نویسندگان

1 هیئت علمی دانشکده علوم پایه ، واحد علوم و تحقیقات ، دانشگاه آزاد اسلامی

2 NA

3 استاد دانشگاه شهید بهشتی

چکیده

ایران به عنوان سومین تولید کننده بادام در جهان محسوب می شودو بیش از 30 گونه ، زیر گونه ویا اکوتیپ پرونوس وجود دارد. در میان گونه های بادام وحشی، گونه اسکوپاریا به عنوان پایه برای ارقام بادام در غرب کشور استفاده می شود. این گونه ذخیره ژنی با خصوصصیات با ارزش برای زادآوری و اصلاح ارقام بادام فراهم می کند. تحقیق حاضر تنوع ژنتیکی سه جمعیت پرونوس اسکوپاریا با استفاده از نشانگرهای ISSR می پردازد. در این تحقیق سعی کرده ایم به بررسی واگرایی ژنتیکی در مقابله تبادل ژنی این جمعیت ها بپردازیم. نشانگرهای مولکولی توانستند 50% پلی مورفیسم میان 38 درخت بادام وحشی مورد مطالعه را نشان دهند. بالاترین تنوع ژنتیکی، اندیس شانون و درصد پلی مورفیسم مربوط به درختان جمعیت دیهوک (یزد) بود. در تجزیه خوشه ایی ، درختان جمعیت دیهوک با فاصله از درختان دو جمعیت دیگر قرار گرفت. در حالیکه تبادل ژنتیکی بین دو جمعیت رشم-معلم (سمنان) و فسا(فارس) مشاهده گردید. آنالیز واریانس مولکولی تفاوت ژنتیکی معنی داری بین جمعیت های مورد مطالعه نشان داد. ازمون مانتل ارتباط معنی داری بین فاصله ژنتیکی و فاصله جغرافیایی نشان نداد. این امر ممکن است به علت تبادل ژنی بین جمعیت های بادام وحشی مورد مطالعه باشد که با درختچه شبکه ایی و انالیز ساختار ژنتیکی نیز نشان داده شده است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Genetic structure of three wild almond populations (Prunus scoparia)

نویسندگان [English]

  • Reihaneh Rasti 2
  • Masoud Sheidai 3

چکیده [English]

Iran ranks the third one in the world for the production of almond and over 30 Amygdalus (Prunus) species, subspecies or ecotypes have been identified in the country. Among the wild almond species, P. scoparia is used as the rootstock for almond in southwest of Iran. This species provides a gene pool of valuable characteristics for breeding and improvement of the cultivated almond. The present study considers genetic diversity analysis of three P. scoparia populations by using ISSR markers. We tried to show genetic divergence versus admixture of these populations. ISSR loci showed 50% polymorphism among 38 wild almond trees studied. The highest values for the genetic diversity, shannon index and percentage of polymorphism were observed in Deihook (Yazd) population. In cluster analysis, Deihook population stands much separated from the other two populations while, Rashm-Moalem (Semnan) and Fasa (Fars) populations showed higher genetic exchange among their trees. AMOVA test showed great genetic difference among the studied populations. The Mantel test did not show association between the genetic and geographical distances of the studied populations. This is possibly due to gene exchange among these populations which was also shown by reticulation and STRUCTURE analyses.

کلیدواژه‌ها [English]

  • genetic differentiation
  • ISSR
  • Prunus scoparia

بررسیساختارژنتیکیسهجمعیتباداموحشی  (Prunus scoparia)

زهرا نورمحمدی1*، ریحانه راستی1 و مسعود شیدایی2

1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

2 ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم زیستی

تاریخ دریافت: 21/3/95                تاریخ پذیرش: 22/7/96

چکیده

ایران به عنوان سومین تولید کننده بادام در جهان محسوب می شود و بیش از 30 گونه، زیر گونه و یا اکوتیپ پرونوس در ایران وجود دارد. در این میان گونه های بادام وحشی، گونه اسکوپاریا پرونوس در ایران وجود دارد. در میان گونه های بادام وحشی، گونه اسکوپاریا به عنوان پایه برای ارقام بادام در غرب کشور استفاده می شود. این گونه ذخیره ژنی با خصوصیات با ارزش برای زاد آوری و اصلاح ارقام با دام فراهم می کند. تحقیق حاضر به تنوع ژنتیکی سه جمعیت پرونوس اسکوپاریا با استفاده از نشانگرهای ISSR می پردازد. در این تحقیق سعی شده به بررسی واگرایی ژنتیک در مقابله تبادل ژنی این جمعیتها پرداخته شود. نشانگر های مولکولی توانستند 50 درصد پلی مورفیسم میان 38 درخت بادام وحشی مورد مطالعه را نشان دهند. بالاترین تنوع ژنتیکی، اندیس شانون و درصد پلی مورفیسم مربوط به درختان جمعیت دیهوک (یزد) بود. در تجزیه خوشه ایی، درختان جمعیت دیهوک با فاصله از درختان دو جمعیت دیگر قرار گرفت. در حالی که تبادل ژنتیکی بین دو جمعیت رشم معلم (سمنان) و فسا (فارس) مشاهده گردید. آنالیز واریانس مولکولی تفاوت ژنتیکی معنی داری بین جمعیتهای مورد مطالعه نشان داد. آزمون مانتل ارتباط معنی داری بین فاصله ژنتیکی و فاصله جغرافیایی نشان نداد. این امر ممکن است به علت تبادل ژنی بین جمعیتها بادام وحشی مورد مطالعه باشد که با درختچه شبکه ایی و آنالیز ساختارژنتیکی نیز نشان داده شده است.

