نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، گروه گیاه پزشکی

2 دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی

چکیده

تعیین خصوصیات ژنتیکی موجودات زنده، اولین قدم برای اصلاح نژاد آ‌ن‌ها می‌باشد. این تحقیق در راستای مطالعه تنوع ژنتیکی جمعیت‌های زنبورعسل کوچکApis florea) ) در جنوب و جنوب غربی ایران انجام گرفت. به این منظور نمونه-برداری در مهرماه سال 1393 از چهار استان خوزستان (دزفول و آبادان)، بوشهر (بندردیلم و خورموج)، فارس (فیروزآباد و خرم‌بید) و هرمزگان (حمیران و بندرعباس) انجام شد. جهت بررسی خصوصیات ژنتیکی بخشی از ژن سیتوکروم‌اکسیداز I و ژن tRNAleu، ناحیه بین ژنی و بخشی از ژن سیتوکروم‌اکسیداز II مورد استفاده قرار گرفت. درخت فیلوژنی نواحی ژنی به روش‌های بیزی وحداکثر تشابه(MP) رسم گردید. پس از همردیفی توالی‌های هشت ناحیه نمونه‌برداری شده از ایران مشخص گردید که بخشی از ژن سیتوکروم‌اکسیداز Iو ناحیه بین ژنی (واقع در بین tRNAleu و ژن سیتوکروم‌اکسیداز II) به ترتیب دو و یک تفاوت تک نوکلئوتیدی (SNP) در جمعیت‌های مورد مطالعه داشتند. همچنین در این مطالعه، تفاوت نوکلئوتیدی بین توالی‌های tRNAleu و ژن سیتوکروم‌اکسیداز II توالی‌های هشت ناحیه نمونه‌برداری شده از ایران مشاهده نشد. نتایج نشان داد که نمونه‌های مورد مطالعه در ایران براساس ژن سیتوکروم‌اکسیداز I به سه گروه تقسیم شدند که بر اساس آن نمونه‌های دیلم، فیروز‌آباد، آبادان و حمیران در گروه اول، نمونه‌های خورموج و بندرعباس در گروه دوم و نمونه‌های دزفول و خرم‌بید در گروه سوم قرار گرفتند. نتایج این مطالعه نشان داد که ژن سیتوکروم‌اکسیداز I در جمعیت-های زنبور عسل کوچک جنوب غربی و جنوب ایران تنوع ژنتیکی بیشتری داشت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of phylogenetic characteristics of dwarf honeybee populations (Apis florea) using COI, intergenic region and COII

چکیده [English]

Determination of genetic characteristics of animates is the first step in breeding. This research was conducted for evaluation of genetic diversity of dwarf honeybee populations (Apis florea) in southwest and southern of Iran. The sampling was conducted in four provinces of Iran including Khozestan (Dezful and Abadan), Boshehr (Bndardeylm and Khormoj) Fars (Firoozabad and Khorrambid) and Hormozgan (Hamiran and Bandar Abbas). For studying of the genetic characteristics, partial COI, tRNAleu, intergenic region and partial COII were evaluated. Phylogenetic trees were drawn by Baysian and Maximum Parsimony (MP) methods. After sequence alignment, there was one and two single nucleotide polymorphism (SNP) in partial COI and intergenic region (situated between tRNAleu and COII) respectively in studied populations of Iran. Sequences of COI gene grouped the studied populations in three groups including Dylam, Firozabad, Abadan and Homeyran in the first group, Khormoj and Bandarabas in the second group and Dezfol and Khorambid in the third group. In addition, COI gene showed more genetic diversity in dwarf honeybee populations in southwest and southern areas of Iran.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Apis florea
  • dwarf honeybee
  • intergenic region
  • Iran

بررسی خصوصیات فیلوژنتیکی جمعیتهای زنبور عسل کوچک (Apis florea) با استفاده از ژنهای سیتوکروم ­اکسیداز I، ناحیه بین ژنی و سیتوکروم اکسیداز II

داود نجف‌زاده1، جواد ناظمی رفیع1* و جلال رستم‌زاده2

1 ایران، سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، گروه گیاه پزشکی

2 ایران، سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی

تاریخ دریافت:‌ 8/8/95                  تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

تعیین خصوصیات ژنتیکی موجودات زنده، اولین قدم برای اصلاح نژاد آنها می­باشد. این تحقیق در راستای مطالعه تنوع ژنتیکی جمعیتهای زنبورعسل کوچکApis florea) ) در جنوب و جنوب غربی ایران انجام گرفت. به این منظور نمونه­برداری در مهرماه سال 1393 از چهار استان خوزستان (دزفول و آبادان)، بوشهر (بندردیلم و خورموج)، فارس (فیروزآباد و خرم­بید) و هرمزگان (حمیران و بندرعباس) انجام شد. جهت  بررسی خصوصیات ژنتیکی بخشی از ژن  سیتوکروم‌اکسیداز  I و ژن  tRNAleu، ناحیه بین ژنی و بخشی از ژن سیتوکروم­اکسیداز II مورد استفاده قرار گرفت. درخت فیلوژنی نواحی ژنی به روشهای بیزی وحداکثر تشابه(MP)   رسم گردید. پس از همردیفی توالیهای هشت ناحیه نمونه‌برداری شده از ایران مشخص گردید که بخشی از ژن سیتوکروم‌اکسیداز  Iو ناحیه بین ژنی (واقع در بین tRNAleuو ژن سیتوکروم­اکسیداز II) به ترتیب دو و یک تفاوت تک نوکلئوتیدی (SNP) در جمعیتهای مورد مطالعه داشتند. همچنین در این مطالعه، تفاوت نوکلئوتیدی بین توالیهای tRNAleu و ژن سیتوکروم­اکسیداز II توالیهای هشت ناحیه نمونه‌برداری شده از ایران مشاهده نشد. نتایج نشان داد که نمونه‌های مورد مطالعه در ایران براساس ژن  سیتوکروم‌اکسیداز  I به سه گروه تقسیم شدند که بر اساس آن  نمونه‌های دیلم، فیروز‌آباد، آبادان و حمیران در گروه اول، نمونه‌های خورموج و بندرعباس در گروه دوم و نمونه‌های دزفول و خرم‌بید در گروه سوم قرار گرفتند. نتایج این مطالعه نشان داد که ژن سیتوکروم­اکسیداز I در جمعیتهای زنبور عسل کوچک جنوب غربی و جنوب ایران تنوع ژنتیکی بیشتری داشت.

