نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه زابل

2 عضو هیئت علمی دانشگاه زابل

چکیده

در این تحقیق سعی شد تا روابط خویشاوندی و فاصله ژنتیکی جمعیت های زیره سبز مورد ارزیابی قرار گیرد. تعداد پنج جمعیت زیره سبز جمع آوری و با استفاده از 10 آغازگر RAPD و 10 آغازگر ISSR بررسی خواهد شد. داده ها با استفاده از نرم افزارهای NTsys pc2.1، GenAlex6.501 و Popgene32 تجزیه و تحلیل خواهند شد. در نشانگر RAPD در مجموع 182 باند تکثیر که آغازگرTIBMBC03 دارای بیشترین تعداد باند (27)، شاخص مارکری (15/12) و شاخص چندشکلی(5/0) و در نشانگر ISSR در مجموع 135 باند تکثیر که آغازگر UBC809 دارای بیشترین تعداد باند (18)، شاخص مارکری(56/7) و شاخص چندشکلی (42/0) بودند. در نشانگر RAPD، بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی (32/0) و شاخص شانن(233/0) متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار و در نشانگر ISSR نیز بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی(18/0) و شاخص شانن(27/0) متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار بود. کمترین میزان تشابه(144/0) بر اساس نشانگر RAPD مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان و در نشانگر ISSR نیز کمترین میزان تشابه (085/0) مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان و همچنین بر اساس اطلاعات حاصل از نشانگر RAPD و ISSR توأم، کمترین میزان تشابه (117/0) مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان بود. در کل نتایج این تحقیق نشان داد که زیره سبز سبزوار به عنوان مرکز تنوع این گیاه بر اساس جمعیت های مورد بررسی پیشنهاد و دورترین جمعیت ها جهت تلاقی های احتمالی و ایجاد تنوع جدید و مفیدتر زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان معرفی می شوند

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Genetic evaluation of different population of Cumin (Cuminum cyminum L.) using DNA molecular markers

نویسندگان [English]

  • leila janipour 1
  • leila fahmideh 2
  • Bahman Fazeli nasab 2

1 University of Zabol

2 University of Zabol

چکیده [English]

in this study tries to kinship and genetic distance between populations is assessed cumin. A total of five population of cumin were collected and then were analyzed using 10 RAPD primers and 10 ISSR primers. To analysis of data will be used NTsys pc2.1, GenAlex6.501 and Popgene32 software. The RAPD primers gave 182 Amplified bands that TIBMBC03 primer had the highest bands (24), marker index (12.15) and diversity index (0.5) and The ISSR primers gave 135 Amplified bands that UBC809 primer had the highest bands (18), marker index (7.56) and diversity index (0.47). In RAPD marker, the highest Nei diversity (0.32) and Shanoon diversity (0.333) was belong to cumin of Sabzvar and also in ISSR marker the highest Nei diversity (0.18) and Shanoon diversity (0.27) was belong to cumin of Sabzvar. According to RAPD marker, the lowest value of similarity (0.114) between Sabzvar and Kashan Cumin and also in ISSR primer, the lowest value of similarity was observed (0.085) between Sabzvar and Kashan Cumin. Moreover, according to both ISSR and RAPD analysis, the lowest genetic similarity was 0.117 between Sabzvar and Kashan Cumin. The results of this study showed that Sabzevar cumin is recommended as a center of plant diversity on the basis of studied populations and the farthest population to earliest possible crosses and create a variety of genetic diversity were cumin of Sabzevar and Kashan.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Genetic diversity
  • Cuminum cyminum
  • RAPD
  • ISSR

ارزیابی ژنتیکی جمعیت‌های مختلف گیاه دارویی زیره سبز با استفاده از نشانگرهای مولکولی DNA 

لیلا جانی پور1. لیلا فهمیده1 و بهمن فاضلی نسب2*

1 زابل، دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی 

2 زابل، دانشگاه زابل، پژوهشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات 

تاریخ دریافت: 24/8/96                تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

ایران یکی از غنی‌ترین منابع گیاهان دارویی جهان به شمار می‌رود که دارای تنوع بالای در شرایط زیستگاهی برای انواع این گیاهان است. بدین منظور در این تحقیق سعی خواهد شد تا روابط خویشاوندی و فاصله ژنتیکی بین جمعیت‌های زیره سبز مورد ارزیابی قرار گیرد. تعداد پنج جمعیت زیره سبز جمع‌آوری و با استفاده از 10 آغازگر RAPD و 10 آغازگر ISSR بررسی خواهد شد. داده‌ها با استفاده از نرم‌افزارهای NTsys pc2.1، GenAlex6.501 و Popgene32 تجزیه‌وتحلیل خواهند شد. در نشانگر RAPD در مجموع 182 باند تکثیر که آغازگر TIBMBC03 دارای بیشترین تعداد باند (27)، شاخص نشانگری (15/12) و شاخص چندشکلی (5/0) و در نشانگر ISSR در مجموع 135 باند تکثیر که آغازگر UBC809 دارای بیشترین تعداد باند (18)، شاخص نشانگری (56/7) و شاخص چندشکلی (42/0) بودند. در نشانگر RAPD، بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی (32/0) و شاخص شانن (233/0) متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار و در نشانگر ISSR نیز بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی (18/0) و شاخص شانن (27/0) متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار بود. کمترین میزان تشابه (144/0) بر اساس نشانگر RAPD مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان و در نشانگر ISSR نیز کمترین میزان تشابه (085/0) مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان و همچنین بر اساس اطلاعات حاصل از نشانگر RAPD و ISSR توأم، کمترین میزان تشابه (117/0) مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان بود. در کل نتایج این تحقیق نشان داد که زیره سبز سبزوار به‌عنوان مرکز تنوع این گیاه بر اساس جمعیت‌های مورد بررسی پیشنهاد و دورترین جمعیت‌ها جهت تلاقی‌های احتمالی و ایجاد تنوع جدید و مفیدتر زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان معرفی می‌شوند.

واژه های کلیدی: تنـوع ژنتیکی، زیره سبز، RAPD، ISSR

* نویسنده مسئول، تلفن: 31232180-054 ، پست الکترونیکی: bfazeli@uoz.ac.ir

مقدمه 

 

ایران یکی از غنی‌ترین منابع گیاهان دارویی جهان به شمار می‌رود که دارای تنوع بالای شرایط زیستگاهی برای انواع این گیاهان است متأسفانه، با وجود بنیان‌گذاران طب سنتی و گیاهی در ایران باستان، هیچ‌گونه کوششی برای پیشرفت در این زمینه صورت نگرفته و فقط فعالیت‌هایی در حد طب سنتی و درمان با مفردات گیاهی آن‌هم به‌صورت خیلی محدود و گاهی نادرست وجود داشته است (36).

