نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی،دانشکده علوم ومهندسی،دانشگاه علم وهنریزد،یزد،ایران

2 هیأت علمی بخش فیزیولوژی و فارماکولوژی انستیتو پاستور ایران

چکیده

سابقه وهدف:سرطان پستان،شایع ترین سرطان تشخیص داده شده وعلت اصلی مرگ ناشی از سرطان در میان زنان است.مقاومت دارویی و سمیت سلولی داروهای ضدسرطانی از دلایلی هستند که سبب جستجو برای یافتن عوامل ضدسرطانی جدیدتر شدند و محققان از آزمایشگاه های مختلف،داوطلب یافتن راه حل مناسب تری جهت درمان سرطان هستند.مشتقات هیدرازیدی فعالیت های دارویی مختلفی شامل:ضدباکتریایی، ضدقارچ،ضددرد، ضدالتهاب، ضدافسردگی وفعالیت های ضدسرطانی را از خود نشان دادند.با در نظر گرفتن این نکته،مشتق جدیدی از این سری ترکیبات، ترکیب1، سنتز شده وفعالیت ضد سرطانی آن در محیط In vitro ثابت شد.جهت تایید بیشتر داده های قبلی ،فعالیت ضد توموری این ترکیب در موش های ماده ی BALB/C سرطانی شده با سلول های 4T1مورد بررسی قرار گرفتند.
موادوروش ها: سلول های 4T1 کارسینومای پستان(به میزان 106 سلول) به صورتfatpad در ناحیه ی غدد پستانی (اولین پستان در سمت راست هر سر موش در ناحیه ی قفسه ی سینه)موش های ماده ی BALB/Cبه جهت ایجادتومور پستان تزریق شدند.
یافته ها: تزریقIP(تزریق داخل صفاقی)سه دوزازترکیب 1 mg/kg)1،10،50 (به طور معنی داری رشد تومور را بعداز سه هفته به تأخیر انداخت.عود رشد تومور در3تا4هفته رخ داد که با نکروز گسترده ونفوذ لکوسیت ها همراه بود که با روش هیستوپاتولوژی تأیید گردید .قابل ذکر است که ترکیب1(1میلی گرم بر کیلوگرم)به طور موثر متاستاز ریه را کاهش داد که توسط مطالعات هیستوپاتولوژی ثابت شد.
نتیجه گیری:نتایج ما در مجموع قوی بودن ترکیب 1را به عنوان یک کاندید امیدوارکننده ی شیمی درمانی برای درمان سرطان پستان انسان آشکار کرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Evaluation of anti-tumor effect of chemical compound[ N-'((5-nitrothiophen-2-YL) methylene)-2(phenylthio)benzohydrazide]in breast cancer mouse model

نویسندگان [English]

  • soudeh dehghani 1
  • mona salimi 2
  • narges nikounahad 1

1 Department of Biology, Science and EngineeringFaculty,YazdScience& Art University, Yazd, Iran

2 Department of Physiology and Pharmacology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran

چکیده [English]

Introduction: Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of cancer death among females. Resistance and cytotoxicity of anticancer drugs are the reasons that warrant the search for newer anticancer agents, and researchers from various laboratories are engaged to find a more pleasant solution for treatment of cancer. Hydrazide derivatives have shown various pharmacological activities including antibacterial, antifungal, analgesic, antiinflammatory, antidepressant and anticancer activities and anticancer. With this point in mind, a novel hydrazide derivative, compound 1 was synthesized and its anticancer activity was evaluated in breast cancer cell line. To further confirm our previous data, we investigated the anti-mammary tumor activity of this compound in BALB/c mice bearing 4T1breast cancer cells. Materials and Methods: 4T1 mammary carcinoma cells (106)were injected into the mammary fat pad of female BALB/c mice to produce breast tumor. Histopathology experiment was also performed to demonstrate the metastasis. Results: i.p. administration of three doses of compound 1 (1, 10, 50 mg/Kg), significantly retarded growth of tumor after 3 weeks. Regression of tumor growth, which occurred in weeks 3 to 4, was associated with extensive necrosis and infiltration of leukocytes and confirmed by histopathological method. Importantly, compound 1(1mg/kg) effectively prevented the lung metastasis, which demonstrated by histopathology experiments. Conclusion: Our results collectively revealed the great potential of compound 1 as a promising chemotherapeutic candidate for human breast cancers.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cancer"
  • "Mouse"
  • "
  • Hydrazide Derivatives"
  • " Metastasis

بررسی اثرضد توموری ترکیب شیمیایی

 ))-'N5-نیتروتیوفن -2-(YLمتیلن)-2(فنیل تیو)بنزوهیدرازید درمدل موشی سرطان پستان

سوده دهقانی1، مونا سلیمی2* و نرگس نیکونهاد1

1 ایران، یزد، دانشگاه علم وهنریزد، دانشکده علوم ومهندسی، گروه زیست شناسی

2ایران، تهران، انستیتو پاستورایران،بخش فیزیولوژی وفارماکولوژی

تاریخ دریافت: 8/6/96                  تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