واژه های کلیدی: Apis florea، ناحیه بین ژنی، زنبورعسل کوچک

* نویسنده مسئول، تلفن: 09199250948‌، پست الکترونیکی: j.nazemi@uok.ac.ir

مقدمه

 

امروزه نقش زنبورعسل در گرده­افشانی گیاهان زراعی، باغی و بهبود محیط زیست به اثبات رسیده است. به طور کلی در تولید میوه­ها و بذرها در مجموع 1 درصد گرده افشانی به وسیله باد، 6 درصد گرده­افشانی توسط همه حشرات به غیر از زنبورعسل و 93 درصد گرده­افشانی تنها توسط زنبورعسل انجام می­گیرد (4). زنبورعسل کوچک A. florea (Fabricus, 1787)، از سلسله جانوران، شاخه بندپایان، رده حشرات، راسته بال­غشائیان، بالاخانواده Apoidea، خانواده Apidae، زیرخانواده Apinae، قبیله Apini و جنس Apis می­باشد. زنبورعسل کوچک برای اولین بار در سال 1787 معرفی گردید (15). این زنبور با ساختن یک شان در فضای باز زندگی می­کند. همچنین زنبورعسل کوچک بر خلاف زنبورعسل معمولی می‌تواند در دمای بالای 40 درجه سانتی‌گراد به گرده افشانی بپردازد در نتیجه نقش مؤثری در گرده‌افشانی درخت خرما در مناطق گرمسیری دارد. بر خلاف زنبورعسل معمولی که در تاریکی فضای کندو، تنه خالی درختان، شکاف سنگها قادر به زندگی است، زنبور عسل کوچک قادر به زیستن در فضای تاریک نیست. منطقه انتشار زنبورعسل کوچک در منطقه غرب آسیا در کشورهایی همانند ایران، عمان، پاکستان، هندوستان، اندونزی،جزیره پاوالان در فیلیپین و همچنین در آفریقای جنوبی و در برخی کشورهای قاره آمریکاست (19). این گونه در ایران در مناطق غربی، جنوبی غربی، جنوبی و گاهی اوقات در جنوب شرق کشور نیز دارای پراکندگیهایی است. مطالعه جمعیتهای جغرافیایی مختلف یک گونه مهم استراتژیک از اهمیت زیادی برخوردار است (4). برای مطالعه جمعیت، روشهای متعددی وجود دارد که امروزه بین محققین سیستماتیک گسترش زیادی یافته است، از جمله آنها می­توان به تنوع ژنتیکی اشاره کرد (5). انعطاف­پذیری فنوتیپی و تغییر پذیری ژنتیکی در صفاتی که برای تشخیص گونه­ها به کار می­رود، می­تواند منجر به شناسایی نادرست شود، اما استفاده از سیستمهای دقیق­تر و سریع­تر جهت شناسایی موجودات زنده، از جمله شناساگرهای مولکولی می­تواند به روند شناسایی نمونه­ها کمک کند (21). در تحقیقات ژنتیکی مرتبط با جانوران، ژنوم میتوکندری ارجحیت بیشتری نسبت به ژنوم هسته دارد (7و23). ژن سیتوکروم­اکسیداز I میتوکندری (سیتوکروم اکسیداز c زیر واحد یک) به عنوان مناسب­ترین ژن برای تحقیقات با شناساگرهای مولکولی جانوری شناخته شده است. در واقع تکامل این ژن به گونه­ای است که قادر می­باشد گونه­های بسیار نزدیک به هم را نیز از هم جدا کند (12). از آنجایی که زنبوران کارگر و نر یک کلنی دی. ان. آی میتوکندری ملکه را به ارث می­برند، بنابراین با استفاده از آنالیز DNA میتوکندری فقط یک زنبور کارگر، اطلاعاتی در مورد اجداد مادری یک کلنی فراهم خواهد شد (6و8).