با توجه به افزایش سریع جمعیت ایران و نیاز روزافزون صنایع دارویی به گیاهان دارویی به‌عنوان ماده اولیه تولید دارو، ضرورت مطالعه و تحقیق بر روی این دسته از گیاهان بیش از پیش اهمیت یافته است. استفاده مطلوب، منطقی و بهینه از این منابع که به لحاظ فناوری بسیار کم‌هزینه‌تر و ساده‌تر از صنایع دارویی شیمیایی است، می‌تواند ضمن تأمین بخشی از نیازهای عمده بهداشتی و درمانی جامعه از خروج مقادیر متنبهی ارز جلوگیری نموده و مانع گسترش وابستگی به بیگانگان شود. بنابراین با اتخاذ سیاست‌ها و راهکارهای مناسب و مبتنی بر یک شناخت واقع‌گرایانه از وضعیت موجود این منابع و کاربرد روش‌های علمی و صحیح در تمام ابعاد اعم از کاشت، داشت، برداشت و بهره‌برداری صنعتی و اقتصادی آن، چه از طبیعت و چه به‌صورت کشت مکانیزه، می‌توان به درکی واقعی و اصولی در خصوص نقش و بازدهی گیاهان دارویی در جوامع رو به رشدی همچون ایران رسید و علاوه بر حفظ و حراست از این سرمایه‌های ملی به شکوفایی و توسعه پایدار جامعه نیز دست یافت(36).

زیره سبز با نام علمی (cuminum cyminum) از خانواده چتریان (apiaceae) و سرشار از متابولیت­های ثانویه است. زیره سبز گیاهی است یک‌ساله از خانواده‌ی جعفری و ارتفاع آن برحسب شرایط محیطی از 15 تا 50 سانتی‌متر متغیر است (44). زﻳﺮه ﺳﺒﺰ ﺑﻮﻣﻲ ﻣﻨﺎﻃﻖ ﻣﺮﻛﺰی و ﺟﻨﻮﺑﻲ آﺳﻴﺎ بوده و در ﭼﻨﺪ ﻛﺸﻮر از ﺟﻤﻠﻪ ﻫﻨﺪ، ﭘﺎﻛﺴﺘﺎن، ﺗﺮﻛﻴﻪ، اﻳﺮان، ﻣﺼﺮ و اﺳﭙﺎﻧﻴﺎ ﻛﺸﺖ می‌شود این گیاه از لحاظ ارزش اقتصادی مهم‌ترین گیاه دارویی کشور محسوب می‌شود (22). اهمیت اقتصادی زیره سبز به دلیل دارا بودن ویژگی‌های از قبیل فصل رشد کوتاه، نیاز آبی کم، عدم تداخل فصل رشد آن با سایر محصولات کشاورزی، توجیه اقتصادی آن نسبت به دیگر محصولات کشاورزی و دیگر محصولات زراعی و صادراتی بودن آن است (28). اسانس این گیاه شامل ترکیباتی نظیر تانن، رزین، آلورون، سیمن، فلاندون و کارون است. ماده اصلی تشکیل‌دهنده‌ی اسانس آلدهیدکومنیک یا کومینول است (40).

از دلایل اهمیت بررسی تنوع ژنتیکی، استفاده در مدیریت مجموعه‌های ژنتیکی باهدف کاهش هزینه‌ها، افزایش دقت و قابلیت استفاده در برنامه‌های اصلاحی است. بنابراین یکی از پایه‌های اساسی علم اصلاح نباتات به‌ویژه برای گیاهان دارویی، دسترسی و آگاهی از میزان تنوع در مراحل مختلف پروژه‌های اصلاحی است (6).

نشانگرهای مولکولی یک ابزار ارزشمندی را برای توصیف و ارزیابی تنوع ژنتیکی درون گونه‌ها فراهم کرده‌اند به‌طوری‌که نشانگرهای مختلف سطوح مختلفی از تنوع را نشان می‌دهند (17).

 فن RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) از نوع نشانگر مبتنی بر PCR، ارزان، سریع و نیازمند به اطلاعات اولیه در مورد ژنوم مورد نظر نیست. در این روش برخلاف سایر روش‌های مبتنی بر PCR از آغازگر منفرد به طول 1 تا 13 نوکلئونید که توالی آن به‌طور اختیاری تعیین می‌شود استفاده می‌گردد. هر آغازگر بخش قابل توجهی از یک مکان ژنی را تکثیر می‌نماید که به آن DNA چندشکلی تکثیر یافته (RAPD) می‌گویند (48).

فن ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)، یک روش مبتنی بر PCR است که شامل تکثیر یک قطعه DNA موجود در فاصله تکثیر پذیر میان دو ناحیه تکراری ریز ماهواره منحصربه‌فرد با جهات مختلف است. این فن، از ریز ماهواره‌ها (ریز ماهواره) با طول bp 25-16، به‌عنوان آغازگر یک واکنش تک آغازگری که لوکوس­های چندگانه ژنومی را برای تکثیر توالی‌های بین ریز ماهواره‌ای با اندازه‌های مختلف، هدف می‌گیرد بهره می‌برد. تکرارهای ریز ماهواره مورد استفاده به‌عنوان آغازگر، می‌توانند دو، سه، چهار یا پنج نوکلئوتیدی باشند. آغازگرهای مورد استفاده می‌توانند به هر نقطه‌ای از DNA متصل شوند. اگرچه معمولاً در انتهای ׳3 یا ׳5 خود به یک تا چهار باز متصل بوده و بر اساس آن‌ها، گسترش می‌یابند (20).

تاکنون تحقیقات مختلفی در مورد استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR به‌صورت جداگانه جهت بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان مختلف مثل رازیانه (8)، آویشن باغی (4)، آویشن کوهی (51)، نعنا (31)، مریم‌گلی (16)، زیره پارسی(19)، گزنه (9) و زیره سیاه  (13) گزارش‌ شده است.

با توجه به اینکه زیره سبز از مهم‌ترین گیاهان دارویی کشور محسوب و سرشار از متابولیت­های ثانویه است (44) به دلیل دارا بودن ویژگی‌های از قبیل فصل رشد کوتاه، نیاز آبی کم، عدم تداخل فصل رشد آن با سایر محصولات کشاورزی، توجیه اقتصادی آن نسبت به دیگر محصولات کشاورزی و دیگر محصولات زراعی و صادراتی بودن آن است (28).و از لحاظ ارزش اقتصادی مهم‌ترین گیاه دارویی کشور محسوب می‌شود (22) در نتیجه در این تحقیق سعی خواهد شد جمعیت‌های مختلف گیاه دارویی زیره سبز از لحاظ میزان تنوع، شباهت و فاصله ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR مورد ارزیابی قرار گیرند.

