نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد گیاهان دارویی

2 هیات علمی دانشگاه ارومیه

3 استادیار دانشگاه ارومیه

چکیده

زرین گیاه با نام علمی (Dracocephalum kotschyi Boiss) گیاهی علفی، چندساله و اندمیک ایران از خانواده نعناع است. تحقیقات اخیر دارویی نشان داده است که فلاونوئید متوکسی موجود در قسمت‌‌های مختلف گیاه خاصیت ضدسرطانی دارد. ریشه‌های مویین پس از تلقیح ریزنمونه برگی با سویه‌ 15834 باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز بدست آمد. در این مطالعه اثر محرکهای زیستی شامل محرک کلشی‌سین در غلظت‌های (0، 01/0، 03/0 و 05/0 درصد) و کیتوسان در غلظت‌های (0، 50، 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر) به مدت 48 ساعت بر رشد ریشه‌های مویین تولید شده و تولید رزمارینیک اسید مطالعه شد. آنالیز واریانس داده‌های حاصل از اثر کلشی‌سین و کیتوسان بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کل، فنل کل و میزان فلاونوئید نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنی‌دار در سطح (P 0.01) قابل مشاهده می‌باشد. بیشترین افزایش در میزان آنتی اکسیدان مربوط به سطح 05/0 درصد می‌باشد (33/90 درصد) و کم ترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نیز در ریشه‌های غیر تراریخت (63 درصد) مشاهده گردید. بیشترین افزایش در میزان آنتی اکسیدان مربوط به سطح 05/0 درصد می‌باشد (33/90 درصد). نتایج آنالیز HPLC نشان داد که بیشترین مقدار رزمارینیک اسید در ریشه‌های تراریخت تیمار شده با محرک کلشی‌سین با غلظت 05/0 درصد به میزان µg /mg DW 8/35 و کیتوسان با غلظت mg/l 100، به میزان µg /mg DW 1/15 و کمترین مقدار رزمارینیک اسید مربوط به ریشه‌های غیر تراریخت (شاهد)، µg /mg DW 8/13 و ثبت گردید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

induction Effects of Colchicine and Chitosan on Rosmarinic Acid Production in Hairy Root Cultures of Zarrin-Giah (Dracocephalum kotschyi Boiss

نویسندگان [English]

  • nasrin ayyobi 1
  • mohamad fattahi 3

چکیده [English]

Dracocephalum kotschyi Boiss belonging to Labiateae family is an herbaceous, pereninal and endemic plant known in Iran as Zarrin-Giah. Recent pharmacological studies demonstrated this plants with methoxylated flavonoids, have anti-cancer effects. Hairy roots were obtained from leaves explants, inoculated with 15834 strain of Agrobacterium rhizogenesis. In present study, The effects of biotic elicitors including, Colchicine with different cocentrations ( 0, 0.01, 0.03 and 0.05% (w/v)) and Chitosan (0, 50, 100 and 150 mg/l) for 48 hours on hairy root growth and Rosmarinic acid production were investigated. ANOVA results of Antioxidant activity, total phenol and total flavonoids showed significant difference among the various treatments (P<0.01). maximum Antioxidant activity (90.23%) was observed in 0.05% colchicine and lowest Antioxidant activity (63%) was observed in non-transformed roots. HPLC analysis revealed that the maximum Rosmarinic acid content (35.8 and 15.1 µg /mg DW ) obtained in colchicine (0.05%) and chitosan (100 mg/l) respectively. Although minimum Rosmarinic acid content (13.8 µg /mg DW) were recorded in non-transformed roots. based on the importance of rosmarinic acid production in the pharmaceutical industry, the results showed that using biotechnological methods, production improving of valuable medicinal substances is acceptable.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Agrobacterium rhizogenes
  • Rosmarinic acid
  • Hairy Roots
  • Elicitors

اثر القایی کیتوزان و کلشی­سین بر تولید رزمارینیک اسید در ریشه مویین زرین گیاه (Dracocephalum kotschyi Boiss) 

نسرین ایوبی، بهمن حسینی* و محمد فتاحی 

ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

تاریخ دریافت: 19/10/94              تاریخ پذیرش: 27/2/95

چکیده 

زرین گیاه با نام علمی (Dracocephalum kotschyi Boiss) گیاهی علفی، چندساله و اندمیک ایران از خانواده نعناع است. تحقیقات اخیر دارویی نشان داده است که فلاونوئید متوکسی موجود در پیکره رویشی گیاه خاصیت ضدسرطانی دارد. ریشه­های مویین پس از تلقیح  ریزنمونه برگی با  سویه 15834 باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز به دست آمد. در این مطالعه اثر محرکهای زیستی شامل محرک کلشی­سین در غلظتهای (0، 01/0، 03/0 و 05/0 درصد) و کیتوزان در غلظتهای (0، 50، 100 و 150 میلی­گرم در لیتر) به مدت 48 ساعت بر رشد ریشه­های مویین تولید شده و تولید رزمارینیک اسید مطالعه شد. آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر کلشی­سین و کیتوزان بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کل، فنول کل و میزان فلاونوئید نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنی­دار وجود دارد. بیشترین افزایش در میزان آنتی اکسیدان (33/90 درصد) مربوط به سطح 05/0 درصد کلشی­سین می باشد و کمترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نیز در ریشه­های غیر تراریخت (63 درصد) مشاهده گردید. نتایج آنالیز HPLC نشان داد که بیشترین مقدار رزمارینیک اسید در ریشه­های تراریخت تیمار شده با محرک کلشی­سین با غلظت 05/0 درصد به میزان µg /mg DW 8/35 و کیتوزان با غلظت mg/l 100، به میزان µg /mg DW 1/15 و کمترین مقدار رزمارینیک اسید مربوط به ریشه­های غیر تراریخت (شاهد)، µg /mg DW 8/13 و ثبت گردید. با توجه به اهمیت تولید رزمارینیک اسید در صنعت داروسازی، نتایج مطالعه نشان داد که با استفاده از روشهای فنآوری زیستی امکان بهبود تولید ترکیبات ارزشمند دارویی فراهم می باشد. 0441-32779558

واژه های کلیدی: آگروباکتریوم رایزوژنز، رزمارینیک اسید، ریشه مویین، محرک

* نویسنده مسئول، تلفن: 32779558-0441 ، پست الکترونیکی: b.hosseini@urmia.ac.ir

مقدمه

 

جنس Dracocephalum از مهم­ترینجنسهایتیرهنعناع بوده که شامل 186 گونه می باشد که 8 گونه آن در ایران می­روید. یکی از گونه­های مهم بومی این جنس در ایرانDracocephalum kotschyi Boiss است که در قسمتهایی از شمال، غرب و مرکز ایران یافت می­شود (28). این گونه انحصاری با نام زرین گیاه (20=n2) و بادرنجبویه دنایی مشخص می­شود. زرین گیاه یکی از گیاهان در معرض انقراض ایران می باشد (5).

