نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد دانشکده علوم کشاورزی و منابع طبیعی، گروه تولیدات گیاهی ،دانشگاه گنبد کاووس
2 استادیار دانشکده علوم کشاورزی و منابع طبیعی، گروه تولیدات گیاهی ،دانشگاه گنبد کاووس
3 دانشیار دانشکده علوم کشاورزی و منابع طبیعی، گروه تولیدات گیاهی ،دانشگاه گنبد کاووس
4 دانشیار گروه گیاهپزشکی ، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
چکیده
بیماری سفیدک سطحی از جمله بیماریهای مهم گندم است در سال های اخیر کاربرد القا کننده ها به میزان زیادی استقبال شده لذا در این مطالعه به منظور بررسی نقش کیتوزان، رقم فلات به عنوان یک رقم حساس انتخاب و در مرحله دو برگی بوسیله کیتوزان اسپری برگی شد، سپس گیاهان تیمار شده به همراه گیاهان شاهد، توسط قارچ Bgt مایهزنی شدند.در نهایت الگوی تظاهر ژنهای MLO، BI-1 و NPR1 با استفاده از تکنیک qRT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که در هر دو گروه از گیاهان تیمار شده با کیتوزان و شاهد روند تظاهر ژن های مورد بررسی پس از اعمال آلودگی به صورت افزایشی بوده، به طوری که گیاهان تیمار شده القای زودهنگام و بالای ژن NPR1 را در ساعات اولیه بعد از آلودگی با Bgt نسبت به گیاهان شاهد نشان دادند و 24 ساعت پس از آلودگی به حداکثر بیان خود رسیدند. اما میزان افزایش در ژن های BI-1 و MLO در گیاهان تیمار شده کمتر از گیاهان شاهد بود، به طوریکه این گیاهان بر خلاف گیاهان شاهد در 24 ساعت پس از آلودگی کمترین میزان بیان را نشان دادند که این نشان دهنده این است که این ژنها با کاهش سطح بیان خود در جهت افزایش سطح گونه های اکسیژن فعال سبب القا مرگ سلولی در گیاه شده تا از این طریق سبب ممانعت از رشد و توسعه قارچ در مراحل اولیه آلودگی گردند. می توان کاربرد کیتوزان را در القای مقاومت سیستمیک در گندم علیه بیماری سفیدک سطحی موثر دانست.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Assay of NPR1, MLO and BI-1 genes expression in susceptible wheat to powdery mildew after treatment with chitosan
نویسندگان [English]
1 MSc. student Plant Production Dept., Faculty of Agriculture & Natural Resources, Gonbad Kavous University, Gonbad Kavous, I.R. of Iran
2 Assistant professor Plant Production Dept., Faculty of Agriculture & Natural Resources, Gonbad Kavous University, Gonbad Kavous, I.R. of Iran
3 Associated of professor Plant Production Dept., Faculty of Agriculture & Natural Resources, Gonbad Kavous University, Gonbad Kavous, I.R. of Iran
4 Associated Professor of Plant Protection Department., Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, I.R. of Iran
چکیده [English]
Powdery mildew is one of the most important diseases of wheat that make yield damage annually. In recent years, the use of induction elicitors has been widely welcomed. Therefore, in this research in order to examine the ability of chitosan , Flat were selected as susceptible cultivar, and the leaves were sprayed with chitosan. Then treated plant together control plants were inoculated with Bgt pathogen.Finally, The expression rate of MLO, B-I1 and NPR1 genes was examined in using Real Time PCR technique Results showed that in both chitosan treated plants and the controls, rate of gene expression were increased after infection for all genes, So that, in the first hours after inoculation, treated plants showed NPR1 expression more rapidly than control. Maximum expression level of this gene was observed at 24 hours after infection. But, in treated plants, the expression rate of BI-1 and MLO were less than the control and they showed minimum expression at 24 hours after infection. These results indicated these genes by decreasing their expression rate in order to increase the level of active oxygen species causes induction of cell death in the plant to inhibition of fungal growth and development in the early stages after infection. The gene expression rate in plants treated with 250 mg/L was more indicative than those treated with chitosan 500 mg/L. Overall; results showed that chitosan could induce systemic resistance in susceptible wheat against powdery mildew in low concentration.
کلیدواژهها [English]
بررسی میزان بیان ژنهای NPR1، MLO و BI-1 در گندم حساس به سفیدک سطحی تحت تیمار با القا کننده کیتوزان
مرجان خاتمی1، لیلا آهنگر1*، فاختک طلیعی طبری1 و حسین صبوری1 و ولیاله بابایی زاد2
1 گنبد کاووس، دانشگاه گنبد کاووس، دانشکده علوم کشاورزی و منابع طبیعی، گروه تولیدات گیاهی
2 ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی، گروه گیاهپزشکی
تاریخ دریافت: 29/1/97 تاریخ پذیرش: 27/4/97
چکیده
بیماری سفیدک سطحی با عامل Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt) از جمله بیماریهای مهم گندم به شمار میرود که در سراسر جهان از جمله ایران سالانه میزان زیادی خسارت به این محصول وارد میکند. در سال های اخیر کاربرد القا کننده های دفاعی به میزان زیادی استقبال شده لذا در این مطالعه به منظور بررسی نقش کیتوزان به عنوان یک محرک زیستی مکانیسم دفاعی، رقم فلات به عنوان یک رقم حساس به سفیدک سطحی انتخاب و در مرحله دو برگی بوسیله کیتوزان اسپری برگی شد، سپس گیاهان تیمار شده به همراه گیاهان شاهد، توسط قارچ Bgt مایهزنی شدند. تمامی مراحل آزمایش در سال زراعی 1395 در آزمایشگاه ژنتیک دانشگاه گنبد کاووس انجام گرفت. در نهایت الگوی تظاهر ژنهای MLO، BI-1 و NPR1 با استفاده از تکنیک qRT-PCR در چهار بازه زمانی در سه تکرار مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که در هر دو گروه از گیاهان تیمار شده با کیتوزان و شاهد روند تظاهر ژن های مورد بررسیپس از اعمال آلودگی به صورت افزایشی بوده، به طوری که گیاهان تیمار شده القای زودهنگام و بالای ژن NPR1 را در ساعات اولیه بعد از آلودگی با Bgt نسبت به گیاهان شاهد نشان دادند و 24 ساعت پس از آلودگی به حداکثر بیان خود رسیدند. اما میزان افزایش در ژن های BI-1 وMLO در گیاهان تیمار شده کمتر از گیاهان شاهد بود، به طوریکه این گیاهان بر خلاف گیاهان شاهد در 24 ساعت پس از آلودگی کمترین میزان بیان را نشان دادند که این نشان دهنده این است که این ژنها با کاهش سطح بیان خود در جهت افزایش سطح گونه های اکسیژن فعال سبب القا مرگ سلولی در گیاه شده تا از این طریق سبب ممانعت از رشد و توسعه قارچ در مراحل اولیه آلودگی گردند. علاوه بر این در این مطالعه مشخص شد که گیاهان تیمار شده با غلظت 250 میلیگرم در لیتر کیتوزان، سطوح بیانی بهتری را نشان دادند، لذا می توان کاربرد کیتوزان را به خصوص در میزان کمتردر القای مقاومت سیستمیک در گندم علیه بیماری سفیدک سطحی موثر دانست.
