نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه سلولی و مولکولی، دانشکده علوم و فناوری های نوین، علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2 گروه علوم پایه، دانشکده داروسازی و علوم دارویی، علوم پزشکی تهران، ،دانشگاه آزاد اسلامی، تهران،ایران

3 گروه فیزیولوژی،دانشگاه آزاد اسلامی واحد همدان.

چکیده

سرطان روده بزرگ سومین سرطان شایع در جهان است. با توجه به افزایش بروز سرطان استفاده از مولکول های جدید شیمی درمانی مورد نیاز می باشد. بسیاری از مطالعات و تحقیقات نشان داده است که سرطان روده می تواند از طریق محصولات دریایی طبیعی که دارای مقادیر بسیاری از مواد فعال بیولوژیکی با ساختارهای شیمیایی و فعالیت های دارویی جدید هستند درمان شود. هدف از این مطالعه بررسی اثرات عصاره هیدروالکلی جلبک Sargassum ciliforium بررده سلولی سرطان کولون HT-29 و ارزیابی بیان ژن های P53 و APC با روش Real time PCR می باشد. در این پژوهش تعیین سمیت عصاره جلبک Sargassum ciliforium با روش MTT در5 غلظت مختلف001/0,01/0,1/0,1,10میلی گرم بر میلی لیتر و یک گروه کنترل بر روی رده های سلولی سرطان کولون HT-29 و رده سلولی نرمال کلیه جنین انسان HEK مورد بررسی قرار گرفت. آنالیز داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون آماری One way ANOVA انجام شد. همچنین بیان ژن های P53 و APC به روش Real time PCR ارزیابی شد. یافته ها نشان داد که عصاره جلبک Sargassum ciliforium در غلظت 10 میلی گرم بر میلی لیتر درکاهش زیستایی رده سلولی سرطان روده در انسان HT-29 وممانعت از رشد سلول های توموری تاثیر دارد و می توان از عصاره این جلبک جهت توسعه داروهای ضد سرطانی استفاده نمود ونتایج حاصل از Real time PCR نشان داد که مرگ سلولی القا شده با عصاره جلبک Sargassum ciliforium از طریق فعال سازی پروتئین APC می باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The Effect of Hydroalcholic extract of Sargassum ciliforium on HT-29 colorectal cancer cell line and evaluation of P53 and APC genes expression using Real time PCR Technique

نویسندگان [English]

  • Armaghan Zahedi 1
  • Tahereh Naji 2
  • Rahim Ahmadi 3

1 Department of Molecular and cellular sciences , Faculty of Advanced Sciences and Technology, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran , I.R. of Iran.

2 Department of Basic sciences, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences,Tehran Medical Sciences, Islamic Azad University,Tehran, I.R. of Iran

3 Department of Physiology,Islamic Azad University,Hamedan,Iran

چکیده [English]

Colon cancer is the third most common cancer in the world,with nearly 1.4 million new caces diagnosed in 2012. Due to the increased incidence of cancer,the use of new chemotherapy molecules is required.Many studies have shown that intestinal cancers can be treated through natural marine products that contain a large amount of active biological substances with new chemical steractuers and new drug activities. The aim of this study was the evaluation of the hydroalcholic extract of Sargassum ciliforium on HT-29 colorectal cells line and the evaluation of P53 and APC genes expression using Real time PCR Technique.In this study, determination of toxicity of Sargassum ciliforium algae extract with MTT method at 5 different concentrations of 0.001 / 0.01 / 0.1 / 0.1, 10 mg / ml and one control group on cell lines of HT-29 colon cancer and cell line Normal kidney of HEK human embryos was studied. Data analysis was performed using SPSS software and one way ANOVA test. Also, the expression of P53 and APC genes was evaluated using Real time PCR The results showed that Sargassum ciliforium alga extract at a concentration of 10 mg / ml would decrease the biosynthesis of the intestinal cancer cell line in HT-29 human and delay the growth of tumor cells, and the extract of this algae can be used to develop anticancer drugs. The results of real time PCR showed that cell death induced by Sargassum ciliforium alga extract was via activation of APC protein.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Colon cancer
  • HT-29 cell line
  • Sargassum ciliforium algae
  • P53 and APC genes