سرطان پستان، شایع ترین سرطان تشخیص داده شده وعلت اصلی مرگ ناشی از سرطان در میان زنان است. مقاومت دارویی و سمیت سلولی داروهای ضدسرطانی از دلایلی هستند که سبب جستجو برای یافتن عوامل ضدسرطانی جدیدتر شده است واز این رو محققان از آزمایشگاههای مختلف، داوطلب یافتن راه حل مناسب تری جهت درمان سرطان می باشند. مشتقات هیدرازیدی فعالیتهای دارویی مختلفی شامل: ضدباکتریایی، ضدقارچ، ضددرد، ضدالتهاب، ضدافسردگی وفعالیتهای ضدسرطانی را از خود نشان دادند. با در نظر گرفتن این نکته، مشتق جدیدی از این سری ترکیبات، به نام ترکیب (1)[N'- ((5-nitrothiophen-2-YL)methylene)-2(phenylthio) benzohydrazide]، سنتز وفعالیت ضد سرطانی آن در محیط vitro In ثابت شده است. جهت تأیید بیشتر داده های قبلی، فعالیت ضد توموری این ترکیب در موشهای ماده BALB/C سرطانی شده با سلولهای 4T1 مورد بررسی قرار گرفتند. سلولهای 4T1 کارسینومای پستان(به میزان 106 سلول) به صورتfatpad  در ناحیه غدد پستانی موشهای ماده BALB/Cبه منظور ایجادتومور پستان تزریق شدند. تزریق IP(تزریق داخل صفاقی)سه دز از ترکیب (1) به میزان mg/kg1،10،50 توانست به طور معنی داری رشد تومور را بعد از سه هفته به تأخیر اندازد. کاهش رشد تومور در 3 تا 4 هفته رخ داد که با نکروز گسترده ونفوذ لکوسیتها همراه بود که با روش هیستوپاتولوژی تأیید گردید . قابل ذکر است که ترکیب(1) همچنین به طور مؤثر متاستاز ریه را کاهش داده که توسط  مطالعات هیستوپاتولوژی ثابت شد. نتایج این تحقیقات در مجموع قوی بودن ترکیب(1) را به عنوان یک کاندید امیدوارکننده شیمی درمانی برای درمان سرطان پستان انسان آشکار کرد.

واژه های کلیدی: سرطان، موش، مشتقات هیدرازیدی، متاستاز

* نویسنده مسئول، تلفن تماس: 64112264، پست الکترونیکی:salimimona@pasteur.ac.ir

مقدمه

 

سالانه بیش از 7 میلیون نفر در جهان در اثر ابتلاء به سرطان جان خود را از دست می دهند و پیش بینی می شود که تعداد موارد جدید ابتلاء تا سال 2020 سالانه از 10 میلیون به 15 میلیون نفر برسد (8و18). طبق گزارشات، میزان مرگ ومیر ناشی ازسرطان درسال2012، هشت میلیون ودویست هزارنفر بوده که این میزان از سال2008، هشت وچهاردهم درصد افزایش یافته است(10). در میان انواع سرطان، سرطان پستان شایع ترین نوع آن در میان زنان می باشد(17). طبق آمار منتشر شده ، از هر هشت زن ایرانی، یک نفرشانس ابتلاء به سرطان پستان را داراست وحدود یک چهارم کل سرطانهای زنان در کشور مربوط به سرطان پستان است(1). بر اساس گزارش ارائه شده در سال 2015، در ایران6160 مورد سرطان پستان تشخیص داده شده است که1063 مورد منجر به مرگ شده است(2).