واژه های کلیدی: گندم، کیتوزان، سفیدک سطحی، مقاومت
* نویسنده مسئول، تلفن:01733335117 ، پست الکترونیکی: L.ahangar63@gmail.com
مقدمه
بیماری سفیدک سطحی که به وسیله قارچ انگل اجباری به نام (Bgt). tritici Blumeria graminis f. sp ایجاد میگردد یکی از بیماریهای مهم گندم است که موجب کاهش چشمگیر عملکرد کیفی و کمی در مزارع گندم میشود (14). اﻣﺮوزه اﺳﺘﻔﺎده از روشهای شیمیایی ﺑﻪ دﻟﯿﻞ ﺿﻌﻒ در ﮐﺎراﯾﯽ، آﻟﻮدﮔﯽ ﻣﺤﯿﻂ زﯾﺴﺖ و اﯾﺠﺎد ﻣﻘﺎوﻣﺖ در ﺑﯿﻤﺎرﮔﺮ ﭼﻨﺪان ﻣﻮرد ﺗﻮﺟﻪ ﻗﺮار ﻧﻤﯽﮔﯿﺮد. بنابراین محققان به دنبال استفاده از مواد بیولوژیک به عنوان یکی از استراتژیهای مقاومتی در گیاهان هستند تا با کاربرد این ترکیبات بتوانند مکانیزمهای دفاعی گیاه را قبل از مواجهه با عامل بیمارگر فعال کنند(43). در سالهای اخیر کاربرد ترکیبات شیمیایی تحت عنوان فعال کننده به میزان زیادی مورد توجه قرار گرفته و در این بین کیتوزان به یک تمرکز اصلی پژوهش در کشاورزی تبدیل شده است. کیتوزان یک فعال کننده زیستی تجزیهپذیر و مشتق شده از پوست سخت پوستان است که امروزه به عنوان ماده افزایش دهنده قدرت دفاعی گیاهان علیه آلودگیهای قارچی به کار میرود (35). کیتوزان بوسیله پدیده مقاومت سیستمیک اکتسابی (SAR) که یکی از انواع مقاومتهای القایی است، منجر به تحریک فعالیت ژنهای پاسخ دهنده به بیمارگر و القای مقاومت نسبت به عوامل بیماریزا خواهد شد (43). شواهد حاکی از آن است که اسپری برگی کیتوزان با غلظتهای 0، 100، 200 و 500 میلی گرم در لیتر در گندم سبب کاهش رشد قارچ Fusarium graminearum شده است (3). پاسخ مقاومت القایی علیه Botrytis cinerea در برگ های خیار تیمار شده با غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان نیز گزارش شده است (8). ناندیش کومار و همکاران (32) نیز با تیمار بذرها آفتاب گردان با محلول 5% کیتوزان توانستند بیماری کپک زدگی را توسط قارچ Plasmopara hastedii ایجاد میگردد را به میزان 46-52 درصد به ترتیب در شرایط گلخانه و مزرعه کنترل نمایند. گزارشها همچنین نشان داد که ارزن تیمار شده با نانوذرات کیتوزان بیان بالایی از ژنهای PAL، PR1، PR5، پراکسیداز و فنیل اکسیداز پس از تیمار با اومایسیت بیوتروف Sclerospora graminicola نشان دادند (37).