مواد و روشها

مواد گیاهی: تعداد 5 جمعیت گیاه زیره سبز از بانک ژن سازمان جنگل‌ها و مراتع کشور تهیه (جدول 1) و با استفاده از نشانگر RAPD و ISSR در آزمایشگاه بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک پژوهشکده زیست‌فناوری کشاورزی دانشگاه زابل در سال 1396 مورد ارزیابی قرار گرفتند.

استخراج و تکثیر DNA : استخراج DNA ژنومی بر مبنای روش دلاپورتا و همکاران (14) به‌ روش تک بوته و از هر جمعیت سه بوته در مجموع پانزده جمیعت انجام شد.

فن RAPD: تعداد 10 آغازگر RAPD که در سایر گیاهان خانواده چتریان جواب داده بودند برای این تحقیق انتخاب (جدول 2) و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بر اساس دستورالعمل ویلیامز و همکاران (48) با کمی تغییر به‌قرار زیر انجام شد: یک میکرو لیتر آغازگرها (10 پیکو مولار) با غلظت نهایی 25/0 میکرو مولار؛ 5/5 میکرو لیتر مستر میکس (x2)(شرکت امپلیکون دانمارک)، 1 میکرو لیتر DNA (10 نانوگرم در میکرو لیتر) و با آب دی یونایزر حجم نهایی تا 15 میکرو لیتر و سپس چرخه حرارتی بدین‌صورت که یک چرخه واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت پنج دقیقه، 40 چرخه (تک‌رشته‌ای شدن DNA در 94 درجه سانتی­گراد به مدت یک دقیقه؛ اتصال آغازگر به DNA تک­رشته­ای در دمای 5/35 درجه به مدت یک دقیقه و بسط آغازگر در 72 درجه سانتی­گراد به مدت دو دقیقه) و یک چرخه بسط نهایی در 72 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. جهت الکتروفورز از ژل آگاروز 5/1 درصد و رنگ­آمیزی با استفاده از ژل رد انجام شد.

فن ISSR : با توجه به اینکه تاکنون هیچ نوع اطلاعاتی مبنی بر شناسایی نشانگرهای ISSR زیره و حتی خانواده چتریان وجود نداشت لذا در این تحقیق از 10 آغازگر ISSR گوجه‌فرنگی استفاده شد (جدول 3). حجم واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز و چرخه‌های حرارتی بر اساس روش یا ترزوپولوس و ببلی (47) با کمی تغییر به شرح زیر انجام شد:

حجم واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 15 میکرو لیتر شامل؛ 1 میکرو لیتر آغازگر (10 پیکو مولار) با غلظت نهایی 25/0 میکرو مولار، 5/7 میکرو لیتر مسترمیکس (امپلیکن دانمارک (x2))، 1 میکرو لیتر DNA (10 نانوگرم در میکرو لیتر) و 5/5 میکرو لیتر آب دی یونایزر و سیکل حرارتی شامل؛ یک چرخه واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتی­گراد واحد به مدت 5 دقیقه؛ 40 چرخه (تک­رشته‌ای شدن DNA در 94 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال آغازگر به DNA تک­رشته­ای در دمای مخصوص (جدول 3) به مدت 1 دقیقه، بسط آغازگر در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5/1 دقیقه) و یک چرخه بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه بود. جهت الکتروفورز از ژل آگاروز 5/1 درصد و رنگ­آمیزی با استفاده از ژل رد انجام شد.

 

 

 

جدول 1- مشخصات جمعیت‌های مورد استفاده در تحقیق 

کد نمونه

اسم فارسی

اسم علمی

محل جمع‌آوری

موقعیت جغرافیایی

1

زیره سبز

Cuminum cyminum

سبزوار

N, 57° 25′ 48″; E, 36° 7′ 12″

2

زیره سبز

Cuminum cyminum

نیشابور

N, 36° 12′ 0″; E, 58° 48′ 0″

3

زیره سبز

Cuminum cyminum

گز بر خوار

N, 51° 23′ 24″; E, 32° 22′ 48″

4

زیره سبز

Cuminum cyminum

اصفهان

N, 51° 39′ 0″; E, 32° 37′ 48″

5

زیره سبز

Cuminum cyminum 

کاشان

N, 51° 34′ 48″; E, 33° 58′ 48″

 

 

جدول 2- نام، توالی و دمای اتصال آغازگرهای RAPD مورد استفاده (48)

دمای اتصال (درجه سانتی­گراد)

توالی ׳3→׳5

نام آغازگر

ردیف

5/35

TGC TCG GCT C

TIBMBA02

1

5/35

GTG CGA GAA C

TIBMBA03

2

5/35

GGA CGA CCG T

TIBMBA06

3

5/35

TCG GCA CCG T

TIBMBB16

4

5/35

ACA CCG TGC C

TIBMBB17

5

5/35

GGC TTG ACC T

TIBMBC03

6

5/35

GAG GCG ATT G

TIBMBC05

7

5/35

GGT CTT CCC T

TIBMBC08

8

5/35

CCT CCA CCA G

TIBMBC12

9

5/35

CTG GTG CTC A

TIBMBC16

10

 

 

جدول 3- نام، توالی و دمای اتصال آغازگرهای ISSR مورد استفاده (47)

دمای اتصال (درجه سانتی­گراد)

توالی ׳3→׳5

نام آغازگر

ردیف

6/47

GACAGACAGACAGACA

UBC-112

1

8/51

GAGAGAGAGAGAGAGAC

UBC-811

2

6/47

ACTGACTGACTGACTG

UBC-820

3

8/51

AGAGAGAGAGAGAGAGC

UBC-808

4

8/51

CACACACACACACACAG

UBC-818

5

9/32

GATAGATAGATAGATA

UBC-872

6

9/32

ATGATGATGATG

UBC-864

7

8/51

AGAGAGAGAGAGAGAGG

UBC-809

8

1/50

ACACACACACACACACT

UBC-857

9

6/47

GACTGACTGACTGACT

UBC-827

10


تجزیه و تحلیل داده­ها: در این تحقیق امتیازبندی الگوهای باندی به‌صورت یک (وجود) و صفر (عدم وجود) برای هر باند انجام شد. صفاتی همچون تعداد باندهای تکثیر شده (AB=Amplified Bands)، تعداد باندهای چندشکل (PB= Polymorphic Bands)، تعداد باند مؤثر (Ne=Effective number of alleles)، درصد چندشکلی (PP= Percent of Polymorphic)، شاخص چندشکلی (DI= Diversity Index)، شاخص شانن (I= Shannon's Information index) و شاخص نی (h= Nei's gene diversity) اندازه­گیری شد. شاخص چندشکلی که میزان آن بین صفر تا یک است (3) با استفاده از فرمول  (Pj فراوانی باند j ام در تمام ژنوتیپ­های مورد ارزیابی) محاسبه شد (11). ضمناً شاخص نشانگری (MI) (24)، شاخص تنوع شانن (26)، شاخص تنوع نی (32) و تنوع بین و درون جمعیتی بر اساس هر دو نشانگر ISSR و RAPD با استفاده از نرم افزار POPGENE 1.32 محاسبه شد.

