نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 موسسه آموزش عالی نوردانش. میمه. ایران

2 پژوهشگاه ملی مهندسی زنتیک و زیست فناوری. تهران. ایران

3 موسسه آموزش عالی نور دانش. میمه .ایران

4 موسسه آموزش عالی نور دانش. میمه. ایران

چکیده

سیانید ترکیبی سمی و بسیار کشنده است که آثار مخربی بر محیط زیست زیست و سلامت انسان می‌گذارد. روش-های فیزیکی و شیمیایی جهت حذف آلودگی برای مساحت‌های بالا، پر هزینه هستند. این مهم منجر به درک کامل‌تر از توان میکرو‌ارگانیسم‌ها از جمله قارچ‌ها در پالایش مؤثر و اقتصادی خاک و آب آلوده شده‌است. در مطالعه حاضر به صورت تصادفی از پساب معدن طلا نمونه‌برداری شد. نمونه‌ها در محیط‌کشت PDA کشت داده‌شد و و سپس برای سنجش توان قارچ‌ها در تجزیه سیانید، از روش اندازه‌گیری پیکریک‌اسید استفاده شد. در این پژوهش همچنین به بررسی میزان فعالیت ویژه آنزیم تجزیه‌کننده سیانید به نام نیتریلاز در غلظت‌های 0، 2، 5 و 10 میلی‌مولار سیانید، در محیط‌کشت قارچ پنی-سیلیوم پرداخته‌شد. بنزونیتریل در حضور آنزیم نیتریلاز تولید بنزوئیک‌اسید و آمونیاک می‌کند. جهت تعیین فعالیت آنزیم نیتریلاز از میزان میزان جذب تولید بنزوئیک‌اسید در 238 نانومتر ارزیابی ارزیابی‌شد. با کمک منحنی استاندارد بدست‌آمده از جذب بنزوئیک‌اسید، فعالیت آنزیم نیتریلاز بدست‌آمد. به‌منظور بررسی سطح معناداری داده‌ها از آزمون‌های آماری ANOVA و t-test استفاده شد. نتایج حاکی از افزایش میزان فعالیت ویژه این آنزیم همگام با افزایش غلظت سیانید به محیط‌کشت است، به‌نحوی که از غلظت 0 تا 10 میلی‌مولار سیانید، فعالیت ویژه آنزیم نیتریلاز 26 درصد افزایش یافته‌است. همچنین در محیط‌کشت قارچ حاوی غلظت‌های مختلف سیانید، غلظت سیانید باقی مانده 52 درصد کاهش یافته است. نتایج بیانگر آن است که قارچ پنی سیلیوم تا غلظت 10 میلی مولار توانائی تجزیه سیانید را به خوبی داشته و مقاومت بالائی از خود نشان می دهد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Investigation of Biodegradation of Cyanide by Secretory Nitrilase Enzyme in Penicillium

نویسندگان [English]

  • mahdiyeh shahabi nejad 1
  • Mohammad Reza zamani 2
  • Fatemeh Heydarian 3
  • Ali Reza Mansoorian 4

1 Higher Education Institute nour danesh. meymeh

2 National Institute of Genetics, Institute of Technology. Tehran. Iran

3 Higher Education Institute, meymeh. iran

4 Higher Education Instituteو, meymeh.iran

چکیده [English]

The cyanide is a toxic and very lethal compound that has devastating effects on the environment and human health. Physical and chemical methods are very costly to remove contamination in high large areas. This fact leads to understanding of the potential of microorganisms, including fungi, in the effective and economical purification of soil and contaminated water. In this study, a random sample was taken from a gold mining wastewater. Samples were cultured in a PDA medium. Then, to evaluate the ability of fungus to measure the fungal power in cyanide decomposition, Picric acid method was used. Take In this study, the specific activity of the cyanide degrading enzyme called nitrilase in concentrations of 0, 2, 5 and 10 mM cyanide was investigated in Penicillium fungus culture media. To determine the nitrilase activity of the spectrophotometer and to absorb benzoic acid at 238 nm. Benzonitrile produces benzoic acid and ammonia in the presence of nitrilase enzyme. With the help of the standard curve obtained from the absorption of benzoic acid, the activity of the nitrilase enzyme was obtained. To analyze the significance level of data, ANOVA and T. test tests were used. The results indicate an increase in the specific activity of this enzyme in conjunction with an increase in the concentration of cyanide in the culture medium. As a result of a concentration of 0 to 10 mM cyanide, the specific activity of the nitrilase enzyme increased by 26%.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biodegradation
  • Cyanide
  • Nitrilase enzyme
  • Penicillium mushroom

بررسی تجزیه زیستی سیانید توسط آنزیم نیتریلاز ترشحی از قارچ پنی­سیلیوم

مهدیه شهابی­نژاد1*، محمد­رضا زمانی2، فاطمه حیدریان1 و علی­رضا منصوریان3

1 ایران، میمه، موسسه آموزش عالی نوردانش، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

2 ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­فناوری، پژوهشکده زیست­فناوری مولکولی گیاهی