با توجه به اهمیت اقتصادی زنبورعسل و نظر به اینکه باید هر فعالیتی در جهت حفاظت از جمعیت این حشره مفید صورت گیرد، شناسایی و طبقه‌بندی برای اصلاح و بهبود زنبوران عسل در ایران ضروری است.  با توجه به اینکه تاکنون هیچ گونه تحقیقی در مورد توانایی نواحی ژنی tRNAleu ، ناحیه بین ژنی و بخشی از سیتوکروم­اکسیداز II در تفکیک جمعیتهای مختلف  A.florea انجام نگرفته بود، مقایسه بخشی از ژن سیتوکروم­اکسیداز I و نواحی ژنی tRNAleu ، ناحیه بین ژنی و بخشی از سیتوکروم­اکسیداز II و بررسی خصوصیات ژنتیکی آنها مورد بررسی قرار گرفت. ضمنا نمونه‌های زنبور عسل کوچک جمع‌آوری شده از ایران با جمعیتهای زنبورعسل کوچک واقع در نقاط دیگر جهان و گونه‌های دیگر زنبورعسل مورد مقایسه قرار گرفت تا توانایی این نواحی ژنی در تفکیک جمعیتهای مختلف زنبورعسل کوچک و گونه‌های دیگر زنبورعسل مورد بررسی قرار گیرد.

مواد و روشها

این تحقیق در آزمایشگاههای گروه گیاه پزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه کردستان در طول سالهای 1393 – 1394 انجام شد. توده‌های زنبورعسل کوچک از چهار استان خوزستان (دزفول و آبادان)، بوشهر (بندردیلم و خورموج)، فارس (فیروزآباد و خرم­بید) و هرمزگان (حمیران و بندرعباس)جمع­آوری شد. کد و مختصات جغرافیایی محلهای نمونه­برداری با استفاده از GPS ثبت گردید (جدول 1). جهت نمونه‌برداری از پنبه آغشته به کلروفرم استفاده شد. از هر منطقه‌ نمونه‌ برداری سه شان با فواصل نسبتاً زیاد از یکدیگر به عنوان سه تکرار انتخاب و 50 زنبور کارگر از هر شان نمونه‌برداری شد. سپس زنبورهای بیهوش به ظرف حاوی الکل مطلق منتقل شدند و مشخصات محل جمع‌آوری بر روی ظرف جمع‌آوری، نوشته شد.  نمونه­ها جهت انجام آزمایشات به آزمایشگاه منتقل و در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. به منظور بررسیهای خصوصیات ژنتیکی، استخراج DNA تمامی نمونه­ها به وسیله روش CTABانجام شد (10). کیفیت DNA و آلودگی احتمالی آن با اندازه گیری نسبت جذب نوری در طول موجهای  A260و A280 مورد بررسی قرار گرفت و جهت اطمینان از استخراج DNA ، مقدار 5 میکرولیتر از DNA به همراه 3 میکرولیتر محلول dye در ژل آگارز یک درصد بارگذاری شد. پس از حصول اطمینان از استخراج و کیفیت DNA استخراجی مشاهده شده روی ژل آگارز، واکنش زنجیره­ای پلی­مراز، با استفاده از جفت آغازگرهایی که توالی آن در  جدول 2 آمده است ژنهای سیتوکروم اکسیداز I و نواحی ژنی tRNAleu ، ناحیه بین ژنی و بخشی از سیتوکروم­اکسیداز II انجام شد. در این تحقیق برای انجام واکنش PCR از روش برخی محققین (11، 13) استفاده گردید. به منظور مشاهده قطعات تکثیر یافته مورد انتظار در PCR از ژل آگارز 1 درصد استفاده شد. جهت تعیین توالی نوکلئوتیدی نمونه­ها، 20 میکرولیتر از محصول PCR به شرکت بایونر کره­جنوبی ارسال شد. توالیهای نوکلئوتیدی ژن COI با کدهای MG548252، MG548253، MG548254، MG548255، MG548256، MG548257، MG548258، MG548259 و توالیهای نوکلئوتیدی ژن COII با کدهای MG548260، MG548261، MG548262، MG548263، MG548264، MG548265، MG548266، MG548267 در بانک ژن NCBI به ثبت رسید. همردیف کردن توالیها با استفاده از نرم‌افزار تحت وب MAFFT انجام شد. آنالیزهای فیلوژنتیکی به روش MP به وسیله نرم­افزار  PAUP (V. 4.0b10)  (22) و روش بیزی با استفاده از نرم­افزار MrBayes (V. 3.2.1) و مدل GTR انجام شد (16). همچنین به روش کیمورای دوپارامتری و با نرم افزار MEGA6.0 فواصل ژنتیکی بین توالیهای نوکلئوتیدی مورد بررسی قرار گرفت.

جدول 1- مختصات جغرافیایی محل جمع­آوری توده­های زنبورعسل کوچک (Apis florea) در جنوب و جنوب­غربی ایران

نام منطقه

مختصات جغرافیایی

ارتفاع از سطح دریا (متر)

دزفول

N32º 22' 16.1"

E48º 22' 58.2"

120

آبادان

N30º 22' 45.4"

E48º 17' 39.0"

4

بندر دیلم

N30º 03' 17.0"

E50º 10' 38.7"

11

خورموج

N28º 39' 19.8"

E51º 23' 47.5"

63

فیروز آباد

N28º 51' 39.1"

E52º 29' 59.0"

1286

خرم بید

N30º 16' 21.3"

E53º 15' 05.9"

1904

حمیران

N27º 02' 00.2"

E53º 41' 30.5"

221

 

 

جدول 2- پرایمرهای مورد استفاده در واکنش زنجیره­ای پلی­مراز DNA زنبورعسل کوچک (Apis florea)