بررسی اثرات عصاره هیدروالکلی جلبک Sargassum ciliforium بر رده سلولی سرطان کولون HT-29 و ارزیابی بیان ژنهای P53 و  APCبا روش Real time PCR

ارمغان زاهدی1، طاهره ناجی2* و رحیم احمدی3

1 تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم دارویی، ،دانشکده علوم و فناوری های نوین، گروه سلولی و مولکولی

2 تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم دارویی، دانشکده داروسازی، گروه علوم پایه

3 همدان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد همدان، گروه فیزیولوژی

تاریخ دریافت: 19/9/96                تاریخ پذیرش: 27/11/96

چکیده

سرطان روده بزرگ سومین سرطان شایع در جهان است که با نزدیک به 4/1 میلیون مورد جدید در 2012 تشخیص داده شده است. با توجه به افزایش بروز سرطان استفاده از مولکولهای جدید شیمی درمانی مورد نیاز است. بسیاری از مطالعاتو تحقیقات نشان داده که سرطان روده می تواند از طریق محصولات دریایی طبیعی که دارای مقادیر بسیاری از مواد فعال بیولوژیکی با ساختارهای شیمیایی جدید و فعالیتهای دارویی جدید هستند درمان شود. هدف از این مطالعه بررسی اثرات عصاره هیدروالکلی جلبک Sargassum ciliforium بررده سلولی سرطان کولون HT-29 و ارزیابی بیان ژنهای P53 و APC با روش Real time PCR می باشد. در این پژوهش تعیین سایتوتوکسیسیته عصاره جلبک Sargassum ciliforium با روش MTT در5 غلظت مختلف001/0,01/0,1/0,1,10میلی گرم بر میلی لیتر و یک گروه کنترل بر روی رده های سلولی سرطان کولون HT-29 و رده سلولی نرمال کلیه جنین انسان HEK مورد بررسی قرار گرفت. آنالیز داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون آماری One way ANOVA انجام شد. همچنین بیان ژنهای P53 و APC به روش Real time PCR ارزیابی شد. یافته ها نشان داد که عصاره جلبک Sargassum ciliforium در کاهش زیستایی رده سلولی سرطان روده در انسان HT29 وممانعت از رشد سلولهای توموری تأثیر دارد و می توان از عصاره این جلبک جهت توسعه داروهای ضد سرطانی استفاده نمود و مشخص شد که مرگ سلولی القاء شده با عصاره جلبک Sargassum ciliforium از طریق فعال سازی پروتئین APC می باشد.

واژه های کلیدی: سرطان روده بزرگ، رده سلولی HT-29،جلبک Sargassum ciliforium ، ژن APC  و P53،Real time PCR

* نویسنده مسئول، تلفن:09123704676 ، پست الکترونیکی: tnaji2002@gmail.com

مقدمه

 