3 ایران، تهران، دانشگاه صنعتی مالک اشتر

تاریخ دریافت:‌ 6/12/96                تاریخ پذیرش: 25/10/97

چکیده

سیانید ترکیبی سمی و بسیار کشنده است که آثار مخربی بر محیط زیست زیست و سلامت انسان می­گذارد. روش­های فیزیکی و شیمیایی جهت حذف آلودگی برای مساحت­های بالا، پر هزینه هستند. این مهم منجر به درک کامل­تر از توان ریز­موجودات از جمله قارچ­ها در پالایش مؤثر و اقتصادی خاک و آب آلوده شده­است. در مطالعه حاضر به صورت تصادفی از پساب معدن طلا نمونه­برداری شد. نمونه­ها در محیط­کشت PDA کشت داده­شد و و سپس برای سنجش توان قارچ­ها در تجزیه سیانید، از روش اندازه­گیری پیکریک­اسید استفاده شد. در این پژوهش همچنین به بررسی میزان فعالیت ویژه آنزیم تجزیه­کننده سیانید به نام نیتریلاز در غلظت­های 0، 2، 5 و 10 میلی­مولار سیانید، در محیط­کشت قارچ پنی­سیلیوم پرداخته­شد. بنزونیتریل در حضور آنزیم نیتریلاز تولید بنزوئیک­اسید و آمونیاک می­کند. جهت تعیین فعالیت آنزیم نیتریلاز میزانمیزان تولید بنزوئیک­اسید در 238 نانومتر ارزیابی ارزیابی­شد. با کمک منحنی استاندارد بدست­آمده از جذب بنزوئیک­اسید، فعالیت آنزیم نیتریلاز بدست­آمد. به­منظور بررسی سطح معناداری داده­ها از آزمون­های آماری ANOVA و t-test استفاده شد. نتایج حاکی از افزایش میزان فعالیت ویژه این آنزیم همگام با افزایش غلظت سیانید به محیط­کشت است، به­نحوی که از غلظت 0 تا 10 میلی­مولار سیانید، فعالیت ویژه آنزیم نیتریلاز 26 درصد افزایش یافته­است. همچنین در محیط­کشت قارچ حاوی غلظت­های مختلف سیانید، غلظت سیانید باقی مانده 52 درصد کاهش یافته است. نتایج بیانگر آن است که قارچ پنی سیلیوم تا غلظت 10 میلی مولار توانائی تجزیه سیانید را به خوبی داشته و مقاومت بالائی از خود نشان می دهد و همچنین اضافه کردن سیانید به محیط­کشت دارای اثر القایی است و فعالیت آنزیم تجزیه­کننده را افزایش می دهد و متقابلاً همراه با بالا رفتن فعالیت آنزیم، میزان تجزیه سیانید نیز افزایش­یافته­است.

واژه های کلیدی: تجزیه زیستی، سیانید، آنزیم نیتریلاز، قارچ پنی­سیلیوم

* نویسنده مسئول، تلفن: 09132099455 ، پست الکترونیکی:Mahdiyeh.shahabi@gmail.com  

مقدمه

 

ترکیبات سیانید به ­طور گسترده­ای در روی کره زمین منتشر شده ­است (8). در اثر در اثر فعالیت‌های صنعتی، ترکیبات آلوده به سیانید از قبیل هیدروژن سیانید، تیوسیانات
(SCN-) و سیانات (CNO- به ‌عنوان پساب­های صنعتی به محیط‌زیست تخلیه می‌شوند. سیانید به­طور طبیعی نیز توسط بسیاری از موجودات تولید می­شود. گیاهان یک منبع شناخته­شده از تولید سیانید هستند. سیانید در گیاهان به عنوان یک مکانیسم دفاعی است. بندپایان، باکتری­ها و قارچ­ها نیز می­توانند سیانید را تولید کنند. سیانید به میزان زیادی در کشاورزی به­دلیل استفاده از آفت­کش­های نیتریل تولید می­شود. سیانید به منظور استخراج طلا از سنگ معدن در بسیاری از کشورها مورد استفاده قرار می­گیرد. سیانید با فلزات سنگین مانند طلا مجتمع می­شود و آن­ها را حل
می­کند و امکان شسته­شدن طلا از سنگ معدن را ایجاد می­کند (6 و 11).

سیانید مولکولی است که در سنتز پروبیوتیک ترکیبات نیتروژن دار مختلف از قبیل آمینواسیدها و بازهای نیتروژن دار شرکت می‌کند (21). سیانید دارای یک الگوی شیمیایی است که در آن یک گروه سیانو(C≡N ) وجود دارد (15 و 16). سیانید به دو صورت معدنی (HCN) و آلی یا نیتریل (RCN) تولید می­شود (14).

سیانید فعالیت ATP سنتتاز را در میتوکندری متوقف می‌کند و به سرعت تنفس کاهش می یابد؛ اما گیاهان و موجودات مختلفی وجود دارند که به سیانید مقاوم هستند چون مسیرهای متناوب تولید ATP را توسعه داده‌اند. با وجود سیانید انتقال الکترون به اتم اکسیژن توسط مسیر آلترناتیو (AOX) انجام می­گیرد (10). زیست پالایی استفاده از ریز­موجودات در حضور شرایط محیطی مطلوب و مواد مغذی کافی به­منظور تجزیه مواد آلوده است (4). با وجود سمیّتی که سیانید دارد؛ طیف وسیعی از ریز­موجودات شناخته‌شده‌اند که آن را تجزیه یا مصرف می‌کنند (12).

تولید سیانید هیدروژن بوسیله ریز­موجودات بوسیله Von loseoke در 1871 نمایش داده­شد، زمانی که او آن­را در Marasmius oreades مشاهده کرد.

Locquin در سال 1989 بیان نموده که 300 گونه بازیدیومیست از 52 جنس و چندین آسکومیست وجود دارند که تولید سیانید می‌کنند. فعالیت آنتی‌بیوتیکی چندین قارچ سیانوژن علیه دیگر قارچ‌ها و باکتری‌ها مرتبط با تولید سیانید آن‌هاست و سیانید توسط Fomes scutelatus تولید شده­است که از رویش دانه‌های کاهو و رشد جوانه جلوگیری می‌کند (1).

