نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

2 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد گرگان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

3 کمیته تحقیقات دانشجویی دانشگاه علوم پزشکی گلستان

4 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

5 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده علوم پایه، گروه زست شناسی

چکیده

پکتینازها گروهی از آنزیم‌های پکتولیتیک هستند که باعث هیدرولیز پکتین موجود در بافت‌های گیاهی می‌شوند. این آنزیم‌ها از مهمترین آنزیم‌های مورد استفاده در صنایع غذایی جهت فرآوری آبمیوه، چای، قهوه و روغن هستند. یک منبع کارآمد جهت تولید صنعتی آنزیم، باکتری‌ها هستند. مطالعۀ حاضر با هدف جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های تولیدکنندۀ آنزیم پکتیناز از خاک حاوی ضایعات انجام گرفت. در این مطالعه از خاک حاوی ضایعات مرکبات در چندین منطقۀ استان گلستان نمونه‌برداری شد. جهت جداسازی باکتری‌های مولد پکتیناز، از محیط تغییر یافتۀ پکتین استفاده شد. فعالیت پکتیناری باکتری‌ها بر اساس تشکیل هالۀ شفاف در اطراف کلنی‌ها متعاقب اضافه کردن محلول لوگل مشخص گردید. جدایه‌ها با فعالیت پکتینازی مطلوب، با استفاده از روش تعیین توالی قطعۀ16S rRNA شناسایی شدند. از 50 نمونه خاک، تعداد 20 باکتری با فعالیت پکتینازی جداسازی شد که تمامی آنها تا سطح جنس و گونه شناسایی گردید. از این بین، 2 جدایه با توجه به بزرگتر بودن قطر هالۀ اطراف کلنی، فعالیت پکتینازی بیشتری را نسبت به بقیه داشتند. بررسی مولکولی نشان داد که این جدایه ها منسوب به دو گونۀ باسیلوس سرئوس و باسیلوس سوبتیلیس می‌باشند. در مطالعۀ حاضر دو گونۀ باکتری با توانایی مطلوب در تولید پکتیناز، جداسازی و معرفی شد. تحقیقات بیشتری برای دستیابی به شرایط بهینه تولید و کینتیک موثر این آنزیم توسط جدایه‌های مذکور مورد نیاز است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Isolation and molecular identification of Bacillus cereus and Bacillus subtilis as pectinase-producing bacteria from various regions of Golestan province

نویسندگان [English]

  • Rasoul Mohammadi 1
  • Tina Dadgar 2
  • Hamidreza Pordeli 2
  • Sajjad Yazdansetad 3
  • Reza Najafpour 4
  • Elika Faraj Tabrizi 5

1 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Damghan Branch, Semnan, Iran

2 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Gorgan Branch, Golestan, Iran

3 Student Research Committee, Golestan University of Medical Sciences, Gorgan, Iran

4 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Qom Branch, Qom, Iran

5 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Qom Branch, Qom, Iran

چکیده [English]

Pectinases belong to the pectolytic enzymes which breakdown pectin polysaccharide present in plant tissues. Pectinase enzymes are the most widely used in food industries to produce fruit juice, tea, coffee, and oil. Bacteria are interesting sources in production of industrial enzymes. The aim of the present study was to isolate and molecular identify pectinase enzyme producing bacteria from soil. In this study, soil samples containing citrus peels were collected from some regions of Golestan province. The optimized pectin agar medium was used to isolate pectinase producing bacteria. Pectinase activity was indicated by the diameter of clear, hydrolyzed zones on the medium plates containing citrus pectin by adding Lugol's iodine. Bacterial isolates with higher pectinase activity were identified by 16S rRNA sequencing method. 20 out of 30 bacterial isolates revealed pectinase activity. All of the isolates were identified based on biochemical tests. Among them, 2 isolates had higher pectinase activity with regard to increase in the diameter of clear zone. Molecular studies indicated that the isolates were Bacillus cereus and Bacillus subtilis. In this study, two species of bacteria were introduced with suitable ability in pectinase production. Further studies are needed to assay the enzyme kinetics under a set of several constraints.