گیاهان دارای یک سیستم امنیتی بسیار قوی بوده و در مواجهه با هر نوع تنشی، گروهی از پروتئینها تحت عنوان پروتئینهای مرتبط با بیمارگر (PR) را تولید می نمایند. ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦﻫﺎی PR گروه متنوعی از ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦﻫﺎی ﮔﯿﺎﻫﯽ ﻫﺴﺘﻨﺪ که ﻣﻮﺟﺐ ﺗﺨﺮﯾﺐ دﯾﻮارهﻫﺎی ﺳﻠﻮل ﻗﺎرﭼﯽ، اﯾﺠﺎد اﺧﺘﻼل در ﻏﺸﺎﻫﺎی ﺳﻠﻮﻟﯽ آن، ﺗﻘﻮﯾﺖ ﺳﯿﺴﺘﻢ ﭘﺎﺳﺦ دﻓﺎﻋﯽ ﻣﯿﺰﺑﺎن، دﺧﺎﻟﺖ در ﺑﯿﻤﺎریزاﯾﯽ و ﺳﻨﺘﺰ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦﻫﺎی ﺿﺪ ﻗﺎرﭼﯽ ﻣﯽﺷﻮﻧﺪ (42). نسخه بیان نشده ژنهای مرتبط با بیماریزایی Non-expresser of PathogensisRelated genes 1(NPR1)، به عنوان واسطه کلیدی در مقاومت القایی شناخته شده است (39). مطالعات نشان داد که وجود NPR1 برای آشکار سازی SAR جهت القای مکانیسم دفاعی علیه طیف وسیعی از بیمارگرها مورد نیاز میباشد (14 و 9). پروتئین NPR1 تحت شرایط نرمال به صورت الیگومریک غیرفعال در سیتوزول سلول وجود دارد، اما به محض آلودگی گیاه به بیمارگر وضعیت اکسایشی سلول تغییر یافته و پروتئین NPR1 بوسیله شکستن پیوندهای دیسولفید خود به فرم مونومری تبدیل شده (31) که میتواند بوسیله کنش با نوع خاصی از فاکتورهای تنظیم کننده رونویسی (TGA)، بیان ژنهای دفاعی PR را القاء کند (31 و 22). NPR1 همچنین بوسیله تنظیم سیگنالهای پایین دست سالسیلیک اسید (SA) بر مسیر SAR تاثیر میگذارد (14 و 13). به طوری که موتانتهایnpr1آرابیدوپسیس، فاقد توانایی القای ژنهای PR و افزایش SAR حتی پس از تیمار با SA میباشند. درحالیکه انتقال ژن NPR1 به این نوع گیاهان موتانت، نه تنها سبب رفع شدن تاثیر جهش میشود بلکه پاسخ به عوامل تحریک کننده SAR را با بیان بالای ژن PR، به حالت اول بر گردانده و سبب مقاومت به آلودگی Pseudomonas syringae میشود (11).
مرگ سلولی برنامهریزی شده (PCD = Programmed Cell Death) یکی از مکانیسمهای دفاعی گیاهان و حیوانات علیه عوامل بیماریزا است. پدیده PCD در حیوانات است بوسیله اعضای خانواده پروتئین BAX (BCL2-Associated X protein) تنظیم میگردد (20). اگرچه تاکنون هیچ همولوگی از پروتئین BAX در ژنوم گیاهی شناسایی نگردید، اما محققین ژن دیگری که به عنوان مهارکننده BAX (BI-1)(BAX- inhibitor) است را در گیاهان شناسایی نمودند (16 و 6) که بیان بالای آن در گیاهان منجر به حساسیت به بیمارگر بیوتروف و افزایش مقاومت به بیمارگر نکروتروف میشود (21 و 6). علاوه بر این، یکی دیگر از ژنهایی که نقش مهمی در حمایت از مرگ سلولی در پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی ایفا مینماید، ژن MLO(Mildew Resistance Locus O) است (34 و 26). پروتئین MLO یک پروتئین غیرعادی تراغشایی است که آلل وحشی آن، تنظیم کننده منفی مرگ سلولی در گیاه بوده (26) به طوریکه بیان بالای ژن MLO در گیاه جو سبب حساسیت بسیار بالای این گیاهان به سفیدک سطحی (Bgh) و افزایش میزان نفوذ قارچ در دیواره سلولی و تشکیل هاستوریوم گردید (24). شواهد همچنین نشان داده است که میزان بیان ژن MLO در طی پیری برگ به طور موثری کاهش مییابد (34). همچنین رینستادلر و همکاران (36) با استفاده از آلل موتانت mlo در جو نشان دادند که پروتئین MLO برای القای حساسیت به سفیدک بسیار مهم میباشد. به طوری که مطالعات نشان داده است که بیان ژنهای BI-1 و MLO در موتانت mlo5 جو از طریق تخریب مکان تجمع پراکسید هیدروژن (H2O2) و سرکوب نمودن پاسخهای دفاعی سبب تسهیل در نفوذ قارچ Bgh و حساسیت در گیاه گردید (15).
کیتوزان یک الیسیتور زیستی است که در تحقیق حاضر به منظور کاهش اثرات مخرب قارچکشها بر سلامت موجودات زنده و محیط زیست، از تاثیر القا کنندگی آن در گندم نسبت به بیماری سفیدک سطحی استفاده گردید. از سویی با توجه به اینکه تاکنون مطالعات خاصی در مورد تاثیر کیتوزان بر میزان بیان ژنهای MLO، BI-1 و NPR1 در بیماری سفیدک سطحی گندم صورت نگرفته است. لذا در این مطالعه به بررسی تاثیر این القاکننده بر تغییرات نسبی این گروه از ژن ها در گندم آلوده به Bgt، پرداخته شد.
مواد و روشها
در این تحقیق رقم فلات به عنوان رقم حساس به بیماری سفیدک سطحی انتخاب شد (3). بذرهای این رقم از ایستگاه تحقیقات کشاورزی گنبد تهیه گردید. جدایه قارچ Blumeria graminis F. sp. tritici (Bgt) نیز از بخش تحقیقات پاتولوژی غلات موسسه اصلاح و تهیه نهال و بذر تهیه و به دلیل بیوتروف بودن، عامل بیماری در اتاقک رشد روی رقم حساس بولانی در دمای 22 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 70% در طول مدت این بررسی تکثیر و نگهداری شد (30).
ارزیابی کاربرد کیتوزان در القای مقاومت به بیماری سفیدک سطحی: به منظور بررسی کاربرد کیتوزان در القای مقاومت در گندم در برابر بیماری سفیدک پودری، برگ گیاهان حساس، 24 ساعت پس از تیمار با غلظت های مختلف کیتوزان به همراه گیاهان کنترل در محیط آب آگار حاوی 20 میلیگرم در لیتر بنزیمیدازول در تشتکهای پتری قرار داده شدند. یک هفته پس از مایهزنی، تعداد کلنی رشد یافته در 5/2 سانتیمتر مربع هر برگ شمارش گردید. آزمایش با پنج تکرار برای هر تیمار انجام شد (7 و 2). سپس نتایج حاصله با آزمون حداقل تفاوت معنی دار (LSD) تجزیه و تحلیل گردید.