شیمی درمانی، پرتو درمانی وژن درمانی از راههای مطرح درمان سرطان به شمار می رود که از این میان شیمی درمانی، درمان سرطان با داروی ضد توموری، رایج ترین راه درمان در سالهای اخیر می باشد. داروهای شیمی درمانی با تأثیر بر تقسیم سلولی، رشد وگسترش تومور سرطانی را مختل می نماید، طوری که سلولهای بدخیم نمی توانند تکثیر شده و یا اینکه آسیب می بینند و توانایی ترمیم را از دست می دهند. واضح است که هر سلولی که تقسیم سلولی درآن انجام شود، می تواند تحت تأثیر شیمی درمانی قرار گیرد. از این رو داروها علاوه بر سلولهای بیمار می توانند موجب اختلال و آسیب در سلولهای سالم بدن نیز شوند و باعث ایجاد عوارض جدی گردند. بنابراین عدم انتخابی بودن و همچنین مقاومت دارویی که در سلولهای سرطانی ایجاد می شود، سبب محدودیت استفاده از داروهای متداول شیمی درمانی شده است(5و7). در نتیجه همواره نیاز به مطالعه، شناخت وکشف داروهای جدید با مکانیسمهای متعدد و پتانسیل مناسب جهت کاهش عوارض داروهای شیمی درمانی مطرح در درمان سرطان ، حائز اهمیت بوده است. یکی از این دسته داروها، مشتقات هیدرازیدی می باشد که این ترکیبات دارای خواصی مانند شلات کنندگی آهن، ضدتشنج، ضدپلاکت، ضدویروس، ضد مالاریا،  ضدباکتریایی، ضدقارچی وضدالتهابی را دارا می باشند(4). همچنین این ترکیبات  اثرات ضدسرطانی وضد ایدز نیز از خود نشان داده اند(19). دراین مطالعه به بررسی خواص ضد توموری ترکیب جدیدی از دسته ترکیبات هیدرازیدی  به نام))- 'N 5-نیتروتیوفن -2-(YL متیلن)-2(فنیل تیو)بنزوهیدرازید (ترکیب 1) (شکل 1) درمحیط in vivo پرداخته شده است، با توجه به اینکه در مطالعه پیشین درمحیطvitro in، اثر ضد سرطانی این ترکیب بر روی رده سلولی سرطان پستان (MCF-7)  بررسی شده و مشاهده شده که این ترکیب اثر ضدسرطانی بر روی سلولهای سرطان سینه را دارا می باشند(µM 18/0= IC50)، لذا این مطالعه برای اثبات بیشتر این اثرطراحی شده است.

 

شکل1- ساختارترکیب شیمیایی: ))-'N5-نیتروتیوفن -2-(YLمتیلن)-2(فنیل تیو)بنزوهیدرازید(1)

مواد و روشها

حیوانات ومواد شیمیایی مورد استفاده: دراین مطالعه 60 سرموش سوری ماده، نژاد BALB/C، سن 5 تا 7 هفته ای از انستیتوپاستورکرج خریداری گردید و در حیوانخانه آزمایشگاه فارماکولوژی انستیتو پاستورتهران به مدت یک هفته برای عادت کردن به محیط وشرایط حیوانخانه با12ساعت روشنایی و12ساعت تاریکی در دمای ±22 درجه سانتی گراد همراه با آب و غذا نگهداری شدند. در این تحقیق، DMSO مورد استفاده از شرکت Sharloاسپانیا، محیط کشت DMEM، سرم جنین گاوی وآنتی بیوتیک پنی سیلین-استرپتومایسین از شرکت Gibco آمریکا، هماتوکسیلین از شرکت Sigma - Aldrich  آمریکا، ائوزین از شرکت Merck آلمان، زایلن از شرکت دکتر مجللی و چسب مخصوص سیتولوژی Entellan از آلمان خریداری شدند.

کشت سلولی: سلولهای رده موشی 4T1 سرطان پستان از بانک سلولی انستیتوپاستور تهیه شد. سلولها در محیط کشت DMEM همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی و 1 درصد آنتی بیوتیک پنی سیلین- استرپتومایسین کشت داده شدند. سلولها پس از تریپسینه شدن و شستشو با بافر PBS ، شمارش شدند و تعداد 106سلول در50 میکرولیتر PBS در سرنگ انسولین به صورت سوسپانسیون تهیه گردید.

بررسی اندازه تومور موشها در زمانهای مختلف: دراین آزمون،  موشها به 6 گروه (n=10) تقسیم شدند. به این صورت که یک گروه کنترل مثبت (مبتلا به سرطان ودرمان نشده )، یک گروه کنترل منفی(سالم)، یک گروه DMSO وسه گروه موشی تحت درمان با دزهای مختلف ) 50 و1،10میلی گرم بر کیلوگرم در روز) ترکیب شیمیایی(1) قرارگرفتند. میزان6 10 سلول 4T1 درسرنگ انسولین شمارش و به صورت  fatpadدرناحیه غددپستانی(اولین پستان درسمت راست هرسرموش در ناحیه قفسه سینه) تزریق گردید. روز تزریق سلول سرطانی، روز صفر در نظر گرفته شد و بعد از مشاهده اولین جوانه تومور(حدودا یک هفته پس از تزریق سلول4T1)، ترکیب شیمیایی(1) در سه دز به گروههای درمانی به صورت داخل صفاقی(IP) با سرنگ انسولین تزریق گردید. درطی اجرای پرتکل درمانی، بعد از رؤیت تومور وقابل اندازه گیری شدن با کولیس، تومورها هر سه روز یکبار با کولیس دیجیتال اندازه گیری و وزن موشها نیز مورد بررسی قرار گرفت.

