بررسی جهش های شایع ژن KRAS در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال تک گیر در استان خوزستان

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه شهید چمران اهواز

چکیده

سرطان کلورکتال (CRC) یکی از بدخیمی های شایع در جهان است. جهش های KRAS یکی از وقایع اولیه در تکوین و پیشرفت CRC می باشند کدون های 12 و 13 از اگزون شماره 1، نقاط داغ جهش در این ژن هستند. در این بررسی فراوانی وقوع جهش های کدون 12 و 13 را در بیماران خوزستانیِ مبتلا به سرطان کلورکتال تک گیر (SCRC) بررسی گردید و با میزان آن در سایر نواحی ایران و نیز در دیگر کشورها مقایسه شد. DNA ژنومی از بافت های توموری 45 بیمار خوزستانی مبتلا به SCRC استخراج شد. جهش های نقطه ای در این دو کدون با روش PCR/RFLP و سپس غنی سازی جهش، شناسایی گردید. جهش ها با توالی یابی به روش Sanger تایید شدند. 13.33% تومورها (6.21) در کدون های 12 و 13 ژن KRAS جهش داشتند. این فراوانی با اغلبِ فراوانی های به دست آمده در دیگر کشورها (33%-53%) و نیز فراوانی های به دست آمده در سایر نقاط ایران (20.3% و 28%) تفاوت دارد که می تواند براساس دلایل متعددی از جمله بالا بودن احتمالی وضعیت ناپایداری میکروستلایتی در آن ها، حساسیت ناکافی روش غربالگری، فاکتورهای ژنتیکی و محیطی متفاوت از جمله رژیم غذایی سرشاز از امگا-3 در این جمعیت باشد. همچنین با استفاده از روش غنی سازی فرکانس الل های شناسایی شده در گروه مورد بررسی دوبرابر گشت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Analysis of common mutations of KRAS gene in patients suffering from sporadic colorectal cancer in Khuzestan province

چکیده [English]

Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies in the world (rate of death: 33%). v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma (KRAS) mutations represent an early event in the development and progression of CRC. Codons 12 and 13 of exon 1 are the hot spots for occurrence of mutations in KRAS. This study is attempted to define the occurrence of KRAS mutations at codon 12 and 13 in patients from Khuzestan suffering from sporadic colorectal cancer (SCRC) and compare them with patients from other regions of Iran and other countries. Genomic DNA was first extracted from 45 SCRC specimens. KRAS point mutations were genotyped by PCR-RFLP analysis followed by enrichment PCR. Enrichment PCR is an appropriate method which we use for detecting even lower percentage of heterozygous mutations in one specimen. Finally Sanger sequencing was used to confirm mutations identified. 13.33% of (6 out of 45) tumor samples showed mutations at codon 12 or 13 of the KRAS gene. It’s totally different with the frequency of those from many of other countries (33-53%) and alternative studies in Iran (20.3% and 28%); that could be because of various reasons such as less role of serrated pathway in development of CRC among Khuzestani population, probable microsatellite instability-high status of these tumors, insufficient sensitivity of RFLP method, different genetic and environmental factors like high intake of omega-3 fat in the Khuzestani usual diet. Also, use of enrichment method, doubled the frequency of mutations identified in this cohort.

کلیدواژه‌ها [English]

  • sporadic colorectal cancer
  • KRAS
  • mutation analysis
  • enrichment-RFLP

بررسی جهشهای شایع ژن KRAS در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال تک گیر در استان خوزستان

سید رضا کاظمی نژاد*، آسیه کازرونیان، حمید گله داری و تینا شفاف

اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده علوم، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 16/12/94            تاریخ پذیرش: 27/5/95

چکیده

سرطان کلورکتال (CRC) یکی از بدخیمیهای شایع در جهان است. جهشهای KRAS یکی از وقایع اولیه در تکوین و پیشرفت CRC می باشند. کدونهای 12 و 13 از اگزون شماره 1، نقاط داغ جهش در این ژن هستند. در این بررسی فراوانی وقوع جهشهای کدون 12 و 13 در بیماران خوزستانیِ مبتلا به سرطان کلورکتال تک گیر (SCRC) تعیین گردید و با میزان آن در سایر نواحی ایران و نیز در دیگر کشورها مقایسه شد. DNA ژنومی از بافتهای توموری 45 بیمار خوزستانی مبتلا به SCRC استخراج شد. جهشهای نقطه ای در این دو کدون با روش PCR/RFLP و سپس غنی سازی جهش، شناسایی گردید. جهشها با توالی یابی به روش Sanger تأیید شدند. 33/13 درصد تومورها در کدونهای 12 و 13 ژن KRAS جهش داشتند. این فراوانی با اغلبِ فراوانیهای به دست آمده در دیگر کشورها (33-53 درصد) و نیز فراوانیهای به دست آمده در سایر نقاط ایران (20.3 و 28 درصد) تفاوت دارد که می تواند براساس دلایل متعددی از جمله بالا بودن احتمالی وضعیت ناپایداری میکروستلایتی در آنها، حساسیت ناکافی روش غربالگری، فاکتورهای ژنتیکی و محیطی متفاوت از جمله رژیم غذایی سرشاز از امگا-3 در این جمعیت باشد. همچنین با استفاده از روش غنی سازی فرکانس آللهای شناسایی شده در گروه مورد بررسی دو برابر گشت.