مغانلو و همکاران (1391) به این نتیجه رسیدند که افزایش ریزموجودات همزیست با گیاهان میزان توانایی تجزیه آلاینده­ها توسط گیاهان را افزایش می­دهد. بیشترین میزان تجزیه آلاینده­ها با مقدار 85 درصد، با تیمار قارچ میکوریزا و باکتری­های تجزیه­گر مشاهده شده­است.

روش­های فیزیکی و شیمیایی جهت حذف آلودگی از مناطق با وسعت نسبتاً کم کاربرد دارند و برای مساحت­های زیاد نظیر خاک­های آلوده به مواد صنعتی، مواد نفتی، محل­های معدنکاری و نظایر آن بسیار پرهزینه هستند. کشورهای صنعتی در تلاش برای دستیابی به فن­آوری­های پالایش ارزان و کارآمد، پیشگام و پیشتاز هستند که این نشانی از درک صحیح از اهمیت مسایل زیست­محیطی و تلاش آگاهانۀ آن­ها در برخورد با معضلات زیست­محیطی می­باشد. مجموعه این تلاش­ها به درک کامل­تر از توان میکرو­ارگانیسم­ها در پالایش مؤثر و اقتصادی خاک و آب آلوده انجامیده است (4).

زمانی و همکاران (1392) در مطالعه­ای نشان دادند که حضور مواد آلاینده در خاک سبب کاهش رشد و توسعه ریشه در خاک و نیز کاهش عملکرد اندام هوایی گیاه ذرت گردید و حضور قارچ اندوفایت در گیاه ذرت ضمن افزایش رشد ریشه­ها در خاک سبب افزایش ریشه­های فرعی در مناطق آلوده به مواد نفتی نیز گردید. حضور قارچ Piriformospora indica در گیاه سبب کاهش بیشتر کل مواد نفتی در ریزوسفر نسبت به گیاهان بدون قارچ شده­بود.

آلماگرو و همکاران (2011) برای حذف سیانید، از روش­های شیمیایی استفاده می‌شود که این روش‌ها بسیار پرهزینه بوده و از طرفی محصولات جانبی خطرناک دیگری را تولید می‌کنند. در مقابل، حذف سیانید به روش زیستی، کم هزینه­تر و بدون خطر است.

نولز (1998) در پژوهشی بیان کرد Marasmus Ordeades و بازیدیومسیت کپک برفی از طریق هیدرلیز سیانید به فرمامید با استفاده از آنزیم سیانید هیدراتاز، به‌عنوان تجزیه‌کننده سیانید شناخته‌شده‌اند .

ریناگلوا (2014) سیانید هیدراتاز (CHTS) هیدروژن سیانیدی که از گلیکوزیدهای سیانوژنیک آزاد می‌شود را سم‌زدایی می‌کنند، سیانید هیدراتاز اولین‌بار در قارچ‌های پاتوژن گیاه (Stemphylume loti Leptopheria maculuns, Gloeocercospora sorghi, Fusarium geneus) گزارش شد.

ازی (2005) در پژوهشی اعلام نمود که دو گونه مورد بررسی از Trichoderma قادر به تجزیه ترکیبات سیانید هستند. این سویه­ها از سیانید به عنوان منبع کربن و گلوکز استفاده می­کنند. همچنین این پژوهش نشان می­دهد در صورتی که به سوبسترا گلوکز اضافه شود میزان تخریب افزایش می­یابد.

ازی (2002) در پژوهشی به بررسی آنزیم­های تجزیه­کننده هیدروژن سیانید پرداخته و به این نتیجه رسید که سویه­های مورد بررسی از قارچ­های Trichoderma harzianum و
T. pseudokoningi با کمک دو آنزیم سیانید هیدراتاز و ردوناز قادر به تجزیه سیانید هستند.

پریرا و همکاران (1996) به این نتیجه رسید که از میان 14 قارچ جدا شده از پساب صنعتی آلوده به سیانید یک سویه از Fusarium oxysporum قادر به تحمل سیانید در پساب صنعتی و محیط­کشت حاوی سیانید است و این توانایی به دلیل تبدیل سیانید به فرم‌آمید غیر سمی توسط آنزیم فرم­آمید هیدرولیاز می­باشد.

در پژوهشی باسیل و همکاران (2008) نشان دادند که قارچ­هایی مانند Neurospora crassa و
Aspergillus nidulans قادر به تخریب سیانید با کمک سیانید هیدراتاز و نیتریلازها می باشند.N .crassa میزان بیشتری از ترکیبات سیانیدی را تخریب می کند و در طیف وسیعی ازPH و دمای بالا پایدار است.

گوپتا و همکاران (2010) به بررسی مکانیزم­ها و مسیرهای آنزیمی مربوط به پاکسازی سیانید از پساب های صنعتی می­پردازند و بیان می­کنند که بسیاری از ریز­موجودات با استفاده از سیانید به تولید آلانین، گلوتامیک اسید، آلفا­آمینو­بوتیریک اسید و بتا سیانوآلانین می­پردازند.

ازی و همکاران (2005) در پژوهشی نشان دادند که در محیط آلوده به سیانید در صورتی که دانه نخود و گندم به قارچ Trichodermaو Fusarium آغشته شده­باشند، به دلیل افزایش کاتابولیسم سیانید گیاه رشد خوبی دارد.

نولز (1976) بسیاری از قارچ‌هایی که پاتوژن گیاهان سیانوژن هستند، سیانیدهیدراتازی را تولید می‌کنند که توسط سیانید القا می‌شود و به این روش HCN را به فرم­آمید تبدیل می‌کنند.

ریبوک (1992) بیان داشته است که تجزیه سیانید در قارچ‌های پاتوژن گیاهی با آنزیم سیانید هیدراتاز صورت می‌گیرد که فرم­آمید تولید می‌کند.