واژه های کلیدی: تمایز ژنتیکی،ISSR، پرونوس اسکوپاریا

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144865939  ، پست الکترونیکی:  z-nouri@srbiau.ac.ir

مقدمه

 

جنس پرونوس (Prunus) از خانواده رزاسه (Rosaceae)، دارای اجداد اروپایی آسیایی است که شامل 200 گونه‌ با اهمیت اقتصادی هستند.این گیاه به صورت بومی در جنوب غرب آسیا رشد می کند. ترکیه، سوریه، ایران، تاجیکستان، ازبکستان و افغانستان زیستگاه این گیاه هستند (2، 3 ،17 و 20).

تا کنون 21 گونه وحشی و 7 هیبرید در ایران شناسایی شده است (14). جمعیتهای وحشی گونه‌های بادام نمایانگر طیف وسیعی از خصوصیات مورفولوژیک آنهاست که به صورت طبیعی در مناطق مختلف ایران رشد کرده‌اند (17). گونه‌های بادام وحشی بیشتر در مناطق بیابانی به عنوان درخت پایه به کنترل فرسایش خاک کمک می‌کند. همچنین به دلیل وجود پوسته سخت و چوبی در برابر حشرات و قارچها مقاوم هستند (20).

گونه‌های وحشی بادام با ژرم‌پلاسم گسترده در تولید و پرورش ارقام اصلاح شده و کمک به ایجاد صفات مناسب مانند شکوفه دهی با تأخیر در اواخر فصل، خودباروری و مقاومت به تنش خشکی و شوری حائز اهمیت هستند (23).

بادام وحشی اسکوپاریا (scoparia) یکی از گونه ها‌ی بومی ایران است که در کنترل فرسایش خاک و بازسازی جنگلها و افزایش بازده محصولات نقش مهمی بازی می‌کند. این گونه اغلب به عنوان پایه برای تولید تجاری و مصارف خوراکی به کار می‌رود (16). بیش از پنج هزار هکتار تا سال 2006 از بادامهای زیرکشت استانهای فارس، کرمان، بوشهر و هرمزگان روی این پایه قرار گرفته اند (6).

بادام دارای ویژگی خودناسازگاری وگرده‌افشانی متقابل است که این باعث افزایش هتروزیگوسیتی این جنس می‌شود. بنابراین برای شناسایی گونه ها مطالعات مولکولی در کنار مطالعات ریخت شناسی از اهمیت شایانی برخوردار است. در این میان نشانگرهای مولکولی مبتنی برDNA  در جنس پرونوس ابزاری مناسب و کاربردی به منظور مطالعه تکامل، ساختار ژنوم و بررسی تنوع ژنتیکی شناخته شده است (7).

زین‌العابدینی و همکاران (22) به مقایسه خصوصیات ژنتیکی چهار گونه وحشی پرونوس پرداختند. در این مطالعه گونه های بادام توسط نشانگرهای ریزماهواره ایی هسته ایی و کلروپلاستی و پروتئینی مورد بررسی قرار گرفتند. در میان این نشانگرها، نشانگر ریزماهواره ایی هسته ایی بیشترین فراوانی و بالاترین پلی‌مورفیسم را نشان دادند.

سرخه و همکاران با بررسی 23 صفت مورفولوژیک، 19 آغازگر AFLP (amplified fragment length polymorphism)، 80 آغازگر RAPD (random amplified polymorphic DNA) و32  جفت آغازگر ریزماهواره ایی روابط فیلوژنیک میان 29 رقم زراعی و 3 گونه وحشی بادام را بررسی نمودند. نتایج این تحقیق نشان دهنده مؤثر بودن تکنیکهای مولکولی در تمایز بین ژنوتیپهای بادام بود (17).

در تحقیقی که نیکومنش و همکاران (10) بر روی برخی ژنوتیپهای بادام ایران و گونه‌های مرتبط با آن انجام دادند، توانستند با استفاده از نشانگر RAPD روابط بین 55 ژنوتیپ بادام و 7 گونه مرتبط با آن را مشخص نمایند.

در تحقیق دیگری تنوع ژنتیکی برخی از گونه‌های بادام وحشی و گونه های مرتبط با پرونوس با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره ایی مورد بررسی قرار گرفته است. با توجه به نتایج به دست آمده از این تحقیق، مناسب‌ترین لوکوسهایی که قادر به جداسازی ژنوتیپهای بادام هستند، مشخص شدند (14).

