبی تکان داده شد تا دو فاز کلروفرم و سدیم هیپوکلریت از هم جدا شوند. جهت جدا سازی فازها نمونه درrpm8000 به مدت10 دقیقه سانتریفیوژ گردید. فاز کلروفرم جداشده با کمک حرارت تبخیر و میزان رسوب حاصل‌ توزین شد.

بررسی با طیف‌سنجی FT-IR: برای بررسی گروههای عاملی پلیمر استخراج شده با طیف سنج FT-IR (Thermo Nicolet AVATAR 370,USA)  بررسی شد. از نمونه تولید شده به همراه ماده مرجع KBr قرصی تهیه و در بازه^1-cm  400-4000 تحت تابش نور قرار گرفت (18 و 34).

نتایج

از خاکهای بررسی‌شده درمجموع 31  نمونه ‌باکتریایی که قادر به تولید بیوپلیمر بودند جدا سازی شد و از بین آنها  دو نمونه که در تست سودان سیاه پاسخ بهتری نسبت به بقیه داشتند انتخاب گردیدند. جهت اطمینان از تولید PHA نمونه‌های جداشده با کمک رنگ‌آمیزی فلورسانس با آکریدین اورنج مورد بررسی قرار گرفتند و مشخص گردید دو جدایه 118EBA و KHG111 بیشترین میزان تولید پلیمر PHA را دارند که در ادامه جدایه EBA118 انتخاب گردید ( شکل 1 و2).

شکل 1- پلیتهای رنگ‌آمیزی شده با سودان سیاه.A) بیشترین میزان تولید B) کمترین میزان تولید

شکل 2- تصویر میکروسکوپ فلورسانس دو نمونه KHG111 و EBA118 رنگ‌آمیزی شده با استفاده از آکریدین اورنج. نقاط نارنجی نشان دهنده نواحی تجمع پلیمرهای PHA می باشد.

شناسایی مورفولوژیکی نشان داد جدایه 118EBA  یک باکتری میله ای شکل گرم منفی بدون اسپور و کاتالاز مثبت می باشد. در شناسایی مولکولی با استفاده از تکنیک PCR و توالی یابی با استفاده از نرم‌افزار آنلاین Ez-Taxon، مشخص گردید که جدایه 118EBA  با شماره دسترسی MK397790 در بانک اطلاعات ژنی NCBI دارای 19/98 درصد تشایه با باکتری Aeromonas hydrophila  می باشد. برای این منظور توالیهای مشابه با توالی Aeromonas hydrophila استخراج و پس از همردیف کردن توالیها با استفاده از Clustal W، درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرم‌افزار MEGA V 6.0 و براساس روش Neighbour joining  رسم شد (شکل3).

تحقیقات انجام شده بر روی تولید PHA توسط Aeromonas hydrophila تاکنون با استفاده از اسیدهای چرب بوده است و تاکنون از گلوکز به تنهایی برای تولید PHA توسط Aeromonas hydrophila استفاده نشده است. در این تحقیق با هدف استفاده از ضایعات حاصل از تجزیه آنزیمی کاغذهای باطله از منبع کربن گلوکز به تنهایی استفاده شد و جهت بهینه ساری محیط کشت از تخمیر دو مرحله ای استفاده گردید.

در مرحله اول از محیط syn1 برای افزایش توده سلولی استفاده شد و عواملی مثل نوع منبع نیتروژن، میزان منبع کربن و نیتروژن، pH، دما و میزان هوادهی بررسی گردید. نتایج بهینه سازی منبع نیتروژن نشان داد از میان سه ترکیب عصاره مخمر، نیترات آمونیوم و اوره، عصاره مخمر با غلظت g/l 7 بیشترین توده سلولی را تولید می کند ( شکل A-4).  از گلوکز که به عنوان تنها منبع کربن استفاده شده بود سه غلظت مختلف بررسی گردید که از بین آنها غلظت g/l 5 بیشترین میزان توده سلولی را تولید کرد (شکل B-4). علاوه بر این نتایج نشان داد که میزان تولید در 8 pH=، دمای 20 درجه و میزان هوادهی 75 درصد افزایش می یابد (شکلهای C-4، D-4 و E-4).