ناحیه قابل تکثیر

توالی

بخشی از سیتوکروم­اکسیداز I

5'- ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3' (Forward)

5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3' (Reverse)

tRNAleu، ناحیه بین­ژنی و بخشی از سیتوکروم­اکسیداز II

5'-GGCAGAATAAGTGCATTG-3' (Forward)

5'-CAATATCATTGATGACC-3' (Reverse)

 


نتایج

نتایج حاصل از تکثیر بخشی از ژن سیتوکروم­اکسیداز I به طول 648 جفت باز متعلق به زنبورعسل کوچک (Apis florea) جمع آوری شده از جنوب و جنوب­غربی ایران در شکل‌ 1 نشان داده شده است. نتایج آنالیز توالیهای این ناحیه پس از همردیفی توالیهای هشت جمعیت مورد بررسی جمع آوری شده از ایران نشان داد که نوکلئوتید T با 46/41 درصد بیشترین فراوانی و نوکلئوتید G با 44/10 درصد کمترین فراوانی را داشتند. همچنین در مقایسه جمعیتهای ایرانی با یکدیگر، دو جایگزینی تک نوکلئوتیدی A/G و G/A به ترتیب در فواصل نوکلئوتیدی 65 و 200 پس از پرایمر رفت (forward) وجود داشت (شکل 3). هنگامی که ژن سیتوکروم ­اکسیداز I جمعیتهای زنبورعسل کوچک ایرانی با زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از چین (A.florea JX982136) مورد مقایسه قرار گرفت، 17 جایگزینی نوکلئوتیدی مشاهده گردید که نشان دهنده‌ تفاوت نوکلئوتیدی بالای این دو گروه بود (شکل 3 ). نتایج حاصل از تکثیر توالیهای نواحی ژنی tRNAleu، ناحیه بین ژنی و بخشی از سیتوکروم­اکسیداز II به طول 377  جفت باز در شکل2 نشان داده شده است. مقایسه توالیهای هشت جمعیت مورد بررسی جمع آوری شده از ایران مشخص نمود که نوکلئوتید T با 14/47 درصد بیشترین فراوانی و نوکلئوتید G با 91/5 درصد کمترین فراوانی را داشتند. پس از همردیفی توالیهای جمعیتهای زنبورعسل کوچک ایرانی با یکدیگر فقط یک جایگزینی T/C در فاصله 79 نوکلئوتیدی پس از پرایمر رفت وجود داشت همچنین پس از مقایسه جمعیتهای ایرانی با جمعیت زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از چین (A.florea JX982136) مشخص گردید که در موقعیت 79 نیز جایگزینی نوکلئوتیدی A وجود دارد (شکل 4). مقایسه جمعیتهای ایرانی زنبورعسل کوچک با زنبورعسل کوچک چین نشان داد که ناحیه tRNAleu زنبورعسل کوچک چین یک حذف نوکلئوتیدی A در موقعیت 9 پس از پرایمر رفت دارد. همچنین حذف نوکلئوتیدهای TAA در ناحیه بین ژنی جمعیتهای زنبورعسل کوچک چین در موقعیتهای 69، 70 و 71 مشاهده گردید. به علاوه یک جایگزینی نوکلئوتیدی در جایگاه نوکلئوتیدی 82 (A→T) در ناحیه بین ژنی زنبورعسل کوچک چین وجود داشت. هیچ گونه تفاوت نوکلئوتیدی بین توالیهای سیتوکروم اکسیداز II زنبورهای عسل کوچک جمع‌آوری شده از ایران وجود نداشت ولی مقایسه توالیهای سیتوکروم اکسیداز II زنبورعسل کوچک چین (A.florea JX982136) با جمعیتهای ایرانی نشان داد که چهار جایگزینی G→T، T→C، T→C و A→T  به ترتیب در موقعیتهای نوکلئوتیدی 160، 166، 235 و250 پس از پرایمر رفت وجود دارد (شکل 4).

 

 

 

 

شکل1- عکس ژل حاصل از بارگذاری نتایج حاصل از تکثیر بخشی از ژن سیتوکروم­اکسیداز I زنبورعسل کوچک Apis florea در جنوب و جنوب­غربی ایران. چاهکها به ترتیب از چپ به راست:1- دزفول، 2- آّبادان، 3-فیروزآباد، 4- خرم­بید، 5- حمیران، 6- بندرعباس 7- خورموج، 8-بندردیلم،  خط­کش ژنی bp100

100bp

 

شکل 2- عکس ژل حاصل از بارگذاری تکثیر نواحی ژنی tRNAleu ، ناحیه بین ژنی و بخشی از سیتوکروم­اکسیداز II  زنبورعسل کوچک در جنوب و جنوب­غربی ایران. چاهکها به ترتیب از چپ به راست: 1-­ دزفول، 2- آبادان، 3-فیروزآباد، 4- خرم­بید، 5- حمیران، 6- بندرعباس 7- خورموج، 8-بندردیلم، خط­کش ژنی bp100

 

 

شکل 3- تفاوتهای نوکلئوتیدی حاصل از مقایسه بخشی از توالیهای ژن سیتوکروم­اکسیدازI  هشت جمعیت زنبورعسل کوچک Apis florea)) در جنوب و جنوب­غربی ایران  با جمعیت زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از چین. 1- بندردیلم، 2- خورموج، 3- حمیران، 4- آبادان، 5- بندرعباس، 6-دزفول، 7- فیروزآباد، 8- خرم­بید، 9- جمعیت زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از چین (Apis florea JX982136). موقعیتهای مشخص شده نشان دهنده فاصله از پرایمر رفت است.