امروزه با توجه به افزایش بروز سرطان در کشورهای در حال توسعه و توسعه یافته استفاده از مولکولهای جدید شیمی درمانی مورد نیاز است (7). به کارگیری عوامل طبیعی و مصنوعی برای جلوگیری یا متوقف کردن پیشرفت سرطانهای مهاجم اخیراً به عنوان یک رویکرد با پتانسیل عظیم شناخته شده است(4). طی دهه گذشته عوامل جدید شامل محصولات دریایی طبیعی که دارای مقادیر بسیاری مواد مؤثر بیولوژیکی هستند، موجب ایمنی و بهبود و زنده ماندن بیماران با سرطان کلورکتال شده است(8و17). مهار آپاپتوز در سلولهای سرطان روده بزرگ باعث افزایش رشد تومور ترویج نئوپلاستیک و مقاومت به عوامل ضد سرطان سیتوتوکسیک می شود. بنابراین ترکیبات فعال زیستی که باعث القای آپاپتوز در سلولهای سرطانی می شود می تواند به عنوان یک عامل درمانی مؤثر مطرح شود (15). مطالعات مختلف از جلبک سارگاسوم نشان داده است که مواد بیواکتیو موجود در جلبک دارای خاصیت سیتوتوکیسک و آنتی اکسیدان است. مطالعات فراوان روی جلبک قهوه ای نشان می دهد که گلیکوپروتئین موجود در سارگاسوم دارای اثرات ضدسرطانی روی سلولهای سرطانی در کولون انسان است (13 و 14). با توجه به اینکه سرطان کلورکتال یکی از سرطانهای شایع در کشورهای در حال توسعه و توسعه یافته است و از طرفی تأثیرات بالقوه جلبک سارگاسوم در گونه های متعدد در بهبود و اثربخشی انواع سرطان به اثبات رسیده است. است این طرح پژوهشی با هدف بررسی اثرات عصاره جلبک Sargassum ciliforium در رده سلولی HT-29 در سرطان کولورکتال با روش MTT و ارزیابی بیان ژنهای P53 و APC با روش  Real time PCRانجام شد.

مواد و روشها

جمع آوری جلبک و تهیه عصاره: جلبک Sargassum ciliforium از مناطق جنوب ایران بندر لنگه جمع آوری شد. بعد شستن جلبک ،به مدت 2 هفته در دمای اتاق خشک شد و پس از تمیز کردن پودر ریز به دست آمده با میزان 300 میلی لیتر آب دیونیزه ترکیب شد و سوسپانسیون به دست آمده را به مدت 3 ساعت جوشانده و سپس سوسپانسیون با عبور از کاغذ صافی فیلتر شد و عصاره فیلتر شده هیدروالکلی لیوفیلیزه شد  و به صورت پودر درآمد. پودر به دست آمده تا زمان استفاده در یخچال نگهداری شد.

تهیه و کشت رده سلولی :HT-29 رده سلولی سرطان کولون HT-29 و رده سلولی نرمال کلیه جنین انسان HEK از انستیتو پاستور ایران خریداری شد. رده سلولی HT-29 در محیط کشت DMEM به همراه سرم 10 درصد FBS  قرارداده شد و 100 میکروگرم بر میلی لیتر پنی سیلین و استرپتومایسین به محیط کشت اضافه شد و رده های سلولی در 37 درجه سانتی گراد در داخل انکوباتور حاوی 5 درصد CO2 و 100 درصد رطوبت کشت داده شد.

تهیه دارو(عصاره جلبک Sargassum ciliforium): ابتدا 1/0 گرم یا 100 میلی گرم از دارو وزن شد سپس ml 1 از PBS برداشته و به 1/0 گرم از پودر لیوفیلیزه از جلبک Sargassum ciliforium اضافه گردید و پس از ورتکس ml9 محیط با PBS به حجم ml10 رسانده شد سپس با فیلتر سر سرنگی2/0 میکرون همان روز عصاره فیلتر شد و کاملاً خالص و یکنواخت گردید. عصاره تهیه شده تا زمان استفاده در فریزر نگهداری شد.

ارزیابی توکسیسیته عصاره به روش MTT: تعیین سایتوتوکسیسیته عصاره با روش MTT انجام شد در این روش غلظتهای 10،1، 1/0، 01/0، 001/0 میلی گرم بر میلی لیتر از عصاره تهیه شد و هریک از غلظتها به عنوان گروههای مستقل به هر چاهک از پلیت 96 خانه ای از سلولهای HT-29 و HEK اضافه شد و به مدت 24 ساعت در انکوباتور5 درصد CO2 و با رطوبت 100 درصد انکوبه شد. سپس محیط کشت رویی را خالی کرده و رنگ MTT اضافه و پلیتها با فویل آلومینیومی پیچیده و به مدت 4 ساعت در انکوباتور انکوبه گردید. در مرحله بعد رنگ MTT را خالی و به هر چاهک DMSO اضافه کرده و به مدت 20دقیقه در  Shakerقرار داده شد تا کاملاً یکنواخت شود و سپس جذب نوری هر چاهک  در طول موج 570 نانومتر مشخص شد.