شاخص نشانگری (Marker Index) نشان‌دهنده‌ی کارایی نشانگر است و با استفاده از فرمول MI=EMR * DI (or PIC) که در آن EMR نسبت چندگانه مؤثر بوده و بیانگر تعداد جایگاه‌های ژنی چند شکل موجود در یک ژنوم است به دست آمد. EMR با استفاده از فرمول EMR= Na * β که در آن Na تعداد مکان‌های چند شکل و ß نیز نسبت مکان‌های چند شکل به تعداد کل مکان‌ها است محاسبه شد (24).

تجزیه خوشه‌ای بر اساس الگوریتم Nj و با استفاده از نرم­افزار Darwin 6.0.12 مبتنی بر ماتریس تشابه نی و لی (33) و جاکارد (21) انجام شد. ضمناً برای هر دندروگرام ضریب کوفنتیک توسط آزمون مانتل با استفاده از نرم­افزار NTSYS-pc v.­2.1 به دست آمد. همچنین به منظور تائید آنالیزهای کلاستر بندی آزمون کوفنتیک و بوتسترپینگ صورت گرفت.

نتایج و بحث

چندشکلی و شاخص چندشکلی: از 10 آغازگر RAPD مورد استفاده در این تحقیق، تعداد 9 آغازگر در تمام زیره­های سبز تکثیر شده و چندشکلی مناسب از خود نشان دادند (شکل 1). در مجموع 182 باند شناسایی شد که آغازگر TIBMBC08 با 3 باند کمترین تعداد و آغازگر TIBMBC03 با 27 باند بیشترین تعداد را در میان باندهای تولیدی توسط هر آغازگر داشتند. میانگین تعداد باند در کل جایگاه­ها برابر 11/13 بود (جدول 4) و با نتایجی که در مطالعات قبلی (36) با میانگین 66/13 برای زیره گزارش شده مشابهت داشت.

در نشانگر RAPD، بیشترین میزان شاخص نشانگری با میزان 15/12 مربوط به آغازگر TIBMBC03 و کمترین میزان شاخص نشانگری با میزان 09/0 مربوط به آغازگر TIBMBC08 و میانگین 4/5 مشاهده گردید. بیشترین میزان شاخص چندشکلی (5/0) مربوط به آغازگر TIBMBB03 و کمترین میزان شاخص چندشکلی (04/0) مربوط به آغازگر TIBMBC08 و با میانگین کل 37/0 مشاهده گردید. بیشترین میزان تعداد باند مؤثره، شاخص تنوع شانن و شاخص تنوع نی به ترتیب 71/1، 58/0 و 41/0 به ترتیب متعلق به آغازگرهای TIBMBB17، TIBMBC05 و TIBMBC08 و کمترین میزان تعداد باند مؤثره، شاخص تنوع شانن و شاخص تنوع نی به ترتیب 47/1، 45/0 و 29/0 متعلق به آغازگر TIBMBB16 بود (جدول 4).

ضمناً تمام 10 آغازگر ISSR مورد استفاده در این تحقیق در تمام زیره­های سبز تکثیر شده و چندشکلی مناسبی از خود نشان دادند (شکل 2). در مجموع 135 باند شناسایی شد که آغازگر UBC112 با 3 باند کمترین تعداد و آغازگر UBC809 با 18 باند بیشترین تعداد را در میان باندهای تولیدی توسط هر آغازگر داشتند. میانگین تعداد باند در کل جایگاه­ها برابر 9/9 بود (جدول 5) و با نتایجی که در مطالعات قبلی (43) از 6 تا 15 باند و میانگین 4/10 گزارش شده بود مشابهت داشت ضمنا چندشکلی بالای ISSR در پزوهش حاضر را میتوان به وسعت مناطق جغرافیایی نمونه برداری شده نسبت داد(1).

 

 

 

 

شکل 1- الگوی نواری تکثیرشده در نشانگر RAPD با استفاده از آغازگر TIBMBC05

(شماره‌ها بیانگر جمعیت­های مورد استفاده و M بیانگر سایز مارکر DM2300)

 

 

 

شکل 2- الگوی نواری تکثیرشده در نشانگر ISSR با استفاده از آغازگر UBC857

(شماره‌ها بیانگر جمعیت­های مورد استفاده و M بیانگر سایز مارکر DM2300)

جدول 4- تعداد باند تکثیرشده (AB)، تعداد باند چندشکلی (PB)، تعداد باند مؤثر (Ne)، درصد چندشکلی (PP)، شاخص چندشکلی (DI)، شاخص شانن (I)، شاخص نی (h) و شاخص نشانگری (MI) در نشانگر RAPD

MI

DI

h

I

PP

Ne

PB

AB

آغازگر

52/3

44/0

3/0

46/0

100

5/1

8

8

TIBMBA02

7

5/0

36/0

54/0

100

62/1

14

14

TIBMBA06

6/3

38/0

29/0

45/0

61/86

47/1

11

13

TIBMBB16

17/8

43/0

40/0

58/0

100

71/1

19

19

TIBMBB17

15/12

45/0

38/0

57/0

100

67/1

27

27

TIBMBC03

15/6

41/0

40/0

58/0

100

69/1

15

15

TIBMBC05

09/0

04/0

41/0

60/0

75

75/1

3

4

TIBMBC08

8/3

38/0

39/0

57/0

100

66/1

10

10

TIBMBC12

18/4

38/0

32/0

49/0

100

54/1

11

11

TIBMBC16

 

در نشانگر ISSR، بیشترین میزان شاخص نشانگری با میزان 56/7 مربوط به آغازگر UB809 و کمترین میزان شاخص نشانگری با میزان 33/0 مربوط به آغازگر UBC112 و میانگین 61/3 مشاهده گردید. بیشترین میزان شاخص چندشکلی (42/0) مربوط به آغازگرهای UBC809 وUBC857  و کمترین میزان شاخص چندشکلی (11/0) مربوط به آغازگر UBC812 و میانگین کل 34/0 مشاهده گردید. بیشترین میزان تعداد باند مؤثره، شاخص تنوع شانن و شاخص تنوع نی به ترتیب 84/1، 64/0 و 45/0 به­ترتیب متعلق به آغازگر UBC808 و کمترین میزان تعداد باند مؤثره، شاخص تنوع شانن و شاخص تنوع نی به­ترتیب 45/1، 41/0 و 27/0 متعلق به آغازگر UBC872 بود (جدول 5).