 

شکل 4- تفاوتهای نوکلئوتیدی حاصل از مقایسه نواحی ژنی tRNAleu، ناحیه بین ژنی و  بخشی از ژن سیتوکروم­اکسیداز II هشت جمعیت زنبور عسل کوچک (Apis florea) در جنوب و جنوب­غربی ایران با جمعیت زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از چین. 1- بندردیلم، 2- خورموج، 3- حمیران، 4- آبادان، 5- بندرعباس، 6-دزفول، 7- فیروزآباد، 8- خرم­بید، 9- جمعیت زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از چین (Apis florea JX982136). موقعیتهای مشخص شده نشان دهنده فاصله از پرایمر رفت است.

 

توالیهای بخشی از ژن سیتوکرم اکسیداز I مورد بررسی قرار گرفت و پس از همترازی، درخت فیلوژنی ترسیم و مقایسه‌ای بین توالیهای زنبورعسل‌ کوچک جمع‌آوری شده از جنوب غربی و جنوب ایران و توالیهای گونه‌های دیگر زنبورعسل به دست آمده از بانک ژن انجام شد (شکل 5). نتایج نشان داد که نمونه‌های مورد مطالعه در ایران براساس ژن  سیتوکروم ‌اکسیداز  I به سه گروه تقسیم شدند که بر اساس آن  نمونه‌های دیلم، فیروز‌آباد، آبادان و حمیران در گروه اول، نمونه‌های خورموج و بندرعباس در گروه دوم و نمونه‌های دزفول و خرم‌بید در گروه سوم قرار گرفتند. در این بررسی از زنبورعسل معمولی یا اروپایی (Apis mellifera L.) به عنوان گروه خارجی برای ریشه‌دار کردن درخت فیلوژنی استفاده گردید. زنبور عسل ریز (A. andreniformis) نزدیکترین فاصله ژنتیکی را با نمونه‌های زنبورعسل کوچک جمع آوری شده از ایران (79/0 تا 83/0) داشت. همچنین زنبورعسل معمولی (A. mellifera)  بیشترین فاصله ژنتیکی را نسبت A. florea از خود نشان داد (132/0 تا 137/0) (شکل 5).

همچنین مقایسه‌ای بین بخشی از ژن سیتوکروم اکسیداز I زنبورعسل کوچک نمونه‌برداری شده از هشت منطقه ایران و داده­های موجود در پایگاه­ داده­ مرتبط با نمونه‌های زنبورعسل کوچک چین، هند، میانمار، تایلند و ویتنام انجام گرفت. از گونه A. andreniformis به عنوان گروه خارجی استفاده گردید. نتایج نشان داد که نمونه‌های جمع‌آوری شده از ایران نزدیکترین فاصله ژنتیکی را با نمونه‌های هند (IndiaAB284148 و IndiaAB284143) داشتند (003/0 تا 005/0). نمونه­های مربوط به ویتنام (AB284149 و (AB284137 و چین (AB284147) و تایلند DQ016083 و ,(AB284146 درکنار یکدیگر قرار گرفتند. همچنین نمونه‌های میانمار (AB284140 وAB284135) بیشترین فاصله ژنتیکی را با نمونه‌های زنبورعسل کوچک ایران داشتند (031/0 تا 034/0) (شکل6).

 

 

 

 

 

 

شکل 5- دندروگرام حاصل از مقایسه داده­های بخشی از ژن سیتوکروم­اکسیداز I متعلق به هشت جمعیت زنبورعسل کوچک (Apis florea) جمع آوری شده از جنوب و جنوب غربی ایران  با توالیهای گونه‌های دیگر زنبورعسل موجود در پایگاه­ داده­ها. گونه زنبورعسل اروپایی (A. mellifera) به عنوان گروه خارجی ((outgroup در نظر گرفته شد.

 

شکل 6- دندروگرام حاصل از مقایسه توالی بخشی از ژن سیتوکروم­اکسیداز I متعلق به هشت جمعیت زنبورعسل کوچک (Apis florea)جمع آوری شده از جنوب و جنوب غربی ایرانبا توالیهای زنبورعسل کوچک موجود در پایگاه­ داده­ها. گونه زنبورعسل ریز (A.andreniformis) به عنوان گروه خارجی (outgroup) در نظر گرفته شد.

 

توالیهای tRNAleu، ناحیه بین ژنی و بخشی از ژن سیتوکرم اکسیداز II مورد بررسی قرار گرفت و پس از همترازی، درخت فیلوژنی ترسیم و مقایسه‌ای بین توالیهای زنبورعسلهای کوچک جمع‌آوری شده از جنوب غربی و جنوب ایران و توالیهای گونه‌های دیگر زنبورعسل به دست آمده از بانک ژن انجام شد (شکل7). نتایج نشان داد که این نواحی ژنی، جمعیتهای زنبورعسل کوچک ایرانی را به دو گروه تقسیم کردند که شامل دیلم، فیروزآباد و آبادان در گروه اول و خرموج، خرم بید، دزفول، بندرعباس و حمیران در گروه دوم بودند. گونه A. cerana بیشترین فاصله ژنتیکی را از نمونه‌های زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از جنوب ایران نشان دادند (130/0). نمونه‌های زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از چین (A.florea JX982136) کاملاً از زنبورهای عسل کوچک ایران جدا شدند همچنین این نواحی ژنی توانستند زنبورعسل ریز (A.andreniformis) را از A. florea به طور کامل جدا کنند (شکل 7).

