پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

ارزیابی عملکرد باکتری های اکسید کننده گوگردی جدا سازی شده از خاک معدن مس و شناسایی مولکولی آنها بر اساس توالی 16S rRNA

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری/دانشگاه تهران

2 عضو هیات علمی دانشگاه تهران

3 رییس آزمایشگاه هیدرومتالورژی، مجتمع مس سرچشمه

چکیده

چکیده

یکی از راهکارهای افزایش راندمان عملیات فروشویی فلزات از کانی های سولفیدی موجود در معادن فلزی، استفاده از گونه-های کارامد باکتری‌های اکسید کننده گوگردی می‌باشد. بنابرین هدف از این پژوهش، جداسازی و شناسایی باکتری‌های اکسید کننده گوگرد از خاک های معدن مس سرچشمه کرمان و بررسی عملکرد آنها در اکسایش گوگرد بوده است. بعد از غنی‌سازی نمونه‌ها، خالص‌سازی گردیدند و سپس جدایه‌ها بر اساس خصوصیات ریخت‌شناسی و روش‌های فیلوژنیک، شناسایی شدند. بر اساس نتایج، 3 سویه اکسید کننده گوگرد متعلق به جنس‌های Acidithiobacillus sp و Sulfobacillus sp ، جداسازی و شناسایی شدند. از این میان، سویه 184 با 95 درصد شباهت به Acidithiobacillus ferridurans ، به علت سرعت رشد بالاتر (تغییر 2 واحد pH و mg S/L 385 در طی 2 هفته) در محیط پایه معدنی حاوی گوگرد، به عنوان سویه‌ برتر انتخاب شد که می‌تواند به عنوان سویه‌ای کاربردی در فروشویی زیستی فلز مس مورد استفاده قرار گیرد.

واژه‌های کلیدی: خاک، باکتری اکسید کننده گوگرد، Thiobacillus

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Operational evaluation of sulfur oxidizing bacteria yield isolated from copper mine soil and their molecular identification based on 16S rRNA sequence

چکیده [English]

Abstract

One ways to increase the operational efficiency of leaching metals from sulfide minerals is using efficient species of sulfur oxidizing bacteria in metal mining. Thus, the aim of this study was to isolate and identify sulfur oxidizing bacteria from soils of Sarcheshmeh copper mine (Kerman, south of Iran) and to survey their operation in sulfur oxidation. After enrichment, samples were purified and then isolates were identified based on their morphological characteristics and phylogenic techniques. Subsequently, three sulfur-oxidizing strains which belonged to Acidithiobacillus sp and Sulfobacillus sp were isolated and identified. Of these three, strain 184, with 95% similarity to Acidithiobacillus ferridurans was selected as the superior strain due to higher growth rate (change of 2 value pH and 385 mg S/L during 2 weeks) in the synthetic mineral medium containing sulfur which can now be used as an applicable strain in bioleaching of copper metal.

Keywords: Soil, Sulfur Oxidizing Bacteria, Thiobacillus

کلیدواژه‌ها [English]

  • soil
  • Sulfur Oxidizing Bacteria
  • Thiobacillus

ارزیابی عملکرد باکتریهای اکسید کننده گوگردی جدا سازی شده از خاک معدن مس و شناسایی مولکولی آنها بر اساس توالی 16S rRNA 

مهدی صادقی پور مروی1، احمد علی پوربابایی1*، حسینعلی علیخانی1، احمد حیدری1 و زهرا منافی2

1 کرج، دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علومو مهندسی خاک

2 کرمان، سرچشمه، شرکت ملی صنایع مس ایران، مجتمع مس سرچشمه، آزمایشگاه هیدرومتالورژی

تاریخ دریافت: 12/12/94              تاریخ پذیرش: 21/4/95

چکیده

یکی از راهکارهای افزایش راندمان عملیات فروشویی فلزات از کانیهای سولفیدی موجود در معادن فلزی، استفاده از گونه­های کارآمد باکتریهای اکسید کننده گوگردی می­باشد. بنابرین هدف از این پژوهش، جداسازی و شناسایی باکتریهای اکسید کننده گوگرد از خاکهای معدن مس سرچشمه کرمان و بررسی عملکرد آنها در اکسایش گوگرد بوده است. بعد از غنی­سازی نمونه­ها خالص­سازی گردیدند و سپس جدایه­ها بر اساس خصوصیات ریخت­شناسی و روشهای فیلوژنیک شناسایی شدند. بر اساس نتایج، 3 سویه اکسید کننده گوگرد متعلق به جنسهای  Acidithiobacillus sp و Sulfobacillus sp ، جداسازی و شناسایی شدند. از این میان، سویه 184 با 95 درصد شباهت بهAcidithiobacillus ferridurans ، به علت سرعت رشد بالاتر (تغییر 2 واحد pH و mg S/L 385 در طی 2 هفته) در محیط پایه معدنی حاوی گوگرد به عنوان سویه­ برتر انتخاب شد که می­تواند به عنوان سویه­ای کاربردی در فروشویی زیستی فلز مس مورد استفاده قرار گیرد.