آزمون هیستوپاتولوژی: بعداز3هفته درمان برطبق پرتکل درمانی موردنظر، موشها درروز32ام کشته وتومورها وریه ها ازبدن هرکدام جدا و با فرمالین 10 درصد فیکس شدند و برای مطالعات هیستوپاتولوژی مورد استفاده قرار گرفتند. برای انجام مطالعات هیستوپاتولوژی، از بافتها لام تهیه گردید وبه روش H&E رنگ آمیزی وسلولهای توموری با بزرگنماییX40، X100وX400 بررسی شدند.

آنالیز آماری:تومورها در گروههای درمانی مختلف با استفاده از کولیس دیجیتال با دقت اندازه گیری01/0میلی متر اندازه گیری شدند و حجم هریک از تومورها با فرمول حجم تومور(2(قطرکوچک)×  قطربزرگ/2) محاسبه گردید. داده ها به صورت mean±SEM و آزمونها حداقل 3بار تکرار شدند. جهت مقایسه میانگین گروههای مختلف با یکدیگر از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA)وPost-Tukey test وp<0.05با استفاده از نرم افزار Graphpad prism6 استفاده گردید.

نتایج

پس از اینکه اندازه تومورها توسط کولیس دیجیتال قابل اندازه گیری بود، حجم تومور هرسه روز یکبار اندازه گیری و تمامی داده های حاصل ، در طی سه هفته در جدول 1 به صورت mean±SEM گزارش شده است. همان طور که در جدول مشاهده می شود، اندازه تومور در گروه کنترل- حامل نسبت به سایر گروهها با گذشت زمان به مقدار بیشتری افزایش می یابد، در حالی که در گروه درمانی با ترکیب شیمیایی(1) این روند کندترمی باشد. به عنوان مثال در دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم در روز اندازه تومور از 29.40±140.8به mm398.41±380.4 در طی سه هفته رسیده است، در صورتیکه در گروه کنترل حامل اندازه تومور از33.64± 268.4 به mm3232.4±1953.0 درطی سه هفته افزایش پیدا کرده است. این مسئله خود شاهدی بر مؤثر بودن ترکیب (1) به ویژه در دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم در روز می باشد. این کاهش اندازه در مورد سایر دزها نیز صدق می کند، به طوری که بعد از تیمار با دز 50 میلی گرم بر کیلوگرم و 10میلی گرم بر کیلوگرم نیزاندازه تومور پس از سه هفته کاهش یافته و اما ترکیب (1) در دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم توانسته به مقدار بیشتری اندازه تومور را نسبت به گروه کنترل حامل کاهش دهد که این تفاوت از لحاظ آمار معنی دار بوده است. معنی داری همه داده ها نسبت به گروه کنترل- حامل سنجیده شده وبا نماد ستاره نمایش داده شده است.

جهت نمایش بهتر نتایج حاصل از تیمار دز 1میلی گرم بر کیلوگرم ترکیب(1)،  نمودار شکل 2 که نمایانگراندازه تومور در گروه کنترل حامل وگروه درمان شده با دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم در طی 32 روز می باشد، رسم شده است.

 

جدول1- میانگین حجم تومور(mm3) در موشها با سرطان پستان (مدل  4T1سرطان پستان) که با ترکیب شیمیایی(1) در دزهایمختلف درمان شده اند(دوز50و10،1 میلی گرم بر کیلوگرم در روز)1.

ترکیب(1)

50میلی گرم بر کیلوگرم

ترکیب(1)

10میلی گرم بر کیلوگرم

ترکیب(1)

ا میلی گرم برکیلوگرم

 

کنترل حامل

گروهها

                  زمان(روز)

246.9±28.10

158.7±11.52*

140.8±29.40*

268.4±33.64

13

363.8±47.38

242.6±24.59*

**48.73±165.8 

402.2±43.91

16

636.3±85.16

*48.78±268.9

228.4±56.38**

565.4±38.25

19

835.6± 64.24

347.6± 35.85***

323.5± 84.80***

817.8± 62.55

22

982.3± 111.6

378.7 ±56.32**

350.3± 110.3***

1073.0±109.4

25

1026.0± 161.5

417.3± 91.76**

370.5± 92.51***

1153.0±112.8

 28

1042.0 ±127.4**

726.1± 34.30**

380.4± 98.41***

1953.0±232.4

32

           

1مقادیر به صورت mean±SEM و*p<0.05  ,**p<0.01  ,*** p<0.001در مقایسه با گروه کنترل حامل در نظر گرفته شده است.