تیمار نمودن گیاهان و آلوده سازی با قارچ سفیدک پودری جهت بررسی الگوی بیان ژن: برای بررسی تأثیر القاکننده کیتوزان در مقابل عامل بیماری، بذرها گندم رقم فلات به مدت یک دقیقه با محلول یک درصد هیپوکلریت سدیم ضدعفونی شده و پس از سه مرتبه شستشو با آب مقطر روی کاغذ فیلتر مرطوب در تشتک پتری قرارداده شدند. پس از جوانهزنی، بذرها به گلدان حاوی خاک مزرعه و ماسه (1:1) ضدعفونی شده منتقل شده و در اتاقک رشد با تناوب 16 ساعت روشنایی با دمای 22 درجه سلسیوس و هشت ساعت تاریکی با دمای 20 درجه سلسیوس با رطوبت نسبی70 درصد نگهداری شدند. پس از گذشت دو هفته، گیاهچهها بهوسیله محلول کیتوزان (Sigma Alderich/ MMW) با غلظت 250 و 500 میلیگرم در لیتر اسپری برگی شدند(3). برای حل نمودن کیتوزان ابتدا آن را با اسید استیک یک درصد حل نموده و سپس به حجم مورد نظر رسانیده شد. گیاهان شاهد نیز با محلول آب و اسید استیک، تیمار شده و در اتاقک کشت نگهداری شدند. پس از گذشت 24 ساعت از تیمار گیاهان با کیتوزان، برگهای گیاهان تیمار شده به همراه گیاهان شاهد، به وسیله اسپورهای قارچ عامل بیماری در غلظت 50 کنیدیوم در میلیمتر مربع مایهزنی شدند. نمونهبرداری از گیاهان شاهد و آلوده در زمانهای 0، 12، 24 و 48 ساعت پس از آلودگی، انجام شد و نمونههای برگی در فریزر C°80- جهت استخراج RNA کل نگهداری شدند.
استخراج RNA از نمونهها، ساخت cDNA و اندازهگیری الگوی بیان ژنهای مورد مطالعه: برای استخراج RNA از نمونههای برگی، از کیت RNX-plus شرکت سیناژن (Cat, No: RN7713C) استفاده گردید. سپس کیفیت RNA استخراج شده در ژل آگارز 5/1 درصد ارزیابی شد. آنگاه نمونههای RNA، جهت زدودن DNA بوسیله آنزیم DNase 1 سیناکلون (cat. No: MO5401) تیمار شده و cDNA مربوط به هر نمونه با استفاده از کیت RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis سیناکلون (cat. No: RT5201) ساخته شد. تمامی این مراحل طبق دستورالعمل هر کیت انجام گرفت. بررسی بیان ژن (qRT-PCR) با استفاده از دستگاه C1000™ Thermal Cycler (AB) و کیت Sina SYBR Blue HS- qPCR Mix (2X)(Cat. No: MM2171) انجام شد. واکنش زنجیرهای پلیمراز شامل مرحله واسرشت سازی اولیه 7 دقیقه در 95 درجه سلسیوس سپس 40 چرخه (شامل 15 ثانیه در 95 درجه سلسیوس، 30 ثانیه در 60 درجه سلسیوس و 60 ثانیه در 72 درجه سلسیوس) بود. پس از اتمام واکنش PCR، برای رسم منحنی ذوب واکنش در دمای 95-60 درجه سلسیوس با اختلاف 5/0 درجه در هر چرخه انجام گرفت. به منظور استاندارد نمودن دادهها، نمونهها بوسیله ژن خانهدار Actin نرمال گردیدند. لیست آغازگرهای مورد استفاده در جدول 1 آمده است. این آغازگرها پس از هم ردیف نمودن توالیهای بدست آمده از بانک ژنی NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) بوسیله نرمافزارهای BioEdit 7.0.9.0 و OligoExplorer V1.4 طراحی شدند.
نرخ بیان ژن نیز به روش ∆∆CT = (CT target gene – CT actin)sample – (CTtarget gene – CT actin)calibrator
اندازهگیری شد(28). این آزمایش در سه تکرار جداگانه انجام گردید و پس از محاسبه بیان ژنهای مورد مطالعه برای هر نمونه، انحراف معیار آنها محاسبه و نتایج با استفاده از آزمون حداقل تفاوت معنیدار (LSD) ارزیابی شدند.
جدول 1- لیست آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق
منبع آغازگر |
اندازه محصول |
آغازگر برگشت |
آغازگر رفت |
نام آغازگر |
||
DN551593 |
150 bp |
AGTGTCTGGATCGGTGGTTC |
AGCCCAATCATAGGAAAAGTGC |
TaActin |
||
KM017011 |
149 bp |
GTA GTC CAC CTT GGT GAC C |
TAC CAG TTC GCA AAT GAT CCT G |
TaMLO |
||
FJ705442, GU564292 |
149 bp |
AGA CTG GCA CCG AGA ACA TC |
CCA CCT CAA GCT CGT TTA CC |
TaBI-1 |
||
KMo17012 |
157 bp |
GAA CAG TAT AAC CTC TTG GGT TTC |
GCT TGT CAG GAT GCT GCT C |
TaNPR1 |
||
نتایج
ارزیابی فنوتیپی اجزای مقاومت در نتیجه کاربرد
کیتوزان: بر اساس نتایج به دست آمده تعداد کلنی رشد یافته در برگ گیاهان تیمار شده با سطوح 250 و 500 میلیگرم در لیتر به ترتیب 43 و 4/29 درصد نسبت به گیاهان شاهد، کاهش معنیداری را نشان دادند (شکل1). این نتایج بیانگر آن است که مقاومت القاء شده توسط کیتوزان نقش مهمی در مقاومت گندم علیه سفیدک پودری و کاهش پیشرفت بیماری ایفا میکند (شکل2). نتایج حاصله با نتایج فائورو و همکاران (17) و کورس وهمکاران (25) مبنی بر کاهش بیماری سفیدک سطحی جو مطابقت داشت. آمبوراب و همکارن (5) نیز بیان کردند که کیتوزان بدلیل ماهیت پلی کاتیونی خود باعث تخریب ساختمان سلولی و تراوش الکترولیتها و پروتئینها شده و بدین ترتیب میتواند از رشد بیمارگر ممانعت نماید. از سویی نتایج حاکی از تاثیر معنی دار کیتوزان 250 نسبت به کیتوزان 500 میلی گرم در لیتر در کاهش شدت بیماری بود.