در مطالعه‌ای مهدی قلی و همکاران (8)، به بررسی تنوع ژنتیکی شش جمعیت از بادام وحشی ایران با نشانگر های ریزماهواره ایی پرداختند. در این تحقیق ارتباط بین تفاوتهای مورفولوژیکی، ژنتیکی و فاصله جغرافیایی این جمعیتها مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج به دست آمده از این مطالعه، بیانگر تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای بادام وحشی بوده است که این تنوع دال بر سازگاری ژنتیکی درختان با مناطق جغرافیایی آنها است.

در مطالعه حاضر سعی بر آن است که به سه سوال زیر پاسخ داده شود: 1- میزان تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتی سه جمعیت بادام وحشی اسکوپاریا چگونه است؟  2- آیا ارتباطی بین تفاوت ژنتیکی و فاصله جغرافیایی جمعیتهای بادام وحشی وجود دارد؟ و 3- آیا جریان ژنی میان سه جمعیت مورد مطالعه وجود دارد؟

مواد و روشها

در این تحقیق سی و هشت درخت بادام وحشی اسکوپاریا از سه منطقه جغرافیایی ایران مورد بررسی قرار گرفتند. برگهای درختان از استانهای سمنان (رشم-معلمان، 10 درخت)، یزد (دیهوک، 18 درخت) و فارس (فسا، 10 درخت) به طور تصادفی انتخاب، جمع‌آوری و در سیلیکاژل ذخیره شدند.

DNA نمونه‌های برگ با استفاده از روش CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) با کمی تغییر طبق پروتکل (5) استخراج شدند. کمیت و کیفیت DNA به ترتیب توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و بارگذاری بر روی ژل آگارز 8/0 درصد سنجیده شد.

در این تحقیق از 10 پرایمر نشانگر ISSR (inter simple sequence repeat) که توسط دانشگاه بریتیش کلمبیا معرفی شده است استفاده شد. این پرایمرهاشامل: (AGC)5GT, (CA)7GT, (AGC)5GG, UBC 810, (CA)7AT, (GA)9C, UBC 807, UBC 811, (GA)9A, (GT)7CA هستند.

واکنش ISSR-PCR در حجم 25 میکرو لیتر شامل بافر1X، کلرید منیزیم (5/1 میلی مول)، مخلوط dNTP (2/0 میلی مول)، نشانگر ها با غلظت نهایی 2/0 میکرو مول، 3 واحد آنزیم Taq DNA پلی مراز و 20 نانوگرم از DNA ژنومی انجام گرفت. تمامی مواد PCR از شرکت بایورون آلمان تهیه شد. واکنش تکثیر در دستگاه ترموسیکلر (Techne، آلمان) با برنامه دمایی: 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد و به دنبال آن 35 سیکل در سه مرحله شامل 30 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی گراد، 1 دقیقه در دمای 50 درجه سانتی گراد و 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد صورت گرفت. در نهایت به منظور توسعه کامل زنجیره های تکثیر یافته ، مخلوط PCR 7 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد گرمادهی شدند. به منظور نمایان سازی و تفکیک باندها، محصول واکنش تکثیر بر روی ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز و سپس با استفاده از رنگ فلئورسنت ژل رد رنگ آمیزی شدند و اندازه باندها بر روی ژل با استفاده از سایز مارکر 100 جفت بازی تخمین زده شدند. به منظور بررسی تکرار پذیری نشانگرهای مورد مطالعه، هر واکنش سه بار تکرار و بر روی ژل آگارز الکتروفورز شدند. باندهای ISSR به دست آمده به صورت دو حالته کدگذاری شدند، بدین صورت که حضور باندها با کد یک و عدم حضور باندها با کد صفر مشخص می­شود.

پارامترهای تنوع ژنتیکی در هر جمعیت مشخص شدند. این پارامترها شامل درصد چند شکلی آللی ، تنوع آللی (19)، تنوع ژنتیکی نای ، شاخص اطلاعات شانون، تعداد آللهای مؤثر و درصد پلی مورفیسم می باشد (4و 19).

گروه بندی جمعیتها با استفاده از خوشه بندی NJ (Neighbor joining) با استفاده از نرم‌افزارDarwin بعد از بوت استرپ کردن انجام گرفت. همچنین رسته بندی براساس مؤلفه های اصلی توسط نرم‌افزار DARwin انجام گرفت.

به منظور بررسی تفاوتهای ژنتیکی بین جمعیتها از آزمون آنالیز واریانس مولکولی (principle coordination analysis) و اندیس فاصله ژنتیکی نای توسط نرم افزار GenAlex (12) انجام گرفت. همچنین آنالیز  Gstو اندازه‌گیری میزان جریان ژنی یا  Nm محاسبه گردید.

آنالیز STRUCTURE درختهای بادام مورد مطالعه با کمک نرم‌افزار STRUCTURE بررسی شد. در این روش ابتدا K  خوشه در نظر گرفته می‌شود که هر کدام از آن خوشه‌ها به وسیله فرکانس آللهای هر لوکوس از یکدیگر متمایز می‌شوند (13). پیوستگی ژنتیکی جمعیتها، با روش خوشه بندی K-Means توسط نرم افزار GenoDive  صورت گرفت.