 

 

شکل 2- مقایسه گروه کنترل با گروه درمانی تیمارشده با دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم از ترکیب(1)درطی روز های مختلف. هر داده نشان دهنده mean±SEM است.منظور از گروه Vehicle control،گروه کنترل و DMSOمی باشد.آزمونOne-way ANOVA(post-Tukey test) ،برای مقایسه گروهها انجام شد. موشهای هرگروه n=10 می باشد، (*p<0.05  ,**p<0.01  ,*** p<0.001) درمقایسه با کنترل– حامل، معنی دار تلقی می شود.

 

همان طور که درتصویر مشاهده می شود، تومور درگروه درمانی(با دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم در روز) نسبت به گروه کنترل حامل با سرعت کمتری رشد کرده ویا حتی در بعضی روزها مانند روز 25 تا 32 ام تومور رشد چندانی نداشته است.

جهت مشاهده اثر ترکیب شیمیایی(1) بر روند رشد تومور و متاستاز آن به ریه،  تعدادی از پارامترها در تومورهای گروه کنترل و گروه درمانی در ریه محاسبه گردید (جدول2). همانطور که در جدول2 مشاهده می شود، اندازه بزرگترین توده توموری در گروه کنترل حامل نسبت به دز مؤثر ترکیب شیمیایی(1) بسیار بیشتر است. همچنین تعداد سلولهای توموری ومیتوز در دز مؤثر ترکیب شیمیایی (1) نسبت به گروه کنترل حامل کاهش چشم گیری داشته است.


جدول2- میانگین حجم تومور ریه(mm3) در موشها با سرطان پستان (مدل  4T1سرطان پستان)

گروه

اندازه بزرگترین توده توموری

2)

تعداد سلولهای توموری در توده

(n/mm2)

تعداد میتوز

(n/mm2)

کنترل حامل

12388.0±186.7

7200.0±130.4

1610.0±71.06

ترکیب شیمیایی(1)

575.0±48.40

4020.0±49.65

405.0±18.51

1مقادیر به صورت mean±SEM و*p<0.05  ,**p<0.01  ,*** p<0.001در مقایسه با گروه کنترل حامل در نظر  گرفته شده است.

 

پس از اندازگیری ابعاد تومور،موشها در روز 32ام قربانی شدند و تومور آنها از محل پستان جدا و برای مطالعات هیستوپاتولوژی فیکس و رنگ آمیزی گردیدند. بررسی توده پستانی نشانگر لانه گزینی سلولهای سرطانی 4T1 والتهاب آن بود. به عبارت دیگر نتیجه رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) از تومور اولیه جدا شده از ناحیه پستانی حاکی از حضور سلولهای نئوپلاستیک تمایز نیافته و پلی مرفیسم با هسته های هایپرکروماتیک و مقادیر کم سیتوپلاسم بودکه بیانگر سرطانی بودن توده ایجاد شده می باشد. همان گونه که در شکل 3 مشاهده می گردد، سلولهای 4T1 سلولهایی بزرگ ومتورم با هستکی مشخص و کروماتینی معلوم است که در نمونه های حاصل به خوبی قابل تشخیص و متمایز از سایر سلولها هستند.

 

 

الف)                                                                                                         ب)

 

شکل3- الف)بررسی هیستوپاتولوژی تومور پستان کنترل مثبت(مبتلا به سرطان و درمان نشده، با بزرگنمایی- 400X) حاصل از تزریق سلول4T1 پس از مدت زمان سه هفته. ب)تصویر تومور پستان گروه درمان شده با دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم در روز از ترکیب(1) (با بزرگنمایی400X).همان طور که در تصویر مشاهده می شود، سلولهای التهابی (لنفوسیت، ماکروفاژ، پلاسماسل و نوتروفیل) در اطراف بافت توموری وجود دارند.

 

 

 

 

همچنین دراین سلولها مراحل مختلف متافاز و تلوفاز قابل ملاحظه می باشد. در نتیجه می توان عنوان نمود که توده بدخیم سرطان پستان، توده ای با واکنش التهابی ایجاد شده است و کپسولی از جنس بافت همبندی اطراف توده شکل گرفته است(شکل3.الف)، در حالی که در تصویری که از گروه درمانی با دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم در روز از تومور پستان تهیه شده، می توان گفت در مقایسه با گروه کنترل از تعداد میتوز ها کاسته شده اما نواحی نکروزی به صورت موضعی افزایش یافته است که این مطلب خود نشانگر پاسخ به درمان است(شکل3.ب). به جهت اطمینان از متاستاز سلولهای سرطان پستان به ریه، از تومورهای ریه نیز لام تهیه و مورد بررسی قرار گرفت(شکل4.الف). همان گونه که در شکل4(الف) مشخص است، سلولهای چند هسته ای و التهابی (لنفوسیت، ماکروفاژ، پلاسماسل و نوتروفیل) را می توان به خوبی مشاهده نمود. همچنین در این تصویر سلولهای توموری که به شکل پلی مورفیسم بوده و دارای هسته ای بزرگ با غشای پر رنگ و حاشیه دار اما مختلف الشکل هستند، قابل مشاهده می باشد.  نکته قابل ذکر آن است که تصویری که از ریه گروه درمانی، دز 1 میلی گرم بر کیلوگرم در روز(شکل4.ب) تهیه شده حاوی بافت نکروزه به وفور می باشد، همچنین تعداد تقسیم میتوز و در نهایت سلولهای توموری نسبت به گروه کنترل مثبت بسیار کمتر است که این خود شاهدی بر اثر گذاری ترکیب(1) بر اندازه رشد  تومور می باشد.