کلیدواژه‌ها [English]

  • pectinase
  • pectin
  • pectin agar medium
  • Bacillus

جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های باسیلوس سرئوس و باسیلوس سوبتیلیس به عنوان تولیدکنندۀ آنزیم پکتیناز از مناطق مختلف استان گستان 

رسول محمدی1، تینا دادگر2، حمیدرضا پردلی2، سجاد یزدان­ ستاد3*، رضا نجف­پور4 و الیکا فرج تبریزی4

1 دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب­شناسی

2 گرگان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد گرگان، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب­شناسی

3 گرگان، دانشگاه علوم پزشکی گلستان، کمیته تحقیقات دانشجویی

4 قم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب­شناسی 

تاریخ دریافت: 19/1/95                تاریخ پذیرش: 11/7/95

چکیده

پکتینازها گروهی از آنزیم­های پکتولیتیک هستند که باعث هیدرولیز پکتین موجود در بافت­های گیاهی می­شوند. این آنزیم­ها از مهمترین آنزیم­های مورد استفاده در صنایع غذایی جهت فرآوری آبمیوه، چای، قهوه و روغن هستند. یک منبع کارآمد جهت تولید صنعتی آنزیم، باکتری­ها هستند. مطالعۀ حاضر با هدف جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های تولیدکنندۀ آنزیم پکتیناز از خاک حاوی ضایعات انجام گرفت. در این مطالعه از خاک حاوی ضایعات مرکبات در چندین منطقۀ استان گلستان نمونه­برداری شد. جهت جداسازی باکتری­های مولد پکتیناز، از محیط تغییر یافتۀ پکتین استفاده شد. فعالیت پکتیناری باکتری­ها بر اساس تشکیل هالۀ شفاف در اطراف کلنی­ها پس از اضافه کردن محلول لوگل مشخص گردید. جدایه­ها با فعالیت پکتینازی مطلوب، با استفاده از روش تعیین توالی قطعۀ16S rRNA  شناسایی شدند. از 50 نمونه خاک، تعداد 20 باکتری با فعالیت پکتینازی جداسازی شد که تمامی آنها تا سطح جنس و گونه شناسایی گردید. از این بین، 2 جدایه با توجه به بزرگتر بودن قطر هالۀ اطراف کلنی، فعالیت پکتینازی بیشتری را نسبت به بقیه داشتند. بررسی مولکولی نشان داد که این جدایه ها منسوب به دو گونۀ باسیلوس سرئوس و باسیلوس سوبتیلیس می­باشند. در مطالعۀ حاضر دو گونۀ باکتری با توانایی مطلوب در تولید پکتیناز، جداسازی و معرفی شد. تحقیقات بیشتری برای دستیابی به شرایط بهینه تولید و کینتیک موثر این آنزیم توسط جدایه­های مذکور مورد نیاز است.

واژه­های کلیدی: پکتیناز، پکتین، محیط پکتین آگار، باسیلوس

* نویسنده مسئول، تلفن: 02332342027 ، پست الکترونیکی: sajjad.yazdansetad@gmail.com

مقدمه

 

پکتین، پلیمر ناهمگون متشکل از واحدهای اسید گالاکترونیک است که با گروه­های متیل استریفیه شده و به فرم زنجیره­های خطی با پیوندهای گلیکوزیدی آلفا [1-4]  در کنار هم قرار گرفته است. پکتین در ساختار جدار سلولی و فضای بین سلولی گیاهان عالی وجود دارد و تعیین کنندۀ استحکام و شکل ظاهری آنها است (3).

پکتین با تغییر چارچوب اصلی به 4 فرم پروتوپکتین (Protopectin)، اسید پکتیک (Pectic acid)، اسید پکتینیک (Pectinic acid) و پلی متیل اسید گالاکترونیک (Poly-D-galacturonic acid methyl ester) دیده می­شود.

پروتوپکتین، فرم نامحلول پکتین است و در میوه­های نارس وجود دارد و با اتصال به سلولز موجب استحکام بافت گیاه می­شود. با رسیدن میوه و ترشح آنزیم پکتیناز، پروتوپکتین تبدیل به اسید پکتیک می­شود. اسید پکتیک، پلیمر محلول متشکل از گالاکتورونان با تعداد کمی از گروه متوکسیل است. اسید پکتینیک، گالاکتورونان­هایی با میزان متغیر متوکسیل که متیلاسیون اسید گالاکتورونیک در آن از صفر تا 75 درصد است. پلی متیل گالاکتورونات، پکتین حاوی پلی گالاکتورونیک اسید با متیل استرهای موضعی و نمک‌های سدیم، آمونیوم و پتاسیم است (5 و14).

آنزیم­های تجزیه کنندۀ پکتین (پکتولیتیک) شامل سه گروه آنزیمی پکتین استراز، پلی گالاکتوروناز و پکتین لیاز است که به مجموعۀ آنها، پکتیناز گفته می­شود. پکتین استراز (پکتین متیل هیدرولاز) با جدا کردن گروه متوکسیل از پکتین و آزادسازی اسید پکتیک و متانول، باعث هیدرولیز پیوندهای استری می­گردد. پلی­گالاکتوروناز پیوندهای گلیکوزیدی آلفا [1-4] واحدهای D-گالاکتورونیک اسید را هیدرولیز می­کند. پلی­گالاکتوروناز دو فرم هیدولیز دارد: یک نوع آنزیم، پیوند گلیکوزیدی را در یک زنجیره مولکولی عاری از گروه متوکسیل می­شکند و نوع دیگر، اتصال­های گلیکوزیدی در زنجیره­های حاوی گروه متوکسیل را هیدرولیز می­کند. پکتین لیاز با جدا کردن دو اتم هیدروژن از کربن­های شماره چهار و پنج و ایجاد یک پیوند دوگانه میان این دو اتم کربن، باعث شکستن پیوندهای گلیکوزیدی می­شود (16).