نتایج

آنالیز تنوع ژنتیکی: تمامی نشانگرهای مورد مطالعه توانستند باندهای تکرار پذیر را ایجاد نمایند. موتیفهای تکراری دی نوکلئوتیدی با نوکلئوتیدهای لنگری در لوکوسهای ISSR مورد مطالعه توانستند آللهای اطلاع رسان بیشتری نسبت به لوکوسها با موتیفهای تکراری سه نوکلئوتیدی نشان دهند.

تعداد آللهای متفاوت در سه جمعیت بادام وحشی بین 33/1 تا 48/1 بود به طوری که بیشترین مقدار آلل مؤثر مربوط به دو جمعیت یزد-دیهوک و فارس-فسا و برابر 404/1 بود (جدول 1). بیشترین و کمترین مقدار اندیس شانون به ترتیب 332/0 و 292/0 مربوط به جمعیت استان یزد و استان سمنان تخمین زده شد. براساس نتایج به‌دست ‌آمده مشخص شد، بیشترین تنوع ژنتیکی یا هتروزیگوسیتی مورد انتظار(228/0) مربوط به جمعیت استان یزد و کمترین مقدار آن (203/0) متعلق به استان سمنانبود.از بین جمعیتهای مورد مطالعه بیشترین درصد پلی‌مورفیسم مربوط به جمعیت یزد 17(/55 درصد) و کمترین میزان پلی مورفیسم در نمونه های استان سمنان 13 (47 درصد) مشاهده شد.

 

جدول 1- پارامترهای تنوع ژنتیکی محاسبه شده در سه جمعیت بادام وحشی اسکوپاریا در استانهای فارس، یزد و سمنان.

تعداد آلل متفاوت

تعداد آلل مؤثر

اندیس شانون

هتروزیگوسیتی مورد انتظار

درصد پلی مورفیسم

 

جمعیت

333/1

404/1

309/0

217/0

48

میانگین

فسا(فارس)

078/0

047/0

035/0

025/0

 

خطا استاندارد

 

483/1

404/1

332/0

228/0

55

میانگین

دیهوک (یزد)

067/0

042/0

033/0

023/0

 

خطا استاندارد

 

356/1

369/1

292/0

203/0

47

میانگین

رشم-معلم(سمنان)

073/0

044/0

034/0

024/0

 

خطا استاندارد

 

391/1

392/1

311/0

216/0

50

میانگین

جمع

042/0

026/0

020/0

014/0

51/2

خطا استاندارد

 

 

 

حضور آللهای منحصر به فرد در برخی درختان جمعیتهای مورد مطالعه احتمالاً به علت رخداد بازآرایی ژنتیکی همچون حذف و اضافه شدگی در توالیهای مورد مطالعه باشد.

آنالیز درون و بین جمعیتهای بادام وحشی:  نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی  بین جمعیتهای مورد مطالعه تنوع کمتری نسبت به درون جمعیتها نشان داد.  به طوری‌که 40 درصد از کل تنوع ژنتیکی بین جمعیتها و 60 درصد آن درون جمعیتهاست و این تفاوت ژنتیکی بین جمعیتهای مورد مطالعه اختلاف معنی داری (001/0P=) را نشان داد.

به منظور بررسی میزان تنوع ژنتیکی و اندازه‌گیری جریان ژنی پارامترهای Gst و Nm بین جمعیتهای مورد مطالعه محاسبه گردید (جدول 2). بیشترین تمایز ژنی بین جمعیتهای فارس و یزد با Gst  94/0  بود. در واقع می‌توان این طور بیان کرد که بیشترین تمایز ژنی بین جمعیت فارس و یزد ایجاد شده است. درحالی که بیشترین میزان جریان ژنی مربوط به جمعیتهای یزد و سمنان است.

 

جدول 2- میزان Gst و جریان ژنی (Nm) بین جمعیتهای بادام استان یزد، سمنان، فارس. سطح Gst>0.5 نشان دهنده تمایز ژنتیکی مناسب بین جمعیتهاست.

 

جمعیت فسا

جمعیت دیهوک

جمعیت رشم-معلم

جمعیت فارس- فسا

---

   

جمعیت یزد-دیهوک

Gst=95/0

Nm=49/1

---

 

جمعیت سمنان -رشم-معلم

Gst=24/0

Nm=54/1

Gst=18/0

Nm=18/2

---

 

 

یکی دیگر از پارامترهایی که در روابط بین جمعیتها مورد بررسی قرار گرفته است، فاصله ژنتیکی نای است. فاصله ژنتیکی نای به صورت جفت جفت نشان دهنده بیشترین فاصله ژنتیکی بین جمعیتهای فسا و دیهوک (213/0) بود در حالی که  کمترین فاصله ژنتیکی مربوط به جمعیتهای یزد و سمنان (135/0) بود. این نتایج تأیید کننده جریان ژنی بالا بین این دو جمعیت است.

