نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

2 عضو هیات علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

چکیده

سیانید ترکیبی بسیار سمی و کشنده است که علیرغم این سمیت در بسیاری از صنایع استفاده می‌شود. فاضلاب صنایع در مقیاس وسیعی حاوی غلظت‌های بالایی از سیانید هستند؛ که به‌منظور تجزیه آن از روش‌های مختلف شیمیایی و فیزیکی استفاده می‌شود. این روش‌ها علاوه بر اینکه پرهزینه هستند؛ در صورت اختلاط با سایر مواد، ترکیبات خطرناک‌تری را نیز تولید می‌کنند. در مقابل استفاده از روش‌ تجزیه زیستی، علاوه بر کاهش هزینه‌ها سازگار با محیط‌زیست نیز هست. مشاهده‌شده است که سیستم‌های میکروبی و گیاهی می‌توانند سیانید را به ترکیبات غیر سمی تبدیل کنند. در این پژوهش با جداسازی باکتری از پساب آلوده به سیانید معدن طلای موته و با بررسی ویژگی‌های مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و 16S rDNA باکتری شناسایی شد. به دنبال دستیابی به بیشترین میزان تجزیه توسط این باکتری‌، شرایط کشت به‌گونه‌ای تغییر داده شد که با پی بردن به فاکتورهای تأثیرگذار بر روند تجزیه، بیشترین بازدهی صورت گیرد. بدین منظور از روش سطح پاسخ(RSM ) استفاده شد. با بهینه‌سازی مقادیر فاکتور‌های تأثیرگذار و در نظر گرفتن برهم‌کنش‌های بین فاکتورها، شرایط کشت بهینه شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Optimization of culture condition of enterobacter ZS extra cellular cyanide degrading enzyme with Response Surface Methodology

نویسندگان [English]

  • zohreh Javasheri 1
  • Saeed Aminzadeh 2
  • mohammad reza zamani 2
  • mostafa motallebi 2

2 Academic Staff

چکیده [English]

Although cyanide is a poisonous and lethal compound, it is used in several industries such as gold extraction. Industrial wastewater contains highly amounts of cyanide. That in order to degrade it, different chemical and physical methods are used. These methods not only include high expenses, but also if they combine with other materials, will produce more hazardous compound as well. On the other hand, utilizing biodegradation method, in addition to decreasing expenses, is environmentally friendly. In this study, bacterium was isolated from Muteh gold mining wastewater. Determination of morphological and biochemical characteristics and 16S rDNA described that the bacterium belong to Enterobacter genus. To achieve the maximum degradation by Enterobacter ZS, culture conditions has been optimized. The variables parameters that effect on the degradation procedure with maximum efficiency was achieved. By optimizing the values of affective factors and consider the interactions between factors, culture conditions were optimized by response surface methodology (RSM).

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cyanide
  • Biodegradation
  • Enterobacter
  • Optimization by Response Surface Methodology
  • Cyanide degrading enzyme

بهینه‌سازی شرایط کشت آنزیم خارج سلولی تجزیه‌کننده سیانید باکتری  انتروباکتر ZS به روش سطح پاسخ