انجام Real time PCR برای رده سلولی HT29 در سه روز متوالی: فلاسک حاوی محیط کشت و سلولهای HT29 از انکوباتور خارج و تریپسینه شد و پس از افزودن محیط کشت سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در 1000دور انجام شد. سپس به دو خانه از پلیت 6 خانه ای به هر خانه λ900 محیط حاوی سلولهای HT29 و λ100FBS اضافه شد و 24 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. پلیت 6 خانه از انکوباتور خارج و محیط رویی تخلیه و PBS اضافه و تریپسینه گردید. محتویات خانه ها به 2 میکروتیوب منتقل و به مدت 5 دقیقه در 1500 دور سانتریفیوژ انجام شد. سپس λ300 بافر شستشو و λ300 اتانول افزوده و پیپتاژ شد. پس از سانتریفیوژ مواد داخل 2میکروتیوب به ستون چرخشی منتقل شد. و 30 ثانیه سانتریفیوژدر 12000دور انجام شد. به ازای هر ستون چرخشی λ10 Dnase و λ70 بافر واکنش اضافه گردید و مخلوط شد. به هر ستون چرخشی λ500 بافر پاک کننده اضافه شد و انکوباسیون و سانتریفیوژ انجام گردید. سپس λ500 بافر شستشو اضافه و 30ثانیه در 12000دور سانتریفیوژ انجام شد. آب Rnase free افزوده و سانتریفیوژ انجام شد. محتویات به میکروتیوب PCR منتقل و به هر کدام λ8 از RNA دارای پرایمر به اضافه λ1 الیگو اضافه شد و به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه در دستگاه PCR قرار داده شد. و بعد از دستگاه خارج کرده و 2 دقیقه میکروتیوبها را در یخ گذاشته و بعد λ10 Reaction به هر کدام اضافه شد و بعد در 2 دما داخل دستگاه ترموسایکلر گذاشته شد. دمای 42 درجه به مدت  30 دقیقه و دیگری در دمای 85 درجه به مدت 5 دقیقه. پس از انجام این مراحل میکروتیوبها داخل دستگاه Real time PCR قرارداده شد. در این پژوهش واکنش Real time PCR در حجم نهایی λ20 انجام شد و دوبار تکرار گردید، غلظت پرایمر ها  150نانومولار بود. نتایج حاصل از نحوه بیان ژنها و آنالیز بیان ژن به روش نیمه کمی با فرمول ΔΔCT و با نرم افزار دستگاه RealTime PCR ABI انجام شد.

نتایج

تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون آماری One way ANOVA انجام شد. تفاوت کمیتها در سطح P<0.05 بررسی شد. علامت *در نمودار معنادارترین تفاوت را نسبت به گروه کنترل نشان می دهد. عصاره جلبک در رده سلولی HT-29 در غلظت 10میلی گرم برمیلی لیتر و در رده سلولی HEK در غلظت 10،1، 1/0میلی گرم بر میلی لیتر توکسیک بود. منحنی تکثیر که نشان دهنده انجام واکنش است و منحنی ذوب که نشان دهنده تکثیر یک محصول منفرد است توسط دستگاه Real time PCR ترسیم گردید. در این پژوهش تعیین کمی بیان ژن با فرمول محاسبه شد.طبق محاسبه ژن APC نسبت به کنترل افزایش بیان داشته و ژن P53 نسبت به کنترل کاهش بیان داشته است.