واژه های کلیدی: سرطان کلورکتال تک گیر، ژن KRAS، آنالیز جهش، Enrichment-RFLP

* نویسنده مسئول، تلفن 09163188499، پست الکترونیکی kazemi_reza@scu.ac.ir

مقدمه

 

سرطان کولون و سرطان رکتوم خصوصیات مشترک زیادی با یکدیگر دارند؛ به همین دلیل اغلب آن دو را با هم به عنوان سرطان کلورکتال (CRC) می نامند. این سرطان یکی از بدخیمیهای شایع در جهان است (11). شیوع CRC در نقاط مختلف جهان تا 10 برابر می تواند متفاوت باشد. به نظر می رسد این تفاوتهای جغرافیایی مربوط به تفاوتهای رژیم غذایی و فاکتورهای محیطی در زمینه ای از استعداد ژنتیکی ابتلا به CRC فرصت بروز پیدا می کنند. در ایران CRC چهارمین سرطان شایع در مردان و سومین در زنان می باشد. 67 جهش KRAS با فراوانی نسبتاًﹰ بالایی در انواعی از سرطانها و در 30 تا 50 درصد از سرطانهای کلورکتال رخ می دهند (5، 6 و 8). خانواده ژنی ras در انسان یکی از هدفهای بالقوه برای تغییرات جهش زایی است که نقش مهمی در تومورزایی در انسان دارند. این خانواده دارای ژنهای K-ras, H-ras, N-ras می باشد (25). ژن KRAS که با نامهایV-KI-RAS2  و c-Ki-ras2 نیز شناخته می شود، پروتوانکوژنی است که بر روی بازوی کوتاه کروموزوم 12 و در ناحیه 12p12.1 و در رشته منفی DNA قرار گرفته است (12). ژن KRAS2، پروتئین KRAS یا همان p21 را کد می کند. پروتئین KRAS یک GTPase کوچک متشکل از 188 یا 189 آمینواسید (بسته به ایزوفرم آن) بوده و دارای وزن مولکولی 21KDa می باشد (24). این GTPase کوچک که در بسیاری از سلولهای انسانی به میزان زیاد بیان می شود، در غشای سلولی لنگر می اندازد و در انتقال پیام درون سلولی شرکت می کند که عمدتاً از طریق فعال سازی مسیر پیام رسانی گیرنده اپیدرمی هورمون رشد (EGFR) می باشد. فراوان ترین انواع جهشهای مشاهده شده در KRAS در تمام سرطانهای انسانی،G > A  ترنزیشن وG > T  ترنسورژن می باشد (13، 16، 19 و 27). جهشهای بدمعنی در RAS اساساً منجر به جایگزینی در کدونهای 12 و 13 از اگزون 1 و 61 از اگزون 2 می شود. جهش در کدونهای 59 و 63 در اگزون 3 نیز گزارش شده است (15). این جهشها فعالیت GTPase ذاتی و با واسطه گری GAP را در این پروتئین تخریب کرده و باعث می شوند همواره در حالت فعال باقی بماند (23، 26، 28، 29 و 30).

در مطالعه حاضر، فراوانی جهش در کدونهای 12 و 13 ژن KRAS  در نمونه ای از جمعیت بیماران خوزستانی مبتلا به سرطان کولورکتال تک گیر مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روشها

برای جمع آوری نمونه های مورد نیاز این مطالعه تعداد 45 بیمار مبتلا به سرطان کلورکتال تک گیر و با سن حداقل 50 سال که به بیمارستانهای مهر، امام خمینی و گلستان اهواز از تاریخ 1/12/1389 تا 1/12/1390 مراجعه کرده بودند، انتخاب شدند. رضایت آنان جلب شده و موافقت کتبی‌شان کسب گردید. سپس، نمونه هایی از بافت توموری و بافت سالم با فاصله حداقل 6 سانتیمتر از بافت تومور برداشت گردید. نمونه ها در داخل لوله های فالکون محتوی الکل 96 درصد قرار داده شد. استخراج DNA از بافتها با استفاده از کیتAccuPrep Genomic DNA Extraction شرکت کره ای Bioneer انجام شد. پس از اطمینان از کیفیت مناسب ژنومهای استخراج شده، قطعه مورد نظر از ژن KRAS توسط PCR با پرایمرهای ویژه تکثیر گردید. پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی Forward که برای تکثیر قطعه مورد نظر ژن KRAS در نظر گرفته شد به صورت 5-ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3′ و با Tm برابر 7/62 درجه سانتیگراد، و پرایمر Reverse، 5′-TCAAAGAATGGTCCTGCACC-3′ با Tm برابر 3/57 درجه طبق آزمایش Bartsch و همکاران (1998) استفاده شد (7). حجم کلی مخلوط PCR، µl25 در نظر گرفته شد. مخلوط PCR شامل µl3 DNA ژنومی، µl75/15 آب مقطر استریل، بافر مناسب آنزیم Taq پلیمراز به میزان µl5/2، µl75/0 محلول کلرید منیزیم mM50، µl5/0 از مخلوط dNTP ها، µl1 از هریک از پرایمرهای forward و reverse با رقت 0.25 و نهایتاً µl 5/0 آنزیم Taq پلیمراز می باشد. در برنامه بهینه شده PCR، واسرشتگی اولیه در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه و 1 سیکل، سپس 35 سیکل واسرشتگی در 94 درجه به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمرها در 55 درجه به مدت 30 ثانیه، گسترش پرایمرها در دمای 72 درجه به مدت 20 ثانیه انجام گرفت (7) و در مرحله آخر گسترش نهایی در دمای 72 درجه به مدت 2 دقیقه و یک سیکل با استفاده از دستگاه ترموسایکلر گرادیانت مدل applied biosystems (AB) انجام شد. پس از عمل تکثیر، 5 میکرولیتر از محصولات PCR در ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز گردید تا از انجام آن اطمینان حاصل شود (2).