زهره جواهری صفا1و2، سعید امین زاده1*، محمدرضا زمانی1 و مصطفی مطلبی1

1 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست‌فناوری

2 میمه، موسسه آموزش عالی نوردانش

تاریخ دریافت: 5/1/95                  تاریخ پذیرش: 7/3/95

چکیده

سیانید ترکیبی بسیار سمی و کشنده است که علی رغم این سمیت در بسیاری از صنایع استفاده می‌شود. فاضلاب صنایع در مقیاس وسیعی حاوی غلظتهای بالایی از سیانید می­باشند؛ که به‌منظور تجزیه آن از روشهای مختلف شیمیایی و فیزیکی استفاده می‌شود. در مقابل استفاده از روش‌ تجزیه زیستی، علاوه بر کاهش هزینه‌ها سازگار با محیط‌زیست نیز هست. در این پژوهش جداسازی باکتری از پساب آلوده به سیانید معدن طلای موته و بررسی ویژگیهای مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و 16S rDNA جهت شناسایی باکتری انتروباکتر ZS موردنظر انجام شد. به­منظور دستیابی به بیشترین میزان تجزیه توسط این باکتری­، شرایط کشت به‌گونه‌ای بهینه­سازی شد که با دستیابی به فاکتورهای تأثیرگذار باعث تسریع روند تجزیه گردید و برای دست یافتن به بیشترین بازدهی از روش سطح پاسخ (RSM= Response Surface Methodology) استفاده شد. با بهینه‌سازی مقادیر فاکتور­های تأثیرگذار و در نظر گرفتن برهمکنشهای بین فاکتورها، شرایط کشت بهینه شد.

واژه های کلیدی: سیانید، تجزیه زیستی، انتروباکتر، بهینه‌سازی به روش  RSM، آنزیم تجزیه‌کننده سیانید

* نویسنده مسئول: تلفن: 02144787303 ، پست الکترونیکی: aminzade@nigeb.ac.ir

مقدمه


تاریخچه آلودگی با سیانید: سیانید یک مولکول باستانی است که در سنتز پروبیوتیک ترکیبات مختلف نیتروژن­دار از قبیل آمینواسیدها و بازها شرکت می‌کند (13). ازنظر تاریخی، استفاده از HCN به‌عنوان یک جنگ‌ افزار شیمیایی چندان موفقیت‌آمیز نبوده و خاصیت فرّار بودن شدید آن، مانع از مصرف وسیع در جنگ جهانی اول گردید. ماده مورد استفاده توسط آلمانها ترکیبی به نام BZyklon  یا همان سولفات کلسیم اشباع‌شده با HCN  (40 درصد) بود، که به این ترکیبات عوامل خون نیز اطلاق می‌شود (6). سیانید مانع از فعالیت سیستم تنفسی در میتوکندری سلول می‌شود و برای حیات موجودات بسیار سمی است (14). این ترکیب دارای یک الگوی شیمیایی است که در آن یک گروه سیانو  وجود دارد که به علت خواص شیمیایی این گروه به اَشکال متفاوتی در طبیعت یافت می‌شود (10 و 11). سیانید ممکن است به‌عنوان یک ترکیب طبیعی توسط باکتریها، جلبک‌ها، قارچها و گیاهان پیشرفته و حتی بعضی از حشرات، عمدتاً به‌منظور دفاع یا حمله تولید شود (1). قوانین زیست‌محیطی بر پایه پساب صنایعی متمرکز می‌شود که از سیانید و یا ترکیبات مرتبط با سیانید استفاده می‌کنند (12). با این ‌وجود مشکلات محیطی زیادی به علت تولید مقادیر انبوه پسابهای آلوده به سیانید به وجود آمده است که توسط فعالیتهای صنعتی بشر ازجمله تولید نیتریلهای ارگانیک، پلاستیکهای آکریلیک، رنگها، داروها، عناصر کیلیت کننده و استفاده از سیانید در معادن طلا و فلز و صنایع جواهرسازی است که به طرق مختلف وارد محیط‌زیست می‌شوند (10). فعالیتهای صنعتی، ترکیبات آلوده به سیانید از­ قبیل هیدروژن سیانید، تیوسیانات (SCN-) و سیانات (CNO-) را به‌عنوان ضایعات صنعتی به محیط ‌زیست تخلیه می‌کنند (5). صنایعی که در ارتباط با ترکیبات سیانیدی می­باشند، معمولاً از روشهای شیمیایی و فیزیکی برای حذف این ترکیب استفاده می­کنند. این روشها علاوه بر اینکه پرهزینه هستند؛ در صورت اختلاط با سایر مواد، ترکیبات خطرناک‌تری را نیز تولید می‌کنند. مشاهده ‌شده است که سیستمهای میکروبی و گیاهی می‌توانند سیانید را به ترکیبات غیر سمی تبدیل کنند. سیانید به‌شدت برای حیات موجودات سمّی است و با سه مکانیسم عمده مانع رشد آنها می‌شود: 1. پیوند محکمی با فلزات دو و سه‌گانه در متالو­آنزیمها برقرار می‌کند (مثل سیتوکروم­اکسیداز) 2. واکنش با ترکیبات کتونی به‌منظور تشکیل مشتقات سیانوهیدرین از سوبستراهای آنزیم می دهد و 3. واکنش با واسطه‌های باز شیف، هنگام فعالیت آنزیمی برای تشکیل مشتقات نیتریل پایدار (7). سمیّت در انسان می‌تواند منجر به تشنج، استفراغ، کما و مرگ شود. میزان کشنده آن در گسترة 5/0 تا 5/3میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن است. اثرات دوره طولانی‌تر آن به‌خوبی درک نشده است اما می‌تواند شامل اختلالات عصبی، آتروفی بینایی و آنمی کشنده باشد (10).