تحقیقات اخیر نشان داده است که ترکیبات  موجود در زرین

گیاه از لحاظ دارویی ارزشمند بوده و حاوی اسانس، فلاونوئید، رزمارینیک اسید و گلیکوزیدهای مونوترپن می باشد. پیکره رویشی زرین گیاه حاوی اسانس بوده و درصد آن بین 6/0 تا 67/1 (حجمی به وزنی) گزارش شده است (3). رزمارینیک اسید دارای فعالیتهای زیستی  قابل توجهی از جمله: ضد ویروس، ضد باکتری، ضد فسادپذیری و آنتی­اکسیدانی است (37).

با توجه به اینکه امروزه روشهای قدیمی و کلاسیک تکثیر و اصلاح گیاهان به تنهایی جواب­گوی بسیاری از نیازها نمی باشد، لازم است روشهای جدیدتری جایگزین یا تکمیل کننده روشهای قبلی مورد استفاده قرار گیرد. مناسب­ترین راه برای رسیدن به این هدف، استفاده از روشهای زیست فناوری می باشد (4). سیستم آگروباکتریوم، اولین سیستم تراریختی موفق در گیاهان می‍باشد که کاربرد آن در سال 1983 میلادی، علائمی از برطرف شدن موانع در مهندسی ژنتیک گیاهی می باشد (10). القاء ریشه موئین به پارامترهای مختلفی وابسته است مثل: گونه گیاهی، سن و بافت گیاهی. عموماً نمونه­های جوان به باکتری­ها خیلی حساس هستند (31). مطالعات قبلی روی القای ریشه مویین از ریز نمونه­های برگی و گیاهچه­های یک ماهه Dracocephalum kotschyi توسط سویه های مختلف آگروباکتریوم رایزوژنز (LBA 9402 ،A13 ،ATTCC15834 ،A4 و MSU 440) نشان داد که بالاترین درصد تراریختی (60 درصد) از سویه ATTCC 15834 حاصل گردید (2).

افزایش تولید متابولیتهای ثانویه، از طریق محرکها در کشت سلولی گیاه، فضای مطالعاتی جدیدی باز کرده است که می‍تواند منافع اقتصادی مهم برای صنایع زیستی داشته باشد که بسیاری از این ترکیبات از ارزش بالای دارویی برخوردارند (7 و 20). کیتوزان پلی ساکاریدی است که به فراوانی در طبیعت از صدف و سایر سخت پوستان دریایی از جمله
 Pandalus borealisو دیواره سلولی قارچها به­دست می­آید (17). در ریحان کیتوزان موجب افزایش مقدار ترکیبات فنولی کل و ترپن­دار، به­ویژه اسید رزمارینیک و اوژنول می­شود (21). در تحقیقی اثر کیتوزان 150 میلی گرم در لیتر روی ریشه مویین Artemisinin annua L. صورت گرفت، و باعث افزایش آرتمیزینین به مقدارµg /mg  8/1 شد (26). کلشی­سین آلکالوئیدی است که برای اولین بار از غدة گل حسرت(Colchicum autumnale)  پاییزه توسط Zeisel در سال1883 استخراج شد (6). با توجه به اهمیت زرین گیاه و ترکیبات بسیار با ارزش این گیاه که کاربرد بسیار فراوانی در داروسازی دارد و با توجه به قرار گرفتن گیاه در لیست گیاهان در معرض انقراض برای استفاده از این گیاه در کوتاه مدت، روشهای کشت بافت شامل کشت سلول و سیستم ریشه مویین می تواند با مقدار کم مواد اولیه انجام شود. بنابراین در پژوهش حاضر برای اولین بار اثر برخی از محرکها مانند کلشی سین و کیتوزان بر میزان مواد مؤثره در این گیاه مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها 

مواد گیاهی: تمامی آزمایشات این پژوهش در قالب طرح کاملاً تصادفی، در آزمایشگاه کشت بافت گیاهی گروه علوم باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه انجام گردید. همچنین مطالعات ژنتیکی و تأیید حضور ژن rol B نیز در پژوهشکده زیست فنآوری دانشگاه ارومیه انجام گردید. برای انجام کار ابتدا بذرهای زرین گیاه، از شرکت پاکان بذر (اصفهان-ایران) خریداری شد. به­منظور برطرف کردن خواب بذر، ابتدا بذور در اسید سولفوریک غلیظ به مدت 10 دقیقه غوطه­ور شدند تا حداکثر جوانه­زنی بذور اتفاق افتد (13). جهت ضدعفونی، بذور ابتدا در اتانول 70 درصد به مدت یک دقیقه غوطه­ور شده و سپس 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده و بعد با هیپوکلریت سدیم 10 درصد تجاری به مدت 10 دقیقه ضدعفونی و در نهایت 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد. لازم به ذکر می باشد که تمام این مراحل در زیر هود لامینار انجام گردید.