 

 

شکل 7- دندروگرام حاصل از مقایسه داده­های tRNAleu، ناحیه بین ژنی و بخشی از ژن سیتوکرم اکسیداز II متعلق به هشت جمعیت زنبورعسل کوچک (Apis florea) جمع آوری شده از جنوب غربی و جنوب ایران با توالیهای گونه‌های دیگر زنبورعسل موجود در پایگاه­ داده­ها. گونه زنبورعسل هندی (A. cerana) به عنوان گروه خارجی ((outgroup در نظر گرفته شد.


بحث

روشهای مولکولی بررسی تنوع و مخصوصاً تنوع DNA میتوکندری می­توانند در بین جمعیتهای زنبورعسل تفاوتها را نشان دهند و روشی برای تمایز آنها از هم باشند. در مطالعه انجام گرفته در این تحقیق، ژنهای مورد استفاده توانستند به خوبی باعث تمایز جمعیتهای مورد مطالعه از همدیگر شوند. پس از انجام بررسیهای مورفومتریک و مولکولی زنبورعسل در مطالعه‌ای مشخص شد که روش مولکولی روش دقیق­تر و مورد اعتماد­تری نسبت به روش مورفومتریک در شناسایی و تشخیص گونه­ها است (18). در بررسی داده‌های مورفولوژیکی، ژنتیکی، رفتاری و اکولوژیکی زنبورعسل کوچک (A.florea) و زنبورعسل ریز (A.andreniformis) در تایلند از مقایسه‌های ژنتیکی ژنهای میتوکندریایی سیتوکروم­ اکسیداز I  و سیتوکروم ­اکسیداز II استفاده شد (9). آنها در این بررسی به این نتیجه رسیدند که این ژن­ها به خوبی می‌توانند جمعیتهای این دو گونه را از یکدیگر تفکیک کنند به طوری که این موضوع نیز در مطالعه حاضر به اثبات رسید. همچنین در تحقیقاتی که محققین بر روی جانوران و با ژنهای مختلف انجام داده­اند، به این نتیجه رسیده­اند که ژن سیتوکروم­اکسیداز I می­تواند یکی از گزینه­های قابل استفاده و قابل اعتماد در تمایز جمعیتها باشد (12). همچنین در بررسیهای انجام شده بر روی موجودات دیگر نیز استفاده از نواحی ژنی میتوکندری مانند نواحی D-loop در تفکیک گونه‌های جنس Rattus spp به کار گرفته شده است (1).

در این تحقیق از بخشی از ژن COI و ناحیه tRNAleu، ناحیه بین ژنی و بخشی از ژن COII برای بررسی توانایی این نواحی ژنی در تفکیک جمعیتهای زنبورعسل استفاده گردید. تاکنون هیچ گونه تحقیقی در مورد توانایی نواحی ژنی tRNAleu، ناحیه بین ژنی و بخشی از ژن COII در تفکیک جمعیتهای زنبورعسل کوچک (Apis florea) انجام نشده بود بنابراین در تحقیق حاضر برای اولین بار این نواحی مورد بررسی قرار گرفت؛ این نواحی به عنوان مهم ترین نواحی ژنی در تفکیک جمعیتها و زیرگونه‌های زنبورعسل اروپایی یا معمولی (Apis mellifera L.) مورد استفاده قرار گرفته است و به اثبات رسیده است که این نواحی ژنی به خصوص ناحیه بین ژنی (بین tRNAleu و COII) نقش مهمی در تفکیک جمعیتها و زیرگونه‌ها دارد (5 و 11). همچنین در تحقیق انجام شده توسط مدبر و ناظمی رفیع (3) از اغلب نواحی ایران نمونه‌های زنبورعسل معمولی جمع‌آوری شد و به اثبات رسید که ناحیه بین ژنی نقش مهمی در تفکیک جمعیتها و زیرگونه‌های زنبورعسل اروپایی دارد به طوری که در مجموع پنج هاپلوتیپ زنبورعسل در نواحی مورد مقایسه در ایران مشاهده شد. یکی از دلایل مهم استفاده از این ناحیه بین ژنی در تفکیک جمعیتهای زنبورعسل این است که جهش می‌تواند در توالی غیر کد کننده، بدون آسیب رساندن به توانایی زنبور عسل تجمع یابد. این ناحیه بین ژنی در بین گونه‌های زنبورعسل تنوع و طول بسیار متفاوتی دارد به طوری که بیشترین طول در زنبور عسل اروپایی (196 تا 642 جفت باز) تا کوچکترین طول در زنبورعسل کوچک (28 تا 39 جفت باز) را دربرمی‌گیرد (14). در تحقیق حاضر و در مقایسه بین توالیهای جمعیتهای زنبورعسل کوچک در برخی نواحی ایران، فقط یک تفاوت نوکلئوتیدی در ناحیه بین ژنی (35 جفت باز) زنبورعسل کوچک (A. florea) مشاهده شد زیرا زنبورعسل کوچک کوتاه ترین ناحیه بین ژنی را در بین گونه‌های دیگر زنبور عسل دارد همچنین هیچ گونه تفاوت نوکلئوتیدی در ناحیه COII و tRNAleu مشاهده نگردید؛ ولی در مقایسه بین جمعیتهای مورد مطالعه در ایران با جمعیت زنبورعسل کوچک جمع‌آوری شده از چین (A.florea JX982136)، تفاوتهای نوکلئوتیدی اعم از جایگرینی و حذف و اضافه (insertion/deletion) نوکلئوتیدی در ناحیه بین ژنی مشاهده شد و نمونه‌های مورد مطالعه کاملاً از جمعیت چین جدا شدند. بنابراین با وجود کوتاه بودن ناحیه بین ژنی زنبورعسل کوچک، این ناحیه نقش موثری در تفکیک جمعیتهای مختلف زنبورعسل کوچک از یکدیگر و حتی گونه‌های دیگر زنبورعسل دارد که این موضوع  نشان‌دهنده توانمندی این نواحی ژنی در تفکیک جمعیتهای مختلف زنبورعسل کوچک می‌باشد.