آنالیز خوشه‌ای به روش NJ بر پایه ماتریس فاصله ژنتیکی دایس در شکل 1 آورده شده است. نتایج نشانگر تفکیک جمعیتها در سه خوشه مجزاست. هر خوشه شامل جمعیت‌ بادامهای وحشی در یکی از استان های یزد، سمنان و فارس است. در بین تمامی خوشه‌ها، درخت بادام شماره 29 از جمعیت یزد در کلاستر مربوط به استان یزد قرار نگرفته و در شاخه سمنان قرار گرفته است که این نشانگر نزدیکی شماره 29 از لحاظ ژنتیکی به جمعیت سمنان است. همچنین درخت شماره 13 از جمعیت یزد نیز با کمی فاصله از گروه خود قرار گرفته است. در این آنالیز خوشه درختان بادام مربوط به جمعیت فارس از دو خوشه دیگر دورتر قرار گرفته است که نشان دهنده تفاوت ژنتیکی این جمعیت از مابقی جمعیتهای مورد مطالعه است.

 

 

شکل 1- آنالیز خوشه‌ای NJ در سه جمعیت یزد-دیهوک(کلاستر شماره 2، درختان شماره 11-29)، سمنان-معلمان(کلاستر شماره 3، درختان شماره 30-38) و فارس-فسا(کلاستر شماره1، درختان شماره 1-10). اعداد بر روی  شاخه‌ها نشان دهنده تعداد بوت استرپها است.

 

با استفاده از آنالیز رسته بندی PCoA10 (شکل 2)، تفاوتهای ژنتیکی میان افراد هر جمعیت به طور مشخص‌تری نمایان می‌شود. جدایی سه جمعیت براساس  این رسته‌بندی ، نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای را تأیید می‌کند. در این رسته‌بندی نیز دو جمعیت یزد و سمنان در فاصله کمتری از هم قرار گرفتند. همچنین درخت شماره 29 از جمعیت یزد در کنار درختان جمعیت سمنان قرار گرفته است که نتایج حاصل از این رسته بندی تأییدی بر آنالیز خوشه‌ای NJ است که در آن فرد 29 وضعیتی مشابه داشت.

در این تحقیق آنالیز Fst بر روی داده ها نشان داد که این مقدار بین دو جمعیت فارس- فسا و یزد- دیهوک برابر با 443/0، بین دو جمعیت فارس- فسا و سمنان- معلمان برابر با 423/0 و بین دو جمعیت یزد- دیهوک و سمنان- معلمان برابر با 336/0 بود که این نتایج نشان‌دهنده تمایز بیشتر بین جمعیت درختان ‌بادام منطقه فارس و یزد است.  به طور کلی هر چه میزان Fst کمتر باشد تبادل ژنی بیشتری بین جمعیتها وجود دارد که بنا بر این اصل تبادل ژنی بین جمعیتهای یزد و سمنان بیشتر از نواحی دیگر است که تأیید کننده جریان ژنی بالا به دست آمده توسط آنالیز Nm می باشد.

 

 

شکل 2- رسته‌بندی PcoA  براساس دو مؤلفه اول با استفاده از داده‌های حاصل از نشانگرهای ISSR. شماره نمونه ها براساس شکل 1 مرتب شده است.

 

تبادل ژنی احتمالی بین جمعیتها در آنالیز درختچه شبکه ایی بررسی شد (شکل 3). براساس این نتایج بین درختان جمعیتهای یزد و سمنان و همچنین درختان جمعیت یزد و فارس تبادل ژنی دیده می‌شود در حالی که بین جمعیت فارس و سمنان تبادل ژنی وجود ندارد. علی رغم تمایز ژنتیکی در جمعیتهای مورد مطالعه (بر اساس آنالیز Fst) آنالیز شبکه ایی در بر گیرنده این مطلب است که جدایی ژنتیکی جمعیت به طور کامل نبوده و درجه ایی از تبادل ژنی بین درختان جمعیتها رخ داده است به طوری که آنالیز مانتل تأیید کننده این مطلب است. با استفاده از این آزمون بین ماتریس فاصله ژنتیکی و جغرافیایی  ارتباط معنی داری (01/0P<) مشاهده نگردید. این نتیجه نشان دهنده عدم تفکیک براساس فاصله در جمعیتهای بادام وحشی مورد مطالعه است.

بر اساس آنالیز ساختار ژنتیکی و آزمون ایوانو جمعیتهای مورد مطالعه سه نوع ترکیب آللی را نشان دادند (شکل 4). در این پلات درختانی نیز مشاهده می‌شوند که درجه بسیار پایینی از ترکیب آللی در آنها وجود دارد و در واقع موارد کمی از آللهای مشترک در جمعیتهای مختلف مشاهده می‌شود.

 

 

شکل 3- درختچه شبکه ایی درختان بادام وحشی مورد مطالعه و تبادل ژنی بین سه جمعیت مورد مطالعه. شماره درختان براساس شکل 1 مرتب شده است. خط‌چینها نشان‌دهنده تبادل ژنی است.