القای ریشه مویین: در این آزمایش ریزنمونه­های تهیه شده از برگهای یک هفته­ای با سویه 15834 آگروباکتریوم رایزوژنز )3/0-4/0= (OD به مدت 1 دقیقه به روش غوطه­وری تلقیح داده شد و سپس به محیط کشتMS  انتقال داده شدند و در دمای 28 درجه سانتی گراد و به مدت 48 ساعت در شرایط تاریکی در دمای 2±24 جهت القای ریشه مویین نگهداری شدند و بعد از 48 ساعت نمونه­ها 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده و به روی کاغذ صافی استریل شده جهت جذب آب اضافی انتقال داده شدند. سپس نمونه­ها  به محیط کشتMS  حاوی 200 میلی­گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم جهت حذف باکتری از ریزنمونه منتقل شده و جهت ظهور ریشه­های مویین در شرایط تاریکی و در زیر فویل آلومینیومی نگهداری شدند. 1/0 گرم از لاین پر رشد ریشه­های مویین به شیشه­های مخصوص توری­دار که حاوی 30 میلی­لیتر محیط مایع MS 4/1 بودند در زیر هود لامینار انتقال داده شد و پس از یک هفته شروع به اعمال تیمار اول کیتوزان در 3 غلظت 50، 100 و 150 میلی­گرم در لیتر در 3 تکرار و تیمار دوم کلشی­سین در 3 غلظت 01/0، 03/0 و 05/0 درصد با 3 تکرار در محیط کشت پایه MS مایع و به مدت 48 ساعت اعمال شد. بعد از 48 ساعت نمونه­ها با آب مقطر استریل شسته شده و به محیط کشت مایع MS 4/1منتقل گردید و در همان شرایط محیطی آزمایش قبل )شیکر انکوباتور با دمای 28 درجه سانتی گراد در شرایط تاریکی و با دور 180 دور در دقیقه) نگهداری شدند. ریشه­های گیاهان غیر تراریخت هم به منظور مقایسه در آزمایشات آنالیز بیوشیمیایی و مولکولی با کشت بذر گیاه در محیط کشت پایه MS تهیه گردید.

عصاره­گیری متانولی جهت اندازه گیری آنتی اکسیدان، فنول کل و فلاونوئید: مقدار 1/0 گرم از ریشه­های خشک شده در آون، در هاون آسیاب شده و به داخل لوله آزمایش منتقل گردید. در زیر هود مقدار 10 میلی­لیتر دی اتیل اتر داخل لوله اضافه و به مدت 24 ساعت در یخچال )4 درجه سانتی گراد) نگهداری شد. بعد از چند بار تکان دادن لوله­ها، عصاره اتری حاصله را در زیر هود داخل بشر 10 سی سی منتقل گردید. دوباره مقدار 5 میلی­لیتر از اتر را داخل لوله ریخته و بعد از گذشت 5 ساعت با تبخیر شدن اتر، به ماده جامد باقی مانده مقدار 5 میلی­لیتر متانول 80 درصد اضافه و سپس دیواره ظرف را کاملاً تمیز کرده تا به محلول اضافه بشود و در نهایت عصاره حاصل شده از صافی عبور داده شده و در یخچال 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد (14 و 35) 

فعالیتآنتی­اکسیدانی: جهت اندازگیری فعالیت آنتی­اکسیدانی به 50 میکرو­لیتر از عصاره متانولی نمونه­ها، 950 میکرو­لیتر DPPH  (mol/lit 5-10×6( اضافه و پس از 15 تا 30 دقیقه در طول موج 517 نانومتر اسپکتروفتومتر قرائت و در فرمول زیر جای گذاری شد. جهت تهیه شاهد (بلنگ) آنتی­اکسیدان نیز به روش بالا عمل کرده، فقط به جای عصاره، 50 میکرولیتر متانول 80 درصد اضافه شد (9).

AC : میزان جذب بلنگ 14AC-ASACأ—10"> 0            

AS : میزان جذب نمونه

اندازه­گیری فنول کل: به منظور اندازه­گیری فنول کل ابتدا به 30 میکرو­لیتر عصاره متانولی، 90 میکرو­لیتر آب و 600 میکرو­لیتر فولین 10 درصد اضافه کرده و پس از 5 الی 10 دقیقه، 480 میکرو­لیتر کربنات سدیم 10 درصد اضافه شده و در نهایت 5/1 الی 2 ساعت در جای تاریک نگهداری گردید تا رنگ نمونه­ها به بنفش تغییر کند و سپس با دستگاه اسپکتروفتومتر و طول موج 765 نانومتر قرائت شد. در نهایت مقدار جذب (Y) را در معادله حاصل از کالیبراسیون جای گذاری کرده تا مقدار فنول کل (X) بر حسب (µg/g DW) به دست آید (33).

Y 0.0007X+0.0145

اندازه­گیریفلاونوئیدکل: برای اندازه­گیری فلاونوئید کل به 500 میکرولیتر از عصاره متانولی، 150 میکرو­لیتر نیتریت سدیم 5 درصد اضافه کرده و پس از 5 دقیقه، 300 میکرو­لیتر کلرید آلومینیوم 10 درصد اضافه شده و پس از 5 دقیقه، 1 میلی­لیتر سود 1 مولار اضافه و در نهایت حجم نهایی با آب مقطر به 5 میلی­لیتر رسانده شد و سپس با دستگاه اسپکتروفتومتر و طول موج 380 نانومتر قرائت شد. مقدار جذب (Y) را در  معادله زیر جای گذاری کرده تا مقدار فلاونوئید کل (X) بر حسب ( mg Qu/g DW) به دست آید. از کوئرسیتین به عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده شد (32).