پس از تکثیر قطعه مورد نظر ژن KRAS در بافتهای توموری و سالم بیماران مورد مطالعه، برای بررسی حضور یا عدم حضور جهش در کدون 12 و 13 این ژن، محصولات PCR با استفاده از تکنیک RFLP با آنزیم محدود کننده BstN1 (Mva1) (شرکت Thermofisher) برش داده و بررسی شدند. برای تهیه مخلوط RFLP از µl10 محصول PCR، µl7 آب مقطر استریل، µl2 بافر R و µl1 آنزیم محدود کننده BstN1 در حجم نهایی µl20 استفاده شد. عملیات RFLP و الکتروفورز محصولات حاصل از آن برای محصولات PCR برای نمونه های توموری و سالم تمامی بیماران انجام گردید. برای افزایش دقت در ردیابی جهشها حتی در درصد کمی از سلولها، پس از انجام RFLP بر روی قطعات تکثیر شده ژن KRAS، Enrichment PCR مجدداً مطابق با برنامه بهینه مذکور با پرایمرهای نامبرده تکرار شد. در این واکنش حجم کلی مخلوط PCR، µl26 در نظر گرفته شد شامل µl1 DNA ژنومی با رقت 3/0، µl75/18 آب مقطر استریل، بافر مناسب آنزیم Taq پلیمراز به میزان µl5/2، µl75/0 محلول کلرید منیزیم mM50، µl5/0 از مخلوط dNTP ها، µl1 از هریک از پرایمرهای forward و reverse با رقت 25/0 و نهایتاً µl 5/0 آنزیم Taq پلیمراز می باشد. محصولات نهایی به وسیله الکتروفورز درصد جداسازی شدند (1)

پس از انجام Enrichment PCR و تکثیر قطعات جهش یافته که در RFLP اول برش نخورده بودند، نیاز به بررسی و تأیید مجدد جهش یافته بودن محصولات این تکثیر وجود داشت. بدین منظور محصولات Enrichment PCR با تکنیک RFLP و مطابق پارامترهای RFLP اول در معرض برش آنزیمی قرار گرفتند. با این تفاوت که به جای محصول PCR، از محصول Enrichment PCR استفاده گردید. سپس برای تأیید درستی عملکرد تکنیک RFLP و نیز تشخیص نوع تغییر نوکلئوتیدی در نمونه های توموری جهش یافته، تمامی نمونه هایی که به عنوان جهش یافته شناسایی گردیدند و همچنین دو نمونه تصادفی از تومورهایی که فاقد جهش تشخیص داده شدند، برای انجام توالی یابی انتخاب شدند. در این مرحله برای انجام PCR بر روی نمونه های انتخابی از پرایمر forward با توالی 5´-TTTTCATGATTGAATTTTGTAAGG-3´ و Tm برابر با 9/53 درجه و پرایمر reverse با توالی 5´-TTGAAACCCAAGGTACATTTCA-3´ با دمای Tm برابر 7/57 درجه طراحی (Oligo, version 3.4; National Biosciences Inc.) و استفاده گردید و PCR انجام شد.

در نهایت محصولات PCR به منظور شناسایی جهشهای موجود در کدون 12 و 13 مورد تعیین توالی قرار گرفتند (Seqlab Germany). توالی یابی در یک جهت و با پرایمر Forward انجام شد. تعیین توالی توسط دستگاه ABI 3130 و بر اساس روش Sanger صورت پذیرفت. با استفاده از نرم افزار Chromas2 کروماتوگرامهای حاصل از تعیین توالی خوانده شد. سپس با توالی مرجع ژن KRAS مربوط به لوکوسNG_007524.1  مقایسه گردید. توالی کدونهای 12 و 13 در هر نمونه با توالی مرجع تطبیق داده شد و تغییرات نوکلئوتیدی آنها آشکار گشت.