بهینه‌سازی: سطوح بهینه برای فاکتورها، به هدف انجام فرآیند بستگی دارند. به‌عنوان مثال، ممکن است هدف رسیدن به بیشترین میزان بازده فرآیند و یا کاهش توان تولیدی فرآیند باشد. طراحی سطح پاسخ ازجمله روشهای بهینه‌سازی است که با استفاده از مجموعه‌ای از تکنیکهای ریاضی و آماری، مسائل را مدل‌سازی می­کند و نه‌تنها باعث می‌شود توسط شبیه­سازی اجرای پرهزینه تمامی آزمایشها کاهش یابد بلکه روند طبیعی بهینه‌سازی فرآیند را که اغلب غیرخطی است مدل می‌کند. هدف روش سطح پاسخ، بهینه‌سازی متغیر خروجی است که متأثر از چندین متغیر مستقل (متغیرهای ورودی) است. ایـن روش در سـال ۱۹۵۱ توسـط Wilson و Box معرفـی شد (8). طرح  Box-Behnken تعداد ۳ سطح را برای هر فاکتور اعمال می­کند. بـرای بـرازش بهینه­سازی مدلهای مرتبـه دو به کار گرفته می‌شود و تعداد آزمایشها کمتر از طرح مرکب مرکزی است (2).

مواد و روشها

جداسازی باکتری مقاوم به سیانید: نمونه‌های آب، خاک و پساب از معدن طلای موته گرفته‌شده است، که این معدن در ۲۷۰ کیلومتری جنوب غرب تهران واقع در رشته‌کوه‌های نسبتاٌ پست در جنوب دلیجان - شمال غربی میمه و شمال شرقی گلپایگان است. ارتفاع منطقه از سطح دریا ۱۹۰۰ تا ۲۳۰۰ متر هست.

غربالگری باکتری با مقاومت بیشتر به سیانید: به‌منظور غربال باکتریهایی با مقاومت بالاتر نسبت به سیانید، یک کلنی از باکتریهایی که در محیط کشت جامد رشد کرده‌اند، برداشته و در 5 میلی‌لیتر محیط کشت مایع نوترینت براث تلقیح شدند. بعد از چند ساعت، با رسیدن باکتریها به غلظت نیم مک فارلند، پتاسیم سیانید را با غلظتهای 1/0، 15/0، 25/0، 50/0، 75/0 و 1 میلی­گرم بر میلی­لیتر به محیط کشت حاوی باکتری اضافه کرده، سپس در دمای 37 درجه سانتی گراد، 5/7pH= و شیک rpm 180 در انکوباتور قرار داده ‌شدند.

شناسایی مورفولوژیکی و بیوشیمیایی: در مرحله بعد برای شناسایی باکتری‌، طبق روشهای شناسایی از منابعی مثل Bergey’s manual of systematic bacteriology مشخصات بیوشیمیایی ، فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی باکتری مدنظر موردبررسی قرار  گرفت. و مشخص شد باکتری موردنظر بیشترین شباهت را به انتروباکتر دارد. اطلاعات مربوطه در جدولهای 1و2 آورده شده است (نرم‌افزار GraphPad Prism 6.0) (4).