 

 

 

 

نمودار1- درصد زیستایی رده سلولی  HT-29تیمار شده با عصاره جلبک Sargassum ciliforium

 

نمودار2- درصد زیستایی رده سلولی  HEKتیمار شده با عصاره جلبک Sargassum ciliforium

 

نمودار3- منحنی تکثیر ژن P53

 

نمودار4- منحنی تکثیر ژن APC


بحث

امروزه سرطان به یک بیماری همه گیر در جهان تبدیل شده است.دانشمندان در تلاش هستند تا با استفاده از روشهای متفاوت شیمی درمانی، اشعه درمانی و جراحی حال عمومی بیماران مبتلا به سرطان را ارتقاء بخشند(6)، ولی باوجود توسعه در مداخلات درمانی، افزایش تأثیر پذیری شیمی درمانی و کاهش اثرات منفی ناشی از آن میزان مرگ و میر بیماران مبتلا به سرطان روده بزرگ همچنان بالاست(12). با توجه به افزایش بروز سرطان در کشور های در حال توسعه و توسعه یافته استقاده از مواد و عصاره های گرفته شده از طبیعت به منظور القای مرگ سلولی (آپاپتوز) در سلولهای سرطانی یکی از رایج ترین راهکارهای درمانی است(3و12).

 

نمودار5- منحنی ذوب ژن APC

 

 

نمودار6- منحنی ذوب ژن P53

در این مطالعه اثر عصاره هیدروالکلی جلبک Sargassum ciliforium دررده سلولی سرطان کولون HT-29 مورد بررسی قرار گرفت. همچنین ارزیابی بیان ژنهای APC و P53 با روش Real time PCR انجام شد. پیشرفتهای آینده در شاخص درمانی به افزایش حساسیت سلولهای توموری به داروهای شیمی درمانی و پرتودرمانی و کاهش اثرات مخرب آنها در بافتهای طبیعی بستگی دارد.


 

نمودار7- بیان ژن P53

 