شکل 1- ارزیابی توانایی کیتوزان در القای مقاومت در گندم به قارچ Bgtبر اساس تعداد کلنیهای رشد یافته در cm25/2 در برگ گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 و 500 میلی گرم در لیتر و تیمار نشده (شاهد). مقایسه میانگین به روش LSD در سطح 1% انجام گرفت.
شکل 2- تعداد کلنیهای رشد یافته در برگ گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 (B) ، کیتوزان 500 (C) میلی گرم در لیتر و گیاهان شاهد (A).
اندازهگیری الگوی بیان ژنهای مورد مطالعه در گندم تحت تیمار با کیتوزان:
ژن NPR1:آنالیز qPCR نشان داد که میزان بیان ژن NPR1در گیاهان تیمار شده با کیتوزان قبل اعمال بیماری روند افزایشی داشته، به طوریکه گیاهان تیمار شده در 24 ساعت پس از تیمار با کیتوزان 250 و 500 میلی گرم در لیتر به ترتیب با میزان بیان 2/4و 1/3 افزایش معنیداری را در سطح 5 درصد نسبت به گیاهان کنترل نشان دادند (شکل 3). همچنین آنالیز بیان ژن پس از اعمال آلودگی نیز حاکی از روند افزایشی میزان رونوشت ژن NPR1در گیاهان پیش تیمار شده و کنترل بود ولی روند افزایشی بیان ژن در گیاهان پیش تیمار شده به طور معنیداری بیشتر از گیاهان شاهد بوده است. گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 و 500 میلیگرم، 12 ساعت پس از آلودگی به ترتیب با افزایش میزان بیان 3/2 و 68/1 برابری نسبت به گیاه کنترل، تفاوت معنیداری نشان دادند. سپس این گیاهان در 24 ساعت پس از آلودگی به ترتیب با میزان بیان 7/9 و 5/6 برابری نسبت به زمان صفر به بیشترین میزان بیان ژن NPR1 رسیدند. از سویی گیاهان کنترل نیز روند افزایشی ولی آرامی از بیان را نشان دادند و سپس در 24 ساعت پس از آلودگی با 4 برابر افزایش بیان نسبت به زمان صفر به حداکثر بیان خود رسیدند. اگرچه هر دو گروه از گیاهان در یک بازه به بیشینه بیان رسیدند ولی مقایسه میزان بیان در زمان اوج بیان نشان داد که در گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 و 500 میلی گرم میزان بیان به ترتیب 4/2 و 63/1برابر بیشتر از گیاهان کنترل میباشد که این افزایش بیان معنیدار بود. سپس در ساعات بعدی (48 ساعت) پس از آلودگی میزان بیان روند کاهشی را نشان داد، در حالیکه میزان کاهش در گیاهان کنترل به طور معنیداری کمتر از گیاهان پیش تیمار شده بود. از سویی نتایج نشان داد که سطح بیان ژن NPR1 در گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 به طور معنیداری بیشتر از تیمار 500 میلی گرم کیتوزان بود.
شکل 3 -سطح بیان ژنهای NPR1 ، MLO و BI-1 در گیاهان تیمار شده با کیتوزان و گیاهان کنترل پس از آلودگی با Bgt . مقایسه میانگین بین تیمارها در هر بازه زمانی با استفاده از آزمون حداقل تفاوت معنی دار در سطح 5 درصد انجام گرفت. میل بارها نشان دهنده مقادیر خطای استاندارد میانگین میباشد.
NPR1 یکی از تنظیم کنندههای کلیدی مقاومت القایی در گیاه میباشد که بوسیله تاثیر در نواحی پایین دست مسیر سیگنالدهی SA، سبب فعال سازی بیان ژنهای PR، القای مرگ سلولی و در نهایت مقاومت به طیف وسیعی از بیمارگرها میشود (39 و 10). نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که میزان بیان ژن NPR1در گیاهان پیش تیمار شده و کنترل به طور قابل توجهی افزایش یافت. به طوریکه این گیاهان در 12 و 24 ساعت پس از آلودگی، همزمان با نفوذ میخ رخنه و رشد هاستوریوم (16) به بیشترین میزان بیان خود رسیدند. همچنین گزارش شد که کیتوزان سبب القای مکانیسم SAR در گیاه شده که این مکانیسم به فعال شدن NPR1 با موقعیت درون هستهای نیاز دارد (14 و 13)، لذا با توجه به نتایج حاصله چنین استنباط میگردد که اسپری کردن کیتوزان بر روی برگ رقم فلات نقش موثری در القای مقاومت از طریق افزایش آمادگی در گیاه حساس دارد. به این دلیل گیاهان پیش تیمار شده به محض آلودگی، بیان بالا و سریعی از ژن NPR1 را نشان داده تا با القای SAR از نفوذ و گسترش بیماری در گیاه جلوگیری نمایند که با نتایج فیتزا و همکاران (18) و لاندی و همکاران (27) مطابقت داشت. همچنین با توجه به اینکه ژن NPR1در ساعات اولیه پس از آلودگی به طور معنیداری در فلات تیمار شده افزایش یافته، میتوان چنین تصور نمود که ژن NPR1 میتواند به عنوان شاخصی برای القای مقاومت به بیمارگر در نظر گرفته شود. نقش NPR1 در مقاومت گندم به فوزاریوم (29)، آرابیدوپسیس به سفیدک سطحی (38) تایید شده است. ماکاندار و همکاران (29) نیز طی مطالعاتی بوسیله انتقال ژن AtNPR1 به گندم حساس سبب افزایش بیان ژن NPR1، فعال نمودن SAR و افزایش مقاومت به Fusarium graminearumگردیدند.