Y 14=0"> .002X+0.011 

تأیید آنالیز PCR برای ریشه مویین: به منظور تأیید حضور ژن rolB، ابتدا DNA ژنومی هریک از ریشه­های مویین به روش CTAB استخراج گردید (19). واکنش زنجیره­ای پلی مراز به منظور تأیید حضور ژن rol B  آگروباکتریوم رایزوژنز در ریشه های مویین انجام گردید توالی آغازگرهای زیر بر اساس توالی ژن در بانکهای اطلاعاتی طراحی و به منظور تکثیر قطعات  780 bpژن rol B مورد استفاده قرار گرفتند:

F : 5´- TGGATCCCAAATTGCTATTCCACGA-3´

R:5´-TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3´

واسرشت­سازی اولیه به مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی گراد سپس 39 سیکل دمایی شامل مرحله واسرشت سازی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای 53 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه و 20 ثانیه، بسط در دمای 72 درجه به مدت 1 دقیقه و 30 ثانیه در نهایت سیکل دمایی 72 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه امجام گرفت. به منظور آماده سازی باکتری به عنوان کنترل مثبت در واکنش PCR، مقداری از کلنی باکتری سویه 15834 در آب مقطر استریل حل شد سپس از محلول حاصل 1 میکرولیتر به تیوپهای حاوی 5/12 میکرو­لیتر PCR master mix، 1 میکرو­لیتر از هر آغازگر و 5/9 میکرو­لیتر آب مقطر استریل دیونیزه اضافه گردید. بعد از انجام واکنشPCR ، 5 میکرولیتر از محصول PCR به همراه 3 میکرولیتر Dye در ژل آگارز 1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید با ولتاژ 80 ولت، به مدت 1 ساعت و 45 دقیقه الکتروفورز گردید. به منظور مشخص شدن اندازه قطعات حاصل از DNA مارکر شرکت فرمنتاز استفاده گردید.

اندازه گیری میزان رزمارینیک اسید در نمونه­های ریشه مویین زرین گیاه: در این پژوهش از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا مدل 1100 اجیلنت، مجهز به پمپ گرادیان چهار حلالی، با دتکتور فوتودیوداری، ستون C18، 30 سانتیمتری استفاده گردید. برای تهیه عصاره­ها از دستگاه اولتراسونیک یوروندا کشور ایتالیا و همچنین برای توزین ترازوی آزمایشگاهی آنالیتیکال به دقت 0001/0و 01/0 گرم مدل ED1245 شرکت سارتوریوس استفاده شد. برای کمی سازی رزمارینیک اسید در نمونه­ها، ابتدا محلول مادر 500 میلی­گرم در لیتر از رزمارینیک اسید در حلال استونیتریل تهیه شد. پنج غلظت متفاوت 1، 6، 30، 60، 120 و 240 میلی­گرم بر لیتر از رقیق سازی محلول مادر تهیه شد و با تزریق مستقیم 20 میکرو­لیتر از آن به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا زمان بازداری و سطح زیر پیک آنها مشخص شد. منحنی کالیبراسیون با استفاده از داده­های به دست آمده رسم گردید و معادله کالیبراسیون به دست آمد. بعد از رسم منحنی کالیبراسیون، نمونه­های ریشه در هاون پودر و یکنواخت شد. برای تهیه عصاره از نمونه­ها، حدود 1/0 گرم از ریشه توزین و به لوله آزمایش منتقل گردید. 2 میلی­لیتر از آبی که 1 درصد اسید استیک دارد به آن افزوده و پس از همزنی کامل به دستگاه اولتراسونیک منتقل گردید تا تحت امواج مافوق صوت قرار گیرد و تماس حلال استخراج کننده با نمونه کامل گردد. سپس نمونه سانتریفیوژ شده و از فاز بالایی و شفاف بعد از گذراندن از فیلتر به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا تزریق گردید. سطح زیر پیک کروماتوگرامهای نمونه­های ریشه محاسبه شده و در معادله کالیبراسیون قرار گرفت و غلظت رزمارینیک اسید در نمونه­های ریشه بر حسب  (µg /mg DW) محاسبه گردید.

آنالیزآماری: تمام آزمایشات در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام گردید. داده­های حاصل از آزمایشات در نرم افزار SAS 9.1 مورد تجزیه وتحلیل آماری قرار گرفتند. مقایسات میانگین داده­ها بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن انجام گرفت و نمودارها با استفاده از نرم افزارExcel 2007  رسم گردید.

نتایجو بحث

تأثیر کلشی­سین بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی: آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر کلشی­سین بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنی­دار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 1). بیشترین افزایش در میزان آنتی اکسیدان مربوط به سطح 05/0 درصد می باشد (33/90 درصد). این مقدار 23/1 برابر میزان آنتی اکسیدان در ریشه­های مویین تیمار نشده و 43/1 برابر ریشه­های غیرتراریخت می باشد. کمترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نیز در ریشه­های غیر تراریخت (63 درصد) مشاهده گردید (شکل1 الف).

 

 

جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر کلشی­سین بر فعالیت آنتی اکسیدانی، فنول کل و فلاونوئید کل در ریشه­های مویین زرین گیاه

میانگین مربعات

درجه

منابع تغییرات

فلاونوئید کل

فنول کل

فعالیت آنتی­اکسیدانی

 

 

**975/4279

**702/1034635

**766/339

4

کلشی سین

183/15

247/49282

066/20

10

اشتباه آزمایش

25/4

13/6

70/5

 

ضریب تغییرات (درصد)

** نشان دهنده معنی دار در سطح احتمال 1 درصد، می باشد.

شکل 1- نمودار اثرات کلشی­سین بر الف: فعالیت آنتی اکسیدانی کل، ب: فنول کل، ج: فلاونوئید کل ریشه­های مویین زرین گیاه. حروف مشابه نشان دهنده عدم اختلاف در سطح احتمال 5 درصد آزمون دانکن می باشد.

 

الف

 

ج

 

ب


تأثیرکلشی­سین بر میزان فنول کل: آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر کلشی­سین بر میزان فنول کل نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنی­دار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 1). افزایش سطح کلشی­سین تا 05/0 درصد با افزایش تولید فنول کل (µg/g DW61/1632) همراه بود. این مقدار 45/1 برابر میزان فنول کل در ریشه­های مویین تیمار نشده و 29/11 برابر ریشه­های غیرتراریخت بود. کمترین میزان فنول کل نیز در ریشه­های غیر تراریخت (µg/g DW52/144) مشاهده گردید (شکل1 ب).