پکتیناز یکی از اولین آنزیم­هایی است که در صنعت مورد استفاده قرار گرفت. امروزه، تقریباً 10% از کل فروش آنزیمی جهان به پکتینازها اختصاص دارد. کاربرد تجاری این آنزیم اولین بار در سال 1930 جهت تهیۀ سرکه و آبمیوه بود. پکتیناز پرکاربردترین آنزیم­ مورد استفاده در صنایع غذایی جهت فرآوری آبمیوه، چای، قهوه و روغن است. در فرآوری آبمیوه، اضافه کردن این آنزیم قبل از فرایند پرس کردن میوه، اثرات نامطلوب کدورت و ویسکوزیته ناشی از وجود پکتین را رفع و موجب شفاف سازی آبمیوه می­شود (11). این آنزیم در صنایع دارویی جهت فرآوری و استحصال دارو و در صنایع چوب و نساجی جهت استخراج کنف و کتان از چوب نیز استعمال دارد (10).

آنزیم­های پکتولیتیک در طبیعت توسط باکتری­ها، قارچ­ها و مخمرها تولید می­شوند (3). پکتینازهای اسیدی عمدتاً منشا قارچی و پکتینازهای قلیایی منشا باکتریایی دارند. باکتری­های جنس سودوموناس (Pseudomonasفلاوباکتریوم (Flovobacteriumاروینیا (Erwinia) و زانتوموناس (Xanthomonas) مهمترین تجزیه کنندگان پکتین هستند. تعدادی از باکتری­های بی­هوازی نیز معمولاٌ قندها و اسیدهای قندی پکتین را به الکل و اسیدهای ضعیف تبدیل می­کنند که مهمترین آنها کلستریدیوم پکتینووروم (Clostridium pectinovorom) و کلستریدیوم فلسی­نئوم (Clostridium felsineum) هستند. فعال­ترین تجزیه کنندگان پکتین باسیلوس­های اسپوردار مانند باسیلوس پلی­میگزا (Bacillus polymyxa) و باسیلوس ماسرانس (Bacillus macerans) می­باشند (1). 

با توجه به کاربردهای تجاری پکتیناز، سالانه هزینه­های زیادی صرف خرید و واردات این آنزیم در کشور می­شود. بومی­سازی تولید آنزیم از منابع موجود نیازمند مطالعات راهبردی است. در این راستا، مطالعه حاضر با هدف جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های باسیلوس سرئوس و باسیلوس سوبتیلیس به عنوان تولید کنندۀ آنزیم پکتینازی از مناطق مختلف استان گلستان انجام گرفت.

مواد و روشها

نمونه­برداری و جداسازی باکتری­ها: نمونه­برداری از اعماق 30-0 سانتی­متری خاک­ مناطق آزادشهر، دلند، خان­بین و گرگان در استان گلستان که عموماً حاوی ضایعات مرکبات بود، انجام گرفت. برای جداسازی باکتری­های مولد پکتیناز، 50 نمونۀ خاک بررسی شد. از نمونه­های خاک با روش رقیق­سازی سریالی، رقت­های متوالی از 1-10 تا 6-10 تهیه شد. از محتویات لوله­ها بصورت جداگانه در محیط کشت اختصاصی پکتین آگار بهینه شده (پکتین مرکبات 1 درصد، سولفات آمونیوم 14/0 درصد، پتاسیم هیدروژن فسفات 2/0 درصد، سولفات منیزیم 7 آبه 02/0 درصد، محلول مغزی 10 درصد، سولفات آهن 7 آبه 5 میلی­گرم بر لیتر، سولفات منگنز یک آبه 6/1 میلی­گرم بر لیتر، سولفات منگنز 7 آبه 4/1 میلی­گرم بر لیتر، کلرید کلسیم 2 میلی­گرم بر لیتر و آگار 2 درصد) کشت داده شد و در 37 درجۀ سانتی­گراد به مدت 48 ساعت گرمخانه­گذاری گردید. تولید پکتین توسط باکتری­ها، با اضافه کردن محلول لوگول 2 درصد (ید و یدید پتاسیم) به محیط کشت و تشکیل هالۀ شفاف در اطراف کلنی­ها مشخص گردید. در مرحلۀ بعد، باکتری­ها با کشت مجدد خالص سازی شدند. جهت بررسی سویه­های برتر تولید کنندۀ آنزیم پکتیناز از روش ایجاد چاهک در محیط پکتین آگار استفاده شد. با انتهای پیپت پاستور شیشه­ای استریل در محیط جامد چاهک­هایی به قطر 4 میلی­متر ایجاد شد. از جدایه­های باکتریایی سوسپانسیون معادل نیم مک­ فارلند تهیه شد و 25 میکرولیتر از آن در چاهک­ بارگذاری و در 37 درجۀ سانتی­گراد به مدت 3 روز گرمخانه­گذاری شد. فعالیت پکتینازی باکتری­ها با اضافه کردن محلول لوگول به محیط و تشکیل هالۀ شفاف در اطراف چاهک معلوم گردید­ (4).