نتایج و بحث

باندهای حاصل شده از واکنش PCR طبق انتظار دارای bp157 طول بودند. کنترل منفی نیز عدم وجود آلودگی در واکنش PCR نشان داد. پس از تکثیر قطعات مورد نظر و هضم آنزیمی آنها با آنزیم محدود کننده BstN1، نتیجه RFLP بر روی ژل آگارز طبق شکل 1 مشاهده شد.

 

 

شکل 1- تصویر محصولات RFLP  قطعات تکثیر شده پس از الکتروفورز بر روی ژل آگارز. چاهک شماره 1، مارکر bp50. چاهک شماره 2 محصول PCR قبل از برش آنزیمی (طول bp157). چاهکهای شماره 3 تا 11، محصولات RFLP انجام شده بر روی قطعات حاصل از PCR. نمونه های دارای آلل وحشی از لحاظ این دو کدون، طی RFLP با آنزیم برش خورده و قطعه ای کوچک تر از قطعه اصلی با طول bp128 تولید کرده اند. چاهک شماره 7، نمونه دارای جهش می باشد.

بر اثر RFLP، دو قطعه با طولهای bp128 و bp29 ایجاد شدند. باند مربوط به قطعه bp29 به علت اندازه بسیار کم، بر روی ژل آگارز قابل مشاهده نیست. چنانچه محصول PCR در کدون 12 یا 13 و یا هر دو کدون جهشی داشته باشد، باعث تغییر نوکلئوتیدی در این دو کدون و در نتیجه از دست رفتن جایگاه شناسایی آنزیم محدود کننده BstN1 می گردد؛ بنابراین طی RFLP این قطعات برش نمی خورند. از این رو پس از الکتروفورزِ نمونه های دارای آلل جهش یافته در کدون/کدونهای 12 و 13، یک باند با طول 157bp بر روی ژل آگارز مشاهده می شود.

تا مرحله PCR/RFLP اول مشخص شد که 3 نمونه دارای جهش در کدون 12 یا 13 یا هر دو کدون از ژن KRAS هستند. بنابراین تا این مرحله و قبل از انجام مراحل غنی سازی جهش، فراوانی جهش در کدون 12 و 13 ژن KRAS در جمعیت بیماران مورد مطالعه که همگی دارای سرطان کلورکتال تک گیر بودند، 67/6 درصد به دست آمد.

سپس بر روی محصولات RFLP واکنش Enrichment PCR انجام گرفت. برای تکثیر آللهای دارای جهش که ممکن است با نسبتهای بسیار کم در نمونه ها موجود بوده و طی RFLP به دلیل دارا بودن جهش، برش نخورده و دست نخورده باقی مانده باشند، یک مرحله PCR با همان پرایمرهای قبلی تکرار شد. در این PCR، آللهای نوع وحشی که در RFLP برش خورده بودند قابل تکثیر نیستند و تنها آللهای جهش یافته تکثیر شده و تعداد آنها افزایش می یابد؛ از این رو مقدار اولیه اندک آنها در این مرحله افزایش یافته و قابل شناسایی می گردد. در شکل 2 تصویر نتایج Enrichment PCR بر روی ژل آگارز مشاهده می شود.

در ادامه جهش یافته بودن محصولاتی که در مرحله قبل تکثیر شدند، RFLP بر روی محصولات Enrichment PCR انجام گرفت. قطعاتِ دارای جهش مجدداً برش نخورده و در الکتروفورز باندی با طول bp157 به دست دادند. این باند در الکتروفورز، تأیید کننده جهش یافته بودن محصول Enrichment PCR و در نتیجه وجود آلل جهش یافته در نمونه اولیه است.

 

 

شکل 2- تصویر محصولات Enrichment PCR پس از الکتروفورز بر روی ژل آگارز. در چاهک شماره 1، مارکر bp50 مشاهده می شود. چاهکهای شماره 2 تا 5، محصولات PCR Enrichment. چاهکهای 2 تا 4، نمونه هایی که تا مرحله قبل به عنوان جهش یافته شناسایی شده بودند. همان گونه که مشاهده می شود در آنها، باند bp157 دیده می شود؛ لذا این نمونه ها آللهای جهش یافته ای دارند که در مرحله قبل (RFLP) برش نخورده و در این مرحله تکثیر شده اند. اما در چاهک شماره 5، باند bp157 وجود ندارد.  

پس از انجام Enrichment PCR و RFLP محصولات آن، مشخص شد که در میان 45 بیمار خوزستانی بررسی شده که همگی مبتلا به سرطان کلورکتال تک گیر بودند، 6 بیمار در تومورهای خود، جهشِ کدون 12 یا 13 یا هر دو کدون ژن KRAS را داشتند که این تعداد 33/13 درصد کل بیماران را شامل می شد. پس از انجام واکنش PCR به منظور توالی یابی، قطعه تکثیر شونده توسط این پرایمرها باbp 419 طول مشاهده شد (شکل 3).