تأثیر کلشی­سین بر میزان فلاونوئید کل: آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر کلشی­سین بر میزان فلاونوئید کل نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنی­دار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 1). افزایش کلشی­سین تا سطح 05/0 درصد با افزایش تولید فلاونوئید کل همراه بود (mg/g DW50/143). این مقدار 41/2 برابر میزان فلاونوئید کل در ریشه­های مویین تیمار نشده و 66/2 برابر ریشه­های غیرتراریخت می باشد. کمترین میزان فلاونوئید کل نیز در ریشه­های غیر تراریخت (µg/g DW83/53) مشاهده گردید (شکل1 ج).

نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش غلظت کلشی­سین در محیط کشت تجمع هر فاکتور ماده آنتی اکسیدان، فلاونوئید کل و فنول کل افزایش یافت ولی در این تحقیق بررسی در زمینه تغییر سطح پلوئیدی ریشه­ها انجام نگردید. افزایش رشد ریشه­های مویین در اثر تیمار با کلشی­سین می تواند به این دلیل باشد که کلشی­سین منجر به افزایش سطح پلوئیدی شده و در نتیجه مضاعف شدگی مستقیم ژنومیک به وجود می­آیند، مواد ژنتیکی آنها مشابه باقی مانده و فقط دز ژنی افزایش می آید، بنابراین منجر به افزایش تولید متابولیتها در اتوتتراپلوئیدها می­شود. یک مدل رایج جهت توجیه این تغییرات را، کاهش نسبت غشای هسته به مقدار کروماتین آن می­دانند. این کاهش سطح منجر به افزایش تماس ماده کروماتینی با غشای هسته­ای و در نتیجه افزایش فعالیت ژنی و بهبود روابط آبی، وضعیت هورمونی و سرعت فتوسنتز به ازای هر سلول را به دنبال دارد (25). از آنجا که فرض بر آن است که با دو برابر شدن ژنوم فعالیت متابولیکی، سنتز rRNA و نسخه برداری افزایش یابد، این افزایش می تواند بر میزان تنفس (8)، فعالیت ژنی و میزان فعالیت آنزیمها تأثیر داشته باشد (27). شواهد به دست آمده از آنالیزهای شیمیایی آلوپلی­پلوئید نشان می­دهد که چنین پلی­پلوئیدهایی از لحاظ ترکیبات فنولی غنی­تر بوده و نسبت به والدین خود تنوع آنزیمی بیشتری نشان می­دهند (12). یافته­های این تحقیق با نتایج تحقیقات  Dejessus- Gonzalezو Weathrs (11) در درمنه (Artemisia annua) و Lavania (23) در گیاه عطری ویتور (Vetiveria zizanioides L.) (24) مطابقت دارد.

تأثیر کیتوزان بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی: آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر کیتوزان بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنی­دار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 2). با افزایش غلظت کیتوزان تا سطح mg/l100 فعالیت آنتی اکسیدانی افزایش نشان داد (66/89 درصد). این مقدار 22/1 برابر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی در ریشه­های مویین تیمار نشده و 42/1 برابر ریشه­های غیرتراریخت بود. کمترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نیز در ریشه­های غیر تراریخت (63 درصد) مشاهده گردید (شکل 2 الف).

تأثیر کیتوزان بر میزان فنول کل: آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر کیتوزان بر میزان فنول کل نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنی­دار در سطح (01/0 P<) وجود دارد (جدول 2). نتایج نشان داد که افزایش سطح کیتوزان تاmg/l 100 باعث افزایش در میزان فنول کل شد. بیشترین افزایش در میزان فنول کل مربوط به سطحmg/l 100 با میانگین µg/g WD 85/1617 و کمترین میزان فنول کل در ریشه­های غیر تراریخت با میانگین µg/g DW52/144 بود. همچنین با افزایش غلظت کیتوزان به mg/l150 میزان فنول کل تولید شده نسبت به مقدار آن در ریشه­های تیمار شده باmg/l 50 تفاوت معنی­داری وجود نداشت (شکل 2 ب ).

 

جدول 2- تجزیه واریانس تأثیر کیتوزان بر وزن تر و خشک، فعالیت آنتی اکسیدانی، فنول کل و فلاونوئید کل در ریشه­های مویین زرین گیاه

منابع تغییرات

درجه آزادی

منابع تغییرات

فلاونوئید کل

فنل کل

فعالیت آنتی­اکسیدانی

وزن خشک

وزن تر

مواد مؤثره

وزن تر و خشک

 

**141/907

**817/1002488

**833/288

00009/0 ns

**449/0

4

3

کیتوزان

616/40

976/3019

600/7

00003/0

016/0

10

8

اشتباه ازمایش

67/8

86/4

61/3

39/6

10/10

 

 

ضریب تغییرات (درصد)

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی دار در سطح احتمال 1 درصد و عدم وجود اختلاف معنی دار می باشد.

 

شکل 2- نمودار اثرات کیتوسان بر الف: فعالیت آنتی اکسیدانی کل، ب: فنول کل، ج: فلاونوئید کل ریشه­های مویین زرین گیاه. حروف مشابه نشان دهنده عدم اختلاف در سطح احتمال 5 درصد آزمون دانکن می باشد.

 

 

الف

 

ب

 

ج

 

تأثیر کیتوزان بر میزان فلاونوئید کل: آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر کیتوزان بر میزان فلاونوئید کل نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنی­دار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 2). افزایش سطح کیتوزان تا سطح mg/l 100 باعث افزایش در میزان فلاونوئید کل شد. بیشترین افزایش در میزان فلاونوئید کل مربوط به سطحmg/l  100 با میانگین (µg/g DW33/96) و کمترین میزان فلاونوئید کل در ریشه­های غیر تراریخت با (µg /g DW83/53) مشاهده گردید. با افزایش غلظت کیتوزان بهmg/l 150 میزان فلاونوئید کل تولید شده نسبت به مقدار آن در ریشه­های تیمار شده باmg/l 50 تفاوت معنی­داری نشان نداد ( شکل 2 ج).