تاکنون مقادیر مختلفی برای چندشکلی و شاخص چندشکلی گزارش شده است مثلاً عبدالهی مندولکانی(1)، 3/7، بریان و همکاران (12) میانگین 51/0، ماکافری و همکاران (27) از 07/0 تا 8/0 و با میانگین 56/0، پراساد و همکاران (37)، میانگین 9/0 (فقط برای موتیف­های دی نوکلئوتیدی)، ژو و همکاران (52) از 4/0 تا 1 و با میانگین 833/0 و بوهن و همکاران (10) میانگین 3/0 گزارش داده­اند. از تمام نتایج بالا به­علاوه نتایج این تحقیق می­توان نتیجه گرفت که شاخص چندشکلی نمی­تواند عدد ثابتی داشته باشد و بستگی به عواملی مثل تعداد باند تولیدی توسط هر جایگاه داشته و حتی تعداد ژنوتیپ، تعداد آغازگر و شاخص چندشکلی دارند (37). به­طوری­که رادر و همکاران (41) میانگین شاخص چندشکلی را در تحقیقی با 18 ژنوتیپ و 15 آغازگر در گندم را 63/0 و همین مقدار را زمانی که تعداد ژنوتیپ­ها 6 عدد بود 54/0 به­دست آوردند.

نشانگر RAPD نسبت به ISSR از شاخص نشانگری و شاخص تنوع شانن و نی بالاتری برخوردار بود و می­تواند به این دلیل باشد که نشانگر RAPD تصادفی بوده اما نشانگر ISSR نیمه تصادفی و چون نشانگرهای تصادفی معمولاً در صورت تکثیر تعداد باند بیشتر تکثیر می‌کنند در نتیجه RAPD توانسته تعداد باند بیشتر و پیرو آن شاخص نشانگری بالاتری نیز داشته است.

ضریب تشابه: ضریب تشابه ژنتیکی در بین 5 ژنوتیپ زیره سبز مورد استفاده با توجه به کل 182 باند تولیدشده در نشانگر RAPD، بر اساس روش نی و لی (33) محاسبه گردید و بیشترین میزان تشابه مربوط به زیره سبز نیشابور و زیره سبز گز برخوار (526/0) و کمترین میزان تشابه مربوط به ژنوتیپ­های زیره سبز سبز­وار و زیره سبز کاشان (144/0) با میانگین 364/0 مشاهده گردید. از طرفی ضریب تشابه ژنتیکی با توجه به کل 135 باند تولید شده در نشانگر ISSR، بر اساس روش نی و لی (33) نیز محاسبه و بیشترین میزان تشابه مربوط به زیره سبز کاشان و زیره سبز اصفهان (647/0) و کمترین میزان تشابه مربوط به ژنوتیپ­های زیره سبز سبز­وار و زیره سبز کاشان (085/0) با میانگین 323/0 مشاهده گردید؛ اما ضریب تشابه ژنتیکی با توجه به کل 217 باند تولید شده در نشانگر RAPD و ISSR، محاسبه و بیشترین میزان تشابه مربوط به زیره سبز کاشان و زیره سبز اصفهان (547/0) و کمترین میزان تشابه مربوط به ژنوتیپ­های زیره سبز سبز­وار و زیره سبز کاشان (117/0) با میانگین 346/0 به دست آمد (جدول 8).

در نشانگر RAPD، بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانن به ترتیب 32/0 و 233/0 متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار و کمترین میزان شاخص تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانن به ترتیب 21/0 و 23/0 متعلق به جمعیت زیره سبز کاشان بود (جدول 6) و در نشانگر ISSR نیز بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانن به ترتیب 18/0 و 27/0 متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار و کمترین میزان شاخص تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانن به ترتیب 113/0 و 115/0 متعلق به جمعیت زیره گز برخوار بود (جدول 7).

بنا بر نظریه واویلوف، منشأ یا خاستگاه اولیه گیاهان متعلق به مراکزی است که بیشترین تنوع را دارا هستند (2). لذا ضرورت دارد در جمع‌آوری ژرم پلاسم و پیدا کردن ژن­های مفید به زیره سبز سبزوار توجه بیشتری شود.

نتایج حاصل از تجزیه واریانس مولکولی که در آن تغییرات مشاهده شده داخل و بین اجزا جمعیت با استفاده از فاصله­های ژنتیکی دسته‌بندی می­شود محاسبه و بر اساس اطلاعات حاصل از نشانگر RAPD، 79 درصد تغییرات ژنتیکی یافت شده درون جمعیت­ها و 21 درصد در بین جمعیت­ها (جدول 9) و بر اساس اطلاعات حاصل از ISSR، 77 درصد تغییرات ژنتیکی یافت شده درون جمعیت­ها و 23 درصد در بین جمعیت­ها مشاهده شد (جدول 10).

گزارش گردیده که ضریب تشابه تا حدودی تحت تأثیر تعداد ژنوتیپ، تعداد آغازگر و غیره قرار می­گیرد. مثلاً پاراشهر و همکاران (35) در زیره سبز با استفاده از نشانگر ISSR تشابه را از 63/0 تا 94/0، سیدلر و همکاران (46) از 33/0 تا 78/0، بوهن و همکاران (10)، میانگین 57/0، ماکافری و همکاران (27) میانگین 44/0، آگراما و توینسترا (3) میانگین 43/0 به­­دست آوردند.

چندین عامل اکولوژیکی سبب انباشته شدن تفاوت ژنتیکی بین دو جمعیت می­شود. مکان­های جغرافیایی مختلف از نظر برخی ویژگی­های اکولوژیکی از جمله عرض و طول جغرافیایی، دما و رطوبت متفاوت­اند. این عوامل فاکتورهای اکو جغرافیایی خوانده می‌شوند و سبب گوناگونی ژنتیک در بین دو جمعیت می‌شوند. با توجّه به نتایج، استفاده از جمعیت­های مناطق جغرافیایی بیشتر برای تأیید الگوی موجود لازم است.

در گونه‌های دگرگشن به علت ایجاد ترکیبات ژنی جدید، جریان ژنی بالا و فشار شرایط محیطی حاکم بر منطقه، منجر به تثبیت یک سری ژن­های خاص شده لذا فاصله ژنتیکی درون جمعیت­ها پراکنده بوده و در عوض تنوع بین جمعیت نسبتاً کم است (39) اما در گونه‌های خودگشن به دلیل وجود الل­های متفاوت درون هر جمعیت، تغییرات بیشتری درون جمعیت­ها وجود دارد (38) و در کل هم در گیاهان خودگشن و هم دگرگشن در اکثر حالات تنوع درون جمعیت بیشتر از تنوع بین جمعیت بوده ولی این میزان تنوع در گیاهان خودگشن بیشتر از دگرگشن است.