شناسایی باکتری­ها: شناسایی جدایه­های باکتری با استفاده از آزمون­های ماکروسکوپی، میکروسکوپی، واکنش گرم و آزمون­های بیوشیمیایی شامل کاتالاز، SIM= Sulfide, Indole, Motility ، مصرف سیترات، اکسیداسیون و تخمیر قند (OF)، متیل رد-ووگس پروسکائر (MR-VP=Methyl Red-Voges Proskauer )، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز کازئین و ذوب ژلاتین انجام گرفت. نهایتاً، جدایه­ها با روش مولکولی تکثیر قطعۀ ژنی 16S rRNA و تعیین توالی آن تایید شدند (6).

استخراج DNA  و تکثیر قطعۀ 16S rRNA باکتری­ها با استفاده از PCR : استخراج DNA باکتری­ها با استفاده از کیت استخراج DNA کیاژن (کیاژن، آلمان(QIAamp DNA mini kit; Qiagen, Germany)) انجام گرفت. واکنش زنجیره­ای پلیمراز با حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل: 10 نانوگرم بر میکرولیتر DNA الگو، 4/0 میکرومولار از هر پرایمر فوروارد و ریورس، 2/0 میلی­مولارdNTP ، 2 میلی­مولار MgCl2، 5/2 میکرولیتر بافر PCR و 1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase انجام گردید. واکنش PCR با روش استاندارد  و با استفاده از پرایمرهای عمومی (F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', R: 5'-GACGGGCGGTGTGTACAA-3') در دستگاه ترمال سایکلر (اپندورف، آلمان(Mastercycler® nexus; Eppendorf, Germany)) تحت شرایط دمایی 5 دقیقه واسرشت شدن اولیه در دمای 94 درجۀ سانتی­گراد و در ادامه 35 چرخه شامل واسرشت شدن در دمای 94 درجۀ سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای 45 درجۀ سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، طویل شدن در دمای 72 درجۀ سانتی­گراد به مدت 90 ثانیه و در نهایت طویل شدن نهایی در دمای 72 درجۀ سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه انجام گرفت (13). در نهایت، قطعۀ تکثیر شده جهت تعیین توالی به شرکت ماکروژن، کره جنوبی (MacroGen, Korea- http://www.macrogen.com) ارسال گردید.

نتایج

جداسازی باکتری­های تولیدکنندۀ پکتیناز: از مجموع 50 نمونۀ خاک حاوی ضایعات مرکبات، 20 جدایه با توانایی مطلوب از نظر تولید پکتیناز جداسازی و خالص سازی شدند. جدایه­ها و محل نمونه برداری در جدول 1 آورده شده است. همۀ جدایه­ها بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی تا سطح جنس و گونه تفکیک و گروه بندی شدند (جدول 2).

 

 

جدول 1- نام جدایه­ها و منطقۀ نمونه­برداری

جدایه باکتری

منطقه آزادشهر

منطقه دلند

منطقه خان ببین

منطقه گرگان

تعداد کل

B. cereus 

2

2

0

2

6

B. subtilis 

1

0

1

0

2

B. brevis 

1

1

1

0

3

B. circulans 

1

1

0

0

2

B. polymixa 

0

1

1

1

3

B. firmus

0

1

0

1

2

B. pumilus

0

0

1

1

2

 

جدول 2- نتایج آزمون­های بیوشیمیایی برای جدایه­ها

جنس و گونه احتمالی

آزمون کاتالاز

آزمون کازئین

آزمون ژلاتین

آزمون نشاسته

آزمون سیترات

آزمون اندول

آزمون حرکت

آزمون MR

آزمون VP

مورفولوژی

B. cereus

+

+

+

+

+

-

+

-

+

باسیلی

B. subtilis 

+

+

+

+

+

-

+

-

+

باسیلی

B. brevis

+

-

-

+

-

-

+

+

-

باسیلی

B. circulans 

+

+

+

+

-

-

-

+

-

باسیلی

B. polymixa 

+

+

+

+

-

-

+

-

+

باسیلی

B. firmus 

+

+

+

+

-

متغیر

متغیر

+

-

باسیلی

B. pumilus

+

+

+

-

+

-

+

+

-

باسیلی

 