ژن MLO : نتایج آنالیز بیان ژن MLOنشان داد که پس از محلول پاشی کیتوزان، سطح تظاهر این ژن به طور قابل توجهی کاهش یافت، بطوریکه گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 و 500 میلی گرم در لیتر به ترتیب با میزان بیان 74/0 و 83/0 نسبت به زمان کنترل کاهش معنیداری را نشان دادند (شکل 3). همچنین بررسی تغییرات الگوی بیان ژن MLO پس از آلودگی با بیمارگر نشان داد بیان این ژن در 12 ساعت پس از آلودگی در گیاهان تیمار شده و شاهد نسبت به زمان صفر القا گردید ولی گیاهان پیش تیمار شده به خصوص در تیمارکیتوزان 250 میلیگرم در لیتر با کاهش 42/1 برابری نسبت به گیاهان کنترل، تفاوت معنیداری را نشان دادند. از سویی ارزیابی میزان بیان این ژن در 24 ساعت پس از آلودگی حاکی از متفاوت بودن روند تغییرات در گیاهان تیمار شده و کنترل بود. به طوریکه گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 و 500 میلی گرم در لیتر به ترتیب با میزان بیان 95/0 و 3/1 برابری نسبت به زمان کنترل به حداقل بیان بعد از آلودگی رسیدند، در حالیکه گیاهان کنترل با میزان بیان 8/1 برابری نسبت به زمان صفر سیر صعودی از بیان ژن را نسبت به گیاهان پیش تیمار شده نشان دادند. مقایسه سطح تظاهر این ژن در بازه 24 ساعت پس از آلودگی حاکی از آن است که میزان بیان در گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 و 500 میلی گرم در لیتر به ترتیب 9/1 و 3/1 برابر کمتر از گیاهان کنترل میباشد. از سویی نتایج الگوی بیان حاکی از کاهش معنیدار سطح بیان این ژن در تمامی بازههای زمانی در گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 نسبت به تیمار 500 میلی گرم در لیتر بود.
ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ MLO، ﮔﻴﺮﻧﺪﻩﻫﺎی ﻏﺸﺎء ﭘﻼﺳﻤﺎﯾﯽ میباشند که فرم وحشی ژن آن تنظیم کننده منفی مرگ سلولی در گیاه می باشد (26). آنالیز بیان ژن MLOدر رقم حساس پس از تیمار با سطوح کیتوزان نشان داد که سطح تظاهر این ژن پس از محلول پاشی به طور قابل توجهی کاهش یافت که این نتیجه بیانگر تاثیر منفی این القا کننده شیمیایی در القای بیان این ژن میباشد. در حالیکه پس از اعمال آلودگی با قارچ Bgt سطح بیان ژن در گیاهان تیمار شده و کنترل به طور قابل توجهی افزایش یافت که این نتیجه میتواند به دلیل درک اولیه گیاه از حمله قارچ سفیدک سطحی باشد، در حالیکه میزان بیان در گیاهان پیش تیمار شده به طور معنیداری کمتر از گیاهان کنترل بود. از این کاهش بیان چنین تصور میشود که گیاهان القا شده همراه با کاهش سطح ژن MLO، تولید H2O2را که مرتبط با فرآیندهای دفاعی و مرگ سلولی در گیاه است (12) در همان ساعات اولیه پس از آلودگی جهت مقابله با لوله تندشی اولیه و اپرسوریوم قارچ آغاز میکنند (40). سپس گیاهان تیمار شده برخلاف گیاهان کنترل، در 24 ساعت پس از آلودگی، اقدام به کاهش سطح بیان ژن MLOنموده، به طوریکه در این بازه زمانی بیشترین تفاوت معنیدار بین دو گروه (تیمار شده و کنترل) از گیاهان مشاهده گردید. همانطور که ذکر شد ژن MLO واکنش دفاعی را سرکوب نموده و سبب القای حساسیت به بیمارگرهای بیوتروف میگردد، لذا فقدان و یا کاهش بیان این ژن، سبب القای مرگ سلولی، تشکیل پاپیلا، پیری زودرس و بیان ژنهای PR در پاسخ به بیمارگر میگردد (34). بنابراین، کاهش قابل ملاحظهی بیان ژن MLOدر 24 ساعت پس از آلودگی همزمان با نفوذ میخ رخنه و توسعه هاستوریوم قارچ را میتوان بدین صورت توجیه نمود. مطالعات نشان داد که H2O2 تولید شده میتواند از سویی در تشکیل پاپیلا و از سویی در مرگ سلولی نقش داشته باشد، لذا تلقیح کیتوزان بر روی گیاه با القای کاهش سطح بیانی ژن MLO در جهت افزایش میزان H2O2 سبب القای مسیر SAR و پاسخهای مقاومتی و مرگ سلولی در محل حمله قارچ شده و بدین ترتیب از گیاه در برابر توسعه قارچ بیوتروف حمایت مینماید. نتایج حاصله با نتایج آهنگر و همکاران (1) مبنی بر کاهش بیان ژن MLO در گندم تیمار شده با سالسیلیک اسید تحت بیماری Bgt مطابقت داشت. ژو و همکاران (45) گزارش نمودند که ژن MLO در خیار سبب حساسیت به بیماری سفیدک سطحی شده است. در حالیکه پسینا و همکاران (33) نیز با سرکوب نمودن ژن MLO در انگور توانستند حساسیت به Erysiphe necator را کاهش دهند. اولین گزارش از تاثیر کیتوزان در سرکوب بیان ژن MLOدر گندم آلوده به Bgt میباشد.