نتایج مطالعه حاضر نیز مناسب بودن ژن سیتوکروم­اکسیداز I برای مطالعه و تفکیک جمعیتهای مختلف زنبور عسل در ایران را نشان می‌دهد. چنانچه در دندروگرام شکل ۶ به خوبی مشخص است که نه تنها بر اساس این ناحیه ژنی می توان دوگونه بسیار نزدیک زنبورعسل کوچک (A.florea) و زنبورعسل ریز (A.andreniformis) را از یکدیگر تفکیک نمود بلکه به خوبی می‌توان جمعیتهای مختلف زنبور عسل کوچک را از یکدیگر تفکیک کرد. این نتایج نیز تأییدی بر توانمندی ژن سیتوکروم­اکسیداز I برای این نوع مطالعات است. پس از انجام مقایسه بین توالی ژن سیتوکروم­اکسیداز I با سایر توالیهای ثبت شده جمعیتهای مختلف زنبورعسل کوچک در پایگاههای داده به این نتیجه رسیده که گونه زنبورعسل کوچک در نواحی مورد مطالعه ایران در کنار نمونه­های هندوستان قرار گرفت و تمامی نمونه‌های شرق آسیا همانند نمونه­های تایلند، میانمار، چین در کنار هم قرار گرفتند. دلیل این همسایگی را می­توان به فاصله جغرافیایی مناطق مورد مقایسه نسبت داد به­عنوان مثال نمونه­های هند و ایران که از نظر فاصله جغرافیایی به یکدیگر نزدیک­تر بودند در کنار یکدیگر قرار گرفتند. بنابراین جمعیتهایی که دارای فاصله جغرافیایی کمتری نسبت به یکدیگر بودند در یک گروه قرار گرفتند.

بررسی منابع موجود نشان از توافق کلی در رابطه با توانمندی یکسان نشانگرهای ریخت شناختی و مولکولی ندارد. برای مثال بررسی تنوع جمعیتهای زنبورعسل در استان اردبیل  بر اساس نشان­گرهای ریخت­شناسی و ریزماهواره­ها نشان داد که هر دو روش مورفومتریک و مولکولی به خوبی می توانند نژادهای مورد مطالعه را از هم تفکیک کنند و آنها را در گروههای جداگانه­ای قرار دهند (2).  ولی با بررسی رابطه فیلوژنتیکی زنبوران عسل با استفاده از DNA میتوکندری (ژن ND2) و هسته­ای (ژن EF- 1α ) مشخص شد که ژنهای میتوکندریایی توانایی بهتری در تفکیک گونه­ها دارند. به علاوه آنها عوامل طبیعی و جغرافیایی را به عنوان عواملی نام بردند که می­توانند باعث تمایز گونه­ها شوند (5).

داده های حاصل از آنالیز توالی ژن tRNAleu و ناحیه بین ژنی و بخشی از سیتوکروم­اکسیداز II، هشت منطقه مورد مطالعه این جمعیتهای مورد مطالعه را  به دو گروه اصلی تقسیم کرد که شامل دیلم، فیروزآباد و آبادان در گروه اول و خرموج، خرم بید، دزفول، بندرعباس و حمیران در گروه دوم بودند. نوع میزبان گیاهی و شرایط  جغرافیایی و اقلیمی مشابه می­تواند از دلایل شباهت و کنار هم قرار گرفتن این جمعیتها باشد (20). از طرف دیگر عامل حمل و نقل می­تواند به­عنوان یکی از دلایل این گروه‌بندی باشد. همان طور که محققان در سالهای اخیر اذعان نمودند که زنبورعسل کوچک به صورت تصادفی و طبیعی و به طور مداوم از طریق حمل و نقل به سایر نقاط هم امتداد انتقال پیدا کرده است. به عنوان مثال می­توان به جمع­آوری کندوهای زنبورعسل کوچک تشکیل شده بر روی دکل کشتیهایی که از بندر جاکارتا در اندونزی به سمت سودان و اردن در حرکت بودند، اشاره کرد (17). از آنجا که قدرت پرواز این زنبوران بسیار کم و محدود است عوامل فیزیکی مانند کوهستان، دریا، زمینهای بایر و غیره می توانند باعث تفرق و جدایی جمعیتهای مورد مطالعه در نبود عامل حمل ونقل شده باشند (15).