بررسی تولید پکتیناز توسط باکتری­ها: قطر هالۀ شفاف ناشی از تولید پکتیناز توسط 20 جدایۀ باکتری در اطراف چاهک موجود در محیط کشت پکتین آگار به مدت 3 روز و با 3 تکرار اندازه­گیری و میانگین این سه تکرار ثبت گردید (نمودار 1). از این 20 جدایه با توانایی تولید پکتیناز، تنها 2 جدایه با توجه به بیشتر بودن قطر هاله، توانایی بالایی را در تولید آنزیم داشتند و به عنوان جدایه­های برتر انتخاب شدند (شکل1).

تکثیر قطعۀ 16S rRNA  باکتری­ها با استفاده از واکنش PCR : تکثیر قطعۀ ژنی 16S rRNA جدایه­ها باندهای مناسب در اندازۀ تقریبی 1500 جفت باز را نشان داد (شکل2). توالی تعیین شدۀ قطعۀ ژنی با نرم­افزار آنلاین BLAST موجود در وب سایت NCBI بررسی شد و درصد شباهت جدایه­ها با دیگر باکتری­های موجود در بانک اطلاعاتی مقایسه گردید (جدول 3).

بحث

بکارگیری آنزیم­ها و متابولیت­های میکروبی در فرآوری و تولید مواد غذایی راهبردی ارزان و مقرون به صرفه است که این امر، شناسایی و معرفی میکروارگانیسم­هایی با ظرفیت بالای تولید را می­طلبد (11).


جدول3- اطلاعات مقایسۀ توالی قطعۀ ژنی 16S rDNA جدایه­ها با بانک اطلاعاتی NCBI

Accession number

Similarity

Bacteria

Isolate

KF150501

98%

Bacillus cereus

PPB 1

KF790812

98%

Bacillus subtilis 

PPB 2

 

نمودار 1- اندازۀ قطر هالۀ شفاف در اطراف چاهک موجود در محیط کشت پکتین آگار

 

 

شکل 1- سمت راست، هالۀ شفاف ایجاد شده توسط جدایۀ باسیلوس سرئوس در محیط پکتین آگار و سمت چپ، هالۀ شفاف ایجاد شده توسط جدایۀ باسیلوس سوبتیلیس در محیط پکتین آگار در روز سوم

 


در مطالعۀ حاضر، تعداد 20 جدایۀ تولید کنندۀ آنزیم پکتیناز از خاک حاوی ضایعات مرکبات جداسازی و شناسایی شد. غربال­گری جدایه­ها بر اساس توانایی حل­کنندگی پکتین در محیط پکتین آگار و اضافه کردن معرف لوگول انجام گرفت.

موکش کومار و همکاران مطالعه­ای را روی تولید و بهینه سازی پکتیناز توسط باسیلوس MFW7 جدا شده از ضایعات تجاری میوه انجام دادند. در مطالعۀ ما نیز گونه­های باسیلوس فعالیت پکتینولیتیک بهتری را نشان دادند. در مطالعۀ کومار و همکاران بیشترین میزان پکتیناز تولید شده پس از 72 ساعت گرمخانه­گذاری در دمای 35 درجه سانتی­گراد بود. در مطالعۀ ما نیز بهترین فعالیت پکتینازی جدایه­ها در همین شرایط بود. منبع جداسازی باکتری­ها در مطالعۀ کومار و همکاران ضایعات نشاسته و در مطالعۀ ما ضایعات میوه بود. در مطالعۀ کومار و همکاران، جهت بررسی تولید پکتیناز از محلول ستیل تری متیل آمونیوم بروماید (CTAB= Cetyltrimethyl ammonium bromide) 1% متعاقب 24 ساعت گرمخانه­گذاری جدایه­ها استفاده شد. در حالیکه در مطالعۀ ما از محیط پایه پکتین آگار تغییر یافته و با اسفاده از محلول لوگول برای بررسی تولید پکتیناز استفاده شد. در مطالعۀ کومار و همکاران، تولید پکتیناز توسط جدایه­ها در مدت 12، 24، 36، 48، 72، 96 و 120 ساعت گرمخانه­گذاری در دماهای 25، 30، 35، 40، 45، 50 و 55 درجۀ سانتی­گراد و در غلظت­های 5/0، 1، 5/1، 2، 5/2، 3 و 5/3 درصد سوبسترا و در pH های 5/3، 5/4، 5/5، 5/6، 5/7، 5/8 و 5/9 مورد آزمایش قرار گرفت. بیشترین میزان تولید پکتیناز بعد از 72 ساعت گرمخانه­گذاری، در دمای 35 درجه سانتی­گراد، 5/6 pH و غلظت 1% سوبسترا بود. در مطالعه ما تولید پکتیناز جدایه­ها در زمان­های 24، 48 و 72 ساعت در دمای 35 درجه سانتی­گراد، غلظت 1 درصد سوبسترا و 5 pH بود. در مطالعۀ کومار و همکاران، تاثیر منابع کربن مثل گلوکز، مالتوز، لاکتوز، نشاسته، گزیلوز و سوکروز و منابع نیتروژن مثل پپتون، اوره و عصاره مخمر نیز روی تولید پکتیناز مورد آزمایش قرار گرفت که لاکتوز در ترکیب با پپتون بیشترین تاثیر را روی تولید پکتیناز داشت. در حالیکه در مطالعۀ ما تاثیر منابع مختلف کربن و نیتروژن روی تولید پکتیناز مورد بررسی قرار نگرفت (7).