تعیین توالی بر اساس 16S rDNA : در مرحله بعد به‌منظور تأیید شناساییهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، توالی یابی16S rDNA باکتری انجام شد. بدین منظور استخراج DNA انجام شد و از پرایمرهای یونیورسال 1492R و 27F استفاده  شد (جدول 1).

 

جدول 1- توالی پرایمرهای یونیورسال 27F و 1492R

نام

توالی

27F

5΄AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3΄

1492R

5΄TACGGYTACCTTGTTACGACTT3΄


طراحی آزمایش به‌منظور بهینه‌سازی میزان تجزیه سیانید: سه فاکتور مؤثر بر میزان تجزیه سیانید شامل دما، pH  و پتاسیم سیانید انتخاب شدند و از طرح Box-Behnken که یک روشی از RSM  می­باشد به‌منظور انجام بهینه‌سازی استفاده شد و براساس آن، هر فاکتور در  سه سطح بررسی گردید (جدول 2). به‌منظور انجام بهینه‌سازی به­روش RSM از نرم‌افزار Design Expert7 استفاده شد.

 

جدول 2- محدوده تغییرات فاکتورها در طراحی سطح پاسخ به روش طرح Box-Behnken

فاکتوریل بالا(۱+)

مرکز(۰)

فاکتوریل پایین(۱-)

واحد

متغیرها

50

38

26

دما

9

5/7

6

-

pH

000/1

575/0

150/0

mg.ml-1

پتاسیم سیانید

 

 

بر اساس طرح مرکب مرکزی، 15 آزمایش برای سه فاکتور مؤثر بر پاسخ طراحی شد که شامل تکرارهایی در نقطه‌ مرکزی است. برای بیشینه­سازی یک فرآیند فرآیند شیمیایی (y)،  با توجه به فرمول زیر، این بازدهی تابعی از سطوح دو فاکتور x1 و x2 است. رابطه‌ بین پاسخ و متغیرهای غیر وابسته با استفاده از یک معادله درجه دوم توضیح داده می‌شود. در این معادله  و  اثرات اصلی و اثرات متقابل هستند.

 

معادله درجه دوم به‌دست‌آمده به‌منظور توضیح رابطه بین متغیرهای مستقل و پاسخ در قالب یک نمودار سه ‌بعدی نشان داده می‌شود که نمودار سطح پاسخ سه‌ بعدی نامیده می‌شود که در قسمت نتایج به آن اشاره ‌شده است.

سنجش آمونیاک: به‌منظور سنجش میزان آمونیاک از کیت آمونیاک گرینر استفاده شد.

محاسبه میزان آمونیاک:

 Ammonia [µg/dl] =  ˟ conc.standard [µg/dl]

Ammonia [μg/dl] x 0,588 = Ammonia [μmol/l]

نتایج

نتایج غربالگری باکتری با مقاومت بیشتر به سیانید: به‌منظور غربال باکتریهایی با مقاومت بالاتر نسبت به سیانید، بعد از 24 و 48 ساعت جذب نمونه‌ها در طول‌موج 600 خوانده شد. اختلاف جذب اولیه و جذب نهایی باکتری در سه روز متوالی در منحنی 1 نشان داده‌ شده است.

نتایج شناسایی مورفولوژیکی و بیوشیمیایی: ویژگیهای بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی باکتری مورد نظر مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد باکتری مورد نظر بیشترین شباهت را به انتروباکتر دارد. اطلاعات مربوطه در جدولهای 3 و 4 آورده شده است.

منحنی 1- منحنی رشد انتروباکتر در سه روز متوالی با غلظتهای مختلف سیانید و سه بار تکرار.

نتیجه ثبت ژن بر اساس 16S rDNA : توالی­یابی ژنوم باکتری بر اساس نواحی محافظت شده 16S rDNA با استفاده از واکنشهای زنجیره‌ای پلیمراز صورت گرفت. باکتری موردنظر دارای 100 درصد یکسانی با انتروباکتر بود که ZS نام‌گذاری شد و در پایگاه داده GenBank با شماره دسترسی KU609073 ثبت گردید.