مارتینکوا (2016) در پژوهشی به بررسی حذف همزمان فنل و سیانید توسط تیروزیناز و سیانید هیدراتاز در فاضلاب کک پرداخته است و نتایج نشان می­دهد که ادغام سیانید هیدراتاز و تیروزیناز راه­های جدیدی را برای اصلاح زیستی فاضلاب­ها با آلودگی پیچیده فراهم می­کند.

آنزیم‌ نیتریلاز هیدرولیز نیتریل‌ها به آمونیاک و کربوکسیلیک­اسید را کاتالیز می‌کنند. نیتریلازها منجر به بیوسنتز پروتئین‌ها و تغییرات پس از ترجمه در گیاهان، جانوران، قارچ‌ها و برخی پروکاریوت‌ها می‌شوند.

14R"> -CN+H2O→RCONH2 نیتریلاز

نیتریلاز در کل فعالیتش را با طیف وسیعی از سوبستراهای نیتریل نشان می‌دهد، بااین‌وجود CHT و CynD (Cyanide dihydratase) اختصاصیت بالایی برای هیدروژن سیانید نشان می‌دهند؛ اما فعالیت خیلی کمی با نیتریل­ها بروز می‌دهند. اگرچه آن‌ها به‌عنوان هیدرولیزکننده نیتریل­ها به اسید مربوطه و آمونیاک شناخته شدند، اما سوبستراهای طبیعی بیشتر نیتریلازها مشخص نشده است (10). نیتریلازها براساس اختصاصیت سوبسترا به سه دسته تقسیم می‌شوند 1. نیتریلازهای آروماتیک که از گیاهان جداشده‌اند. ارگانیسم‌هایی از قبیل Nocardia sp. و Fusarium solani قادر به تجزیه نیتریل‌های آروماتیک، مثل بنزونیتریل هستند. 2. نیتریلازهایی که نیتریل‌های آروماتیک را تجزیه می‌کنند نمی‌توانند بر روی نیتریل‌های آلیفاتیک تأثیری داشته باشند.
Rhodococcus rhodochrous K22 از نیتریل‌های آلیفاتیک مثل آکریلونیتریل، به‌عنوان سوبسترای اختصاصی استفاده می‌کند 3. نوع جدیدی از نیتریلاز میکروبی که در آلکالیژنز فکالیس JM3 (Alcaligenes faecalis JM3) وجود دارد که به‌عنوان آریل استونیتریلاز (arylacetonitrilase) طبقه‌بندی‌شده است (2، 6). مکانیسم عمل آنزیم نیتریلاز به این صورت است که توسط گروه تیول یک حمله نوکلئوفیلی به کربن نیتریل صورت می­گیرد. مراحل بعدی حمله توسط دو مولکول آب و پروتونه­کردن اتم نیتروژن است که به فرم آمونیاک تبدیل شده­است (10).

با توجه به خطرات و معایب سیانید برای سلامت انسان و محیط­زیست و با در نظر گرفتن نتایج مطالعات صورت گرفته در رابطه با زیست پالایی می­توان به این نتیجه رسید که استفاده از موجودات زنده یکی از فناوری های پیشرفته در این زمینه است که می­تواند با هزینه کمتر (در مقایسه با روش­های فیزیکی و شیمیایی)، در مقیاس وسیع­تر و اثر­بخشی بالاتر به کمک جوامع بشری آمده و این مشکل بزرگ را رفع نماید. با توجه به اهمیت تجزیه سیانید توسط ریزموجودات و نقش کلیدی آنزیم نیتریلاز در فرایند تجزیه سیانید در قارچ­ها، هدف اصلی این تحقیق بررسی میزان فعالیت این آنزیم تحت تاثیر غلظت­های مختلف سیانید و اندازه­گیری میزان تجزیه سیانید است. این پژوهش به بررسی تجزیه زیستی سیانید توسط آنزیم نیتریلاز در قارچ پنی­سیلیوم پرداخته­است تا راهکار مناسب به منظور تجزیه زیستی آلاینده­های زیست محیطی صنایع مختلف از جمله معدن طلا را ارائه دهد.

مواد و روشها

در این پژوهش به بررسی میزان تجزیه سیانید آزاد توسط قارچ پنی­سیلیوم پرداخته­شد. ابتدا قارچ در محیط­کشت مایع در غلظت­های مختلف سیانید (2، 5 و 10 میلی­مولار)کشت داده­شد. بعد از گذشت هفت روز محیط­کشت را با کاغذ صافی فیلتر کرده و قارچ در درون فویل پیچیده و در آون به­منظور بررسی وزن خشک در دمای 60 درجه قرار داده شد. بعد از گذشت 48 الی 72 ساعت وزن خشک قارچ اندازه­گیری شد. از محلول زیری نیز به­منظور تعیین میزان سیانید باقی­مانده در محیط­کشت قارچ، از طریق رنگ­سنجی پیکریک­اسید استفاده شد. در این روش از پیکریک­اسید 5/0 درصد و سدیم­کربنات 500 میلی­مولار استفاده شد. برای اندازه­گیری سیانید محیط­کشت در یک واکنش 180 میکرولیتری، 100 میکرولیتر محیط­کشت حاوی سیانید که در آن قارچ رشد کرده­است به همراه 80 میکرولیتر پیکریک­اسید اضافه شد. به­عنوان نمونه­ی شاهد از 100 میکرولیتر آب مقطر به همراه 80 میکرولیتر پیکریک­اسید استفاده­شد. بعد از تغییر رنگ جذب آن در 492 نانومتر اندازه­گیری شد. میزان سیانید مصرفی توسط قارچ از طریق اندازه­گیری اختلاف جذب بین کنترل منفی و محیط­کشت قارچ تعیین شد (3، 18).