 

 

الف)                                                                                                         ب)

شکل4- الف) بررسی هیستوپاتولوژی ریه کنترل مثبت(مبتلا به سرطان و درمان نشده، با بزرگنمایی-400X) حاصل از تزریق سلول4T1 پس از مدت زمان سه هفته.همان طور که در تصویر مشخص  شده، سلولهای التهابی به اطراف سلولهای توموری فراخوانده شده اند.ب) تصویر ریه گروه درمان شده با دز 1میلی گرم بر کیلوگرم در روز با بزرگنمایی400X.همان طور که در تصویر مشاهده می شود، سلولهای التهابی (لنفوسیت ، ماکروفاژ،  پلاسماسل و نوتروفیل) در اطراف بافت توموری وجود دارند.


بحث و نتیجه گیری

تاکنون اثرات متفاوتی از ترکیبات هیدرازیدی گزارش شده است، همچون اثرات ضدتشنج، ضدویروس، ضد مالاریاو بسیاری از اثرات دیگر، اما اخیراً توجه دانشمندان به سمت اثرات ضدسرطانی ترکیبات هیدرازیدی معطوف شده است. در عین حال با توجه به مطالعه پیشین مبنی بر اثرات ضدسرطانی ترکیب هیدرازیدی جدیدی به نام ))- 'N5-نیتروتیوفن -2-(YLمتیلن)-2(فنیل تیو) بنزوهیدرازید (ترکیب 1) که به تازگی طراحی شده واثرات آن بر روی رده سلولی سرطان سینه به اثبات رسیده(14و16)، از این رو تصمیم بر این شد تا مطالعه  in vivoاین ترکیب نیز انجام گیرد. برای بررسی اثرات vivo in لازم بود، مدل موشی سرطان پستان ایجاد شود. درواقع مطالعات in vivo توانایی بررسی تشکیل تومور، پیشرفت آن وپاسخ درمان مورد نظر را فراهم می نماید و با ایجاد مدل  in vivo سرطان پستان، می توان بیماری سرطان پستان در انسان را به سهولت شبیه سازی کرد که در مطالعات بالینی و فارماکولوژیکی، ایجاد چنین مدلهایی برای تقلید بیماری انسانی بسیار مفید به نظر می رسد. یکی از رایج ترین مدلهای  in vivo سرطان، استفاده از تزریق سلولهای سرطانی رده موشی است که به کمک آن می توان انواع تومورهای حاصل از سرطان را ایجاد کرد. در مطالعات
in vivo سرطان پستان، استفاده از سلولهای 4T1 همواره به عنوان مدلهای مناسبی پیشنهاد می شود. بر طبق مطالعات انجام شده، سلولهای 4T1 درموش BALB/C بیشترین حالت تهاجمی را دارا می باشند وشرایطی مشابه با سرطان پستان در انسان را ایجاد می نماید. موش نژاد BALB/C  نوعی موشهای اصلاح ژنتیکی شده می باشد که بسیاری از مدلهای تومور موشی ایجاد شده در طول سالیان گذشته، در این نوع موش انجام شده است (15).