 

 

جدول 3- ویژگیهای مورفولوژیکی باکتری انتروباکتر ZS

ویژگیهای مورفولوژیکی

پیگمان

اسپور

حرکت

گرم

شکل

موکوئیدی

منفی

منفی

منفی

میله ای

 

جدول 4- ویژگیهای بیوشیمیایی باکتری انتروباکتر ZS

ویژگیهای بیوشیمیایی

سیترات

اندول

VP

ONPG

اینوزیتول

اوره

لیزین

مانیتول

لاکتوز

مالتوز

گزیلوز

مثبت

منفی

مثبت

مثبت

مثبت

مثبت

مثبت

مثبت

مثبت

مثبت

مثبت

 


جدول 5- طراحی آزمایش به روش سطح پاسخ با استفاده از سه فاکتور مستقل دما، pH و سیانید و میزان تجزیه در آزمایشهای انجام‌شده.

 

دما (˚C)

pH

سیانید (mg.ml-1)

میزان تجزیه (IU)

1

26

0/6

57/0

33/0

2

26

0/9

57/0

32/0

3

50

0/9

57/0

17/0

4

26

5/7

15/0

19/0

5

50

5/7

15/0

34/0

6

26

5/7

00/1

21/0

7

50

5/7

00/1

49/0

8

38

0/6

15/0

25/0

9

38

0/9

15/0

14/0

10

38

0/6

00/1

27/0

11

38

0/9

00/1

16/0

12

38

5/7

57/0

10/0

13

38

5/7

57/0

10/0

14

38

5/7

57/0

10/0

15

38

5/7

57/0

10/0

نتایج بهینه‌سازی با طراحی آزمایش به روش RSM : تجزیه‌وتحلیل آماری: طراحی آزمایش به روش Box-Behnken به‌منظور تعیین میزان اثر سه فاکتور دما، pH و پتاسیم سیانید بر پاسخ بهینه و برهمکنش بین این فاکتورها، توسط نرم‌افزار Minitab 17.0 و در سه سطح انجام شد. 15 آزمایش توسط این نرم‌افزار طراحی و انجام گردید و میزان آمونیاک تولیدشده به‌عنوان پاسخ محاسبه شد (جدول 5). پس از وارد کردن داده‌ها، پاسخ فرآیند، مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج بهینه‌سازی عاملهای فرآیند: نرم‌افزار Minitab 17.0 در بخش بهینه‌سازی، پس از آنالیز نتایج آزمایش، ترکیبی از سطوح عاملهایی را ارائه می­دهد که شرایط بهینه را (پاسخ بیشینه یا کمینه) برای هر پاسخ فراهم می‌نماید. در اینجا، هدف، دستیابی به شرایط بهینه (بیشینه درصد سیانید تجزیه‌شده) مورد نظر است. شرایط بهینه پیشنهاد شده و مقادیر پیش‌بینی شده در شرایط بهینه توسط نرم‌افزار به ترتیب در جدول 6 آمده است.

جدول6- شرایط بهینه پیشنهادشده توسط نرم‌افزار به روش سطح پاسخ.

پتاسیم سیانید (mg.ml-1)

pH

دما(˚C)

150/0

6

50

 

عموماً در آزمایشهای طراحی‌شده، از تحلیل واریانس به‌منظور تعیین عاملهای مهم و از رگرسیون، در ارائه مدل کمی برای نشان دادن ارتباط بین عاملهای مهم و پاسخ استفاده می‌شود. برای تعیین کمیت یک متغیر مجهول با استفاده از متغیرهای معلوم به‌صورت یک رابطه ریاضی از رگرسیون استفاده می­شود. پس از پیش‌بینی این رابطه ریاضی، اعتبار کل مدل رگرسیون با استفاده از تجزیه‌ و تحلیل واریانس داده‌ها (جدولANOVA) مورد آزمون قرار می‌گیرد. در این تحقیق، تحلیل واریانس داده‌ها (جدول 7) نشان می‌دهد که مدل ارائه‌شده (رابطه 1) با ۹۵ درصد اطمینان، دارای اثر معنی‌دار است. رابطه 3-۱ مدل ارائه‌شده برای میزان تجزیه صورت گرفته را برحسب عاملهای کد شده نشان می‌دهد.