محیط­کشت جامد PDA= Potato dextrose agar : مقدار مورد نیاز از پودر پوتیتو دکستروز آگار به مقدار آب مقطر مورد نیاز اضافه­شد. سپس به مدت ‌زمان 15 دقیقه در دمایC ˚ 121 اتوکلاو گردید. بعد از اینکه دمای آن به 50 تاC ˚ 60 کاهش یافت به پلیت­های یک­بار مصرف ریخته­شد. پس از منعقد شدن محیط­کشت، آن‌ها به یخچال با دمایC ˚4 منتقل گردیدند( 2).

محیط­کشت مایعPD= Potato dextrose : به­منظور تهیه محیط­کشتPD  می­توان سیب­زمینی قطعه قطعه شده را در آب­مقطر پخته و به­صورت یک سوسپانسیون نسبتا غلیظ درآورد. سپس مایع صاف شده سیب­زمینی را به یک ارلن منتقل نموده و به میزان لازم قند دکستروز را به آن افزوده و با افزودن مجدد آب­مقطر، حجم را به یک لیتر رسانیده و با کمک اتوکلاو محلول تهیه شده استریل می­شود( 2).

جهت تعیین فعالیت آنزیم نیتریلاز از جذب ببنزوئیک­ اسید در 238 نانومتر استفاده گردید. در این روش 15 میکرولیتر از بنزونیتریل 10 میلی­مولار در متانول، 250 میکرولیتر بافر بافر Tris/ Hcl 50 میلی­مولار با 8 = ppH، به همراه 5 میکرولیتر از آنزیم ترشحی در محیط­کشت در 45 درجه سانتیگراد قرار داده­شد. بعد از گذشت 5 دقیقه واکنش با 30 میکرولیتر HCl 1 مولار متوقف می­شود و جذب در 238 نانومتر خوانده­شد (22). بنزونیتریل در حضور آنزیم نیتریلاز تولید بنزوئیک­اسید و آمونیاک می­کند (17). با کمک منحنی استاندارد بدست­آمده از جذب بنزوئیک­اسید، فعالیت آنزیم نیتریلاز بدست­آمد. در این پژوهش یک یونیت (Unit) آنزیم برابر است با مقدار آنزیمی که یک میکرو­مول محصول در دقیقه ایجاد کند.

همچنین به منظور محاسبه فعالیت ویژه آنزیم از طریق روش برادفورد غلظت آنزیم ترشحی در محیط­کشتغلظت پروتئین اندازه گیری و و فعالیت ویژه آنزیم ترشحی در محیط­کشت از رابطه زیر بدست­آمد:

14ظˆغŒعکظ‡ ظپط¹ط§ظ„غŒطھ =Unitظ¾ط±ظˆطھط¦غŒظ†ط؛ظ„ط¸طھ ">

نتایج

در حضور سیانید، پیکریک­اسید به ایزوپروپیک اسید تبدیل­شده و شدت رنگ رابطه مستقیم با غلظت سیانید آزاد دارد. پس از گذشت هفت روز از کشت قارچ در غلظت­های مختلف سیانید (0، 2، 5 و 10 میلی مولار) نتایج رنگ سنجی پیکریک­اسید که در شکل 1 نشان داده شده است بیانگر آن است که با افزایش غلظت سیانید طیفی از رنگ پرتقالی روشن تا تیره ایجاد شده­است.

 

شکل 1- تغییر در شدت رنگ محیط­کشت قارچ حاوی سیانید

در شکل 1غلظت سیانید باقی­مانده در محیط­کشت قارچ، با غلظت اولیه سیانید که بترتیب 2، 5، 10 و 15 میلی­مولار می­باشد مقایسه شده­است.

 

 

شکل 2- غلظت ابتدایی سیانید و غلظت سیانید باقی­مانده در محیط­کشت قارچ

 

همان­طور که شکل 2نشان می­دهد با افزایش غلظت سیانید تا 10 میلی­مولار توان تجزیه سیانید توسط قارچ نیز بالا می­رود، اما در غلظت 15 میلی­مولار توان تجزیه سیانید کاهش یافته­است.

بمنظور بررسی وجود تفاوت معنادار بین داده­ها از آزمون آماری تی­تست استفاده­شد.

 

جدول 1- آزمون t-test در غلظت­های مختلف سیانید در قارچ پنی­سیلیوم

 

میانگین

انحراف معیار

انحراف از میانگین

95% confidence interval of the difference

T

درجه آزادی

Sig(2- tailed)

کمترین

بیشترین

غلظت 2 mM

59/0 mM

164/0

094/0

18/0

1

23/6

2

025/0

غلظت 5 mM

68/3 mM

119/0

068/0

38/3

98/3

43/53

2

000/0

غلظت 10 mM

26/9 mM

122/0

07/0

95/8

56/9

76/130

2

000/0

غلظت 15 mM

68/6 mM

21/0

123/0

153/6

21/7

05/54

2

000/0

 

نتایج آزمون تی­تست نیز حاکی از وجود اختلاف معنادار بین غلظت اولیه اولیه سیانید و غلظت سیانید باقی­مانده در محیط­کشت قارچ می­باشد.

در مرحله بعد وزن خشک قارچ مطابق آنچه در شکل 3 ملاحظه می­شود، بدست­آمد.

 

 

شکل 3- مقایسه وزن خشک قارچ در غلظت­های 2، 5 ، 10 و 15 میلی­مولار و وزن خشک شاهد

 

شکل 3 نیز نشان می­دهد که در اثر اضافه شدن سیانید به محیط­کشت قارچ، رشد قارچ متوقف نشده­است و قارچ از طریق تجزیه سیانید توانسته­است منابع غذایی را در اختیار خود قرار داده و رشد کند و تا غلظت 10 میلی­مولار وزن قارچ زیادتر شده­است، یعنی منابع غذایی زیادتری در اختیار قارچ بوده­است. اما در غلظت 15 میلی­مولار رشد قارچ کاهش یافته­است، ولی با این وجود این قارچ توانسته در این غلظت نیز زنده بماند و از بین نرفته­است.