 

شکل 2- تکثیر قطعۀ ژنی 16S rRNA جدایه­ها (ستون 1: قطعۀ تکثیر شده 16S rRNA جدایۀ باسیلوس سرئوس، ستون 2: قطعۀ تکثیر شده 16S rRNA جدایۀ باسیلوس سوبتیلیس، ستون 3: کنترل منفی)

 

موتاز الاجلندی و همکاران فعالیت پکتینازی را بر روی چندین جدایۀ وحشی باسیلوس سوبتیلیس انجام دادند. آنها 50 گونۀ باکتری را از خاک و فاضلاب­های کارخانۀ آبمیوه جداسازی کردند. برای سنجش فعالیت پکتینازی، جدایه­ها در محیط پکتین آگار کشت داده شدند و در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه­گذاری شدند. پس از گرمخانه­گذاری، روی کلنی­های رشد یافته در پلیت، کلرید کلسیم یک مولار و محلول لوگل ریخته شد. از 50 نمونۀ باکتری، فقط 4 باکتری هالۀ شفاف وسیعتری را در اطرافشان تشکیل دادند که نشان­ دهندۀ فعالیت پکتینازی بود. موتاز الاجلندی و همکاران برای ایجاد شرایط بهینۀ تولید آنزیم، آزمایش را در شرایط گوناگون انجام دادند. رشد این گونه­ها در شرایط هوازی و دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت در محیط­های کشت مختلف همچون Landy broth، Yeast extract-pectin broth و M9-minimal salt medium جهت مطالعۀ تاثیر نوع محیط کشت و منبع کربنی بر تولید پکتیناز انجام گرفت. پس از انجام آزمایشات بیوشیمیایی و مولکولی روی این 4 نمونه مشخص شد که این باکتری­ها از سویه­های مختلف باسیلوس سوبتیلیس هستند که با مطالعۀ ما مطابقت داشت. با این حال در مطالعۀ ما شرایط تولید آنزیم بررسی نشد (1).

جانانی و همکاران باکتری­های تولید کنندۀ پکتیناز را از خاک­های ضایعات کشاورزی در مناطق مختلف جنوب هند جداسازی کردند. آنها جهت بررسی فعالیت پکتینازی باکتری­ها از محیط کشت (YEP) Yeast extract-pectin broth  استفاده کردند و پس از 48 ساعت گرمخانه­گذاری در دمای 30 درجۀ سانتی­گراد با افزودن لوگول و تشکیل هالۀ شفاف در محیط کشت، باکتری­های پکتینولیتیک را غربال­گری کردند. علاوه بر این، جهت بهینه­سازی تولید پکتیناز از دماهای 30 و 37 درجه سانتی­گراد و 2/7 pH و گرمخانه­گذاری به مدت 72-24 ساعت استفاده شد. تاثیر منابع مختلف نیتروژن و کربن از قبیل پکتین، پوست گندم و پوست برنج در غلظت 1% محیط کشت پایه نیز بررسی شد. در مطالعۀ ما، آزمایش در دمای 37 درجه سانتی­گراد و 2/7 pH و بمدت 72-24 ساعت گرمخانه­گذاری انجام شد ولی فقط از پکتین مرکبات به عنوان تنها منبع کربن برای تولید پکتیناز استفاده شد. در مطالعۀ جانانی و همکاران، از 10 گونۀ باکتریایی جدا شده، 3 گونه فعالیت پکتینازی نشان دادند. آنها دریافتند که تولید آنزیم در محیط کشت حاوی پوست گندم بیشتر از محیط کشت حاوی پوست برنج رخ می­دهد. علاوه بر این، معلوم شد که دمای بهینه برای تولید آنزیم 30 درجۀ سانتی­گراد است. آزمون­های مولکولی، سویه­های مختلف باسیلوس را تایید کرد. انتخاب سویه­های برتر تولید کنندۀ پکتیناز در مطالعۀ جانانی و همکاران بر اساس اندازۀ قطر هالۀ شفاف اطراف کلنی­های باکتری توصیف شد. بطوریکه، باکتری­هایی که اندازۀ قطر هالۀ اطراف کلنی­های آنها کمتر از 15 میلی­متر بود از لحاظ تولید پکتیناز در ردۀ خیلی خوب، باکتری­هایی که اندازۀ قطر هالۀ اطراف کلنی­های آنها کمتر از 10 میلی­متر بود، در ردۀ خوب، و باکتری­هایی که اندازۀ قطر هالۀ اطراف کلنی آنها کمتر از 5 میلی­متر بود در ردۀ ضعیف قرار گرفتند. باکتری­هایی هم که در اطراف کلنی­های آنها هاله­ای مشاهده نشد، فاقد فعالیت پکتینازی بودند (4). معیار انتخاب جدایه­های برتر تولید کنندۀ پکتیناز در مطالعۀ ما نیز دقیقا با مطالعۀ اخیر مطابقت داشت. 