واژه­های کلیدی: خاک، باکتری اکسید کننده گوگرد، Thiobacillus

* نویسنده مسئول، تلفن: 02632231787، پست الکترونیکی: pourbabaei@ut.ac.ir

مقدمه

 

گوگرد دهمین عنصر موجود در پوسته زمین است که در ساختار اسید آمینه به صورت گروه سولفیدریل و پل دی سولفیدی، در اقیانوسها به صورت سولفات، در جو زمین به صورت گاز اکسید گوگرد و در سنگ و خاک به صورت کانی سولفیدی وجود دارد (7 و 12). روشهای مرسوم استخراج فلزات از معادن فلزی، مبتنی بر اعمال شرایط دمایی بالا در کوره­های ویژه می­باشد که با اعمال تیمارهای مخصوص در نهایت منجر به استخراج فلزات از کان سنگ فلزی می­گردد. این روشها به هیدرومتالوژی معروف هستند و از گذشته تا کنون برای استخراج فلزات گران­بها مورد استفاده قرار می­گرفتند. محصول نهایی این روش استخراج فلزات، به عنوان ضایعات حاصل از استخراج فلزات، غلظت کمی از فلزات را دارد و در اصطلاح کم عیار می­باشد. از آنجایی که با روش مرسوم استخراج فلزات، نمی­توان فلز موجود در آنها را استخراج نمود، از روشهای موسوم به فروشویی زیستی برای استخراج فلز از کانسنگ کم عیار استفاده می­شود تا به استخراج فلز از کانسنگ کم عیار، منجر گردد. از طرفی روشهای مرسوم استخراج فلزات، اثرات زیست محیطی منفی به دنبال دارد و معادن صنعتی استخراج فلزات، همواره به دنبال راههای دوستدار محیط زیست به عنوان جایگزین روشهای مرسوم استخراج فلزات هستند که فروشویی زیستی فلزات، یکی از این گزینه­هاست. بدین منظور، برای غنی­سازی هر چه بیشتر جمعیت میکروبی به منظور استفاده در فروشویی زیستی فلز مس از کانسنگ کم عیار مس، به شناسایی باکتریهای اکسید کننده گوگرد در معدن مس سرچشمه کرمان اقدام گردید. باکتریهای بومی موجود در محیط، ضمن توان رقابت پذیری بالایی که دارند امکان سازگاری با شرایط اقلیمی محیط را بیشتر از گونه­های غیر بومی دارند و از این جهت، بیشتر مورد توجه هستند (19). سینتیک واکنش اکسایش گوگرد، پایین است و از طرفی، عملکرد باکتریهای اکسید کننده گوگرد نیز متفاوت می­باشد، یعنی برخی تند رشد بوده و توانایی اکسیدکنندگی بالایی دارند و برخی کند رشد بوده و توانایی اکسید کنندگی پایینی دارند (15 و 17). به طور کلی، توانایی اکسیدکنندگی گوگرد در سویه­های گرما دوست و اسید دوست بیشتر از سویه­های خنثی­دوست معتدل دوست است (18). این توانایی متفاوت آنها در اکسیدکنندگی گوگرد، به ژنهای موجود در ژنوم این میکروارگانیسم­ها ارتباط دارد (43 و 46). جنسهای مختلفی از قبیل Acidithiobacillus sp، Starkey sp، Acidiphilium sp، Acidianus sp و Sulfolobus spتوانایی اکسید کنندگی گوگرد را دارند. بر این مبنا، هدف از این پژوهش، ارزیابی عملکرد سویه­های مختلف اکسیدکننده گوگرد در معدن مس سرچشمه بود. بدین منظور، به جداسازی و شناسایی باکتریهای اکسیدکننده گوگرد از معدن مس سرچشمه، اقدام گردید تا از نتایج آن، برای اهداف صنعتی مانند فروشویی زیستی فلز مس استفاده گردد.

مواد و روشها

نمونه­برداری: به منظور جداسازی و شناسایی باکتریهای اکسید کننده گوگرد، نمونه­برداری از خاک محدوده معدن مس سرچشمه واقع در استان کرمان، انجام گردید. بدین منظور، 22 نمونه خاک در شرایط استریل به آزمایشگاه منتقل و در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. آزمایشهای شیمیایی شامل، اسیدیته و شوری توسط دستگاه پ­هاش سنج و ای سی سنج مدل یونیکم، انجام شدند. غنی­سازی نمونه­ها بر روی محیط پایه معدنی 9k که گوگرد به عنوان تنها منبع انرژی به آن اضافه شده بود، انجام گردید (29). محیط پایه معدنی (گرم در لیتر) شامل K2HPO45/0، KCl 1/0، MgSO4. 7H2O 5/0، Ca(NO3)201/0، (NH4)2SO43 وFeSO4.7H2O 01/0 به همراه 1 گرم در لیتر گوگرد بود. شرایط اسیدیته محیط کشت، 5/1 تا 5/7 و دمای محیط کشت 25 و 45 درجه سانتی گراد تعیین شد تا شرایط برای جداسازی باکتریهای اسید دوست و خنثی دوست (14) و همچنین معتدل دوست و گرمادوست معتدل مهیا گردد (38).

جداسازی: یک گرم از نمونه خاک با 50 میلی لیتر از محیط کشت 9k حاوی 1 گرم گوگرد در لیتر، در داخل ارلن 200 میلی لیتری ریخته شد و به مدت 2 هفته در دمای 30 و 45 درجه سانتی گراد در همزن با دور rpm 120 گرماگذاری شدند. سپس 200 مایکرولیتر از این محلول، مجدد در شرایط مشابه، به محیط کشت جدید منتقل و گرماگذاری انجام شد. این عمل، برای هر نمونه، 5 بار تکرار شد و در نهایت، محیطهایی که رشد میکروبی آن بر اساس کدورت ایجاد شده، قابل تشخیص بود، به منظور جداسازی سویه خالص اکسید کننده گوگرد، انتخاب گردید.

خالص­سازی: به منظور خالص سازی سویه­های اکسید کننده گوگرد، رقتهای متوالی تا 6-10 تهیه و به محیط کشت آگار 9k ، منتقل شد و به روش ریختن در پلیت و با استفاده از میله U شکل در پلیت، به طور یکسان پخش گردید. پلیتها به مدت 2 هفته در دمای 30 و 45 درجه سانتی گراد گرماگذاری شده و بعد از این مدت، کلنیهای رشد کرده، به روش خطی، کشت داده شدند و سپس خالص­سازی سویه­ها انجام گردید. به منظور اطمینان از خالص بودن نمونه­ها، 5 مرحله تجدید کشت انجام شد (41).