 

 

جدول 2- آزمون t-test مربوط به وزن خشک قارچ پنی­سیلیوم در غلظت­های مختلف

 

میانگین

انحراف معیار

انحراف از میانگین

95% confidence interval of the difference

T

درجه آزادی

Sig(2- tailed)

کمترین

بیشترین

وزن شاهد در غلظت 2 mM

028/0 mM

001/0

00066/0

025/0

031/0

43

2

001/0

وزن شاهد در غلظت 5 mM

017/0 mM

003/0

002/0

008/0

025/0

16/8

2

015/0

وزن شاهد در غلظت 10 mM

006/0 mM

0005/0

0003/0

005/0

008/0

20

2

002/0

وزن شاهد در غلظت 15 mM

042/0 mM

0005/0

0003/0

041/0

044/0

128

2

000/0

 

نتایج جدول 2 نشان­دهنده وجود تفاوت معنا­دار بین وزن خشک شاهد و نمونه­ها در غلظت­های 2، 5، 10 و 15 میلی­مولار می­باشد.

بنزونیتریل در حضور آنزیم نیتریلاز تولید بنزوئیک اسید و آمونیاک می­کند. با کمک منحنی استاندارد بدست آمده از جذب بنزوئیک اسید، فعالیت آنزیم نیتریلاز بدست­آمد.

در رابطه با فعالیت ویژه آنزیم نیتریلاز در قارچ پنی­سیلیوم نیز، فعالیت ویژه در غلظت­های مختلف سیانید مطابق شکل 4 می­باشد.

 

 

شکل 4- فعالیت ویژه آنزیم نیتریلاز در غلظت­های مختلف سیانید در قارچ پنی­سیلیوم

 

همانطور که شکل 4 نشان می­دهد همراه با افزایش غلظت سیانید فعالیت آنزیم نیتریلاز هم بالا می­رود. در رابطه با فعالیت ویژه آنزیم نیتریلاز در قارچ پنی­سیلیوم نیز، فعالیت ویژه در غلظتهای مختلف سیانید مطابق جدول 3 می باشد.

جدول 3 بیانگر آن است که با افزایش غلظت سیانید، فعالیت ویژه آنزیم افزایش یافته­است.

جدول 3- فعالیت ویژه آنزیم نیتریلاز در غلظت­های مختلف سیانید در قارچ پنی­سیلیوم

فعالیت ویژه آنزیم

غلظت سیانید

342/0

0

372/0

2mM

797/0

5mM

301/1

10mM

 

 

 

جدول 4- تحلیل واریانس غلظت آنزیم نیتریلاز در قارچ پنی­سیلیوم

 

مجموع مجذورات

درجه آزادی

میانگین مجذورات

F

Sig

بین گروهی

درون گروهی

کل

208/0

003/0

212/0

3

8

11

069/0

000/0

8/169

000/0

 

 

تحلیل واریانس غلظت آنزیم نیتریلاز در قارچ پنی­سیلیوم نشان­دهنده معنادار بودن آزمون است. در واقع در مقایسه بین میانگین گروه­های مختلف تفاوت معنادار وجود دارد.

شکل 5 بیانگر آن است که با افزایش غلظت سیانید، فعالیت ویژه آنزیم افزایش یافته­است. نتایج آزمون دانکن نشان می­دهد که همه­ی میانگین­ها به جز در غلظت 0 و 2 میلی­مولار سیانید با هم تفاوت معنادار دارند.

 

 

شکل 5- مقایسات میانگین غلظت آنزیم نیتریلاز در قارچ پنی­سیلیوم

جدول 5- تحلیل واریانس غلظت پروتئین در قارچ پنی­سیلیوم

 

مجموع مجذورات

درجه آزادی

میانگین مجذورات

F

Sig

بین گروهی

درون گروهی

کل

000/0

000/0

000/0

3

8

11

000/0

000/0

5/389

000/0

 

جدول 5 تحلیل واریانس قارچ پنی­سیلیوم نشان­دهنده معنادار بودن آزمون است.

شکل 6 بیانگر تفاوت غلظت پروتئین کل در قارچ پنی سیلیوم در غلظت­های مختلف است که نتایج آزمون دانکن نیز بر روی ستون­ها به نمایش گذاشته شده­است.

 

 

شکل 6- مقایسات میانگین غلظت پروتئین در قارچ پنی­سیلیوم

 

آنچه ملاحظه می­شود بیانگر آن است که با افزایش غلظت سیانید در محیط­کشت قارچ فعالیت ویژه آنزیم نیتریلاز نیز افزایش می­یابد و در نتیجه میزان تجزیه سیانید در محیط بالا می­رود و منابع غذایی لازم برای رشد قارچ در اختیار قارچ قرار داده می­شود. در غلظت 15 میلی­مولار که توان قارچ برای تجزیه سیانید کاهش یافته­است، متقابلاًٌ وزن قارچ نیز کاهش­یافته و علاوه بر این میزان آنزیم هم کاهش می­یابد.

بحث و نتیجه­گیری

بررسی­های انجام شده بر تحقیقات گذشته بیانگر آن است که در اکثر این تحقیقات تمرکز اصلی بر روی دو جنس اصلی تریکودرما و فوزاریوم و گونه­های مختلف این دو جنس برای تجزیه سیانید و اندازه­گیری فعالیت آنزیم نیتریلاز انجام گرفته و در تحقیقات معدودی به فعالیت تجزیه سیانید توسط قارچ پنی­سیلیوم اشاره گردیده­است که می توان به دو تحقیق زیر اشاره نمود.