سورز و همکاران، 168 گونۀ باکتری با فعالیت پکتینازی را از خاک و بقایای تجزیه شدۀ سبزیجات جدا کردند. منبع کربنی مورد استفاده در محیط کشت باکتری­ها، پکتین مرکبات بود. معرف مورد استفاده جهت غربال­گری باکتری­های مولد پکتیناز، لوگول بود. قطر هالۀ شفاف ناشی از تجزیۀ پکتین توسط گونه­ها پس از 72-48 ساعت گرمخانه­گذاری در دمای 30 درجه سانتی گراد اندازه­گیری شد و معلوم شده که گونه­های مختلف باسیلوس بالاترین فعالیت پکتینازی را داشتند. فعالیت پکتینازی این  گونه­ها تحت شرایط مختلف pH و دما مورد ارزیابی قرار گرفت. بهترین فعالیت در 7-6 pH  و دمای 55-45 درجه سانتی­گراد مشاهده شد. این مطالعه با مطالعۀ ما مطابقت داشت با این تفاوت که بررسی­های ما در دمای 37 درجه سانتی­گراد و pH خنثی انجام شد (15).

آلتانا و همکاران، مطالعه­ای را روی جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های تولید کنندۀ پکتیناز خارج سلولی از ضایعات کارخانجات روغن زیتون در ترکیه انجام دادند. آنها توانستند باسیلوس­های ترموفیلیک تولید کنندۀ لیپاز و پکتیناز خارج سلولی را جدا کنند. محیط کشت مورد استفاده در آن مطالعه، باسیلوس اسیدوکالداریوس آگار و (YSG) Yeast extract starch agar بود که باکتری­ها در این دو محیط، در دمای 50 درجۀ سانتی­گراد به مدت 72-48 ساعت گرمخانه­گذاری گردید. برای بررسی باکتری­ها با فعالیت پکتینازی، از محیط کشت حاوی پکتین مرکبات استفاده شد. بعد از 4-3 روز گرمخانه­گذاری در دمای 50 درجۀ سانتی­گراد، از محلول 1% CTAB جهت شناسایی باکتری­های مولد پکتیناز استفاده شد (2).

کواتارا و همکاران  مطالعه­ای را روی تولید آنزیم پکتینولیتیک توسط گونه­های باسیلوس در طول تخمیر قهوه انجام دادند. با این حال، نقش باسیلوس­ها در تخمیر قهوه بخوبی شناخته شده نیست. در مطالعۀ کواتارا و همکاران نیز از پکتین به عنوان منبع کربن استفاده گردید و باکتری­ها در محیط حاوی 1 درصد پکتین مرکبات کشت داده شد. بعد از 48 ساعت گرمخانه­گذاری در دمای 30 درجۀ سانتی­گراد، از محلول لوگل جهت غربال­گری باکتری­ها با فعالیت پکتینازی استفاده شد (9).

ناگاراجو و همکاران، باسیلوس لیکنی­فرمیس و باسیلوس سوبتیلیس با توانایی تولید پکتیناز را از خاک حاوی ضایعات سبزیجات جداسازی کردند. آنها از محیط کشت آگار غربال کنندۀ پکتیناز (PSAM= Pectinase Screening Agar Medium) و گرمخانه­گذاری در دمای 37 درجۀ سانتی­گراد به مدت 24 ساعت و از محلول یدین 50 میلی­مولار استفاده کردند (8).