انتخاب سویه برتر: به منظور ارزیابی توانایی اکسایش گوگرد، جدایه­های خالص­سازی شده در مرحله قبل، به محیط کشت مایع پایه معدنی 9k، منتقل گردیدند و بر مبنای تغییر اسیدیته و سولفات محیط، ارزیابی شدند. در این مرحله، بهترین جدایه از نظر توانایی اسیدی کردن محیط و همچنین تولید سولفات، انتخاب گردید.

بررسی تغییرات pH و سولفات توسط جدایه­ها: به منظور بررسی تغییرات pH و سولفات توسط جدایه­های مورد آزمایش، تیمارهای دمایی 25، 30، 35، 40 و 45 و همچنین تیمارهای اسیدیته 5/1، 5/2، 5/3، 5/4، 5/5، 5/6 و 5/7 در محیط کشت پایه معدنی 9k، اعمال گردید.

استخراج DNA و واکنش زنجیره­ای پلیمراز: شناسایی مولکولی سویه­های مورد نظر با استفاده از ماکر 16S rRNA انجام شد. بدین منظور ابتدا زیست توده از سویه­ها تهیه شد و سپس با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت کیاژن مطابق دستورالعمل شرکت مذکور، به استخراج DNA اقدام گردید. سنجش کیفی DNA، با الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد و سجش کمی DNA، با استفاده از نانودراپ و با محاسبه نسبت nm 280/260 انجام شد. PCR و تکثیر ژن مربوطه با استفاده از پرایمرهای 27f (5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) و  1492r (5´-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3´) انجام گردید و تأیید آن به وسیله الکتروفورز انجام شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز در حجم نهایی 50 مایکرولیتر انجام گردید که 5 مایکرولیتر بافر PCR X1، 5 مایکرولیتر بافر MgCl2 با غلظت برابر 2 میلی مولار، 4 مایکرو لیتر dNTP با غلظت 100 مایکرو مولار،  5/2 مایکرو لیتر از هر پرایمر رفت و برگشت با غلظت 5/0 مایکرو مولار، 1 مایکرو لیتر آنزیم Taq DNA پلیمراز   U/µl 02/0، 1مایکرو لیتر  DNA و 29 مایکرو لیتر آب مقطر  استفاده شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز به شرح زیر انجام شد: واسرشت اولیه در دمای 95 درجه سانتی گراد برای مدت 5 دقیقه، 35 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت در دمای 94 درجه سانتی گراد برای 30 ثانیه، اتصال در دمای 59 درجه سانتی گراد برای مدت 50 ثانیه و سنتز در دمای 72 درجه سانتی گراد برای مدت 2 دقیقه و پس از اتمام این 30 چرخه، برای سنتز نهایی، مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد. در مرحله بعد، محصول PCR، با استفاده از کیت فرمنتاز و مطابق دستورالعمل شرکت مذکور، کلون گردید و با استفاده از دستگاه سکوئنسر، توالی­یابی شد.

آنالیز داده­ها: نتایج توالی­یابی با استفاده از نرم­افزار Chromas 2.01 (Technelysium Pty Ltd) ویرایش گردید و با استفاده از نرم­افزار BLASTn با توالیهای معتبر ثبت شده در پایگاه ژنی NCBI مقایسه شد و نزدیک­ترین سویه بر اساس مشابهت در توالی ژن 16S rRNA شناسایی گردید. تحلیل تبارزایی سویه­ها با استفاده از نرم­افزار ClustalW انجام شد (50). رسم درخت تبارزایی با استفاده از الگوریتم Neighbor-Joining و با استفاده از نرم افراز MEGA6 انجام گردید (22).

نتایج

آنالیز شیمیایی: جدول 1، اسیدیته و هدایت الکتریکی نمونه­های مورد بررسی را نشان می­دهد. میانگین اسیدیته نمونه­ها 56/4 و هدایت الکتریکی آنها 75/2 دسی زیمنس بر متر بود. بدین ترتیب، نمونه­های مورد آزمایش، اسیدی بوده و نسبتاً شور بودند.

توانایی اکسایش گوگرد: در مرحله غنی­سازی، از محیطهای کشت که به وسیله نمونه­ها تلقیح شده بودند و کدورت ایجاد کرده بودند، 3 سویه با توانایی اکسایش گوگرد خالص­سازی شد. جدول 2، توانایی آنها در شرایط یکسان محیط (اسیدیته 7، دمای 30 درجه سانتی گراد، rpm 120)، از نظر تغییر اسیدیته و تولید سولفات نشان می­دهد. شماره­ سویه­ها (148، 155 و 184) نشان دهنده مراحل مختلف جدا سازی و خالص سازی آنها از نمونه های خاک بود.

 

 

جدول 1- اسیدیته و هدایت الکتریکی خاکهای مورد بررسی

پارامترها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمونه­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

میانگین

 

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

S11

S12

S13

S14

S15

S16

S17

S18

S19

S20

S21

S22

 

   pH

56/4

53/4

31/4

43/4

69/4

69/4

59/4

01/5

51/4

60/4

52/4

40/4

56/4

46/4

56/4

58/4

56/4

57/4

54/4

56/4

56/4

56/4

56/4

   EC(dS/m)

75/2

76/2

76/2

75/2

75/2

75/2

77/2

71/2

75/2

75/2

71/2

74/2

73/2

75/2

75/2

75/2

75/2

69/2

75/2

74/2

81/2

75/2

75/2

1S:  نمونه شماره 1        EC: هدایت الکتریکی

 

جدول 2 نشان می­دهد، از میان سویه­های مورد بررسی، سویه 184 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان داد و سویه­های 148 و 155 گرچه قادر به رشد در روی محیط کشت بودند ولی در شرایط دمایی و اسیدیته موجود (درجه حرارت 30 درجه سانتی گراد و اسیدیته 5/7) توانایی کمتری برای اکسایش گوگرد نشان دادند که در مرحله بعدی آزمایش، شرایط بهینه دما و اسیدیته آنها برای رشد و اکسایش گوگرد، تعیین گردید.