شکل 3- رسم درخت فیلوژنتیکی جدایه EBA118 با استفاده از نرم‌افزار MEGA V 6.0 و براساس روش Neighbour joining

شکل 4- نتایج بهینه‌سازی تولید توده سلولی در محیط 1syn. A) بهینه‌سازی نوع و میزان منبع نیتروژن. B) بهینه‌سازی میزان منبع گلوکز. C) بهینه‌سازی دما. D) بهینه‌سازی میزان pH. E) بهینه‌سازی میزان هوادهی.

در مرحله دوم با هدف بهینه سازی تولید بیوپلیمر، بیومس حاصل از محیط syn1 به محیط syn2 منتقل و تأثیر فاکتورهای نسبت کربن به نیتروژن ، pH، دما و میزان هوادهی بر روی تولید پلیمر بررسی گردید. در بررسی نسبت کربن به نیتروژن (C:N) از بین شش مورد مطالعه شده بیشترین میزان تولید پلیمر PHA در نسبت 1: 3 (g/l  32/13) حاصل شد (شکل A-5) و در بررسی میزان تولید بیو پلیمر در  pH های مختلف نتایج نشان داد که بیشترین میزان تولید در 7 pH با مقدارg/l  44/14حاصل می‌گردد (شکل B-5). در بهینه‌سازی دما نتایج نشان داد تفاوت معنی داری بین سه دمای 20، 30 و 37 درجه سانتی گراد وجود ندارد و بیشترین میزان تولید در دمای 37 درجه با مقدار g/l 94/14 مشاهده شد (شکل C-5). بیشترین تولید پلیمر در هوادهی 80 درصد ‌مشاهده شد که معادل g/l 99/14 بود (شکل D-5).

شکل 5- نتایج بهینه‌سازی تولید PHAs در محیط 2syn. A) بهینه‌سازی نسبتC:N. B) بهینه‌سازی pH. C) بهینه‌سازی دما. D) بهینه‌سازی میزان هوادهی

پلیمر PHA تولید شده توسط جدایه 118EBA  جهت بررسی نوع آن توسط دستگاه  FT-IR  طیف‌سنجی گردید. مقایسه نتایج به‌دست‌آمده با طیف نمونه استاندارد PHB شرکت سیگما نشان داد که پلیمر تولیدشده به‌وسیله جدایه 118EBA از نوع هموپلیمر PHB خالص نیست و احتمالاً نوعی کوپلیمر است (شکل6). در نمونه تولید شده به‌وسیله این جدایه، 12 پیک مهم که نشان دهنده باندهای قوی در ناحیه ^{1 –} cm 488-3000 است مشاهده شد که نشان‌دهنده حضور گروه C-H در CH3 است؛ باندهای ^{1 –} cm 1377 و 1462 نیز به ترتیب نشان‌دهنده C-O-H و C-H نامتقارن در CH3 است. در نمونه استاندارد طیف قوی در ناحیه^{1 –} cm 1726 حضور C=O را نشان می دهد درحالی که طیف در ناحیه^{1 –} cm 1282 مربوط به –C-H  است. در نمونه های PHB خالص پیکها در محدوده cm^-1 649-3400 دیده می شود. در حالی که در این نمونه متفاوت بود که تأیید می کند نمونه یک هموپلیمر نیست.

شکل 6- طیف FT-IR پلیمر تولیدشده به‌وسیله نمونه 118EBA، باندهای قوی در ناحیه ^{1 –} cm 2851-3000 نشان‌دهنده حضور گروه C-H در CH3 و باندهای ^{1 –} cm 1377 و 1462 نیز به ترتیب نشان‌دهنده C-O-H و C-H نامتقارن در CH3 است