ژن BI-1 : پروتئین BI-1 یکی از تنظیم کنندههای منفی مرگ سلولی است که دارای نقش همه جانبه در پاسخ به استرس میباشد (26 و 19). به طوریکه شواهد بیانگر این بود که بیان بالای این ژن از مرگ سلولی ایجاد شده توسط H2O2 و SA نیز جلوگیری مینماید (23). پروتئین BI-1 همچنین در کنار کنترل مرگ سلولی، قادر خواهد بود مقاومت غیراختصاصی جو در موتانت mlo را از بین برده و سبب نفوذپذیری این گیاهان به ایزولههای مختلف قارچ سفیدک سطحی گردند (15). تجزیه و تحلیل بیان ژن BI-1نشان داد که گیاهان پیش تیمار شده با کیتوزان 250 و 500 میلی گرم در لیتر به ترتیب با میزان بیان 8/0و 9/0 برابری نسبت به زمان صفر کاهش معنیداری را نسبت به گیاه کنترل نشان دادند (شکل 3). در حالیکه نتایج آنالیز بیان ژن BI-1، پس از اعمال آلودگیحاکی از افزایش بیان این ژن همراه با روندی متفاوت در گیاهان پیش تیمار شده و کنترل بود. بیان این ژن در هر دو گروه از گیاهان در 12 ساعت پس از آلودگی القاء گردید ولی تفاوت معنیداری بین کیتوزان 500 با گیاهان کنترل مشاهده نشد. در حالیکه گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 میلی گرم در لیتر، با کاهش 3/1 برابری نسبت به گیاه کنترل تفاوت معنیدار را نشان دادند . این گیاهان (تیمار کیتوزان 250) نهایتأ در 24 ساعت پس از آلودگی با میزان بیان 07/1 برابری نسبت به زمان صفر به بیشترین بیان خود رسیدند. در حالیکه گیاهان کنترل روند افزایشی سریعتری از میزان بیان ژن BI-1را پس از آلودگی نشان داده و در نهایت در 24 ساعت پس از آلودگی با میزان بیان 47/1 برابری نسبت به زمان صفر به بیشینه بیان خود رسیدند. بررسی الگوی بیان ژن نشان داد که اگرچه اوج بیان ژن BI-1در گیاهان پیش تیمار شده و کنترل در یک بازه زمانی (24 ساعت) رخ داده ولی میزان بیان در گیاهان کنترل 37/1 برابر بیشتر از گیاهان پیش تیمار با کیتوزان 250 بود که این میزان افزایش در سطح 5 درصد معنیدار میباشد. در حالیکه مجددا تفاوت معنی داری بین گیاهان کنترل و تیمار شده با 500 میلی گرم کیتوزان ددر این بازه زمانی مشاهده نشد. سپس هر دو گروه از گیاهان در 48 ساعت پس از آلودگی روند کاهشی بیان را در پیش گرفتند به طوریکه گیاهان تیمار شده با کیتوزان سطوح کمتری از بیان را نشان دادند.
به طور کلی بررسی روند تغییرات بیان ژن BI-1در نمونههای برگی رقم فلات پس از محلول پاشی با کیتوزان حاکی از القا میزان بیان این ژن در ساعات پس از آلودگی بود، در حالیکه گیاهان تیمار شده کاهش معنیداری را نسبت به گیاهان شاهد نشان دادند. مطالعات قبلی نشان داد که ژن BI-1 ممکن است همانند MLO به عنوان یک تنظیم کننده منفی مرگ سلولی پاسخپذیر به شرایط اکسایشی درگیر در فرآیند پیری برگ عمل نماید (34). لذا تصور میگردد همانند ژن MLO، فقدان و یا کاهش ژن BI-1نیز میتواند به دلیل ارتباط با مرگ سلولی و القای پاسخهای مقاومتی سبب مقاومت بالای گیاه به ایزولههای قارچ سفیدک سطحی گردد. از سویی نتایج مطالعات ایشمن و همکاران (14) نیز نشان داد که بیان بالای ژن HvBI-1 در جو سبب کاهش انفجار H2O2 در دیواره سلولی ژنوتیپ مقاوم mlo و حمایت از توسعه هاستوریوم قارچ در گیاه میگردد. در حالیکه هوکلهوفن و همکاران (20) نشان دادند که کاهش بیان ژن BI-1سبب مرگ سلولی و افزایش نواحی نکروزه در محلهای آلوده شده میگردد. بنابراین کاهش سطح بیان این ژن در گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان کنترل در بازههای زمانی مصادف با نفوذ میخ رخنه و توسعه هاستوریوم قارچ در گیاه یعنی 24 ساعت پس از آلودگی می تواند بیانگر تاثیر مثبت پیش تیمار کردن کیتوزان بر روی برگ گندم حساس به Bgt، باشد. به طوریکه کیتوزان از طریق القای آمادگی میتواند در افزایش پتانسیل مقاومتی در رقم حساس بسیار موثر باشد، لذا این گیاهان پس از اعمال آلودگی با قارچ Bgt بوسیله کاهش سطح بیان ژن BI-1 ، سبب افزایش تجمع H2O2و متعاقبأ القای مرگ سلولی در سلولهای مورد حمله شده تا از نفوذ و توسعه بیشتر قارچ در سلول میزبان ممانعت نمایند. به طوری که مطالعات نشان داد که بیان بالای ژن BI-1درگندم سبب متوقف شدن مرگ سلولی گردید (44). بر اساس بررسی منابع موجود این اولین گزارش از تاثیر کیتوزان در سرکوب بیان ژن BI-1در گندم آلوده به بیماری Bgt میباشد که با نتایج آهنگر و همکاران (1) مبنی بر کاهش بیان ژن BI-1 در گندم تیمار شده با سالسیلیک اسید و قارچ Piriformospora indica تحت آلودگی با Bgt مطابقت دارد.