نتیجه گیری کلی

مقایسه توالیهای نوکلئوتیدی جمعیتهای زنبورعسل کوچک جمع آوری شده از ایران و توالیهای نوکلئوتیدی جمعیتهای زنبورعسل کوچک نقاط دیگر دنیا در بانک ژن نشان داد که  tRNAleu، ناحیه بین ژنی و بخشی از سیتوکروم­اکسیداز II  و بخشی از ژن سیتوکروم ­اکسیداز I توانایی تفکیک جمعیتهای مختلف زنبورهای عسل کوچک را دارند.

1- رجبی مهام، ح.، کشتکار، س.، حسن زاده کیابی، ب. و میرزایی، م. 1394. تنوع ژنتیکی جمعیت نزد گونه های جنس Rattus در شهر تهران. مجله پژوهش‌های سلولی و مولکولی، جلد 28، شماره 2، 236-223.

2- زهری، ص.، اصغری، ع. و دادخواه، م. 1392. تنوع جمعیتهای زنبورعسل بر اساس نشانگرهای مورفولوژیکی وریزماهواره­ در استان اردبیل. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی، جلد26، شماره 4، 462-471.

3- مدبر، م.  و ناظمی رفیع، ج. 1395. بررسی خصوصیات مرفومتریک هندسی و ژنتیکی زنبورعسل معمولی (Apis mellifera L.). پایان نامه، دانشگاه کردستان، 90 صفحه.

4- نراقی، م. 1388. زنبورعسل و زنبورداری. انتشارات آییژ، 248 صفحه.

 

5- Arias, M. C.  and Sheppard, W. S. 2005. Phylogenetic relationships of honeybees (Hym.: Apinae: Apini) inferred from nuclear and mitochondrial DNA sequence data. Molecular phylogenetics and evolution, 37(1): 25-35.‏

6- Behura, S. K. 2007. Analysis of nuclear copies of mitochondrial sequences in honeybee (Apis mellifera) genome. Molecular Biology and Evolution, 24: 1492-1505.

7- Dawnay, N., Ogden, R., McEwing, R., Carvalho, G. R. and Thorpe, R. S. 2007. Validation of the barcoding gene COI for use in forensic genetic species identification. Forensic Science International, 173(1): 1-6.‏

8- De la Rúa, P., Jaffé, R., Dall'Olio, R., Muñoz, I. and Serrano, J. 2009. Biodiversity, conservation and current threats to European honeybees. Apidologie, 40(3): 263-284.

9- Deowanish, S., Wattanachaying, W., Wongsiri, S., Oldroyd, B. P., Leepitakrat, S., Rinderer, T. E. and Sylvester, H. A. 2001. Biodiversity of dwarf honeybees in Thailand. In Procceding. Seven International Conference on Tropical Bees, 97-102.

10- Evans, D. J., Schwarz, R. S., Chen, Y. P., Budge, G., Cornman, R. S., Delarua, P., Miranda, J., Foret, S., Foster, L., Gauthier, L., Genersch, E., Gisder, S., Jarosch, A., Kucharski, R., Lopez, D., Lun, D. M., Moritz, R., Maleszka, R., Muñoz, I. and Pinto, M. A. 2013. Standard methods for molecular research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research, 52(4): 8-15.

11- Garnery, L., Vautrin D., Cornuet J. M., and Solignac, M. 1991. Phylogenetic relationships in the genus Apis inferred from mitochondrial DNA sequence data. Apidologie, 22: 87-92.

12- Hebert, P. D., Cywinska, A. and Ball, S. L. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society of London.  Biological Sciences, 270: 313-321.‏

13- Hebert, P. D., Penton, E. H., Burns, J. M., Janzen, D. H. and Hallwachs, W. 2004. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the Neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(41): 14812-14817.

14- Hepburn, R. and Radloff, S. 2011. Honetbees of asia. Springer Heidelberg Dordrecht London New York, P 683.

15- Hepburn, H. R., Radloff, S. E., Otis, G. W., Fuchs, S., Verma, L. R., Ken, T., Chaiyawong, T., Tahmasebi, G., Ebadi, R. and Wongsiri, S. 2005. Apis florea: morphometrics, classification and biogeography. Apidologie, 36: 359-376.

16- Huelsenbeck, J. P. and Ronquist, F. 2001. MrBayes: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics, 17(8): 754-755.‏

17- Mcmillan, A. A. 2005. A provisional Quaternary and Neogene lithostratigraphical framework for Great Britain. Netherlands Journal of Geosciences, 84(2): 87-107.‏

18- Reece, R. J. 2004. Analysis of genes and genomes. John Wiley and Sons, 492 P.

19- Ruttner, F. 1988. Biogeography and taxonomy of honeybee. Springer-Verlag Berlin Germany, 284 P.

20- Smith, M. A., Fisher, B.L. and Hebert, P. D. 2005. DNA barcoding for effective biodiversity assessment of a hyperdiverse arthropod group: the ants of Madagascar. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 360: 1825-1834.

21- Stoeckle, M., Janzen, D., Hallwachs, W., Hanken, j. and Baker. J. 2003. Taxonomy, DNA and the barcode of life. BioScience, 53(9): 1-14.

22- Swofford, D. L. 2003. PAUP*: phylogenetic analysis using parsimony, version 4.0 b10.

23- Wade, N. 2004. A species in a second: promise of DNA barcodes. New York Times. 14 P.