بارکلی و همکاران (1998) به این نتیجه رسیدند کهFusarium solani , Trichoderma polysporum,Fusarium oxysporum, Scytalidium thermophilum, Penicillium miczynskiقادر به رشد در محیط کشت با وجود هگزا سیانو فرات [K4Fe(CN)6] به عنوان تنها منبع نیتروژن تحت شرایط اسیدی هستند. رشد با حذف تدریجی سیانید از مایع­رویی کشت همراه بود، پس از پایان رشد، حداقل 50٪ از سیانید کل کاهش یافته­است.

اوزل و همکاران (2010) در پژوهشی به بررسی برخی ویژگی­های مربوط به تخریب زیستی در برخی از سویه­های بازیدیومیست­ها شاملPolyporus arcularius (T 438), Schizophyllumcommune (T 701), Clavariadelphus truncatus (T 192),Pleurotus eryngii (M 102), Ganoderma applanatum (M 105), Trametes versicolor (D 22), Cerrena unicolor (D 30), Schizophyllum commune (D 35)  و (Ganoderma lucidum (D 33پرداخته­است. از میان آنها P. arcularius, S. commune  و G. lucidum نقش بیشتری در تجزیه سیانید داشتند و از بین این سه سویه نیز  P. arculariusبهعنوان بهترین سویه با توجه به شرایط اپتیمم پیشنهاد شده­است.

نتایج بدست­آمده از مقالات نشان­دهنده توانایی بسیاری از قارچ­ها از جملهTrichoderma harzianum،
T pseudokoningi،  Fusarium oxysporum،  Aspergillus nidulans ، Neurospora crassPenicillium و غیره برای تجزیه زیستی سیانید است. دیگر تحقیقات انجام گرفته بر روی قارچ­های دیگر است که مواردی از آنها به شرح زیر می­باشند:

ازی (2005) در پژوهشی اعلام نمود که دو گونه مورد بررسی از Trichodermaقادر به تجزیه ترکیبات سیانید هستند. این سویه­ها از سیانید به عنوان منبع کربن و گلوکز استفاده می­کنند (8). آزمایش‌های انجام‌شده سرعت بالای کاتابولیکی سیانید توسط گونه‌های Trichoderma را در مقایسه با گونه‌های Fusarium نشان می‌دهد. به­نظر می‌رسد اگر گلوکز به‌عنوان متابولیت همراه باشد، به‌طور تأثیرگذاری سرعت تجزیه سیانید را از طریق گذر زمان افزایش می‌دهد (13). ازی (2002) در پژوهشی به بررسی آنزیم­های تجزیه­کننده هیدروژن سیانید پرداخته و به این نتیجه رسید که سویه­های مورد بررسی از قارچ­هایTrichoderma harzianum  و T. pseudokoningi با کمک دو آنزیم سیانید هیدراتاز و رودانس قادر به تجزیه سیانید هستند (7). پریرا و همکاران (1996) به این نتیجه رسیدند که از میان 14 قارچ جدا شده از پساب صنعتی آلوده به سیانید یک سویه از Fusarium oxysporum قادر به تحمل سیانید در پساب صنعتی و محیط­کشت حاوی سیانید است و این توانایی به دلیل تبدیل سیانید به فرم­آمید غیر­سمی توسط آنزیم فرم­آمید هیدرولیاز می­باشد (19). در پژوهشی باسیل و همکاران (2008) نشان دادند که قارچ­هایی مانند Neurospora crassa و  Aspergillus nidulans قادر به تخریب سیانید با کمک سیانید هیدراتاز و نیتریلازها می­باشند (6). ازی و لینچ در پژوهشی در سال 2005 به این نتیجه رسیدند که افزایش غلظت سیانید در محیط­کشت قارچ منجر به افزایش وزن خشک قارچ می‍شود (8). داده­های حاصل از آزمون تی­تست در این پژوهش نیز نشان­دهنده تفاوت معنادار بین غلظت­های اولیه و غلظت­های نهایی سیانید در محیط­کشت و وزن خشک شاهد و وزن خشک نمونه در غلظت­های مختلف می­باشد که بیانگر آن­است که، همراه با افزایش غلظت سیانید میزان تجزیه سیانید و وزن خشک نمونه بالا رفته­است.

طبق نتایج مقالات مورد مطالعه و این پژوهش برخی قارچ­ها قادر به تولید آنزیم­های تجزیه­کننده سیانید هستند و از این طریق هم کربن و گلوکز مورد نیاز برای رشد را در اختیار خود قرار می­دهند و هم به تجزیه­زیستی سیانید می‍پردازند. در مطالعه حاضر برای سنجش تجزیه سیانید، از روش اندازه­گیری پیکریک­اسید استفاده شد. این روش برای سنجش سیانید آزاد و کمپلکس­های ضعیف سیانید -فلز مورد استفاده قرار می­گیرد. که نتایج نشان­دهنده کاهش 52 درصدی غلظت سیانید در محیط­کشت حاوی قارچ پنی‍سیلیوم است. در رابطه با فعالیت ویژه آنزیم نیتریلاز نتایج نشان­دهنده تفاوت معنادار بین داده­ها می­باشد به این معنی که، با افزایش غلظت سیانید، فعالیت ویژه آنزیم نیز افزایش یافته­است، بنابراین می­توان به این نتیجه رسید که اضافه کردن سیانید به محیط­کشت دارای اثر القایی است و فعالیت آنزیم تجزیه­کننده را بالا می­برد و متقابلاً همراه با بالا رفتن فعالیت آنزیم، میزان تجزیه سیانید افزایش­یافته و در نتیجه منابع کربن و نیتروژن بیشتری در اختیار قارچ قرار گرفته که منجر به رشد بیشتر قارچ شده­است. بنابراین با توجه به نتایج این پژوهش، اصلاح زیستی راهکاری موثر و مقرون­به­صرفه برای درمان آب­های آلوده و خاک می­باشد، که در مقایسه با روش­های فیزیکی و شیمیایی تاثیر کمتری بر محیط می­گذارد. همچنین با بهبود شرایط محیطی برای فعالیت ریزموجودات، می­توان میزان تجزیه زیستی توسط آن­ها را افزایش داد.