 

 

جدول 5- تعداد باند تکثیرشده (AB)، تعداد باند چندشکلی (PB)، تعداد باند مؤثر (Ne)، درصد چندشکلی (PP)، شاخص چندشکلی (DI)، شاخص شانن (I)، شاخص نی (h) و شاخص نشانگری (MI) در نشانگر ISSR

MI

DI

H

I

PP

Ne

PB

AB

آغازگر

38/2

34/0

45/0

64/0

100

84/1

7

7

UBC808

56/7

42/0

421/0

6/0

100

76/1

18

18

UBC809

07/4

37/0

336/0

51/0

100

55/1

11

11

UBC811

33/0

11/0

329/0

50/0

100

54/1

3

3

UBC112

68/4

39/0

320/0

48/0

100

54/1

12

12

UBC818

6/3

36/0

322/0

49/0

100

51/1

10

10

UBC820

8/1

3/0

374/0

537/0

100

68/1

6

6

UBC827

32/6

42/0

394/0

57/0

11/94

71/1

16

17

UBC857

88/2

36/0

42/0

61/0

100

75/1

8

8

UBC864

48/2

35/0

27/0

41/0

88/88

45/1

8

9

UBC872

 

جدول 6- تعداد کل باندها (AB)، تعداد باند چندشکلی (PB)، درصد چندشکلی (PP)، تعداد باند مؤثر (Ne)، شاخص شانن (I) و شاخص نی (h) در نشانگر RAPD

کد جمعیت

AB

 PB

PP

Ne

h

I

1

182

114

64/62

35/1

32/0

333/0

2

182

89

90/48

2/1

21/0

23/0

3

182

99

40/54

25/1

24/0

26/0

4

182

90

45/49

21/1

25/0

23/0

5

182

110

44/60

379/1

21/0

23/0

 

جدول 7- تعداد کل باندها (AB)، تعداد باند چندشکلی (PB)، درصد چندشکلی (PP)، تعداد باند مؤثر (Ne)، شاخص شانن (I) و شاخص نی (h) در نشانگر ISSR

کد جمعیت

AB

PB

PP

Ne

h

I

1

135

62

93/45

33/1

18/0

27/0

2

135

40

63/29

2/1

131/0

180/0

3

135

21

56/15

07/1

113/0

115/0

4

135

19

07/14

12/1

126/0

129/0

5

135

60

44/44

27/1

162/0

154/0

 

جدول 8- دورترین جمعیت­های زیره سبز مورد استفاده بر اساس ماتریس تشابه به‌دست‌آمده از روش نی و لی و نشانگرهای RAPD، ISSR و توأم

میزان تشابه

نشانگر مورد استفاده

دورترین جمعیت ها

144/0

RAPD

زیره سبز سبزوار- زیره سبز کاشان

085/0

ISSR

زیره سبز سبزوار - زیره سبز کاشان

177/0

ISSR - RAPD

زیره سبز سبزوار - زیره سبز کاشان

جدول 9- تجزیه واریانس مولکولی جمعیت­های زیره سبز بر اساس اطلاعات نشانگر RAPD

                درصد واریانس

میانگین مربعات

مجموع مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

21

**067/60

267/240

4

بین جمعیت

79

**467/33

667/34

10

درون جمعیت

 

 

933/574

14

جمع کل

**: تفاوت معنی دار در سطح یک درصد (P<0.01)

جدول 10- تجزیه واریانس مولکولی جمعیت­های زیره سبز بر اساس اطلاعات نشانگر ISSR

                درصد واریانس

میانگین مربعات

مجموع مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

23

**733/67

933/270

4

بین جمعیت

77

**467/13

667/134

10

درون جمعیت

 

 

600/405

14

جمع کل

**: تفاوت معنی دار در سطح یک درصد (P<0.01)

 

در تحقیق حاضر نتایج تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگر RAPD (تنوع ژنتیکی درون جمعیت ها 79 و تنوع بین جمعیت­ها 21 درصد) و بر اساس ناشنگر ISSRs (تنوع ژنتیکی درون جمعیت ها 77 و تنوع بین جمعیت­ها 23 درصد) بود. وجود تنوع بالا درون جمعیت در گیاهان دیگر با استفاده از نشانگر RAPD (شباهت بیشتر گونه M. piperita را با گونه M. aquatic) (31) و نشانگر ISSR؛ شوید (7)، لاله واژگون (30)، مازودار و وی­ول (5)، نعناع (42)، سیب شرقی (25) و مرزه (23) گزارش شده است

از عوامل مؤثر در توجیه تنوع بیشتر درون جمعیت مواردی از جمله خودگشن بودن گیاه، یک­ساله بودن، ازدیاد با بذر، تعداد مکان­های اللی موردبررسی، موقعیت اللی و ژنوتیپی جمعیت، نوع تلاقی و اندازه جمعیت را می­توان ذکر نمود (36) بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت­ها به دلیل دخالت چندین عامل از جمله پیوستگی، تلاقی خویشاوندی، مهاجرت و تفاوت‌های موجود در افراد تشکیل دهنده جمعیت­ها دارای پیچیدگی­هایی است (29).

در تحقیقی نیز آنالیز واریانس مولکولی تنوع درون و بین جمعیتی سیب شرقی را به­ترتیب 94 و 6 درصد از کل تنوع نشان دادند، که بیانگر تنوع درون جمعیتی قابل ملاحظه در جمعیت­های این گونه بوده و بیان کردند که علی­رغم شرایط رویشگاهی متفاوت و فاصله جغرافیایی زیاد جمعیت­ها از یکدیگر این مسئله می­تواند حاکی از سطح بالای برقراری جریان ژن و تبادل ژنتیکی بین جمعیت­های سیب جنگلی شمال ایران باشد(25).

با توجه به اینکه فاصله ژنتیکی بیشتر در هنگام تلاقی جمعیت­ها یا لاین­ها، سبب افزایش مکان­های ژنی هتروزیگوت و بالا بردن احتمال اثر هتروزیس می­شود (34)؛ و از طرفی فاصله ژنتیکی ممکن است با صفات مطلوب مرتبط باشد در نتیجه می­توان پس از بررسی­های بیشتر، از آن­ها در برنامه­های بهنژادی استفاده کرد(7). لذا بر این اساس چون کمترین میزان تشابه مربوط به جمعیت­های تربچه French breakfast و Vikima بوده و یشترین تنوع درون جمعیتی مربوط به جمعیت French breakfast  بود در نتیجه می­توان ذکر کرد که جهت هر نوع تلاقی و اصلاح گیاه دارویی تربچه بهتر است جمعیت French breakfast به عنوان یکی از پایه­های پدری یا مادری و یا دهنده ژن انتخاب کرد.