 

شکل 3- تصویر محصولات ‏PCR‏ برای توالی یابی. در چاهک شماره ‏‎1‎، مارکر ‏‎bp50‎‏ مشاهده می گردد. در ‏چاهکهای شماره ‏‎2‎‏ و ‏‎3‎‏ محصولات ‏PCR‏ ژنومها مشاهده می شود. در چاهک شماره 4‎‏ کنترل منفی واکنش بارگذاری شده است.‏

با استفاده از نرم افزار Chromas2 کروماتوگرامهای حاصل از تعیین توالی خوانده شد، سپس با توالی مرجع KRAS مربوط به لوکوس NG_007524.1 مقایسه گردید. توالی کدونهای 12 و 13 در هر نمونه با توالی مرجع تطبیق داده شدند و تغییرات نوکلئوتیدی آنها آشکار گشت. کروماتوگرامهای مربوط به توالی یابی محصولات PCR نمونه های دارای جهش و فاقد آن، با استفاده از پرایمر Forward  در شکل 4 مشاهده می شوند. کروماتوگرامها از نظر وجود جهش در کدونهای 12 و 13 و علاوه بر اینها، در کدونهای 59، 61، 63 و 146 این ژن که همگی نقاط داغ جهشی KRAS می باشند، بررسی گردید.

جهشهای کدون 12 و 13 به ترتیب (5/6) 34/83 درصد و (1/6) 66/16 درصد از کل جهشهای KRAS را در گروه نمونه مورد بررسی شامل شدند. در 8 نمونه توالی یابی شده، هیچ جهشی در کدونهای 59، 61، 63 و 146 وجود نداشت. از نظر رده بندی سنی، تمام جهشها در بیماران رده سنی بالاتر یا مساوی 60 سال یافت شد و بیماران زیر 60 سال جهشی در این دو کدون KRAS نداشتند. اگر نتایج به دست آمده در مراحل اول، دوم و سوم مقایسه شود، می توان گفت پس از اولین PCR/RFLP فراوانی جهش برابر 67/6 درصد به دست آمد. پس از انجام مراحل غنی سازی وجود جهش در 3 نمونه دیگر نیز آشکار گشت و فراوانی برابر 33/13 درصد به دست آمد و این نتایج پس از توالی یابی تأیید گشتند.

 

شکل 4- کروماتوگرامهای حاصل از توالی یابی محصول PCR آللهای نوع وحشی (A) و جهش یافته (B) ژن KRAS.

در نخستین بررسی جامع RASCAL که بر روی 2721 بیمار CRC از 13 کشور انجام شد، جهشهای کدون 12 یا 13 ژن KRAS در 7/37 درصد تومورها گزارش شد. 81 درصد این جهشها در کدون 12 و مابقی در کدون 13 رخ داده بود. 78 درصد جهشها نیز در باز سوم این دو کدون اتفاق افتاده بود (4). در دومین بررسی RASCAL بر روی 3439 بیمار CRC از 35 مرکز در 19 کشور، فراوانی جهش KRAS برابر 8/34 درصد برآورد شد (5). در سال 2012 در کشور چین با استفاده از PCR/Sequencing مطالعاتی بر روی کدونهای 12، 13 و 14 از 57 نمونه انجام شد و میزان فراوانی جهش 9/43 تخمین زده شد (21). در سال 1994 در نروژ مطالعات PCR/SSO برای 12 جهش خاص در کدونهای 12 و 13 از 251 بیمار انجام گرفت و فراوانی جهش 4/39 محاسبه گشت (9). در فرانسه در سال 2010، PCR/Sequencing برای 7 جهش خاص در کدونهای 12 و 13 از 61 بیمار میزان 37 درصد برای فراوانی جهش نشان داد (17). مطالعات PCR/RFLP/Enrichment PCR/RFLP در ژاپن در سال 2004 بر روی کدون 12 و 13 از 234 بیمار، فراوانی جهش را 31 درصد نشان داد (22 و 31). مطالعه ای در سال 2008 در ترکیه با استفاده از روش PCR/SSCP/Sequencing کدونهای 12 و 13 از 53 بیمار، میزان جهش را 11 درصد گزارش داد (3). در کشور پرو در سال 2011 با استفاده از روش PCR/Sequencing در اگزون 1 از 90 بیمار میزان فراوانی جهش 7/16 درصد گزارش داده شد (14) و در کشور ایران در سال 2010 فراوانی جهش در کدونهای 12 و 13 از 59 بیمار در شهر تهران با استفاده از روش PCR/Sequencing میزان 3/20 درصد گزارش شده است (31). سهم هریک از مسیرهای مختلف سرطان زایی CRC در بروز انواع توارثی و تک گیر این بیماری متفاوت است؛ بنابراین فراوانی جهش KRAS نیز در این دو نوع بیماری می تواند متفاوت باشد. هرچند که در نخستین مطالعه جامع RASCAL مشخص شده که فراوانی این جهشها در میان تومورهای تک گیر، FAP و HNPCC تفاوت معنی داری نشان نمی دهد (4)؛ اما در برخی مطالعات دیگر گفته شده است که دو گروه آخر در مقایسه با تومورهای تک گیر تفاوت نرخ جهش KRAS دارند (10، 18 و 20).