نمودار8- بیان ژن APC


از این رو استفاده از ترکیبات آنتی اکسیدانی با سمیت نسبتاً امن به همراه حساس کردن سلولها برای درمان بالقوه و مؤثر می باشد(2). در سالهای اخیر پیشرفتهای قابل ملاحظه ای در تأثیر مواد فعال زیستی در کاهش خطر ابتلاء به سرطان صورت گرفته است که این ترکیبات از نظر شیمیایی و عملکرد زیستی دارای تنوع می باشند(19). در این پژوهش از عصاره جلبک Sargassum ciliforium برای تیمار سلولهای سرطان روده بزرگ HT-29 و بررسی زیستایی آنها استفاده شده است. یکی از جهشهای شایع که در سرطان روده بزرگ غیر فعال می شود غیر فعال شدن ژن APC است و هنگامی که APC جهش نداشته باشد اغلب فعال شدن جهشها در بتا کتنین اتفاق می افتد(10). جهش در APC یا بتا کتنین باید توسط جهشهای دیگر ادامه یابد تا به سمت سرطانی شدن پیش رود. با این حال حاملین جهشهای غیر فعال شدن APC خطر ابتلاء به سرطان روده بزرگ با سن حدود  سال 40 تقریباً 100درصد است (16). بسیاری از جهشهایی که در ژن APC ایجاد می شود باعث تولید یک پروتئین APC کوتاه، غیرطبیعی و فاقد عملکرد می شود. این پروتئین کوتاه نمی تواند از رشد بیش از حد سلولی جلوگیری کند در نتیجه منجر به تشکیل پولیپ می شود که می تواند سرطانی شود. پروتئین APC به طور معمول با کمک گلیگوژن سنتاز کیناز 3 آلفا یا بتا ((GSK-3و از طریق تعامل با 20 اسیدآمینه و تکرارهای SAMP یک کمپلکس تخریب ایجاد می کند که این مجموعه پس از ساخت قادر به اتصال به بتا کتنینها در سیتوپلاسم است. با کمک کازئین کیناز1(CK1) که حامل فسفوریلاسیون اولیه بتا کتنین وگلیکوژن سنتاز کیناز 3 بتا توانایی فسفوریلاسیون بتا کتنین برای بار دوم را دارد. این اهداف بتا کتنین برای یوبی کوئیتیناسیون  و تخریب به وسیله پروتئازومهای سلولی است. و این مهار کننده ها برای جا به جایی به داخل هسته به عنوان فاکتورهای رونویسی برای تکثیر ژن عمل می کنند. APC همچنین از طریق اتصال به دومین PD2 در اثبات میکروتوبول ها نقش دارد. غیر فعال شدن APC می تواند پس از واکنشهای زنجیره ای خاص در سیتوپلاسم آغاز شود (20). جهش در APC اغلب در اوایل سرطانها مثل سرطان روده بزرگ رخ می دهد (18).جهش در APC منجر به از دست دادن تنظیم بتا کتنین و مهاجرت سلول تغییر یافته و بی ثباتی کروموزوم می شود.حدود 80 درصد سرطانهای روده بزرگ در انسان در اثر جهش ژن APC می باشد.  P53به عنوان نگهبان ژنوم در حفظ ثبات ژنوم از طریق جلوگیری از جهش ژنوم نقش دارد.(11 ). ژن TP53 اغلب یک ژن جهش یافته است که در حدود 50 درصد از سرطانهای انسانی نقش دارد و این نشان می دهد ژن TP53 نقش مهمی در جلوگیری از تشکیل سرطان دارد. پروتئینهایی که توسط TP53 کد می شوند به DNA متصل شده و در تنظیم بیان ژن برای جلوگیری از جهش ژنوم نقش دارند (9). در سلولهای عادی P53 توسط تنظیم کننده منفی آن MDM2 می شود. پس از آسیب DNA و یا تنشهای دیگر مسیرهای مختلف به تفکیک P53 و کمپلکس MDM2 منجر می شود. هنگامی که P53 فعال می شود باعث توقف چرخه سلولی شده و اجازه می دهد از طریق تعمیر بقای سلول یا آپاپتوز القاء شود. چگونه P53 این مسیر را انتخاب می کند ناشناخته است. P53 فعال شده و به DNA متصل می شود و بیان چندین ژن از جمله Micro RNA/Mir-340/C1P1/WAF1 کد گذاری می شوند. P21(WAF1) به کمپلکس G1(CDK1-CDK2-CDK6-CDK4) متصل می شود. مولکولهای مهم برای انتقال و جا به جایی G1 به S در چرخه فعالیت آنها را مهار می کند. وقتی P21(WAF) با کمپلکس CDK2 همکاری می کند، P53 جهش یافته برای مدت طولانی به DNA متصل نمی شود در نتیجه پروتئین P21 در دسترس نخواهد بود و نمی تواند به عنوان یک سیگنال توقف برای تقسیم سلولی عمل کند (1). P53 در پاسخ به هزاران عامل استرس زا از جمله آسیب به DNA ناشی از UV یا عوامل شیمیایی مانند پراکسیدهیدروژن، استرس اکسیداتیو، شوک اسمزی، کاهش ریبونوکلئوتید و نامنظم بودن بیان انکوژن فعال می شود. پروتئینهای P53 جهش یافته اغلب باعث القای MDM2 شده و باعث تجمع P53 در سطح بسیار بالایی می شود. علاوه بر این پروتئین P53 جهش یافته باعث مهار سطح پروتئین P53 می شود در برخی موارد جهشهای بی معنی در P53 باعث مختل شدن ثبات و عملکرد P53 می شود (5و21). در این مطالعه اثرات عصاره هیدروالکلی جلبک Sargassum ciliforium بر سلولهای سرطانی روده بزرگ رده HT-29 برای اولین بار مورد بررسی قرار گرفت و در مجموع نتایج حاصل از این آزمایش تأیید می کند که عصاره این جلبک دارای فعالیت توکسیک و قابلیت مهار رشد در سلولهای سرطانی روده بزرگ رده HT-29 می باشد. بررسی مولکولی و ارزیابی بیان ژنهای APC و P53 به روش Real time PCR نشان داد که مرگ سلولی القاء شده با عصاره جلبک Sargassum ciliforium از طریق فعال سازی پروتئین APC و افزایش بیان ژن APC که یک ژن سرکوبگر تومور به ویژه در سرطان روده می باشد.