 

 

شکل4- پلات  ساختار ژنتیکی (STRUCTURE) جمعیتهای درختان بادام وحشی. اعداد روی هر ستون، شماره درختهای جمعیتها براساس شکل 1 است. اعداد داخل پرانتز شماره جمعیت را نشان می‌دهد(شماره 1 جمعیت سمنان، شماره 2 جمعیت یزد و شماره 3 جمعیت فارس)

 

خوشه بندی K-Means یکی از دقیق ترین روشهای گروه بندی است. بر این اساس، داده های حاصله از نشانگرهای مولکولی درختان بادام وحشی را می توان در یک تا سه گروه‌ مشخص دسته‌بندی کرد (جدول 3). با توجه به آنالیز صورت گرفته بهترین خوشه‌بندی بر اساس معیار اطلاعات Bayesian 3 گروه و براساس pseudo-F 2 گروه است. براساس این خوشه‌بندی هر چه میزان BIC کمتر باشد و میزانPseudo-F بیشتر باشد، خوشه‌بندی بهتر خواهد بود.

با وجود تبادل ژنی رایج در جمعیتهای مورد مطالعه، آنالیز واریانس مولکولی  تفاوت معنی داری( 1./0P< ) بین جمعیتها نشان داد. حضور آللهای منحصر به فرد در ترکیب آللی جمعیتها در آنالیز ساختار ژنتیکی هم در تأیید مطالب بالا می باشد(شکل 4).

 

جدول 3- خوشه‌بندی Means K- سه جمعیت بادام وحشی مورد مطالعه از K=1 تا K=3. علامت * نشان دهنده عدد خوشه بندی بر اساس pseudo-F و علامت & عدد خوشه بندی بر اساس BIC

k

SSD(T)

SSD(AC)

SSD(WC)

r-squared

pseudo-F

AIC

BIC

Rho

1

390.842

0

0

0

0

90.678

230.433

0

2*

390.842

81.178

309.664

0.208

9.437

84.063

225.224

0.364

3&

390.842

134.042

256.8

0.343

9.134

79.313

221.748

0.402

 

 

بحث

تحقیق حاضر بیانگر تنوع بالاتر لوکوسهاISSR با موتیفهای تکراری دی نوکلئوتیدی با نوکلئوتیدهای لنگری است. مطالعات مختلف در این زمینه نشان دهنده این مطلب است که موتیفهای دی نوکلئوتیدی با  نوکلوتید های لنگری الگوی باندی بهتر با پلی مورفیسم بالاتر را نشان می دهد (2، 9 ،15 و 18).

نتایج حاصل از پژوهش حاضر، مقادیر تقریبا مشابهی از پارامترهای ژنتیکی در جمعیتهای مورد مطالعه در مقایسه با مطالعه نورمحمدی و همکارانش (11) را نشان داد. در مطالعه مذکور نیز سه جمعیت بادام وحشی ایران که از استانهای خراسان (بیرجند)، تهران (فیروزکوه) و فارس (فیروز آباد) جمع‌آوری شده بودند، مورد مطالعه قرار گرفتند.

 بررسی این مارکرها در 3 جمعیت بادام وحشی مورد مطالعه حاکی از تنوع ژنتیکی بالای این درختان است. وجود تنوع بالا میان درختان بادام را می توان به گرده افشانی متقابل و خود ناسازگاری در بادام دانست. بهرحال مضاعف شدگی و حذف ژنی نیز می تواند نقش در افزایش تنوع ژنتیکی درختان بادام ایفاء کند.

آنالیز ساختار ژنتیکی جمعیتهای مورد مطالعه نشان از سه ترکیب آللی را در این افراد نشان داد. رویش درختان در مناطق جغرافیایی متفاوت، ترکیب خاصی از آللها را به دلیل سازگاری با محل کسب کرده‌اند. درختانی نیز در این مطالعه مشاهده می‌شوند که موارد کمی از آللهای مشترک در جمعیتهای مختلف را نشان می دهند. این آنالیز  میزان بسیار کم تبادل  ژنی بین سه جمعیت بادام وحشی را نشان می دهد. به طور کلی آنالیز ساختار ژنتیکی درختان بادام وحشی وجود تمایز ژنتیکی بین سه جمعیت را نشان می دهد که آنها را در سه گروه مجزا تقسیم‌بندی کرده است.

با وجود تبادل ژنی رایج در جمعیتهای مورد مطالعه، آنالیز واریانس مولکولی  تفاوت معنی داری بین جمعیتها نشان داده است که این موضوع می تواند به دلیل بازآراییهای ژنتیکی بالا در افراد جمعیتها به خاطر سازگاری محلی یا رانش ژنتیکی باشد. واگرایی ژنتیکی جمعیتها می تواند باعث تغییرات مورفولوژیکی در درختان شود. این امر باعث شده است که برخی از تاکسونومیست ها جمعیتهای بادام وحشی را به عنوان اکوتیپهای مختلف در نظر بگیرند. حضور آللهای منحصر به فرد در ترکیب آللی جمعیتها در آنالیز ساختار ژنتیکی هم در تأیید مطالب بالا می باشد.