در مطالعه حاضر، در مجموع تعداد 45 تومور از 45 بیمار خوزستانی مبتلا به سرطان کلورکتال تک گیر از نظر جهش در کدونهای 12 و 13 ژن KRAS با روش PCR/RFLP وEnrichment PCR/RFLP ارزیابی گشته و در 6 عدد از تومورها جهش در کدونهای ذکر شده یافت شد. با روش توالی یابی، وجود جهش در این نمونه ها و نیز فقدان جهش در دو نمونه تصادفی از نمونه های فاقد جهش تأیید شد. فراوانی جهش این دو کدون در نمونه مورد بررسی با روش PCR/RFLP برابر 67/6 درصد و با روش تکمیلی Enrichment PCR/RFLP برابر 33/13 درصد به دست آمد. آشکار است که با روش کامل PCR/RFLP/Enrichment PCR/RFLP حساسیت شناسایی جهش تا دو برابر افزایش داده شده است و این روش دو برابر دقیق تر در شناسایی جهش عمل می کند. طبق مطالعات جامعی که فراوانی جهش KRAS را در جمعیتهای مختلف جمع بندی و تحلیل نموده اند، میانگین جهش این ژن در جمعیتهای مختلف بیماران CRC برابر 7/37 درصد و 8/34 درصد گزارش شده است که بیشتر از فراوانی به دست آمده در این بررسی می باشد. فرضیات متعددی در رابطه با دلایل احتمالی پایین بودن فراوانی جهش KRAS در جمعیت مورد بررسی نسبت به بسیاری از جمعیتهای دیگر می توان ارائه داد. به عنوان مثال، با توجه به بررسیهای دیگرِ انجام شده بر روی این نمونه و پایین بودن فراوانی جهش APC و بالا بودن فراوانیهایپرمتیلاسیون این ژن در این گروه نمونه، امکان بالا بودن فراوانی فنوتیپ متیلاتور جزایر CpG یا ناپایداری میکروستلایتی در این گروه تومورها وجود دارد. این دو گروه، هر دو با نرخ پایین جهش KRAS همراهی نشان می دهند. در ضمن با توجه به یافته های دو بررسی پیشین و بررسی حاضرِ انجام شده بر روی این نمونه پیشنهاد می گردد در تکوین این تومورها، مسیر سرطان زایی Serrated سهم بیشتری نسبت به مسیر آدنوما-کارسینوما داشته است؛ زیرا جهش APC و KRAS که جزء رویدادهای مسیر آدنوما-کارسینوما می باشند، در این نمونه دارای شیوع پایینی بوده و در مقابل هایپرمتیلاسیون APC که از رویدادهای مسیر سرطان زایی Serrated می باشد، فراوانی بالایی داشته است. از دیگر دلایل احتمالیِ فراوانی پایین جهش KRAS در نمونه مورد بررسی می توان به خیلی بزرگ نبودن این نمونه و به دنبال آن خطای نمونه گیری و سوگیری اشاره کرد. به عنوان مثال ممکن است بخش زیادی از تومورهای گروه نمونه را تومورهای دارای سطوح تمایزی پایین تشکیل داده باشند. طبق گزارشات شیوع جهش KRAS در این گونه تومورها کمتر از تومورهای سایر سطوح تمایزی است. علاوه بر این، از آن جایی که سلولهای توموری از نظر جهش این ژن موزاییک هستند و نیز این جهش تقریباً همیشه به صورت هتروزیگوت روی می دهد، این احتمال وجود دارد که برخی تومورهایی که نسبتهای پایین آلل جهش یافته/سالم دارند، توسط روش غربالگری به کار رفته به عنوان تومورِ دارای جهش شناسایی نشوند و در آمار تومورهای جهش یافته محسوب نگردند. این پدیده نیز به نوبه خود، فراوانی محاسبه شده کمتری برای فراوانی این جهش در پی خواهد داشت. با توجه به پایین بودن نرخ جهش در کدون 12 و 13 ژن KRAS در بررسیهای دیگرِ انجام شده بر روی جمعیت ایرانی، این احتمال وجود دارد که در این جمعیت نقاط داغ جهش KRAS در کدونهای دیگر اگزون اول یا اگزونهای دیگر باشد. شیوه زندگی، رژیم غذایی سرشار از ماهی و امگا-3، فاکتورهای محیطی و زمینه ژنتیکی متفاوت از دیگر فاکتورهای مؤثر بر فراوانی جهش KRAS در بیماران CRC این استان می باشد. با توجه به تأثیر قابل توجه جهش KRAS در میزان پاسخ دهی به شیمی درمانی در بیماران مبتلا به CRC تحت درمان با شیمی درمانی، انجام مطالعات مشابه بر روی سایر جمعیتهای ایرانی لازم است تا بتوان به درستی درباره نیاز یا عدم نیاز به انجام آزمون مولکولی جهش KRAS قبل از ارجاع بیماران ایرانی مبتلا به CRC برای شیمی درمانی، تصمیم گیری قطعی نمود.