مشکل عمده دیگر درمطالعات حیوانی ایجاد مدل متاستاتیک می باشد. یکی از مهم ترین موانع مطالعه متاستاز، دردست نبودن مدل مناسبی است که بتواند به صورت قابل اطمینان پروسه متاستاز درشرایطin vivo را مشابه سازی نماید. مدلهای گزنوگرافت که در آنها سلولهای توموری انسان به موش سرکوب شده ایمنی تزریق می شوند، به طور گسترده برای مطالعه رشد ومتاستاز تومور در موش به کار می رود(9). اگرچه ایجاد تومور اولیه با این شرایط امکان پذیر است، شبیه سازی متاستاز تومور در این مدل بسیار مشکل می باشد. ازمیان این مدلها، مدل سینژنیک (Syngeneic) مناسب ترین مدل برای ایجاد مدلهای متاستاتیک می باشد. در این مدل چندین مزایا وجود دارد که عبارتند از:1)در دسترس بودن آن، 2)هزینه پایین حیوانات میزبان، 3)تکرار پذیری داده ها. با توجه به اینکه در این مدل هم سلولهای سرطانی وهم میزبان این سلولها، موش می باشد(21) و از طرفی سلولهای توموری انسان به طور ضعیفی در موش متاستاز می یابند و هنگامی که متاستاز هم ایجاد شود اغلب خصوصیات غیر منتظره دارد، لذا این مدل را برای انجام این آزمون مناسب دیده اند. در واقع مدلهایی که با استفاده از سلولهای توموری موشی باشند، به طور مؤثرتری متاستاز می یابند و خصوصیاتی مشابه آنچه در بیماران سرطانی دیده می شود، تظاهر پیدا می کند(11). این نوع مدل امکان آنالیز تومور درحیوان با سیستم ایمنی طبیعی را فراهم می‍نماید. ازآنجایی که سیستم ایمنی نقش مهمی در ایجاد وپیشرفت سرطان ایفاء می نماید، مدلهایی که بتوان در موش دارای ایمنی کامل(نسبت به Nude mouse) به کار برد، برای آنالیز پیشرفت ومتاستاز سرطان وارزیابی داروها ضروری خواهد بود (20). نتایج حاصل از مطالعات در این تحقیق ایجاد این مدل توسط تزریق سلولهای سرطانی به ناحیه زیر غدد شیری را تأیید نمود، به طوری که پس از گذشت تقریباً هفت روز حضور این تومور قابل لمس بود. جهت تأیید بیشتر تومور ایجاد شده، مطالعات هیستوپاتولوژی بر روی بافت تومور و ریه انجام گرفت. با توجه به حضور سلولهایی با هسته های بزرگ و دارای شکل پلی مورفیسم و همچنین مشاهده مراحل مختلف تقسیم سلولی، مشخص شد که این نوع مدل توموری  به خوبی ایجاد شده است. نکته قابل توجه آن بودکه با گذشت زمان به تدریج اندازه تومور بزرگتر شده به طوری که درهفته چهارم به اندازه ای رسید که نه تنها قابل اندازه گیری بود، بلکه کاملاً قابل مشاهده نیز بود. نمونه بافتی تومور جدا گردید و از نظر حضور سلولهای غیر نرمال سرطانی مورد بررسی قرار گرفت. پس از بررسی مشخص شد که تومور حاصل از نوع سرطانی بدخیم است که این نتایج با نتایج حاصل از مطالعه ای که در سال 2006 توسط Tobias Hahn و همکاران صورت گرفت، در یک راستا بودند و هر دو نشان دادند که تومور حاصل از این مدل از نوع سرطان پستان است(12). مرحله بعد مشخص بودن حالت متاستاتیک سرطان پستان ایجاد شده بود. از آن جا که مطالعات نشان دادند، ریه از جمله نواحی است که متاستاز در آن سریع دیده می شود (3و6)، لذا بافت ریه از موشهای توموری نیز جدا و مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل ازمطالعات هیستوپاتولوژی تأیید نمود که این بافت نیز توموری شده است. بنابراین اکنون مدل سرطان پستان متاستاتیک ایجاد گردیده است. لذا تصمیم این شد که از این مدل برای بررسی اثرات ضد توموری ترکیب (1) استفاده گردد. نتایج حاصل از اندازه گیری تومور با کولیس دیجیتال وبررسیهای هیستوپاتولوژی نشان داد که ترکیب(1) در دز 1میلی گرم بر کیلوگرم توانسته اندازه تومور را درمدت سه هفته به صورت معنی داری نسبت به گروه کنترل - حامل کاهش دهد. به این صورت که از هفته دوم رشد تومور کاهش یافته ودر هفته سوم توانسته بیشترین اثر را بر روی کاهش اندازه تومور داشته باشد. دز مؤثر علاوه بر کاهش اندازه تومور توانسته تا حد زیادی از متاستاز تومور به ریه نیزجلوگیری نماید که این امر خود نکته قابل تأملی در درمان سرطان پستان می باشد(13).  نکته قابل توجه آن است که اثر دز 50 میلی گرم بر کیلوگرم از ترکیب (1) در کاهش اندازه تومور، کمتر از سایر دز ها بوده است که این کاهش را می توان به سمیت ترکیب در این دز نسبت داد. باتوجه به بررسیهای صورت گرفته می توان نتیجه گرفت که ترکیب شیمیایی (1) جهت کاهش رشدتومور در سرطان پستان انسانی نیز می تواند مؤثر می باشد چرا که مدل موشی، مدل شبیه به سرطان پستان در انسان است، هر چند که مطالعات تکمیلی بیشتری با انجام آزمونهای مولکولی و ایمنوهیستوشیمی مورد نیاز می باشد.

1- Ahmadi, M., Asadi, F., Jalali-fard, B., Sadoghi, F. ( 2005) Management of health nformation. Tehran:Nopardaz ublications.