بحث

بیشتر کارهای انجام شده با Aeromonas hydrophila برای تولید PHA با استفاده از اسیدهای چرب همچون اسید اولئیک و یا اسید اولئیک همراه با گلوکز بوده است (10 و 35) و با توجه به اینکه تاکنون از منبع گلوکز به تنهایی برای تولید پلیمر توسط Aeromonas hydrophila استفاده نشده است در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفت و شرایط تولید به روش دو مرحله ای بهینه سازی گردید. گلوکز در بسیاری از کارها توسط باکتریهای مختلف برای تولید PHA به عنوان منبع کربن مورد استفاده قرار گرفته است و نشان داده شده است که نسبت به سایر منابع کربنی برای تولید PHA بهتر بوده است. Chen و همکاران نشان دادند که باکتری ائروموناس هیدروفیلا در حضور گلوکز نسبت به اسید لوریک بیومس بیشتری را تولید می کند که مشابه نتایج حاضر می باشد (10). Shah در بررسی پنج منبع کربن گلوکز، سوکروز، مالتوز، فروکتوز و لاکتوز بیشترین میزان تولید را هنگامی مشاهده کرد که گلوکز را به ‌عنوان منبع خود برگزیده بود (33). Panigrahi و همکارانش نیز منابع گلوکز، فروکتوز، مالتوز و سلولز را در چند باکتری جداسازی شده بررسی کردند و بهترین شرایط را در حضور گلوکز مشاهده کردند (29).Aly و همکارانش نیز نشان دادند که از بین پنج نوع منبع کربن مختلف، گلوکز با غلظت g/l 5 بیشترین میزان بیومس را تولید می کند (3). نتایج این تحقیق نشان داد جدایه EBA118 قادر است بیشترین بیومس را با غلظت 5 گرم بر لیتر گلوکز تولید کند. همچنین مشاهده گردید عصاره مخمر با غلظت l/g 7  بهتر از دو منبع نیتروژنی دیگر میزان رشد جدایه را افزایش می دهد و مشخص گردید افزایش نسبت نیتروژن به کربن در این مرحله باعث افزایش توده سلولی می شود، که می توان نتیجه گیری کرد حضور انواع آمینواسیدها و ویتأمینهای موجود در عصاره مخمر باعث افزایش رشد می شوند (2). Shah نتایجی مشابه نتایج حاضر به دست آورد و نشان داد عصاره مخمر از بین سایر منابع نیتروژنی (عصاره گوشت، عصاره مالت، آمونیوم سولفات، پپتون و عصاره مخمر) بیشترین تأثیر را بر روی رشد باکتری Bacillus subtilis دارد (33).Aly  و همکارانش که تولید PHA را در باکتریهای مختلف بررسی می کردند نیز نشان دادند عصاره مخمر بهترین تأثیر را بر روی تولید بیومس دارد (3).

در بررسی میزان pH بر روی تولید بیومس مشخص گردید pH محیط 1Syn در طی 24 ساعت رشد اولیه جدایه به‌ اندازه دو واحد کاهش یافته و باکتری پس از رشد شرایط محیط را اسیدی می کند و مقدار آن را به 6 می رساند که این می تواند رشد بیشتر در 8 pH- را توجیه کند. از طرفی جنس آئروموناس در شرایط قلیایی قادر به رشد می باشد، بنابراین اگر میزان pH اولیه در حد خنثی و یا کمی پایین تر باشد شرایط در حین رشد برای باکتری کاملاً نامناسب شده و تولید بیومس کاهش می یابد. در بررسی انجام شده بر روی باکتری Azomonas macrocytogenes  بهینه تولید در 9=pH (12) و بر روی باکتری  Bacillus cereus MM7  7=pH به عنوان مقدار بهینه به دست آمده است (3).  اما در مورد باکتریهای دیگر عمدتاً مقادیر اسیدی pH به ‌عنوان بهترین pH گزارش‌شده است (4).