تشکر و قدردانی

مؤلفین این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز به دلیل حمایت مالی و تمامی عزیزان یاری دهنده در انجام این پروژه، نهایت سپاس و امتنان را دارند.

  1. حسین زاده کلاگر ا.، فلاح ف.، یوسف زاده ح.، 1394. تنوع و تمایز ژنتیکی جمعیتهای توس (Betula pendula) ایران، با استفاده از چندشکلی DNA‌ سه ناحیه (KIK2, DT, CD) ژنوم کلروپلاستی. مجله زیست شناسی ایران 194:28.
  2. محمدآبادی م.، 1394. تنوع آللی ژن کالپاستین در گوسفند سنجابی. مجله زیست شناسی ایران 397:28.
    1. Akkiprik, M., Celikel, C.A., Düşünceli, F., Sönmez, O., Güllüoğlu, B.M., Sav, A. and Ozer, A., 2008. Relationship between overexpression of ras p21 oncoprotein and K-ras codon 12 and 13 mutations in Turkish colorectal cancer patients. The Turkish journal of gastroenterology: the official journal of Turkish Society of Gastroenterology, 19(1), pp.22-27.
    2. Andreyev, H.J.N., Norman, A.R., Clarke, P.A., Cunningham, D. and Oates, J.R., 1998. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the multicenter “RASCAL” study. Journal of the National Cancer Institute, 90(9), pp.675-684.       
    3. Andreyev, H.J.N., Norman, A.R., Cunningham, D., Oates, J., Dix, B.R., Iacopetta, B.J., Young, J., Walsh, T., Ward, R., Hawkins, N. and Beranek, M., 2001. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the ‘RASCAL II’study. British journal of cancer, 85(5), p.692.       
    4. Banck, M.S. and Grothey, A., 2009. Biomarkers of resistance to epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies in patients with metastatic colorectal cancer. Clinical Cancer Research, 15(24), pp.7492-7501. 
    5. Bartsch, D., Bastian, D., Barth, P., Schudy, A., Nies, C., Kisker, O., Wagner, H.J. and Rothmund, M., 1998. K-ras oncogene mutations indicate malignancy in cystic tumors of the pancreas. Annals of surgery, 228(1), p.79.   
    6. Bazan, V., Migliavacca, M., Zanna, I., Tubiolo, C., Grassi, N., Latteri, M.A., La Farina, M., Albanese, I., Dardanoni, G., Salerno, S. and Tomasino, R.M., 2002. Specific codon 13 K-ras mutations are predictive of clinical outcome in colorectal cancer patients, whereas codon 12 K-ras mutations are associated with mucinous histotype. Annals of Oncology, 13(9), pp.1438-1446.    
    7. Breivik, J., Meling, G.I., Spurkland, A., Rognum, T.O. and Gaudernack, G., 1994. K-ras mutation in colorectal cancer: relations to patient age, sex and tumour location. British journal of cancer, 69(2), p.367.   
    8. Burmer GC, Levine DS, Kulander BG, Haggitt RC, Rubin CE, Rabinovitch PS. C-Ki-ras mutations in chronic ulcerative colitis and sporadic colon carcinoma. Gastroenterology. 1990 Jan 8;99(2):416-20.    
    9. Calistri, D., Rengucci, C., Seymour, I., Leonardi, E., Truini, M., Malacarne, D., Castagnola, P. and Giaretti, W., 2006. KRAS, p53 and BRAF gene mutations and aneuploidy in sporadic colorectal cancer progression.Analytical Cellular Pathology, 28(4), pp.161-166.     
    10. Chen, F., JUNB jun B proto-oncogene, 2011 (accessed June 8, 2011). http://atlasgeneticsoncology. org/Genes. JUNBID178. Html.    
    11. Downward, J., 2003. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.Nature Reviews Cancer, 3(1), pp.11-22.   
    12. Egoavil, C.M., Montenegro, P., Soto, J.L., Casanova, L., Sánchez-Lihon, J., Castillejo, M.I., Martinez-Canto, A., Perez-Carbonell, L., Castillejo, A., Guarinos, C. and Barbera, V.M., 2011. Clinically important molecular features of Peruvian colorectal tumours: high prevalence of DNA mismatch repair deficiency and low incidence of KRAS mutations. Pathology-Journal of the RCPA, 43(3), pp.228-233.   
    13. Grimmond, S.M., Raghavan, D. and Russell, P.J., 1992. Detection of a rare point mutation in Ki-ras of a human bladder cancer xenograft by polymerase chain reaction and direct sequencing. Urological research, 20(2), pp.121-126.   
    14. Haigis, K.M., Kendall, K.R., Wang, Y., Cheung, A., Haigis, M.C., Glickman, J.N., Niwa-Kawakita, M., Sweet-Cordero, A., Sebolt-Leopold, J., Shannon, K.M. and Settleman, J., 2008. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.Nature genetics, 40(5), pp.600-608.   