Response = + 0.17 - 0.050 * A + 5.000E-003 * B - 2.500E-003 * C + 0.045 * A * B + 0.000 * B * C + 0.027 * A2 - 0.13 * B2 +0.038 * C2           (رابطه ۱)

جدول 7- تجزیه‌وتحلیل فرآیند بهینه‌سازی و بررسی فاکتورها با آنالیز واریانس (ANOVA)

Source

DF

F

Value

p-value

Prob > F

 

Model

8

66.34

< 0.0001

Significant

A-Temperature

1

98.25

< 0.0001

Significant

B-pH

1

0.98

0.3546

 

C-Cyanide

1

0.37

0.5630

 

AB

1

29.84

0.0009

Significant

BC

1

0.000

1.0000

 

A2

1

18.57

0.0035

Significant

B2

1

399.28

< 0.0001

Significant

C2

1

34.54

0.0006

Significant

Residual

7

 

 

Lack of Fit

3

1.83

0.2813    not significant             

Pure Error

4

 

 

Cor Total

15

 

 

R-Squared= 0.98, Adj R-Squared 0.97

 

نتایج بررسی اثر دما و pH : پس از واردکردن نتایج به‌دست‌آمده از آزمایشهای طراحی‌شده توسط برنامه RSM، بررسی آماری واریانس داده‌ها (جدول ANOVA) نشان داد که بیشترین میزان تداخل در مورد دو فاکتور دما و pH رخ می‌دهد. در دمای پایین و افزایش pH منجر به کاهش میزان پاسخ (درصد تجزیه سیانید) می‌شود و در دمای بالا و pH خنثی کاهش میزان پاسخ دیده می‌شود (شکلهای 1، 2 و 3).

 

 

 

شکل 1- نمودار سه‌ بعدی سطح پاسخ اثر تغییر فاکتورهای دما و pH بر مقدار تولید آمونیاک. تأثیر متقابل دما و pH بر میزان تولید کاملاً مشخص است؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان تجزیه در دمای بالا و pH پایین است.

 

شکل 3- نمودار اثر متقابل فاکتورهای تأثیرگذار دما و pH بر مقدار تجزیه سیانید .در این نمودار محور افقی نشان‌دهنده دما و محور عمودی، pH و رنگ نمودار میزان تولید آمونیاک است که رنگهای متمایل به قرمز درصدهای تجزیه بالاتر را نشان می­دهد.


 

شکل 2- نمودار نرمال پلات اثر تغییر فاکتورهای دما و pH  بر مقدار تجزیه سیانید

بحث

به­منظور بالا بردن درصد تجزیه سیانید توسط انتروباکتر ZS، بهینه­سازی با استفاده از طراحی Box-Behnken RSM در سه سطح انجام شد. با استفاده از آنالیز داده­ها (ANOVA)، مدل طراحی‌شده با پارامترهای تخمین زده‌ شده مانند P-value و Lack off fit، در جدول 7 آورده شده است. به­منظور بررسی دو فاکتور، فرضیه­ای ایجاد می­شود که بر اساس این مدل هیچ تفاوت معناداری بین دو فاکتور وجود نداشته باشد، در این صورت صحت فرضیه بر اساس P-value اثبات می­شود. بدین‌صورت که اگر 05/0P-value≤ باشد فرضیه نادرست بوده و دو فاکتور اختلاف معنادار دارند ولی فرضیه با 05/0P-value> درست بوده و فاکتورها اختلاف معناداری ندارند. درصورتی‌که P-value مدل کمتر از 05/0باشد، مدل این تحقیق معنی­دار است، که در این مطالعه، P-value مدل ، 0001/0<  به دست آمد. Lack off fit نشان می­دهد، خطا در مدل پیشنهادی RSM تأثیری نداشته است و باید مقدار Lack off fit بی­معنی­ باشد (05/0P-value>>). در مدل آزمایش در این تحقیق Lack off fit برابر 28/0 به­دست آمد که مقدار آن مورد تأیید است. اگر این پارامتر معنی­دار باشد، کل مدل و آزمایش بی­معنی بوده و ارزشی ندارد. ضریب همبستگی(R2) مدل، احتمال درست بودن مدل پیشنهادی نرم­افزار را نشان می­دهد. با آنالیز انجام‌شده، میزان ضریب همبستگی (R2) 98 درصد به دست آمد. نزدیک بودن AdjR2  به R2 تأییدکننده R2 است. اختلاف قابل قبولی بین 98 درصدR2= و 97 درصدAdjR2= مشاهده شد. Residual در ANOVA نشان‌دهنده صحت تعداد نمونه­ها است که باید 6≤ باشد که در این مطالعه 7 گزارش شد. همه این سنجشها تأیید می­کند که مدل استفاده‌شده برای پیش­گویی درصد تجزیه سیانید در طیفی از مقادیر داده‌ شده معنی­دار است.