تجزیه خوشه­ای: تجزیه خوشه­ای در روش RAPD، ISSR و توام، جمعیت­های زیره سبز را در سه گروه مختلف طبقه­بندی کرده و مشاهده شد جمعیت­ها از لحاظ موقعیت جغرافیایی از همدیگر تفکیک شدند (شکل 3، 4 و 5). در گروه اول جمعیت­های زیره سبز نیشابور، سبز­وار قرار گرفتند و در گروه دوم جمعیت زیره سبز گز برخوار و در گروه سوم جمعیت­های زیره سبز اصفهان و کاشان قرار گرفتند که در هر سه گروه جمعیت­های که از لحاظ موقعیت جغرافیایی نزدیک به هم بودند در یک گروه قرار گرفتند. لازم به ذکر است که جمعیت زیره سبز گز برخوار که در یک گروه جداگانه قرار گرفته دارای بیشترین میزان باند تکثیری در بین تمام جمعیت­ها بود (داده نشان داده نشده است).

نتیجه گیری

با توجه به اینکه RAPD و ISSR دو نشانگر غالب بوده و بر اساس کم هزینه و آسان بودن جهت انجام و قابلیت تکرار بودن ISSR در آزمایشگاه­های مختلف نسبت به RAPD، از این دو نشانگر بسیار در تحقیقات مختلف استفاده شده است و از طرفی برخی محققین دریافته­اند که ISSR الگوی نشانگر پیچیده­تری نسبت به RAPD تولید می­کند (45, 49, 50, 53) و همچنین برخی دیگر نیز دریافته­اند که RAPD الگوی نشانگر پیچیده­تری تولید می­کند (15, 18, 24) در این تحقیق نیز تا حدودی RAPD نسبت به ISSR تنوع بیشتری تولید نمود.

یکی دیگر از اهداف این تحقیق انتخاب دورترین جمعیت­ها جهت تلاقی­های احتمالی و ایجاد تنوع جدید و مفیدتر است که زیره سبز سبز­وار و زیره سبز کاشان دورترین جمعیت­ها بودند. همچنین بر اساس شاخص­های تنوع شانن و نی، سبزوار به عنوان مرکز تنوع این گیاه بر اساس جمعیت­های مورد بررسی پیشنهاد می­گردد.

لازم به ذکر است که آغازگرهای ISSR که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت برگرفته از گوجه فرنگی (47) بودند و توانستند در زیره سبز نیز تکثیر شوند که این خود می­تواند دلیلی بر روند تکاملی و مناطق حفاظت شده مشترک بین زیره سبز و گوجه­فرنگی باشد.


 

 

 

شکل 3- تجزیه خوشه­ای جمعیت­های زیره سبز بر اساس نشانگر RAPD، ماتریس تشابه نی و لی و روش NJ با نرم افزار Darwin.

 

 

شکل 4- تجزیه خوشه­ای جمعیت­های زیره سبز بر اساس نشانگر ISSR، ماتریس تشابه نی و لی و روش NJ با استفاده از نرم افزار Darwin

 

شکل 5- تجزیه خوشه­ای جمعیت­های زیره سبز بر اساس نشانگر RAPD و ISSR، ماتریس تشابه نی و لی و روش NJ با استفاده از نرم افزار Darwin

منابع 

1- Abdollahi Mandoulakani B, Azizi H (2014) Identification of ISSR markers associated with morphological traits in cultivated alfalfa (Medicago sativa L.) populations. Journal of Cellular and Molecular Researches 27: 260-268. 27210

2- Adams RP (2007) Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectrometry. Allured publishing corporation.

3- Agrama H, Tuinstra M (2003) Phylogenetic diversity and relationships among sorghum accessions using SSRs and RAPDs. African journal of biotechnology 2: 334-340.

4- Alamdary SBL, Safarnejad A, Nematzadeh GA (2012) Using RAPD Marmer For Genetic Diversity Assessment of Several Thymus Species. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research 20: 192-201.

5- Alikhani L, Rahmani MS, Shabanian N, Badakhshan H, Khadivi-Khub A (2014) Genetic variability and structure of Quercus brantii assessed by ISSR, IRAP and SCoT markers. Gene 552: 176-183. 10.1016/j.gene.2014.09.034

6- Avise JC (2012) Molecular markers, natural history and evolution. Springer Science & Business Media.

7- Bahari Z, Shojaeiyan A, Rashidi Monfared S, Mirshekari A, Nasiri K, Amiriyan M (2015) Investigation of Genetic Diversity among Some Iranian Dill (Anethum graveolens L.) Landraces, Using ISSR Markers. Journal of Plant Genetic Research 2: 11-22.

8- Bahmani K, Noori SAS, Darbandi AI, Akbari A (2015) Molecular mechanisms of plant salinity tolerance: a review. Australian Journal of Crop Science 9: 321.

9- Bharmauria V, Narang N, Verma V, Sharma S (2009) Genetic variation and polymorphism in the Himalayan nettle plant Urtica dioica based on RAPD marker. Journal of Medicinal Plants Research 3: 166-170.

10- Bohn M, Utz HF, Melchinger AE (1999) Genetic similarities among winter wheat cultivars determined on the basis of RFLPs, AFLPs, and SSRs and their use for predicting progeny variance. Crop Science 39: 228-237.

11- Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American journal of human genetics 32: 314-322.

12- Bryan G, Collins A, Stephenson P, Orry A, Smith J, Gale M (1997) Isolation and characterisation of microsatellites from hexaploid bread wheat. Theoretical and Applied Genetics 94: 557-563.

13- Dehghan-kohestani S, Amin-Baghizadeh A, Ranjbar GA, Babaeian-jelodar N (2008) Genetic diversity of germplasm cumin [Bunium persicum (Boiss.) B. Fedtsch.] Kerman province using molecular markers RAPD. Quarterly Scientific-Research Medicinal and Aromatic Plants of Iran 24: 414-427.

14- Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB (1983) A plant DNA minipreparation: version II. Plant molecular biology reporter 1: 19-21.

15- Domblides A, Domblides E, Kharchenko V, Potekhin G (2010) Study of genetic variation among parsley (Petroselinum Crispum (Mill.) Nym.) samples using RAPD and ISSR markers. Moscow University biological sciences bulletin 65: 152-154.

16- Echeverrigaray S, Agostini G (2006) Genetic relationships between commercial cultivars and Brazilian accessions of Salvia officinalis L. based on RAPD markers. Revista Brasileira de Plantas Medicinais 8: 7-13.

17- Fazeli-Nasab B, Naghavi MR (2011) Identification of Rust resistance among wheat cultiras using SSRs markers. Daneshe Zeraat 3: 79-88.

18- Gajera BB, Kumar N, Singh AS, Punvar BS, Ravikiran R, Subhash N, Jadeja GC (2010) Assessment of genetic diversity in castor (Ricinus communis L.) using RAPD and ISSR markers. Industrial Crops and Products 32: 491-498. 10.1016/j.indcrop.2010.06.021

19- Hashemi H, Safarnejad A (2010) The use of RAPD markers dor assessing the genetic diversity of Bunium persicum (Boiss) B. FEDTSCH populations. International Journal of Science and Nature 1: 202-208.