1. اخوت، س. م و زاد، س. ج. (1384)، قارچ شناسی و بیماری های قارچی گیاهی،  ص 3- 13.

2. جواهری صفا ، ز. س، امین زاده. م، زمانی و م، مطلبی (1396)، تجزیه زیستی سیانید توسط نیتریلاز: اهمیت نیتریلاز ها به عنوان آنزیم تجزیه کننده سیانید در دو گروه باکتری و قارچ ها ، اولین کنگره ملی زیست شناسی و علوم طبیعی ایران.

3. محسنی، م. س، فیروزیار و ا، نظری. (1394)، جداسازی و بررسی ویژگی های باسیلوس MF3 تجزیه کننده سیانید در شرایط قلیایی، مجله پژوهش های سلولی و مولکولی( مجله زیست شناسی ایران) ، جلد 28، شماره 3.

 

4. Adams, G. P, Fufeyin. S, Okoro and I, Ehinomen. (2015)," Bioremediation, Biostimulation and Bioaugmention: A Review", International Journal of Environmental Bioremediation & Biodegradation, Vol. 3, No. 1, 28-39.

5. Barclay, M. A, Hart. CH, Knowles. J, Meeussen and V, Tetdl. (1998), "Metabolism and enzymology of cyanide/ metallocyanide biodegradation by Fusarium solani under neutral and acidic conditions", Enzyme and microbial technology, 23(5): 321-330.

6. Basile, L. J. (2008), "Cyanide-degrading enzymes for bioremediation", Texas A&M University.

7. Ezzi, M. I and J. M, Lynch. (2002), "Cyanide catabolizing enzymes in Trichoderma spp", Enzyme and microbial technology, 31(7): 1042-1047.

8. Ezzi, M. I and J. M, Lynch. (2005), "Biodegradation of cyanide by Trichoderma spp. and Fusarium spp", Enzyme and microbial technology, 36(7): 849-854.

9. Fernandez.R, Dolghih. E, Kunz. D, (2004), "Enzymatic Assimilation of Cyanide via Pterin-Dependent Oxygenolytic Cleavage to Ammonia and Formate in Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764", Applled and environmental microbiology,p p. 121–128.

10. Gupta, N. CH, Balomajumder and V, Agarwal. (2010), "Enzymatic mechanism and biochemistry for cyanide degradation: a review", Journal of hazardous materials, 176(1): 1-13.

11. Igeño,M.(2007), Biodegradation of cyanide-containing wastes by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344,2007, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. P.100-108.

12. Knowles, C. J. (1988), "Cyanide utilization and degradation by microorganisms.", Cyanide compounds in biology, 140: 3-15.

13. Kitleartpornpairoat , R and S, Potivichayanon. (2010), "Biodegradation of Cyanide by a Novel Cyanide- degrading Bacterium", 4 2010-06-20.

14. Kobayashi, M and S, Shimizu. (2000), "Nitrile hydrolases", Curr Opin Chem Biol ,4:95-102.

15. Luque- Almagro, V. M. F, Mercha´n. R, Blasco. M, Igen˜o. M, Martı´nez-Luque. C, Moreno-Vivia´n. F, Castillo and M, Rolda´n. (2011), "Cyanide degradation by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 involves a malate: quinone oxidoreductase and an associated cyanide-insensitive electron transfer chain", Microbiology, 15,739- 746.

16. Luque- Almagro, V. M. R, Blasco. M, Martínez-Luque. C, Moreno-Vivián. F, Castillo and M, Roldán. (2011), "Bacterial cyanide degradation is under review: Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344, a case of an alkaliphilic cyanotroph", Biochemical Society transactions, 39(1): 269-274.

17. Martinkova. L, Vejvoda. V, Kren. V. 2008, " Selection and screening for enzymes of nitrile metabolism" Journal of Biotechnology 133 , 318–326

18. Özel, Y.S, Gedikli. P, Aytar. A, Ünal. M, Yamaç. A, Çabuk and N, Kolankaya. (2010), "New fungal biomasses for cyanide biodegradation", Journal of Bioscience and Bioengineering, Volume 110, Issue 4, 431– 435.

19. Pereira, P. J, Arrabaqab and M, Amaral-Collaqo. (1996), "Isolation,  selection and characterization of a cyanide- degrading fungus from an industrial effluent", International biodeterioration & biodegradation, 37(1): 45-52.

20. Potivichayanon S., and R. Kitleartpornpairoat. (2010), Biodegradation of cyanide by novel cyanide degrading bacterium, World Academy of Science Engineering and Technology, 42, 2010, 1362–1365.

21. Raybuck, S. A. (1992), "Microbes and microbial enzymes for cyanide degradation", Biodegradation, 3(1): 3-18.

22. Vejvoda. V, Kubaˇca. D, Davidovaa. A, Kaplana.O, ˇSulca,b. M,ˇSvedaa. O, Chaloupkovac. R, Martinkovaa. L. (2010)," Purification and characterization of nitrilase from Fusarium solani IMI196840" Process Biochemistry 45 , 1115– 1120