ارتباط بین فاکتورها و تأثیرات متقابل بین آنها در رابطه 1 آورده شده است. به‌طوری‌که Y، درصد تجزیه سیانید را به­عنوان عملکرد متغیرهای آزمایش(Xi) نشان می­دهد. بر­همکنش فاکتورهایی که معنی­دار بوده و 05/0P-value<  دارند، بر روند تجزیه سیانید تأثیر می­گذارند. در این آزمایش، P-value برای بر­همکنش دما و pH برابر با 0009/0 بوده و معنی­دار است.

مدل پیشنهادی این آزمایش از معادله درجه دوم پیروی می­کند. متمایز کردن متغیرهایی که بیشترین تأثیر را بر نتیجه نهایی دارند؛ کار دشواری است. در این آزمایش، تأثیر برهمکنش دما و pH بر نتیجه نهایی میزان درصد تجزیه سیانید در شکل‌های 1 و 3 نشان داده ‌شده است. ارتباط بین این دو، خطی نبوده و این حالت انحنا به علت تأثیر متقابل pH بر فاکتور دما است.

دُز کشنده سیانید برای انسان به­صورت بلع یا هضم در گستره‌ای از 50 تا 200 میلی­گرم(1 تا 3 میلی­گرم سیانید آزاد در هر کیلوگرم وزن بدن) است. دُز کشنده به­صورت جذب پوستی به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای بالاتر است و حدود 100 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن است. در عملیات استخراج طلا از محلولهای بسیار رقیق سدیم سیانید در گستره 05/0و 01/0 درصد سیانید استفاده می­گردد (9).

باکتری Scenedesmus obluquis بر­گرفته­ شده از پساب معدن طلای Ovacik، سیانید 91/77 میلی­گرم بر لیتر را به‌طور تدریجی با pH اولیه 3/10 تقریباً به 6 میلی­گرم بر لیتر کاهش داده است. نتایج آزمایش نشان می­دهد باکتری  Scenedesmus obluquis 91 درصد سیانید را طی 77 ساعت تجزیه می­کند (3).

در مطالعه دیگری، باکتری باسیلوس را با بهینه­سازی آزمایش با بررسی فاکتورهای pH، دما و غلظت whey-waste، نقاط بهینه حاصل از بهینه­سازی را به ترتیب در 88/9pH=، دمای 33 درجه سانتی‌گراد و غلظت 27/14 گرم بر لیتر whey-waste انجام دادند. نتیجه این بهینه­سازی این بود که از 500 میلی­گرم بر لیتر مقدار اولیه سیانید، مقدار 53/206 میلی­گرم بر لیتر سیانید طی 96 ساعت توسط گونه­های میکروبی تجزیه گردید (3).