بررسی بیشترین تغییرات pH و سولفات:در مرحله بعد، برای اینکه حداکثر توان اکسایش سویه­ها تعیین گردد، شرایط بهینه رشد آنها به وسیله اعمال تیمارهای مختلف دمایی و اسیدیته طی مدت 2 هفته، تعیین گردید.

جدول 2- توانایی سویه­ها برای تغییر اسیدیته و تولید سولفات در شرایط محیطی یکسان (اسیدیته 5/2 و دمای 30 درجه سانتی گراد و rpm 120)

سویه

تغییرات pH

تغییرات سولفات(mg S/l)

148*

70/1

342

184

00/2

385

155

11/0

33

*: شماره­ سویه­ها (148، 155 و 184)، نشان دهنده مراحل مختلف جداسازی و خالص سازی آنها از نمونه­های خاک بود.

 

 

  

(ب)          در دمای 30 درجه سانتی گراد                                         (الف) در اسیدیته 5/2

شکل 1- تغییرات pH و سولفات برای جدایه­های مورد آزمایش بعد از 2 هفته در محیط کشت 9k، در pH و درجه حرارت ثابت

 

شکل 1 تغییرات pH و سولفات برای جدایه­های مورد آزمایش بعد از 2 هفته در محیط کشت 9k، در pH و درجه حرارت ثابت را نشان می­دهد.

 

 

Firmicutes 
 

 

Gamma-proteobacteria 
 

 

شکل 2- درخت تبارزایی سویه­های اکسید کننده گوگرد بر اساس روش Neighbor-Joining   منتج از آنالیز توالیهای ژن 16S rRNA . عدد نشان داده شده در گرهها، نشان دهنده bootstrap 1000 می­باشد.

 

بر اساس نتایج شکل 1 (الف)، در شرایطی که اسیدیته محیط کشت 5/2 باشد، سویه های مورد بررسی از نظر دمای بهینه رشد، به دو گروه تقسیم­بندی شدند. گروه اول، شامل 2 سویه 184 و 148 بود که مزوفیل بودند و دمای بهینه رشد آنها 30 درجه سانتی گراد به دست آمد. گروه دوم شامل سویه 155 بود که در گروه ترموفیل معتدل جای گرفت و دمای بهینه رشد آن، 40 درجه سانتی گراد تعیین شد. همچنین از شکل 2 (ب) چنین بر می­آید که سویه­های مورد بررسی از نظر اسیدیته بهینه رشد، در دمای 30 درجه سانتی گراد، همگی اسید دوست بودند و در اسیدیته 5/2 بیشترین رشد را نشان دادند. بدین ترتیب 2 سویه 148 و 184 مزوفیل و اسید دوست بودند و سویه 155 نیز ترموفیل معتدل و اسید دوست بود.

شکل 1 (الف و ب) نشان داد، سویه 184 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را در شرایط مزوفیل و ترموفیل معتدل نشان داد. به طوری که اکسایش گوگرد در شرایط مزوفیل همواره بیشتر از شرایط ترموفیل بود. شکل 1 (الف) نشان داد در اسیدیته 5/2، بیشترین توانایی تغییر اسیدیته محیط، 2 واحد بود که توسط سویه 184 به دست آمد و کمترین توانایی اکسایش گوگرد نیز به وسیله سویه 155 به دست آمد که 7/0 بود که این روند در تولید سولفات نیز مشاهده شد. به طوری که بیشترین و کمترین تولید سولفات 385 و 33 میلی گرم گوگرد در لیتر به دست آمد که به ترتیب مربوط به سویه­های 184 و 155 بود. دامنه تغییرات اسیدیته در پژوهش حاضر حدود 2 است که این نتیجه، با سایر تحقیقات همخوانی داشت (52). شکل 1 (ب) نیز نشان داد در دمای 30 درجه سانتی گراد، 3 سویه مورد بررسی همگی اسید دوست بودند و اسیدیته بهینه آنها 5/2 به دست آمد. در این شرایط، بیشترین و کمترین تغییرات اسیدیته به ترتیب به سویه­های 184 و 155 تعلق داشت و بیشترین و کمترین تغییرات سولفات نیز به همین سویه­ مربوط بود. جدول 3 دما و اسیدیته (بهینه و رشدی) سویه را نشان می­دهد. این نتایج با نتایج پژوهش قبلی همخوانی نشان داد (39).

جدول 3- دما و اسیدیته (بهینه و رشدی) سویه

سویه

دمای بهینه

دمای رشد

اسیدیته بهینه

اسیدیته رشد

148

30

45-10

5/2

5/6-5/1

184

30

45-10

5/2

5/6-5/1

155

40

60-20

5/2

5/5-5/1

شناسایی بر اساس توالی 16S rRNA: نتایج تعیین توالی ژن 16S rRNAسویه­های مورد نظر و مقایسه شباهت آنها با داده­های معتبر ثبت شده در پایگاه NCBI، در جدول 4 نشان داده شده است.

 

جدول 4- مقایسه میزان شباهت ژن 16S rRNA سویه­های مورد آزمایش با سویه­های استاندارد

نام سویه

شماره دستیابی

درصد شباهت

سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت

تاکسونومی

148

KR020047

6/94

Acidithiobacillus thiooxidans NR 115265

 

Bacteria; Proteobacteria;

Gammaproteobacteria;

Acidithiobacillales,

Acidithiobacillaceae, 

Acidithiobacillus;

184

KR020046

0/95

Acidithiobacillus ferridurans NR 117036 

 

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Acidithiobacillales; Acidithiobacillaceae; Acidithiobacillus

155

KR020045

6/94

Sulfobacillus acidophilus NR 074758

Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiales incertae sedis; Clostridiales Family XVII. Incertae Sedis; Sulfobacillus; Sulfobacillus acidophilus

 

بر اساس نتایج مشاهده شده در جدول 4، سویه 148، 184 و 155 به ترتیب Acidithiobacillus thiooxidans، Acidithiobacillus ferridurans  و
Sulfobacillus acidophilusشناسایی شدند. دو سویه 148 و 184 به گاماپروتئوباکتریا تعلق داشتند ولی سویه 155 به Firmicutes تعلق داشت.