نتایج مطالعه نشان داد که با تغییر غلظت کیتوزان، خصوصیات بیوشیمیایی ریشه­های مویین تحت تیمار تحریک­زایی تغییر می­یابد اما این تغییر رابطه مستقیمی با افزایش غلظت عنصر محرک ندارد و می تواند در یک غلظت بهینه، حداکثر تغییرات بیوشیمیایی مشاهده و در بعد از آن یا کاهش در خصوصیات بیوشیمیایی و ترکیبات تولیدی اتفاق بیفتد و یا اینکه تغییر معنی­داری بین غلظتهای بالای مورد استفاده و غلظت بهینه وجود نداشته باشد. نتایج سایر مطالعات نیز نشان داده است که غلظت محرک نقش مهمی در فرآیند تحریک دارد و عامل مؤثری بر شدت پاسخ است. غلظت مؤثر محرک بر حسب گونه گیاهی متفاوت است، به طوری که غلظتی از محرک که در یک گیاه اثر تحریکی بر متابولیتهای ثانویه دارد، ممکن است در گیاه دیگر اثری نداشته باشد. در غلظتهای بالا، محرکها واکنش فوق حساسیت را القاء می­کنند که منجر به مرگ سلولها می­گردد در حالی که غلظتهای پایین سبب القای واکنشهای دفاعی می­گردد (21). مکانیسم اثر محرکهای زیستی در گیاهان به خوبی مشخص نشده است ولی به نظر می رسد که محرکهای زیستی (کیتوزان) به ترکیبات دیواره سلولی حمله می­کنند و در پی پاسخ به پیام محرک، سیستم دفاعی گیاه فعال می­شود. محرکها به وسیله گیرنده­ گیاهی یا R پروتئین شناسایی می­شوند. شناسایی در دیواره پلاسما، آغاز سیگنال پاسخ­دهی می باشد. بعد از سیگنال تحریک، گیرنده­های گیاهی سیگنال اجرایی­شان را مثل نشت یونی، انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال، فسفریلاسیون و دفسفریلاسیون پروتئینها را به کار می­اندازد و به وسیله مولکولهای پیام­بر دوم مثل H2O2، اسید جاسمونیک، اسید سالسلیک، آزادکننده­های کلسیم داخلی و تلفیق چند ژن و سرانجام بیان ژن دفاعی مانند فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) باعث تولید فیتوآلکسین­هایی مانند فنولها می­شوند. با این حال این وقایع و بر همکنش بین آنها پیچیده و هنوز در حال بررسی است (36). یافته­های این تحقیق با نتایج بیضایی و همکاران در تربچه (Raphanus sativus L.) (1) مطابقت دارد.

ریزنمونه­های گیاهی تلقیح شده با سویه 15834 آگروباکتریوم رایزوژنز بعد از یک هفته ریشه­ مویین تولید کردند (شکل 3). نتایج آنالیزPCR  برای ریشه­های تراریختی احتمالی، حضور قطعه­ایی حدوداً به طول bp 780 مربوط به ژنrol B  برای ریشه­های حاصل از تلقیح با باکتری A.rhizogenes را نشان داد که هم اندازه قطعات تکثیر شده در نمونه کنترل مثبت (باکتری A. rhizogenes) بود، در صورتی که در ریشه­های شاهد (ریشه­های غیر تراریخت) به علت عدم تلقیح با A. rhizogenes  هیچ نواری مشاهده نگردید (شکل 4).

میزان رزمارینیک اسید: مقدار رزمارینیک اسید در ریشه­های غیرتراریخت، و ریشه­های مویین تحت تأثیر محرکهای مختلف به وسیله دستگاه HPLC اندازگیری شد (شکل 5). مطابق (جدول 3) مقدار رزمارینیک اسید، کمترین مقدار رزمارینیک اسید مربوط به ریشه­های غیر تراریخت، µg /mg DW 8/13 و بیشترین مقدار رزمارینیک اسید در ریشه­های تراریخت تیمار شده با محرک کلشی­سین با غلظت 05/0 درصد به میزان µg /mg DW 8/35 و کیتوزان با غلظت mg/l 100، به میزان µg /mg DW 1/15 می باشد. در تحقیق حاضر تجمع رزمارینیک اسید در ریشه­های مویین احتمالاً به دلیل برخی تغییرات بیوشیمیایی در متابولیسم گیاه-آگروباکتریوم رایزوژنز می باشد (16). مقدار رزمارینیک اسید در ریشه­هایی که با محرکها تیمار شده­اند خیلی بیشتر از ریشه­های تیمار نشده بود. بیوسنتز متابولیتهای ثانویه در ریشه­های مویین به صورت ژنتیکی کنترل می­شود، اما مواد غذایی و شرایط محیطی نیز بر آن مؤثر می باشد (30).

جدول 3- اندازه گیری اسید رزمارینیک در تیمارهای مختلف زرین گیاه

نمونه

غلظت اسید رزمارینیک (میکروگرم بر گرم وزن خشک)

ریشه­های غیر تراریخت

8/13

ریشه­های تراریخت تحت تیمار کلشی­سین

8/35

ریشه­های تراریخت تحت تیمار کیتوزان

1/15

در این مطالعه دو نوع محرک زیستی جهت تحریک تولید رزمارنیک اسید مورد استفاده قرار گرفت که نتایج آنالیز HPLC تغییر در میزان اسید رزمارینیک را در هر دو تیمار نشان داد. در ارتباط با دلیل اصلی اثر این محرکها بر تغییر تولید متابولیتهای ثانویه مطالعه جامعی انجام نشده است اما احتمال می رود که کلشی­سین با جلوگیری از به هم پیوستن زیر واحدهای میکروتوبول )پروتئین توبولین( و یا با از هم باز نمودن آنها مانع از تشیکیل دوک در هنگام تقسیم سلولی شده، کروموزومها را در مرحلۀ متافاز متوقف می­کند و مانع وقوع آنافاز در آنها می گردد. بنابراین، تقسیم سلولی بدون تشکیل دیوارة سلولی رخ می­دهد که منجر به دو برابر شدن شمار کروموزومها در سلول گیاهی می­گردد (18 و 34).