گونه باکتریایی باسیلوسCN-22 جداشده از رسوب گل‌ولای آب‌فلز کاری، با توانایی ذاتی خود قادر به تجزیه سیانید است. با بهینه­سازی شرایط با pH اولیه 3/10، دمای 31 درجه سانتی‌گراد، دور چرخش r.p.m 193 و میزان تلقیح 38/2 درصد، روند تجزیه سیانید کنترل شد. به‌طوری‌که غلظت اولیه سیانید 200 میلی­گرم بر لیتر را به 62/6 میلی­گرم بر لیتر تبدیل می­کند (15).

باکتریPseudomonas pseudoalcaligenes جداشده از معدن طلای Kuala Lipis Pahang، می‌تواند غلظت بالاتر از 39 میلی­گرم بر لیتر سیانید را تحمل کند اما رشد آن در غلظت 52 میلی­گرم بر لیتر سیانید متوقف می­گردد (14). در بررسی دیگری، درصد تجزیه سیانید با غلظت اولیه 150 میلی­گرم بر لیتر توسط Rhizopus oryzae ، 83 درصد و توسط Stemphylium loti، 90 درصد گزارش‌شده است (14).

در این پژوهش تجزیه سیانید توسط آنزیمهای خارج سلولی انجام‌شده است. ازجمله مزایایی این روش نسبت به روشهای داخل سلولی، استفاده مستقیم از باکتری می­باشد، به این معنی که در این روش نیازی به شکستن سلول و آماده‌سازی عصاره سلولی نمی‌باشد. درنتیجه از این منظر، جنبه اقتصادی داشته و امکان استفاده در صنایع مرتبط با سیانید و ترکیبات سیانید دار را فراهم می‌کند.

1. Basile, L.J., Cyanide-degrading enzymes for bioremediation. 2008, Texas A&M University.

  1. Douglas, C.M., Design and analysis of experiments. John Wiley and sons, 2001.
  2. Gurbuz, F., H. Ciftci, and A. Akcil, Biodegradation of cyanide containing effluents by Scenedesmus obliquus. Journal of hazardous materials, 2009. 162(1): p. 74-79.
  3. Kersters, K. and M. Vancanneyt, Bergey's manual of systematic bacteriology. 2005.
  4. Kitleartpornpairoat, S.P.a.R., Biodegradation of Cyanide by a Novel Cyanide-degrading Bacterium. 2010. 4 2010-06-20.
  5. Knowles, C.J. and A.W. Bunch, Microbial cyanide metabolism. Advances in microbial physiology, 1986. 27: p. 73-111.
  6. Knowles, C.J., Cyanide utilization and degradation by microorganisms. Cyanide compounds in biology, 1988. 140: p. 3-15.
  7. Lazic, Z.R., Design of experiments in chemical engineering: a practical guide. 2006: John Wiley & Sons.
  8. Logsdon, m.j., the management of cyanide in gold extraction. international council on metals and the environment, 1999. 44(international council on metals and the environment).
  9. Luque-Almagro, V.M., et al., Cyanide degradation by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 involves a malate: quinone oxidoreductase and an associated cyanide-insensitive electron transfer chain. Microbiology, 2011. 157(3): p. 739-746.
  10. Luque-Almagro, V., et al., Bacterial cyanide degradation is under review: Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344, a case of an alkaliphilic cyanotroph. Biochemical Society transactions, 2011. 39(1): p. 269-274.
  11. Mekuto, L., S.K.O. Ntwampe, and V.A. Jackson, Biodegradation of free cyanide and subsequent utilisation of biodegradation by-products by Bacillus consortia: optimisation using response surface methodology. Environmental Science and Pollution Research, 2015: p. 1-10.
  12. Raybuck, S.A., Microbes and microbial enzymes for cyanide degradation. Biodegradation, 1992. 3(1): p. 3-18.
  13. Tiong, B., et al., Cyanide Degradation by Pseudomonas pseudoalcaligenes Strain W2 Isolated from Mining Effluent. Sains Malaysiana, 2015. 44(2): p. 233-238.
  14. Wu, C.-F., et al., An effective method for the detoxification of cyanide-rich wastewater by Bacillus sp. CN-22. Applied microbiology and biotechnology, 2014. 98(8): p. 3801-3807.