آنالیز فیلوژنیک: شکل 2، درخت تبارزایی سویه­های اکسید کننده گوگرد بر اساس روش  Nighbor-Joining منتج از آنالیز توالیهای ژن 16S rRNA را نشان می­دهد.

بر اساس شکل 2، جدایه­های مورد بررسی در دو گروه قرار گرفتند. 2 سویه 148 و 184 در یک گروه monocladetic قرار دارند و سویه 155 در گروه جداگانه قرار گرفت.

بحث

همان طور که در مقدمه ذکر شد، استفاده از باکتریهای اکسیدکننده گوگرد در فروشویی زیستی فلزات موجود در کانیهای سولفیدی، ضمن به کارگیری کانسنگهای کم عیار در استخراج فلزات، هزینه کمتری در بردارد و اثرات زیست محیطی منفی روشهای مرسوم استخراج فلزات را نیز در بر ندارد و کاربرد فروشویی زیستی، در آینده، روبه فزونی خواهد گذاشت (1، 2، 11، 31، 37 و 42).

نتایج آنالیزها نشان داد، که از 3 سویه مورد بررسی، 2 سویه Acidithiobacillus sp.و 1 سویه دیگر Sulfobacillus sp.بود که در تحقیقات قبلی نیز (11، 37 و 42) این باکتریها در محیط معدن گزارش شده بودند. در طی فرآیند زیستی اکسایش گوگرد، محصولات متنوعی تولید می­گردد ولی در هر حال محصول نهایی سولفات می­باشد (3) که از این ترکیب در کنار شاخص تغییر اسیدیته، می­توان در ارزیابی توان اکسایش گوگرد استفاده کرد. در این پژوهش نیز از توانایی تغییر اسیدیته و تولید سولفات برای ارزیابی توانایی اکسایش گوگرد توسط باکتریها، استفاده گردید که این پارامترها، شاخص خوبی برای سنجش توانایی اکسایش گوگرد، مورد ارزیابی قرار گرفتند (6).

از میان 3 سویه شناسایی شده، سویه 184 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان داد. سویه 184، با 95 درصد شباهت به گونه Acidithiobacillus ferridurans  تعلق داشت. باکتریهای اکسید کننده گوگرد که خنثی دوست و قلیا دوست هستند بیشتر در کلاس بتا پروتئوباکتریا قرار دارند و شناخته ­شده­ترین جنسهای باکتریهای اکسید کننده گوگرد هستند (27). اما سویه 184 در کلاس گاماپروتئوباکتریا قرار داشت. این باکتری گرم منفی، شکل straight rods اسیددوست، مزوفیل، بی­هوازی اختیاری و شیمیولیتوتروف اجباری است که علاوه بر توانایی اکسایش گوگرد، توانایی اکسایش آهن را نیز داشت. این نتایج با سایر تحقیقات (20) همخوانی داشت. باید در نظر داشت 3 گونهAcidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus ferridurans  و Acidithiobacillus ferrivoransبسیاری از خصوصیات فیزیولوژیک یکسانی دارند ولی برخی خصوصیات فنوتیپی (از قبیل تحرک) متفاوت نیز دارند (20 و 49). Acidithiobacillus thiooxidansجنس اسیدی تیوباسیلوس با توجه به نقشی که در فرآیند اکسایش گوگرد دارد از نظر اقتصادی در صنعت بسیار مهم است. رشد کند و مشکل بودن رشد برروی محیطهای جامد که از مشخصات این باکتریهاست ضرورت جداسازی، شناسایی و به کار گیری گونه های جدید با کارآیی بالاتر را نشان می دهد ( 5 و 8). این جدایه، گرم منفی، مزوفیل، شیمیولیتوتروف، اسیدی دوست بود که با نتایج تحقیقات قبلی (39) همخوانی داشت. Sulfobacillus acidophilus باکتری ترموفیل معتدل، هوازی، گرم مثبت، اسید دوست و rod شکل، کلنی گرد، عدم توانایی رشد در حضور شناساگر بود. این نتایج با تحقیق قبلی همخوانی داشت (24). این جدایه، از گوگرد عنصری و پیریت به عنوان تنها منبع انرژی و از سوبسترای آلی از قبیل گلوکز و گلوتامات به عنوان منبع کربن استفاده می­کند. این نتایج با سایر تحقیقات قبلی (13) همخوانی داشت. خصوصیات فیزیولوژیک و  شناسایی توالیهای DNA نشان داد که این باکتری، گونه جدیدی از Sulfobacillus sp بود.

نتایج تحقیقی نشان داد که نرخ اکسایش گوگرد بعد از 2 هفته به حد ثابتی می­رسد (20 و 21) که این نتیجه نیز با نتایج تحقیق حاضر همخوانی داشت. در یک پژوهش، باکتریهای اکسید کننده گوگرد، اسیدیته محیط را طی دو هفته تا 8 واحد کاهش دادند و مقدار تولید سولفات تا 20 میلی گرم گوگرد بر گرم گزارش شد (40). همچنین در گزارشی دیگر، بین 10 تا 40 میلی گرم گوگرد بر کیلوگرم خاک، طی مدت 10 هفته تولید گردید (44). بر اساس نتایج این پژوهش تغییرات سولفات و اسیدیته، کمتر از نتایج گزارشات قبلی بود که می­تواند به دلیل تفاوت در توانایی اکسایش گوگرد توسط باکتریها باشد. نتایج تحقیقی (20 و 47) نشان داد که اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس در دمای کمتر از 30 درجه سانتی گراد و اسیدیته بالای 7/0 توانایی اکسایش گوگرد را داشت که این نتایج با نتایج این پژوهش همخوانی داشت. در یک تحقیق (35)، دمای بهینه رشد سولفوباسیلوس را 55 درجه سانتی گراد گزارش کردند. گرچه بیشتر تمرکز مطالعات انجام شده بر روی گونه­های مزوفیل Thiobacillus بوده است ولی در مورد گونه های ترموفیل آن نیز مطالعاتی انجام شده است (27، 28 و 34).