Yan و همکاران (38) تجمع رزمارینیک اسید و فعالیت آنزیمهای تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) و فنیل آلانین آمونیالیاز ((PAL را در Salvia miltiorrhiza تحت تیمار عصاره مخمر و + Agبررسی کردند. نتایج نشان داد که هر دو محرک منجر به تجمع رزمارینیک اسید گردید.

 

 

 

الف

 

د

 

ج

 

ب

 

شکل 3– القای ریشه مویین در ریزنمونه ­های مختلف گیاه زرین گیاه

الف) ریزنمونه­های برگ و میانگره یک هفته­ای زرین گیاه کشت شده در محیط MS جامد. ب) ظهور ریشه­های مویین روی ریزنمونه­های برگ یک هفته­ای ج) ریشه­ مویین (لاین پررشد) در محیط کشت جامد MS د) ریشه­ مویین (لاین کم رشد) در محیط MS جامد

 

         M          C+                C1-              C2-          1            2             3           4                    

 

1000 bp

 

100 bp

 

500 bp

 

شکل 4- آنالیز واکنش زنجیره­ای پلی­مراز جهت تأیید حضور ژنrol B  در ریشه­های تراریخت زرین گیاه. .M : DNA مارکر 1kb (Fermentase). C+: باکتری آگروباگتریوم سویه 15834 به عنوان کنترل مثبت.-1C: واکنش PCR بدون DNA به عنوان کنترل منفی اول. -2C: ریشه­های شاهد غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی دوم. لاین 1-4: ریشه­های مویین القاء شده در ریزنمونه­های برگ یک هفته­ای توسط سویه 15834 آگروباکتریوم رایزوژنز. 

 

 

 

الف

 

ج

 

ب

 

شکل 5- کروماتوگرام HPLC برای تعیین مقدار رزمارینیک اسید ریشه های مویین گیاه بذرالبنج مشبک

الف) نمونه استاندارد. ب) ریشه­های تیمار شده با کلشی­سین (05/0 درصد). ج) ریشه­های تیمار شده با کیتوسان (mg/l100).

 

به کارگیری محرکها یکی از موفق­ترین استراتژیها در افزایش متابولیتهای ثانویه از جمله رزمارینیک اسید هستند. محرکها به عنوان محرکهای دفاعی و القاء کننده تنش در گیاه تعریف می­شوند که به صورت مستقیم و غیرمستقیم با فعال کردن ژنهای مرتبط با بیوسنتز ترکیبات ثانویه سبب افزایش تولید این ترکیبات می­گردند و میزان اثر محرکها بر تولید متابولیتهای ثانویه معمولاً به غلظت و زمان وابسته است (36). کیتوزان باعث تولید فیتوآلکسین­ها (29) و بسیاری از ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی(21)  می­شود. سنتز ترکیبات دفاعی گیاه پس از تحریک با کیتوزان، معمولاً مرتبط با فعالیتهای فیزیولوژیکی، عمدتاً به­عنوان آنتی­اکسیدانها به­عنوان مثال پلی­فنولها است (15).  همچنین کیتوزان جهت افزایش عملکرد بسیاری از ترکیبات مفید در کشتهای آزمایشگاهی در بافتها و گیاهان کامل مورد استفاده قرار گرفته است. به­ عنوان مثال، در ریحان کیتوزان موجب افزایش مقدار کل ترکیبات فنولی و ترپن­دار، به­ویژه اسید رزمارینیک و اوژنول شد (22).

نتیجه­گیری

زرین گیاه از گیاهان  دارویی مهم و  باارزش  می باشد  که

به دلیل عدم توجه کافی دارای مشکلات متعددی می باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که امکان القاء و تولید ریشه مویین به راحتی با استفاده از انتخاب سویه و ریزنمونه مناسب فراهم بوده و استفاده از محرکهای مختلف می توان باعث ایجاد تغییر در تولید متابولیتهای ثانویه به ویژه رزمارینیک اسید شود. با تغییر نوع محرک و غلظت آن امکان تغییر متابولیتهای ثانویه و آنزیمهای آنتی اکسیدانی وجود دارد. به نظر می رسد با انتخاب و تعیین محرک مناسب زیستی یا غیر زیستی به راحتی امکان تولید متابولیتهای با ارزش از طریق کشت ریشه مویین فراهم گردد.

1- بیضایی، س.، صفی­پور افشار، ا. و سعید نعمت­پور ف. (1394). تولید ترکیبات فنولی درکشت ریشه‌های مویین گیاه تربچه (Raphanus sativus L.). مجله پژوهش­های سلولی و ملکولی، (انتشار ان لاین).

2- شرفی، ع.، هاشمی، ه.، موسوی، ا. و آزادی، پ. (1392). باززایی گیاه داروییDracocephalum kotschyi  پس از القاء ریشه موئین. هشتمین همایش ملی زیست فناوری، دانشگاه تهران، 28 (3): 215-208.

3- فتاحی، م. (1391). ارزیابی تنوع مورفولوژیک، فیتوشیمیایی و تولید ریشه موئینه در بادرنجبویه دنایی. رساله دکتری، دانشگاه تهران،220 ص.

4- مشایخی، ک. (1386). جنین زایی رویشی گیاهی. انتشارات فراغی، 483 ص.

5- مظفریان، و.ا. (1382). فرهنگ نام­های گیاهان ایران. انتشارات فرهنگ معاصر، 740 ص.

 

6- Ade, R. and Kumar Rai, M. (2010). Review: Colchicine, current advances and future prospects. Nusantara Bioscience, 2: 102-125.

7- Angelov, Z., Georgiev., S. and Roos, W. (2006). Elicitation of plants. Biotechnology and Biotechnology, 20:2.

8- Byrne, M.C., Nelson, C.J. and Randall, D.D. (1981). Ploidy effects on anatomy and gas exchange of tall fescue leaves. Plant physiology, 68: 891-893.

9- Chiou, A., Karathanos, V.T., Mylona, A., Salta, F.N., Preventi, F. and Andrikopoulos, N.K.) 2007(. Currants (Vitis vinifera L.) content of simple phenolics and antioxidant activity. Food Chemistry, 102: 516-522.