    15. Italiano, A., Hostein, I., Soubeyran, I., Fabas, T., Benchimol, D., Evrard, S., Gugenheim, J., Becouarn, Y., Brunet, R., Fonck, M. and François, E., 2010. KRAS and BRAF mutational status in primary colorectal tumors and related metastatic sites: biological and clinical implications. Annals of surgical oncology, 17(5), pp.1429-1434.   
    16. Konishi, M.O.T.O.K.O., Kikuchi-Yanoshita, R., Tanaka, K.I.Y.O.K.O., Muraoka, M.A.S.A.T.O.S.H.I., Onda, A.S.A.K.A., Okumura, Y.U.K.A.K.O., Kishi, N.A.O.K.O., Iwama, T.A.K.E.O., Mori, T.A.K.E.O., Koike, M. and Ushio, K., 1996. Molecular nature of colon tumors in hereditary nonpolyposis colon cancer, familial polyposis, and sporadic colon cancer.Gastroenterology, 111(2), pp.307-317.   
    17. Malumbres, M. a`nd Barbacid, M., 2003. RAS oncogenes: the first 30 years. Nature Reviews Cancer, 3(6), pp.459-465.    
    18. Mancini, I., Santucci, C., Sestini, R., Simi, L., Pratesi, N., Cianchi, F., Valanzano, R., Pinzani, P. and Orlando, C., 2010. The use of COLD-PCR and high-resolution melting analysis improves the limit of detection of KRAS and BRAF mutations in colorectal cancer. The Journal of Molecular Diagnostics, 12(5), pp.705-711.    
    19. Mao, C., Zhou, J., Yang, Z., Huang, Y., Wu, X., Shen, H., Tang, J. and Chen, Q., 2012. KRAS, BRAF and PIK3CA mutations and the loss of PTEN expression in Chinese patients with colorectal cancer. PLoS One, 7(5), p.e36653.    
    20. Nagasaka, T., Sasamoto, H., Notohara, K., Cullings, H.M., Takeda, M., Kimura, K., Kambara, T., MacPhee, D.G., Young, J., Leggett, B.A. and Jass, J.R., 2004. Colorectal cancer with mutation in BRAF, KRAS, and wild-type with respect to both oncogenes showing different patterns of DNA methylation. Journal of Clinical Oncology, 22(22), pp.4584-4594.    
    21. Oliveira, C., Velho, S., Moutinho, C., Ferreira, A., Preto, A., Domingo, E., Capelinha, A.F., Duval, A., Hamelin, R., Machado, J.C. and Schwartz, S., 2007. KRAS and BRAF oncogenic mutations in MSS colorectal carcinoma progression. Oncogene, 26(1), pp.158-163.   
    22. Palaghia, M., Prelipcean, C.C., Cotea, E., Vlad, N. and Leneschi, L., 2015. Metastatic Colorectal Cancer: Review of Diagnosis and Treatment Options.Journal of Surgery [Jurnalul de chirurgie], 10(4), pp.249-256.   
    23. Palmirotta, R., Savonarola, A., Ludovici, G., De Marchis, M.L., Covello, R., Ettorre, G.M., Ialongo, C. and Guadagni, F., 2011. Concurrent mutation in exons 1 and 2 of the K-ras oncogene in colorectal cancer. Folia Histochemica et Cytobiologica, 49(4), pp.729-733.   
    24. Rajagopalan, H., Bardelli, A., Lengauer, C., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Velculescu, V.E., 2002. Tumorigenesis: RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair status. Nature, 418(6901), pp.934-934.  
    25. Roberts, M.L., Drosopoulos, K.G., Vasileiou, I., Stricker, M., Taoufik, E., Maercker, C., Guialis, A., Alexis, M.N. and Pintzas, A., 2006. Microarray analysis of the differential transformation mediated by Kirsten and Harvey Ras oncogenes in a human colorectal adenocarcinoma cell line. International journal of cancer, 118(3), pp.616-627.    
    26. Scheffzek, K., Ahmadian, M.R., Kabsch, W., Wiesmüller, L., Lautwein, A., Schmitz, F. and Wittinghofer, A., 1997. The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science, 277(5324), pp.333-339.   
    27. Schubbert, S., Shannon, K. and Bollag, G., 2007. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer, 7(4), pp.295-308.   
    28. Shen, L., Toyota, M., Kondo, Y., Lin, E., Zhang, L., Guo, Y., Hernandez, N.S., Chen, X., Ahmed, S., Konishi, K. and Hamilton, S.R., 2007. Integrated genetic and epigenetic analysis identifies three different subclasses of colon cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(47), pp.18654-18659.  
    29. Sobhani, S., Ghaffarpour, M., Mostakhdemin Hosseini, Z., Kamali, F., Nour Mohammadi, Z. and Houshmand, M., 2010. The prevalence of common mutation frequency in K-ras codons 12, 13 in Iranian Colorectal Cancer patients. Genetics in the 3rd millennium, 8(2), pp.2011-2018.    

  • تاریخ دریافت: 16 اسفند 1394
  • تاریخ بازنگری: 02 خرداد 1395
  • تاریخ پذیرش: 27 مرداد 1395