دمای بهینه باکتری Aeromonas hydrophila  در کتاب مرجع Bergey بین 20-28 درجه سانتی گراد ذکر شده است که این کاملاً با نتایج حاصل از مطالعه حاضر که دمای بهینه ‌20 درجه را نشان داد مطابقت دارد (16). در دو تحقیق جداگانه که بر روی Bacillus cereus MM7 و Azomonas macrocytogenes انجام شد دمای 37 درجه را به عنوان دمای بهینه معرفی کرده اند (3 و 13). در پایان مرحله اول با در نظر گرفتن تمامی شرایط بهینه حاصل‌شده می توان نتیجه گرفت که فاکتور منبع نیتروژن و دما بیشترین تأثیر را در تولید بیومس داشتند و با بهینه سازی شرایط کشت میزان تولید بیومس تا 4 برابر افزایش یافت.

تولید بیوپلیمر در مرحله دوم رشد به میزان مواد غذایی در محیط کشت بستگی دارد و نسبت C:N در میزان تولید تأثیر زیادی دارد. مختارانی و همکاران معتقدند با افزایش بیش‌ از حد مواد غذایی در محیط رشد باکتری فعالیت باکتری محدود شده و باعث مصرف پلیمر تولید شده توسط باکتری می شود (2). سایرین نیز معتقد هستند وقتی نسبت کربن به نیتروژن کاهش می یابد میزان بیشتری از کوانزیم A به چرخه کربس می رسد و تعداد واحدهای 3HB نسبتاً کاهش می یابد و با افزایش نسبت کربن به نیتروژن یعنی افزایش غلظت سوبسترای کربن نسبت به غلظت نیتروژن از رشد میکروبی ممانعت می کند و سنتز PHB شروع می شود (8، 18 و 36). در پژوهش حاضر نسبت C:N، 3:1 به دست آمد در حالی که Chen  و همکاران نسبت کربن به نیتروژن را10:1 برای اولئیک اسید در باکتریAeromonas hydrophila NIU01 به دست آوردند و Wei و همکاران در باکتری Cupriavidus taiwanensis184 نسبت کربن به نیتروژن 8:1 را به دست آوردند (8 و 42). در مطالعاتی که به‌وسیله Panigrahi و همکارانش در گونه‌ای از Bacillus انجام شد بیشترین میزان تولید در نسبت C:N، 20:1 مشاهده شد (29).

در بررسی pH مشخص گردید باکتری با رشد در محیط2 Syn  مقدار pH محیط را کاهش ‌داده و اسیدی می کند. اسیدی شدن pH هر چند برای رشد توده سلولی مناسب نیست اما این شرایط نامناسب ایجاد شده در افزایش تولید پلیمر مؤثر است و بیشترین میزان پلیمر درpH 7 تولید شد. Chen و همکاران نیز برای تولید پلیمر توسط باکتری Aeromonas hydrophila   در فرمانتور از pH 6.5 استفاده کردند که با نتایج حاضر مشابه است (8). در مطالعات انجام‌شده به‌ وسیله سایرین بر روی گونه‌های Bacillus 7 =pH به‌عنوان بهینه گزارش شده است (3، 29). با توجه به اینکه طیف دما برای باکتریAeromonas hydrophila 20-28 درجه است اما تولید بهتر پلی مر در دمای 37 درجه مشاهده شد که نشان دهنده این است که افزایش دما موجب ایجاد شرایط نامناسبی می شود که برای تولید پلیمر مطلوب می باشد. Kulkarni و همکاران و Aly و همکاران نیز دمای بهینه 37 درجه را برای باکتریهای Halomonas campisalis MCM B-1027 و Bacillus cereus به ترتیب به دست آوردند (3 و 21).  Hamiehو همکارانش در دو باکتری Lactobacillus acidophilus و Bacillus thurnigiensis بیشترین میزان تولید PHB را در میزان هوادهی 80 درصد (ml250/50) مشاهده کردند و نشان دادند اکسیژن و هوادهی اثر افزایشی بر روی تولید پلیمر دارد که مشابه نتایج تحقیق حاضر بود (14). در دومین مرحله بهینه‌سازی، دو فاکتور pH و هوادهی بیشترین تأثیر را در تولید بیوپلیمر داشتند و میزان تولید پلیمر به g/l 99/14 رسید که 13/44‌ درصد افزایش را نشان می دهد و مشابه نتایج Lu و همکاران است که با بهینه سازی شرایط توانستند 45 درصد تولید پلیمر را در باکتری Aeromonas hydrophila CGMCC0911  افزایش دهند (25). Chauhan و همکاران با بررسی دو باکتری Bacillus cereus و Ralstonaia eutrophus نشان دادند در بهترین شرایط میزان g/l 59/0 و 69/0 تولید پلیمر را به ترتیب دارند (6). Shen و همکاران با استفاده از لجن فعال که مقدار کمی سدیم لورات به آن اضافه شده بود توانستند g/l 5/0 کوپلی استر PHBHHx را با استفاده از میکروبهای موجود در لجن تولید کنند (35).