در کل بر اساس مطالعات انجام شده پیشنهاد میگردد که پروتئین BI-1 میتواند به عنوان یک واسطه کلیدی عمل نموده که میتواند واکنشهای مرگ سلولی را در طی کنش با انواع مختلفی از بیمارگرها تنظیم کند. از سویی مطالعه و بررسی این ژن در کنار ژن MLO میتواند به عنوان مارکر مناسبی برای ارزیابی میزان حساسیت ژنوتیپهای گندم به قارچ سفیدک سطحی مورد استفاده قرار گیرد. علاوه بر این در شکل 4، منحنی ذوب مربوط به ژنهای مورد بررسی نشان داده شده است. همانطور که مشاهده میشود هیچ نوع یک اضافی که حاکی از تکثیر غیر اختصاصی ژن مورد نظر و وجود آغازگر دایمر باشد دیده نمیشود.
بحث و نتیجه گیری
کاربرد خارجی کیتوزان بوسیله القای مکانیسم مقاومتی SAR سبب القا بیان ژنهای دفاعی در بافتهای تیمار شده با این فعال کننده میگردد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که سطح بیان ژن دفاعیNPR1 پس از 24 ساعت تیمار با کیتوزان افزایش معنیداری را نشان داده، در حالیکه دو ژن کنترل کننده منفی مرگ سلولی MLO و BI-1، کاهش معنیداری را نسبت به گیاه کنترل نشان دادند. همچنین پس از اعمال آلودگی نیز گیاهان پیش تیمار شده با بیان زود
هنگام خود تفاوت معنیداری را نسبت به گیاهان کنترل نشان دادند که این نتایج بیانگر موثر بودن نقش کیتوزان در القای ژنهای مسیر مقاومت میباشد. به طور کلی نتایج این بررسی نشان داد که کاربرد خارجی کیتوزان بوسیله افزایش سطح SA در گیاه، القای SAR، بیان PR پروتئینها، MLO و BI-1، و دیگر محصولات ژنهای دفاعی سبب افزایش مقاومت در گیاه به بیماری میگردد.
از سویی میزان بیان ژن های دفاعی در گیاهان تیمار شده با کیتوزان 250 در سطوح بالا و مناسب تری نسبت به گیاهان تیمار شده با کیتوزان 500 میلی گرم در لیتر بود. به نظر می سد یکی از دلایل مشاهده این نتایج اثرات سمی کیتوزان در غلظت بالا باشد، لذا توصیه می گردد سطوح بالای کیتوزان مصرف نگردد. بنابراین بر اساس این مطالعه در مقاومت به سفیدک کاربرد سطح 250 میلی گرم در لیتر کیتوزان توصیه می گردد.
از نتایج بدست آمده چنین استنباط میگردد یک همبستگی بین زمان و فعالیت ژنهایNPR1، MLO و BI-1 و مقاومت یا تحمل به بیماری سفیدک سطحی وجود دارد. با توجه به تغییرات مشاهده شده در الگوی بیان ژنهای مورد مطالعه و نقش آنها در مقاومت، تصور میشود این ژنها در ارتباط با پاسخهای دفاعی گندم نسبت به بیمارگر نقش بسیار مهمی را ایفا مینمایند. بنابراین این ژنها میتوانند به عنوان ژنهای کاندید، برای مطالعات بیشتر در جهت تولید ارقام مقاومی که دارای سطح بیان بیشتری از این ژنها باشند، محسوب شوند. به طور کلی نتایج حاصل از الگوی بیان ژن، بهبود خصوصیات مرفولوژیکی و شمارش کلنیهای رشد یافته بیانگر موثر بودن نقش کیتوزان در القای مقاومت گندم حساس به قارچ Bgt بود. از سویی با در نظر گرفتن مزایای زیست محیطی کیتوزان و نیز هزینههای فراوان کودهای شیمیایی از نظر اقتصادی و هزینههای جبران ناپذیر زیست محیطی، کیتوزان را میتوان در جهت کاهش خسارت بیماری و کم نمودن آثار سوء استفاده از مواد شیمیایی مورد استفاده قرار داد.
شکل4 – منحنی ذوب ریل تایم برای ژنهای Actin (A) ، NPR1 (B)، MLO (C) و BI-1 (D) در گیاهان تیمار شده با کیتوزان و گیاهان کنترل قیل و پس از آلودگی با Bgt. آنالیز مرحله ذوب نشان دهنده وجود تنها یک پیک با دمای ذوب مشخص میباشد که در واقع تاییدی بر تک محصوله بودن آغازگرهای مورد استفاده میباشد.
25. -Koers, S., Guzel-Deger, A., Marten, I. and Roelfsema. M. R. 2011. Barley mildew and its elicitor chitosan promote closed stomata by stimulating guard-cell S-type anion channels. Plant. J. 68:670-80.
28. Livak, K.J. and Schmittgen, T. D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod. Methods. 25: 402-408.
29. Makandar, R., Essig, J. S., Schapaugh, M. A., Trick H. N. and Shah. J. 2006. Genetically engineered resistance to Fusarium head blight in wheat by expression of Arabidopsis NPR1. Molecular Plant- Microb Interaction. 19: 123-139.
42. Van Loon, L.C., Rep M. and Pieterse, C. M. J. 2006. Significance of Inducible Defense-related proteins in infected plants. Phytopathology. 44: 135-162.