هر 3 سویه مورد بررسی اسید دوست بودند ولی دو سویه 148 و 184 در دمای 30 درجه سانتی گراد رشد بهینه داشتند و مزوفیل بودند، ولی سویه 155 در دمای 40 درجه سانتی گراد رشد مطلوب داشت و ترموفیل معتدل بود که با نتایج تحقیق قبلی (30) همخوانی نشان داد. همچنین در تحقیق حاضر، هر 3 سویه مورد بررسی، اسید دوست و توانایی تحمل اسیدیته کم را داشتند ولی سویه 184 توانایی تحمل اسیدیته کمتری را نشان داد. این نتایج با نتایج پژوهش قبلی همخوانی نشان داد (20). نتایج پژوهش حاضر در مورد Sulfobacillus acidophilus با نتایج تحقیق قبلی همخوانی نشان داد.

علت تفاوت در توانایی اکسایش گوگرد در میان سویه­های مختلف به تفاوت در عملکرد ژنهای اکسایش گوگرد و آهن (از قبیل sox – اکسید کننده گوگرد- iro – اکسید کننده آهن- و rus) مربوط است (20 و 44). به طوری که تنوع ژنی نیز موجب تنوع آنزیمی در فرآیند اکسایش گوگرد می­شود (25، 33 و 48). به عنوان مثال،  A. ferrooxidans و  A. ferrivorans ژن تثبیت کننده نیتروژن (نیتروژناز) را دارند که بقیه ندارند (20). در Acidithiobacillus ferridurans  برخی ژنها اختصاصی هستند مثل ژن iro  که کدکننده iron oxidase می­باشد و در دو سویه دیگر (Acidithiobacillus thiooxidans, Sulfobacillus acidophilus)  وجود ندارد و برخی ژنها عمومی است مثل ژن rusB  که کدکننده  iso-rusticyanin  می­باشد و در دو سویه دیگر نیز وجود دارند (49). از دیگر دلایل تفاوت در عملکرد باکتریهای اکسیدکننده گوگرد، مربوط به تنوع ژنی اپرون sox است (45). به طوری که آلفا پروتئوباکتریا، اپرون کامل sox (sulfur oxidizing) را دارند ولی بتا و گاما پروتئوباکتریا، اپرون sox را به طور ناقص دارند، یعنی ژنهای کد کننده سولفور دهیدروژناز را ندارند و به جای آن سیستم احیای برگشتی سولفات را دارند (15). در Sulfobacillusژنهای اختصاصی Calvin–Benson–Bassham (cbb) نقش دارند (9). در این پژوهش، سویه 148 و 184 (Acidithiobacillus spp.) متعلق به گاما پروتئوباکتریا بودند  ولی سویه 155 (Sulfobacillus  sp.) متعلق به Firmicutesبود که این خود یکی دیگر از دلایل تفاوت عملکرد این سویه­ها بود.

علت اینکه باکتریهای اکسید کننده گوگرد در دماهای مختلف، عملکرد متفاوتی دارند نیز به سیستم آنزیمی آنها مربوط می شود. به عنوان مثال، آنزیم cytochrome c که از طریق مسیر TOMES، در اکسایش گوگرد دخالت دارد توسط بخشی از اپرون sox به نام  soxAXانجام می­گیرد (10 و 26)  که این آنزیم در مزوفیلهای اکسید کننده گوگرد، به دمای بالا حساس بوده و فعالیت خود را در دمای بالا از دست می­دهد (32 و 36).Sulfobacillus acidophilus  که در گروه ترموفیلهای معتدل قرار دارد آنزیمهای مقاوم به دمای بالا دارند که در اصطلاح ترمو آنزیم (thermozymes) نامیده می­شوند به طوری که در این دما قادر به فعالیت و رشد هستند (23 و 51).

با توجه به این نتایج و در نظر گرفتن اینکه عملکرد سویه­های 148 و 184 در دمای 30 درجه سانتی گراد در سطح مطلوبی قرار داشت، برای عملیات فروشویی زیستی فلز مس از کانسنگ سولفیدی آن، در شرایط اسیدی، پیشنهاد می­گردد و استفاده از سویه 155، برای شرایط اسیدی و دمای 40 درجه سانتی گراد، پیشنهاد می­گردد.  بر اساس نتایج تحقیق حاضر، سویه 184 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان داد که آنالیز مولکولی نشان داد این سویه به Acidithiobacillus ferridurans تعلق دارد.

با توجه به اینکه شباهت سه سویه شناسایی شده در این پژوهش با سویه­های استاندارد، کمتر از 99 درصد بود احتمالاً سویه­های جدیدی هستند که بومی ایران می­باشند و تحقیق در مورد ثبت این گونه­های جدید نیازمند آنالیز دقیق­تر آنها می­باشد. فاکتورهای مختلفی از قبیل تعداد جمعیت میکروبی، تنوع جمعیت میکروبی، شرایط اقلیمی (از قبیل درجه حرارت، هوادهی، پتانسیل آب در خاک)، سطح ویژه گوگرد در تماس با محیط، اندازه ذرات، فراوانی باکتریهای هترتروف موجود در محیط و فراوانی سوبسترای ترکیبات آلی و معدنی (Attoe & Olson 1966; Germida & Janzen 1993)، در اکسایش گوگرد دخیل هستند (4 و 16).

نتیجه­گیری

در پژوهش حاضر، بر اساس نتایج شناسایی مولکولی و آزمایشات انجام شده، 3 سویه اکسید کننده گوگرد شناسایی گردید که 2 سویه آن (148، 184) مزوفیل و اسید دوست بودند (به ترتیب Acidithiobacillus thiooxidansوAcidithiobacillus ferridurans). در حالی که سویه دیگر (155)، ترموفیل معتدل و اسید دوست بود (Sulfobacillus acidophilus). از میان این 3 سویه، سویه­ 184، بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان داد که می­تواند در فروشویی زیستی مس مورد استفاده قرار گیرد.  