20- Innark P, Ratanachan T, Khanobdee C, Samipak S, Jantasuriyarat C (2014) Downy mildew resistant/susceptible cucumber germplasm (Cucumis sativus L.) genetic diversity assessment using ISSR markers. Crop Protection 60: 56-61. 10.1016/j.cropro.2014.03.003

21- Jaccard P (1912) The distribution of the flora in the alpine zone. New phytologist 11: 37-50.

22- Kafi M, Rashed Mohasel MH, Kochaki A, Mplafiaei A (2002) Cumin, produced and production technology. Ferdowsi University of Mashhad Institute Press: 200.

23- Kameli M, Hesamzadeh S, Ebadi M (2013) Assessment of genetic diversity on populations of three satureja species in Iran using ISSR markers. Annals of Biological Research 4: 64-72.

24- Khaled AGA, Motawea MH, Said AA (2015) Identification of ISSR and RAPD markers linked to yield traits in bread wheat under normal and drought conditions. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 13: 243-252. 10.1016/j.jgeb.2015.05.001

25- khodadoost a, yousefzadeh h, amirchakhmaghi n, Abdollahi h, hoseinzadeh a (2017) Genetic diversity of Malus orientalis in Hyrcanian forest using ISSR-PCR markers. Journal of Cellular and Molecular Researches 29: 359-369.

26- Lewontin RC (1972) The apportionment of human diversity. In: Evolutionary biology. (ed)^(eds). Springer. pp. 381-398.

27- Maccaferri M, Stefanelli S, Rotondo F, Tuberosa R, Sanguineti MC (2007) Relationships among durum wheat accessions. I. Comparative analysis of SSR, AFLP, and phenotypic data. Genome 50: 373-384. 10.1139/g06-151

28- Meghdadi N, Kamkar B (2011) Land suitability analysis for Cumin production in the North Khorasan province (Iran) using Geographical Information System. Int J Agri Crop Sci 3: 105-110.

29- Mohammadi SA, Prassana BM (2003) Analysis of genetic diversity in crop plants-Salient statistical tools and considerations. Crop Science 43: 1235-1248.

30- Momeni H, Shiran B, Khodambashi M, Cheghamirzaei K (2013) Studying of genetic diversity in some population of Fritillaria imperialis L. in Iranian Zagros region using ISSR marker and morphological traits. Iranian journal of horticulture 44: 61-72.

31- Momeni S, Shiran B, Razmjoo K (2006) Genetic variation in Iranian mints on the bases of RAPD analysis. Pakistan Journal of Biological Sciences 9: 1898-1904.

32- Nei M (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences 70: 3321-3323.

33- Nei M, Li W-H (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences 76: 5269-5273.

34- Olfati JA, Samizade H, Peyvast GA, Rabiei B, Khodaparast SA (2012) Rleationship between genetic distance and heterosis in cucumber. International Journal of plant breeding 6: 21-26.

35- Parashar M, Jakhar M, Malik C (2014) A review on biotechnology, genetic diversity in cumin (Cuminum cyminum). International Journal of Life Science and Pharma Research 4: L17-L34.

36- Pejmanmehr M, Hasani MA, Fakhr-Tabatabai SM, Hadian J (2009) Genetic diversity and segregating of populations Zyrh English (Bunium persicum (Boiss)) using molecular markers RAPD. Journal of Environmental Sciences 7: 63-76.

37- Prasad M, Varshney R, Roy J, Balyan H, Gupta P (2000) The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity in wheat. Theoretical and Applied Genetics 100: 584-592.

38- Rao VR, Hodgkin T (2002) Genetic diversity and conservation and utilization of plant genetic resources. Plant cell, tissue and organ culture 68: 1-19.

39- Rauf S, Teixeira da Silva J, Khan AA, Naveed A (2010) Consequences of plant breeding on genetic diversity. International Journal of plant breeding 4: 1-21.

40- Rios J, Recio M (2005) Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of ethnopharmacology 100: 80-84.

41- Roder MS, Plaschke J, König SU, Börner A, Sorrells ME, Tanksley SD, Ganal MW (1995) Abundance, variability and chromosomal location of microsatellites in wheat. Molecular and General Genetics MGG 246: 327-333.

42- Rodrigues VF, Oliveira RR, Vega MR (2014) A new isocoumarin from Cajanus cajan (Fabaceae). Natural product communications 9: 493-494.

43- Rostami-Ahmadvandi H, Cheghamirza K, Kahrizi D, Bahraminejad S (2013) Comparison of morpho-agronomic traits versus RAPD and ISSR markers in order to evaluate genetic diversity among Cuminum cyminum L. accessions. Australian Journal of Crop Science 7: 361.

44- Salamati M, Zeinali H (2013) Evaluation of genetic variation in different populations of Cuminum cyminum L. using morphological traits. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants 29: 51-61.

45- Sarwat M, Das S, Srivastava P (2008) Analysis of genetic diversity through AFLP, SAMPL, ISSR and RAPD markers in Tribulus terrestris, a medicinal herb. Plant cell reports 27: 519-528.

46- Seidler-Łożykowska K, Kuczyńska A, Mikołajczyk K, Nowakowska J, Bocianowski J (2014) Estimation of genetic distance among genotypes of caraway (Carum carvi L.) using RAPD-PCR. Acta Scientiarum Agronomy 36: 183-188.

47- Terzopoulos P, Bebeli P (2008) DNA and morphological diversity of selected Greek tomato (Solanum lycopersicum L.) landraces. Scientia Horticulturae 116: 354-361.

48- Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic acids research 18: 6531-6535.

49- Yang K-j, Zhang X-p, Zhang Z-x, Gong Y-x (2007) Analysis of actuality of Emmenopterys henryi community in Tiantangzhai of Anhui Province. Journal of Plant Resources and Environment 16: 79.

50- Ye Y, Zhang J, Ning G, Bao M (2008) A comparative analysis of the genetic diversity between inbred lines of Zinnia elegans using morphological traits and RAPD and ISSR markers. Scientia Horticulturae 118: 1-7.

51- Zabeti SM, Ismaeili A, Madah-arefi H, Nazaryan-firouzabadi F, Rezaeinezhad A, Mojori F (2013) Genetic diversity thyme, Thymus Pubescens based on indicator species RAPD. New Journal of Cellular and Molecular Biology Biotechnology 4: 25-31.

52- Zhou H-f, Xie Z-w, Ge S (2003) Microsatellite analysis of genetic diversity and population genetic structure of a wild rice (Oryza rufipogon Griff.) in China. Theoretical and Applied Genetics 107: 332-339.

53- Zinodini A, Farshadfar M, Safari H, Moradi F, Shirvani H (2013) Study of Genetic Relationships of Some Mint Species Using R-ISSR Markers. Crop Biotechnology 5: 11-21.