2- Alizadeh otaghvar, H.,Hosseini, M.,Tizmaghz, A.,Shabestanipour, GH.,Noori, H. (2015) Areview on metastatic breast cancer in iran. Asian pacific journal of tropical biomedicine,5(6): 429-433.

3- Baliga, MS.,Meleth, S.,Katiyar, SK.( 2005) Growth inhibitory and antimetastatic effect of green tea polyphenols on metastasis-specific mouse mammary carcinoma 4T1 cells in vitro and in vivo systems.Clinical Cancer Research,11(5):1918-27.

4-Bharti, SK.,Nath, G.,Tilak, R.,Singh, SK.( 2010) Synthesis, anti-bacterial and anti- fungal activities of some novel Schiff bases containing 2, 4-disubstituted thiazole ring. European Journal Of Medicinal Chemistry,45: 651-660.

5- Chidambaram, M.,Manavalan, R., Kathiresan, K.( 2011) Nanotherapeutics to overcome conventional cancer chemotherapy limitations. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences,14(1):67-77.

6- DuPre, SA., Redelman, D., Hunter, KWJr.(2007) The mouse mammary carcinoma 4T1: characterization of the cellular landscape of primary tumors and metastatic tumor foci. Int J Exp Pathol,88(5): 351-60.

7- Gottesman, MM.( 2002) Mechanisms of cancer drug resisitance. Annual review of medicine,53(1):615-27.

8- HasanpoorDehkordi, A., Azari, S.( 2006) Quality of lifeand related factor in cancer patients. Behbood,10(2):110-19.

9- Hepper, GH., Miller, FR.,Shekhar, PM.( 2000) Nontransgenic models of breast cancer.Breast Cancer Res,2(5):331-4.

10- International Agency for Research on Cancer;Fact sheet by cancer .Available at:URL: http//globocan.iarc.fr.Pages/fact_sheets_cancer.aspx.

11- Jonkers, J.,Derksen, PW.( 2007) Modeling metastatic breast cancer in mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia,12(2-3):191-203.

12- Masferrer, JL.,Leahy, KM.,Koki, AT.,Zweifel, BS.,Settle, SL.,Woerner, BM,et al. (2000) Antiangiogenic and antitumor activities of cyclooxygenase-2 inhibitors.Cancer research,60(5):1306-11.

13- Motovali-Bashi, M., Kouhkan, F., Hojati, Z. (2016) The role of SNP in fibroblast collagenase gene with increasing of metastasis risk and viability reduction in breast cancer patients.Journal of Molecular and Cellular Research, 26(3):365-377.

14- Mousavi, E., Tavakolfar, SH., Almasirad, A., Kooshafar, Z., Dehghani, S., Afsharinasab, A.,et al.( 2017) In vitro and in vivo assessments of two novel hydrazide compounds against breast cancer as well as mammary tumor cells. Cancer Chemotherapy and Pharmacology,79:1195–1203.

15- Redelman, D.,Hunter, KW.( 2007) The mouse mammary cracinoma 4T1: characterizaition of the cellular landscape of primary tumours and metastatic foci.International journal of experimental pathology,88(5):351-60.

16- Rezaei, M., Ghafoori, H., Jamalzadeh, L., Aghamaali, M., Mohammadi, A.(2017) Anti-inflammatory effects of novel thiazolidinedione derivative on RAW 264.7 cells stimulated with LPS.Journal of Molecular and Cellular Research,29(3):282-290.

17- Safaee, A., Zeighami, B., Tabatabaee, HR., MoghimiDehkordi, B.( 2008) Quality of life and Related Factors in Breast Cancer Patients under Chemotherapy. Iranian Journal of Epidemiology,3(4):61-6.

18- Saki, A., Hajizadeh, E., Tehranian, N.( 2011) Evaluating the Risk Factors of Breast CancerUsing the Analysis of Tree Models.Ofogh-eDanesh.Journal of Breast Cancer Gonabad University of Medical Sciences,17(2):60-9.

19- Vicini, P.,Zani, F.,Cozzini, P.,Doytchinova I.( 2002) Hydrazones of 1, 2- benzisothiazole hydrazides: synthesis, antimicrobial activity and QSAR investigations. European Journal Of Medicinal Chemistry,37: 553-564.

20- Xanthopoulos, JM., Romano, AE., Majumdar, SK.( 2005) Response of Mouse Breast Cancer Cells to Anastrozole,Tamoxifen, and the Combination. J Biomed Biotechnol,(1): 10-9.

21- Zhang, Y., Cao, W., Toneri, M., Zhang, N., Kiyuna, T., Murakami, T.,et al. (2017) Toxicology and efficacyof tumor-targeting Salmonella typhimurium A1- R compared to VNP 20009 in a syngeneic mouse tumor model in immunocompetent mice.Oncotarget.(1):1-13.