10- Chawla. H.S. (2000). Introduction to plant biotechnology. 500pp.

11- De Jesus-Gonzalez, L. and Weathers, P.J. (2003). Tetrapolid Arttemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploids. Plant Cell Reports, 21: 809-813.

12-  Dhawan, O.P. and Lavania, U.C. (1996). Enhancing the productivity of secondary metabolites via induced polyploidy: A Review. Euphytica, 87: 81-89.

13- Fattahi, M., Nazeri, V., Sefidkon, F., Zamani, Z. and Palazon, J. (2011). The effect of pre-sowing treatments and light on seed germination of Dracocephalum kotschyi Boiss: An endangered medicinal plant in Iran. Horticulture, Environment, and Biotechnology, 52: 559-566.

14- Fattahi, M., Nazeri, V., Torras-Claveria, L., Sefidkon, F., Cusido, R.M., Zamani, Z. and Palazon, J. (2013). Identification and quantification of leaf surface flavonoids in wild-growing populations of Dracocephalum kotschyi by LC-DAD-ESI-MS. Food Chemistry, 141: 139-146.

15- Ferri, M. and Tassoni, A. (2011). Chitosan as elicitor of health beneficial secondary metabolites in vitro plant cell culture. Ibm Journal of Research and Development, 1: 445-455.

16- Gandi, S. and Giri, A. (2012). Genetic transformation of Centella asiatica by Agrobacterium rhizogenes. Journal of Pharmacognosy, 3(2): 82-84.

17- Gavhane, Y., Gurav, A. and Yadav, A. (2013). Chitosan and its applications. Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 4: 312-331.

18- Gupta, P. K. (2002). Cytology Genetics and Evolution. Rastogi Publications. India, 864p.

19- Khan, S., Irfan, Q.M., Kamaluddin, A.T. and Abdin, M.Z. (2007). Protocol for isolation of genomic DNA from dry and fresh roots of medicinal plants suitable for RAPD and restriction digestion. African Journal of Biotechnology, 6: 175-178.

20- Khosroushahi, A.Y., Valizadeh, M., Ghasempour, A., Khosroushahi, M., Maghdibadi, H., Dadpour, M.R. and Omidi, Y. (2005). Improved Taxol production by combination of inducing factors in suspension cell culture of Taxus bacata. Cell Biology International Reports, 30(3): 9-262.

21- Kim S.J., Lee S.Y. and Park, S. (2004). Agrobacterium mediated genetic transformation of Perilla frutescens. Plant Cell Reports, 23: 386-390.

22- Kim, S.J., Lee, S.Y. and Park, S. (2009). An efficient protocol for peant (Arachis hepogaea L) transformation mediated by Agrobacterium rhizogenes. Romanion Biothechnological Letters, 14(5): 4641-4647.

23- Lavania, U.C. (1988). Development of fertile autotetrapliod strain in Hyoscyamus muticus. Journal of Tropical Agricultural, 65: 277-278.

24- Lavania, U.C. (1988). Enhanced productivity of the essential oil in the artificial autotetraploid of Vetiver (Vetiveria zizanioides L.). Euphytica, 38: 271-276.

25- Levin, D.A. (1983). Polyploidy and novelty in flowering plants. American Naturalist, 122:1-25.

26- Putalun, W., Luealon, W., De-Eknamkul, W., Tanaka, H., & Shoyama, Y. (2007). Improvement of artemisinin production by chitosan in hairy root cultures of Artemisia annua L. Biotechnology letters29(7), 1143-1146.

27- Randall, D.D., Nelson, C.J., and Asay, K.H. (1977). Ribulose bisphosphate carboxylase altered genetic expression in tall fescue. Plant Physiology, 59: 38-41.

28- Rechinger, H. )1986(. Labiatae in flora iranica. Akademische Druck Verlagsantalt, Graz, Austria, 701p.

29- Righetti, L., Franceschetti, M., Ferri, M., Tassoni, A. and Bagni, n. (2007) Resveratrol production in Vitis vinifera cell suspensions treated with several elicitors. Caryologia, 60: 169-171.

30- Sevon, N. and Oksman-Caldentey, K.M. (2002). Agrobacterium rhizogenes mediated transformation: root cultures as asource of alkaloids. Planta Medica, 68: 859–868.

31- Sevón, N., Hiltunen, R. and Oksman-Caldentey, K.M. (1992) Chitosan increases hyoscyamine content in hairy root cultures of Hyoscyamus muticus. Pharmaceutical and Pharmacological Letters, 2: 96-99. 

32- Shin, Y., Liu, R.H., Nock, J.F., Holliday, D., Watkins, C.B. (2007). Temperature and relative humidity effects on quality, total ascorbic acid, phenolics and flavonoid concentrations, and antioxidant activity of strawberry. Postharvest Biology and Technology, 45: 349-357.

33- Slinkard, K. and Singleton. V.L. (1977). Total phenol analysis: automation and comparison with manual methods. American Journal of Enology and Viticulture, 28(1): 49-55.

34- Tambong, J. T., Sapra, V.T. and Garton, S. (1998). In vitro induction of tetraploids in colchicine-treated cocoyam plantlets. Euphytica, 104: 191-197.

35- Vieira, R.F., Grayer, R.J., Paton, A. and Simon, J.E. (2001). Genetic diversity of Ocimum gratissimum L. based on volatile oil constituents, flavonoids and RAPD markers. Biochemical Systematics and Ecology, 29: 287-304.

36- Wen Wang, J. and Yong Wu, J. (2010). Tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza and production in plant tissue cultures. Application Microbiology Biotechnology, 88: 437-449.

37- Xiao, Y., Di, P., Chen, J., Liu, Y., Chen, W. and Zhang, L. (2009). Characterization and expression profiling of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene (Smhppd) from Salvia miltiorrhiza hairy root cultures. Molecular Biology Reports, 36: 2019-2029.

38- Yan, Q., Shi, M., Ng, J. and Wu, J.Y. (2006). Elicitor-induced rosmarinic acid accumulation and secondary metabolism enzyme activities in Salvia miltiorrhiza hairy roots. Plant Science, 170: 853-858.