یکی از دلایل تبادل ژنی بین جمعیتها وجود پدیده خودناسازگاری در گونه بادام به عنوان یکی از مکانیسمهای ژنتیکی-تکاملی است که دگرلقاحی و تبادل ژن را در میان افراد مختلف جمعیتها سبب می‌شود. این نوع لقاح منجر به تنوع ژنتیکی بالا در گیاهان بادام می‌شود. وجود تبادل ژنی بین جمعیتهای مختلف  پرونوس اسکوپاریا می‌تواند منجر به ایجاد هیبریداسیون بین آنها شود.

مهدی قلی و همکاران (8) تبادل ژنتیکی بین پنج جمعیت بادام وحشی گونه اسکوپاریا شامل جمعیتهای تهران، فارس، سمنان، خراسان، لرستان و قم را با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره ایی نشان داده اند. در مطالعه مذکور این نشانگرها نتوانستند تمایز جغرافیایی بین جمعیتها را به خوبی نشان دهند. دو جمعیت فارس و سمنان به طور مشترک در مطالعه حاضر نیز بررسی شده است. اگرچه نشانگرهای ریزماهواره ایی توانایی تفکیک ژنتیکی این دو جمعیت را نداشتند، نشانگرهای ISSR  توانستند به طور واضح این دو جمعیت را در دو گروه مجزا قرار دهند. یک دلیل ممکن برای  این مطلب قدرت تفکیک بالای نشانگرهای ISSR است که به علت توالیهای تکراری بین ژنی خنثی این نوع نشانگرهاست که به طور مرتب بازآرایی می شوند.

با توجه با اینکه در مطالعه حاضر بیشترین جریان ژنی و کمترین فاصله ژنتیکی بین دو جمعیت یزد و سمنان مشاهده شده است می توان فاصله جغرافیایی کمتر بین استان سمنان و یزد در مقایسه با استان فارس را موید شباهت ژنتیکی بیشتر دو جمعیت سمنان و یزد دانست.

تبادل ژنتیکی بین گونه های مختلف بادام وحشی ایران توسط زین العابدینی و همکاران(21) با استفاده از نشاگرهای ریزماهواره ایی هسته ایی و کلروپلاستی نیز گزارش شده است.   

همچنین نورمحمدی و همکارانش با مطالعه سه جمعیت بادام وحشی ایران (بیرجند،فیروزکوه و فیروز آباد) تمایز ژنتیکی این جمعیتها را با استفاده از نشانگرهای ISSR اثبات نمودند (21). در این مطالعه سه ترکیب آللی متفاوت مشخص گردیده است. این مسئله نشانگر این موضوع است که درختان بادامی که در هر منطقه رشد کرده‌اند، ترکیب آللی خاص خود را، در نتیجه سازگاری با شرایط جغرافیایی، به دست آورده‌اند (11).

علاوه بر موارد ذکر شده در تحقیق حاضر، خوشه‌بندی به روش K-means   نیز براساس  pseudo-F، گروه‌بندی دوتایی را پیشنهاد می‌کند که به نظر می‌رسد با توجه به تفاوت ژنتیکی کمتر میان جمعیتهای یزد و سمنان آنها را یک گروه در نظر گرفته و جمعیت استان فارس را به صورت گروهی جداگانه در نظر گرفت. البته در همین خوشه‌بندی با توجه به معیار اطلاعات  Bayesian تقسیم بندی به سه گروه مجزا صورت گرفته که تأییدی بر آنالیز رسته بندی PCoA و خوشه بندی NJ است. مطالعه دیگری در زمینه خوشه‌بندی بادام به روش K-means با استفاده از نشانگرهای مولکولی گزارش نشده است بلکه از این خوشه‌بندی برای دسته‌بندی ‌ویژگیهای مورفولوژیک مانند پوسته و مغز بادام استفاده شده است (1).

نتیجه گیری کلی

به طور کلی آنچه به نظر می رسد این است که تفاوت ژنتیکی  بین سه جمعیت واقع شده در نواحی مختلف جغرافیایی وجود دارد. تفاوتهای ژنتیکی معنی‌دار میان سه جمعیت مورد مطالعه بادام وحشی، نشان دهنده وقوع تغییرات ژنتیکی جمعیتهاست که این تفاوتهای ژنتیکی بیان کننده وجود ساختار ژنتیکی متفاوت در هر یک از جمعیتهای مطالعه شده است. بدیهی است این تفاوتهای ژنتیکی به منظور سازش‌پذیری جغرافیایی روی داده‌اند. وجود پلی مورفیسم ژنتیکی در بین جمعیتها می‌تواند منبع مناسبی برای ایجاد فرم‌های زراعی و اصلاح نژاد شده‌ باشد.

همچنین نتایج حاصل از این مطالعه نشان دهنده این مطلب است که نشانگرهای ISSR در تحقیقات ژنتیکی بر روی بادام وحشی می توانند نشانگرهای مناسبی به منظور بررسی تنوع ژنتیکی و تفاوت میان جمعیتها باشند.