در پژوهش حاضر نتایج طیف سنجی نشان داد پلیمر PHA تولید شده توسط جدایه 118EBA   از نوع هموپلیمر PHB خالص نیست و احتمالاً نوعی کوپلی استر PHBHHx است (33 و 34)که جدایه EBA118 توانسته است در غیاب اسیدهای چرب و تنها در حضور گلوکز آن را بسازد. سویه های Aeromonas hydrophila و  Aeromonas caviae معمولاً جزو بهترین سویه های شناخته شده برای تولید PHBHHx با زنجیره متوسط در مقیاس صنعتی می باشند (43). برای تولید این ترکیب توسط این باکتریها از اسیدهای چربی همچون لوریک‌اسید و اولئیک اسید استفاده می کنند و منابع کربن همچون گلوکز را نیز به محیط اضافه می کنند که باعث تغییر در نسبت مونومرهای 3HB و HHx  می شوند (25). Doi و همکاران و Chen و همکاران معتقدند که حضور اسیدهای چرب زنجیره بلند برای سنتز PHA توسط ائروموناس هیدروفیلا ضروری می باشد (10 و 11)، اما در پژوهش حاضر مشخص گردید که باکتری بدون حضور اسید چرب نیز می تواند PHA بسازد. Lu و همکاران معتقد هستند که گلوکز نقش مهمی را در رشد سلول و تجمع PHBHHx بازی می کند و در غلظتهای کمتر از g/l 10 باعث افزایش درصد منومرهای HHx می شود (25). نتایج این تحقیق نشان داد که جدایه EBA 118 برای تولید کوپلی استر از گلوکز تنها نیز می تواند استفاده کند که این می تواند راه کار جدیدی برای استفاده از منابع کربن ارزانتر همچون آب‌پنیر (30)، زیلوز (19) و باطله‌های کاغذ (1 و 26) باشد و بدین ترتیب یکی از مشکلات اساسی در تولید PHAs که هزینه زیاد ماده اولیه آن می باشد را کاهش داد (25، 32، 38 و 43).

نتیجه گیری

هتروپلیمرهایی همچون PHBHHX به سبب زیست‌ سازگارپذیری و خواص فیزیکی همچون انعطاف‌پذیری و قدرت تحمل فشارهای زیاد نسبت به هموپلیمرها و امکان استفاده از آنها در بخشهای مختلف صنعتی مثل تولید ایمپلنتهای پزشکی و ابزارهای مهندسی بافت اهمیت بیشتری دارند و این ویژگی باعث شده است تا توجهات زیادی برای تولید صنعتی آنها انجام شود. از طرفی تحقیقات انجام شده نشان داده است باکتری Aeromonas hydrophila قادر به تولید این نوع هتروپلیمر می باشد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد جدایه EBA118 که یک Aeromonas sp   می باشد بدون نیاز به استفاده از اسیدهای چرب می تواند از گلوکز به تنهایی استفاده کند و کو پلی استر PHBHHx را تولید کند. در نتیجه به راحتی می توان از باطله های کاغذ که فراوان و ارزان هستند استفاده کرد و علاوه بر تولید یک ترکیب مفید و دوستدار محیط زیست به پاک سازی محیط زیست نیز کمک کرد.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از دانشگاه فردوسی مشهد به خاطر تأمین کلیه امکانات این تحقیق (گرنت شــماره33632/3)  تشکر و قدردانی به عمل می آید.