1- Arnold, J.,David, P.(2010).The P53 family:a subject collection from cold spring Harbor perspectives in biology laboratory press.Molecular cancer,126:273-84.

2-Bedi, A., et al.(1995).Inhibition of apoptosis during development of colorectal cancer.Cancer Res,55:1181-1816.

3-Chan, E.W., et al.(2009).Effect of diffrent during methods on the antioxidant properties of leaves and tea of ginger species food chemistry.Biomed Res,113:166-172.

4-Ferlay,   J., et al.(2013).Cancer incidence and mortality worldwide Globo CAN,IARC Cancer Base.International Agency for Research on cancer,10:48-62.

5-Hean, B.,et al.(2008). National center for Biotechnology information.united stated National institute of Health,The P53 tumor suppressor protein,56:93-98.

6- Hooshmand, K. , Asoodeh, A.(2016). The influence of GL-9 peptide on A549 and human and animal blood cells,Iranian J.Bio,29(4):463-473.

7-Joo, W.,Visintin, I.,Mor, G.(2013). Targeted cancer therapy Are the days of systemic chemotherapy numbered?. Biomed Res,76:308-314.

8-Kim, E.,Park, S.,Lee, J.,Park, J.(2010). Fucoidan present in brown olgae induces apoptosis of human colon cancer cells.BMC Gastroenterol,10:96-99.

9-kead, AP.,Strachan, T.(1999).Human molecular genetics 2,New York.Wiley cancer Genetics, 38:33-40.

10- lim, S., et al.(2008).Evaluation of antioxidant activity of extract from brown seaweed Sargassum siliqastrum,j.Agrictood chem,50:3862-3860.

11- Mind, DP.,Anvarian, Z.,Rudiger, SG.,Maurice, MM.(2011).Messing up disorder: How do missense mutations in the tumor suppressor APC lead to cancer?.Molecular cancer,10:47-59.

12-Michael, E., et al.(2014).Colorectal cancer aguid for journalistan colorectal treatment.Biomed Res,4:22-27.

13-Mann, J.R.,Backlund, M.G.,Dubois, R.N.(2005).Mechanism of disease In flammatory mediators and cancer prevention.Natclin practoncol,2:202-210.

14-Namvar, F.,Mahamad, R.,Baharara, J.,Balnejah, S.Z.,Fargahi, f.,Rahman, H.S.(2013). Antioxidant antiproliferative and antiangiogenesis effects of polyphenol rich seaweed (Sargassum muticum). Biomed Res, 604-787.

15-Pereira, D.M.,[at al].(2011).Anti proliferative activity of meroditerpenoids isolated from the brown alga stypopodium flabelliforme against several cancer cell Mar Drugs,9:852-862.

16- Smit, A.j.(2004). Medicinal and pharmaceutical uses of the seaweed  natural products. Areview. J.Applphycol,16:245-262.

17-Siegel, R.,Naishadham, D.,Jemal, A.( 2012).Cancer statistics.CA cancer J clin,62:10-29.

18- Stamos, JL.,Weis, WL.(2013).The β-catenin destruction complex.Cold spring Harbor perspective sin Biology,5:78-98.

19-Rodriquez, R.,Vivas, J.,Ming, B.(2012).The invasive seaweed Sargassum filcilum is on the move aling the nexican pacific coastline.Europpubmed central,55:5-17.

20- Yamamoto, N.,Fujihara, M.(1997).Anticancer effect of seaweed fraction and partical characterication of the polysacaccharide with Antitumor activity from Sargassum fulvellum.bspn EXPMED, 47:23-26.

21- Yuan, J.,Luo, K.,Zhang, L.,Cheville, JC.,Lou, Z.(2010). Usp10 regulates P53 localization and stability by deubiquitination P53 Cell,140:384-96.