سپاسگزاری

این پژوهش، با حمایت مالی شرکت ملی صنایع مس ایران (مجتمع مس سرچشمه، امور تحقیق و توسعه) انجام شد که بدین وسیله، تشکر و قدردانی می­گردد.

1- شیرسلیمانیان، م. ص.، اعتمادی فر، ز و امتیازی، گ. 1393. گوگردزدایی از تیوفن توسط باکتری Pseudomonas stutzeri SEE-. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی. 27(1). 205-219.
2- نقوی، ه.، سام، ع و سالاری، ح. 1394. امکان سنجی پیریت زدایی از زغالسنگ با استفاده از بیوفلوتاسیون. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی. 28(3). 430-437.
 
3- Alam, M., Pyne, P., Mazumdar, A., Peketi, A. and Ghosh, W. 2013. Kinetic enrichment of 34S during proteobacterial thiosulfate oxidation and the conserved role of soxB in SS bond breaking. Applied and Environmental Microbiology. 79(14): 4455-4464.
4- Attoe, O. and Olson, R. 1966. Factors affecting rate of oxidation in soils of elemental sulfur and that added in rock phosphate-sulfur fusions. Soil Science. 101(4): 317-325.
5- Babana, A. H., Samaké, F. and Maïga, K. 2011. Characterization of some agricultural soils: Presence and activity of Tilemsi rock phosphate-solubilizing Thiobacilli. British Microbiology Research Journal. 1: 1-9.
6- Bardsley, C. and Lancaster, J. 1960. Determination of reserve sulfur and soluble sulfates in soils. Soil Science Society of America Journal. 24 (4): 265-268.
7- Benson, S. W. 1978. Thermochemistry and kinetics of sulfur-containing molecules and radicals. Chemical Reviews. 78 (1): 23-43.
8- Brito, E. M., Piñón-Castillo, H. A., Guyoneaud, R., Caretta, C. A., Gutiérrez-Corona, J. F., Duran, R., Reyna-López, G. E., Nevárez-Moorillón, G. V., Fahy, A. and Goñi-Urriza, M. 2013. Bacterial biodiversity from anthropogenic extreme environments: a hyper-alkaline and hyper-saline industrial residue contaminated by chromium and iron. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (1): 369-378.
9- Caldwell, P. E., MacLean, M. R. and Norris, P. R. 2007. Ribulose bisphosphate carboxylase activity and a Calvin cycle gene cluster in Sulfobacillus species. Microbiology. 153 (7): 2231-2240.
10- Dambe, T., Quentmeier, A., Rother, D., Friedrich, C. and Scheidig, A. J. 2005. Structure of the cytochrome complex soxXA of Paracoccus pantotrophus, a heme enzyme initiating chemotrophic sulfur oxidation. Journal of Structural Biology. 152 (3): 229-234.
11- Demergasso, C. S., Castillo, D. and Casamayor, E. O. 2005. Molecular characterization of microbial populations in a low-grade copper ore bioleaching test heap. Hydrometallurgy 80 (4): 241-253.
12- Eriksen, J. 2009. Soil sulfur cycling in temperate agricultural systems. Advances in Agronomy. 102: 55-89.
13- Dufresne, S., Bousquet, J., Boissinot, M. and Guay, R. 1996. Sulfobacillus disulfidooxidans sp. nov., a new acidophilic, disulfide-oxidizing, gram-positive, spore-forming bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 46: 1056-1064.
14- Garrity, G. M., Bell, J. A. and Lilburn, T. 2005. Acidithiobacillales ord. nov. Springer. 60-63. 
15- Georgievskii, V., Annenkov, B. N. and Samokhin, V. 2013. Mineral nutrition of animals. Studies in the Agricultural and Food Sciences. Elsevier. 591.
16- Germida, J. and Janzen, H. 1993. Factors affecting the oxidation of elemental sulfur in soils. Fertilizer Research. 35 (1-2): 101-114.
17- Ghosh, W. and Dam, B. 2009. Biochemistry and molecular biology of lithotrophic sulfur oxidation by taxonomically and ecologically diverse bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. 33 (6): 999-1043.
18- Hallberg, K. B. and Lindström, E. B. 1994. Characterization of Thiobacillus caldus sp. nov., a moderately thermophilic acidophile. Microbiology. 140 (12): 3451-3456.
19- Havlin, J., Beaton, J. D., Tisdale, S. L. and Nelson, W. L. 2005. Soil fertility and fertilizers: An introduction to nutrient management. Pearson Prentice Hall Upper Saddle River, New Jersey, USA. 515: 202-205.
20- Hedrich, S. and Johnson, D. B. 2013a. Acidithiobacillus ferridurans sp. nov., an acidophilic iron-, sulfur-and hydrogen-metabolizing chemolithotrophic gammaproteobacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 63 (11): 4018-4025.
21- Hedrich, S. and Johnson, D. B. 2013b. Aerobic and anaerobic oxidation of hydrogen by acidophilic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 349 (1): 40-45.
22- Hiraishi, A., Nagashima, K. V., Matsuura, K., Shimadaa, K., Takaichi, S., Wakao, N. and Katayama, Y. 1998. Phylogeny and photosynthetic features of Thiobacillus acidophilus and related acidophilic bacteria: its transfer to the genus Acidiphilium as Acidiphilium acidophilum comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology. 48 (4): 1389-1398.
23- Jaenicke, R. 1981. Enzymes under extremes of physical conditions. Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 10 (1): 1-67.
24- Johnson, D. B., Okibe, N. and Hallberg, K. B. 2005. Differentiation and identification of iron-oxidizing acidophilic bacteria using cultivation techniques and amplified ribosomal DNA restriction enzyme analysis. Journal of Microbiological Methods. 60: 299-313.