1- Antonucci, F.,  Costa, C., Pallottino, F.,  Paglia, G., Rimatori, V.,  De Giorgio, D., Menesatti, P. 2010. Quantitative method for shape description of almond cultivars (Prunus amygdalus Batsch). Food and Bioprocess Technology 5(2):768-785.

2- Blair, M.W., Panaud, O., McCouch, S.R. 1999. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (Oryza sativa L).Theoretical Applied Genetics 98: 780–792.

3- Browicz, K., Zohary, D. 1996. The genus Amygdalus L. (Rosaceae): species relationships, distribution and evolution under domestication. Genetic Resources and Crop Evolution 43: 229–247.

4- Freeland, J.R., Kirk, H., Peterson, S.D. 2011. Molecular Ecology (2nd ed). UK: Wiley-Blackwell. p. 449.

5- Krizman, M., Jakse, J., Baricevic, D., Javornik, B., Mirko, P. 2006. Robust CTAB-activated charcoal protocol for plant DNA extraction. Acta agriculturae Slovenica87: 427 – 433.

6- Madani, B., Rahemi, M., Assad, M.T., Tafazoli, E., Mardani, A.A. 2006. A study on morphological, cytogenetic and grafting take of five almond rootstocks. M.Sc. Thesis, University of Shiraz, Shiraz. p.92 [in Persian].

7- Martinez-Gomez, P., Sanchez-Perez, R., Rubio, M., Dicenta, F., Gradziel, T.M.,  Sozzi, G.O. 2005. Application of recent biotechnologies to Prunus tree crop genetic improvement. Ciencia e  Investigasion Agraria 32(2):73–96

8- Mehdigholi, K., Sheidai, M., Niknam, V., Attar, F., Noormohammadi, Z. 2013. Population structure and genetic diversity in Prunus scoparia of Iran. Annales Botanici Fennici 50: 327- 336.

9- Nagaoka, T., Ogihara, Y. 1997. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theoretical Applied Genetics 94: 597–602.

10- Nikoumanesha, K., Ebadia, A., Zeinalabedinib, M., Gogorcenac, Y. 2011. Morphological and molecular variability in some Iranian almond genotypes and related Prunus species and their potentials for rootstock breeding. Scientia Horticulturae 129: 108–118.

11- Noormohammadi, Z.,Mahdavipoor, Z., Sheidai, M., Mehdigholi, K., Hasheminejad -Ahangarani –Farahani, Y. 2013. Coalescence, STRUCTURE and reticulation analysis of genetic diversity in Prunus scoparia populations. Phytologia Balcanica 19: 339-346.

12- Peakall, R., Smouse, P.E. 2006. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6: 288-295.

13- Pritchard, J.K., Stephens, M., Donnelly, P. 2000. Inference of population structure using multilocus genotype Data. Genetics 155: 945-959.

14- Rahemi, A., Fatahi, R., Ebadi, A., Taghavi, T., Hassani, D., Gradziel, T., Folta, K., Chaparro, J. 2012. Genetic diversity of some wild almonds and related Prunus species revealed by SSR and EST-SSR molecular markers. Plant Systematic Evolution 298:173–192.

15- Reddy, M.P., Sarla, N., Siddiq, E.A. 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding.Euphytica128: 9–17.

16- Rouhi, V., Samson, R., Lemeur, R., Van Damme, P. 2007. Phytosynthetic gas exchange characteristics in three different almond species during drought stress and subsequent recovery. Environmental and Experiment Botany 59:117-129

17- Sorkheh, K., Shiran, B., Rouhi, V., Asadi, E., Jahanbazi, H., Moradi, H., Gradziel, T.M., Martinez-Gomez, P. 2009. Phenotypic diversity within native Iranian almond (Prunus spp.) species and their breeding potential. Genetic Resources and Crop Evolution 56: 947-961

18- Tsumura, Y., Ohba, K., Strauss, S.H. 1996. Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in Douglasfir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica). Theoretical Applied Genetics 92: 40–45.

19- Weising,  K.,  Nybom, H.,  Wolff, K.,  Kahl, G. 2005. DNA  Fingerprinting  in  Plants.  Principles, Methods, and Applications. (2nd  ed.), Boca Rayton, Fl., USA: CRC Press, pp. 472.

20- Yousefzadeh, K., Houshmand, S., Madani, B., Martinez-Gomez, P. 2010. Karyotypic studies in Iranian wild almond species. Caryologia 63: 117-123.

21- Zeinalabedini, M., Khayam-Nekoui, M., Grigorian, V., Gradzielc, T.M., Martínez-Gómezd, P. 2010. The origin and dissemination of the cultivated almond as determined by nuclear and chloroplast SSR marker analysis. Scientia Horticulturae 125: 593–601.

22- Zeinalabedini, M., Majourhat, K., Khayam-Nekoui, M., Grigorian, V., Torchi, M., Dicenta, F, Martı´nez-Go´mez, P. 2008. Comparison of the use of morphological, protein and DNA markers in the genetic characterization of Iranian wild Prunus species Scientia Horticulturae  116: 80–88.

23- Zohary, D., Hopf, M. 2000. Domestication of plants in the old world, 3rd edn. Oxford University Press, NY.