روسدیانا و همکاران، مطالعه­ای را روی تولید پکتیناز تولید شده توسط باسیلوس فیرموس (Bacillus firmus) انجام دادند. آنها این باکتری را از شیر گاو محلی جداسازی کردند. شرایط بهینه برای تولید پکتیناز توسط این باکتری با متغیرهای مختلف محیطی مانند pH، دما، زمان تخمیر و تاثیر یون­های فلزی مورد بررسی قرار گرفت. محیط کشت باکتری محتوی 1% پکتین بود. بهترین فعالیت پکتینازی این باکتری در 8-7 pH، دمای 50-40 درجۀ سانتی­گراد و زمان تخمیر 18 ساعت بود. افزودن 2 میلی­مولار روی، 8 میلی­مولار منیزیم و 2 میلی­مولار پتاسیم به محیط کشت نیز باعث بهتر شدن فعالیت پکتینازی باکتری گردید (12).

نتیجه­گیری 

بی­تردید، خاک منبع گسترده­ای جهت جداسازی میکروارگانیسم­های تولید کنندۀ آنزیم­های صنعتی است. کشور ما با توجه به تنوع اقلیمی از این موهبت بسیار غنی است. با جداسازی سویه­­های بومی برتر تولید کنندۀ آنزیم پکتیناز و اِعمال روش­های مهندسی زیستی، می­توان در جهت بهینه­سازی و بومی­­سازی تولید این آنزیم پرمصرف گام برداشت. در مطالعۀ حاضر دو گونۀ باکتری با توانایی مطلوب در تولید پکتیناز، جداسازی و معرفی شد. تحقیقات بیشتری برای دستیابی به شرایط بهینه تولید و کینتیک موثر این آنزیم توسط جدایه­های مذکور مورد نیاز است که می­تواند توسط سایر محققین به تفصیل مطالعه گردد.

1.    Al-Ajlani MM, Ahmad Z, Hasnain S. (2012). Pectinase activity of wild-type Bacillus subtilis isolated from Pakistan. Biotechnology Research, 1(2): 7-12.

2.    Altana A. (2004). Isolation and molecular characterization of extracellular lipase and pectinase producing bacteria from olive oil mills. MSc thesis, Izmir institute of technology, Turkey.

3.    Amande T, Adebayo-Tayo B, Ndubuisi-Nnaji U, Ado B. (2013). Production and partial characterization of pectinases from mango peels by Aspergillius tamari. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 3(1): 59-62.

4.    Janani, Loganathan K, kumar G, Rao B. (2011). Screening of pectinase producing microorganisms from agricultural waste dump soil. Asian Journal of Biochemical and Pharmaceutical Research, 2(1): 329-337.

5.    Jayani R, Saxena S, Gupta R. (2005). Microbial pectinolytic enzymes: A review. Process Biochemistry, 40(9): 2931-2944.

6.    John GH, Noel RK, Peter H, James, TS, Stanley TW, 1997. Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology (In Russian). 9th ed. Moscow: Mir Publishers 2.

7.    Mukesh kumar DJ, Saraya GM, suresh K, Andal Priyadharshini D, Raja Kumar R, Kalaichelvan PT. (2012). Production and Optimization of Pectinase from Bacillus sp. MFW7 using Cassava Waste. Asian Journal of plant science and Research, 2(3): 369-375.

8.    Naga raju V, Divakar G. (2013). Screeninig and isolation of pectinase pruducing bacteria from various regions in Bangalore. International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical sciences, 4(1): 151-154.

9.    Ouattara HG, Koffi BL, Karou GT, Sangare A, Niamke SL, Diopoh JK. (2008). Implication of Bacillus sp. in the production of pectinolytic enzymes during cocoa fermentation. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(9): 1753-1760.

10.  Panda SS, Sahoo K, Das R, Dhal NK. (2012). Pectinolytic and cellulolytic activity of soil fungal isolates from Similipal Bioreserve Forest. World Enviroment, 2(2): 1-3.

11.  Rokade DD, Vaidya SL, Rehman Naziya MA, Dixit.PP. (2015). Screening of pectinase producing bacteria, isolated from Osmanabad fruit market soil. International Journal of Interdisciplinary and Multidisciplinary Studies (IJIMS), 2(6): 141-145.

12.  Roosdiana A, Prasetyawan S, Mahdi K, Sutrisno S. (2013). Production and Characterization of Bacillus   firmus Pectinase. The Journal of Pure and Applied Chemistry Research, 2(1): 35-41.

13.  Sambrook J, Russell D, Irwa, 2001. Molecular Cloning, a Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

14.  Semenova MV, Grishutin SG, Gusakov AV, Okunev ON, Sinitsyn AP. (2003). Isolation and properties of pectinases from the fungus Aspergillus japonicas. Biochemistry (Moscow), 68(5): 559-569.

15.  Soares M, Silva RD, Gomes E. (1999). Screening of bacterial strains for pectinolytic activity: characterization of the polygalacturonase produced by Bacillus sp. Revista de Microbiologia, 30(4): 299-303.

16.  Venkata naga raju E, Divakar G. (2013). Screeninig and Isolation of pectinase pruducing bacteria from various regions in Bangalore. International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical sciences, 4(1): 151-154.