25- Kappler, U. 2011. Bacterial sulfite-oxidizing enzymes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. 1807 (1): 1-10.
26- Kappler, U., Aguey-Zinsou, K-F., Hanson, G. R., Bernhardt, P. V. and McEwan, A. G. 2004.  Cytochrome c551 from Starkeya novella characterization, spectroscopic properties, and phylogeny of a diheme protein of the soxAX family. Journal of Biological Chemistry. 279 (8): 6252-6260.
27- Kelly, D. P., McDonald, I. R. and Wood, A. P. 2000. Proposal for the reclassification of Thiobacillus novellus as Starkeya novella gen. nov., comb. nov., in the alpha-subclass of the Proteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (5): 1797-1802.
28- Kelly, D. P. and Wood, A. P. 2000. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (2): 511-516.
29- Le Roux, N., Wakerley, D. and Hunt, S. D. 1977. Thermophilic thiobacillus-type bacteria from Icelandic thermal areas. Journal of General Microbiology. 100 (1): 197-201.
30- Leduc, L., Trevors, J. and Ferroni, G. 1993. Thermal characterization of different isolates of Thiobacillus ferrooxidans. FEMS Microbiology Letters. 108 (2): 189-193.
31- Liu, J-y., Xiu, X-X. and Cai, P. 2009. Study of formation of jarosite mediated by Thiobacillus ferrooxidans in 9K medium. Procedia Earth and Planetary Science. 1 (1): 706-712.
32- Lyric, R. M. and Suzuki, I. 1970. Enzymes involved in the metabolism of thiosulfate by Thiobacillus thioparus. I. Survey of enzymes and properties of sulfite: cytochrome c oxidoreductase. Canadian Journal of Biochemistry. 48 (3): 334-343.
33- Masau, R. J. Y., Oh, J. K. and Suzuki, I. 2001. Mechanism of oxidation of inorganic sulfur compounds by thiosulfate-grown Thiobacillus thiooxidans. Canadian Journal of Microbiology. 47 (4): 348-358.
34- McDonald, I. R., Kelly, D. P., Murrell, J. C. and Wood, A. P. 1996. Taxonomic relationships of Thiobacillus halophilus, T. aquaesulis, and other species of Thiobacillus, as determined using 16S rDNA sequencing. Archives of Microbiology. 166 (6): 394-398.
35- Melamud, V., Pivovarova, T., Tourova, T., Kolganova, T., Osipov, G., Lysenko, A., Kondrat'eva, T. and Karavaiko, G. 2003. Sulfobacillus sibiricus sp. nov., a new moderately thermophilic bacterium. Microbiology. 72 (5): 605-612.
36- Middaugh, C. and MacElroy, R. 1976. The Effect of Temperature on Ribose-5-phosphate Isomerase from a Mesophile, Thiobacillus thioparus, and a Thermophile, Bacillus caldolyticus. Journal of Biochemistry. 79 (6): 1331-1344.
37- Mulligan, C. N., Kamali, M. and Gibbs, B. F. 2004. Bioleaching of heavy metals from a low-grade mining ore using Aspergillus niger. Journal of Hazardous Materials. 110 ( 1): 77-84.
38- Nemati, M. and Harrison, S. 2000. A comparative study on thermophilic and mesophilic biooxidation of ferrous iron. Minerals Engineering. 13 (1): 19-24.
39- Nurmi, P. 2009. Oxidation and control of iron in bioleaching solutions. Tampereen teknillinen yliopisto. Julkaisu-Tampere University of Technology. Publication. 840.
40- Okabe, S., Odagiri, M., Ito, T. and Satoh, H. 2007. Succession of sulfur-oxidizing bacteria in the microbial community on corroding concrete in sewer systems. Applied and Environmental Microbiology. 73 (3): 971-980.
41- Øvreås, L., Torsvik, V. 1998. Microbial diversity and community structure in two different agricultural soil communities. Microbial Ecology. 36 (3-4): 303-315.
42- Plumb, J., McSweeney, N. and Franzmann, P. 2008. Growth and activity of pure and mixed bioleaching strains on low grade chalcopyrite ore. Minerals Engineering. 21 (1): 93-99.
43- Pronk, J., Meulenberg, R., Hazeu, W., Bos, P. and Kuenen, J. 1990. Oxidation of reduced inorganic sulphur compounds by acidophilic thiobacilli. FEMS Microbiol Rev. 75: 293-306.
44- Riffaldi, R., Saviozzi, A., Cardelli, R., Cipolli, S. and Levi-Minzi, R. 2006. Sulphur mineralization kinetics as influenced by soil properties. Biology and Fertility of Soils. 43(2): 209-214.
45- Rzhepishevska, O. 2008. Physiology and Genetics of Acidithiobacillus species: Applications for Biomining. Umea university, Sweden. 1-73.
46- Salazar, C. N., Acosta, M., Galleguillos, P. A., Shmaryahu, A., Quatrini, R., Holmes, D. S. and Demergasso, C. S. 2013. Analysis of gene expression in response to copper stress in Acidithiobacillus ferrooxidans strain D2, isolated from a copper bioleaching operation. In:  Advanced Materials Research. Trans Tech Publ. 825: 157-161.
47- Schrenk, M. O., Edwards, K. J., Goodman, R. M., Hamers, R. J. and Banfield, J. F. 1998. Distribution of Thiobacillus ferrooxidans and Leptospirillum ferrooxidans: implications for generation of acid mine drainage. Science. 279 (5356): 1519-1522.
48- Suzuki, I. 1999. Oxidation of inorganic sulfur compounds: chemical and enzymatic reactions. Canadian Journal of Microbiology. 45 (2): 97-105.
49- Talla, E., Hedrich, S., Mangenot, S., Ji, B., Johnson, D. B., Barbe, V. and Bonnefoy, V. 2014. Insights into the pathways of iron-and sulfur-oxidation, and biofilm formation from the chemolithotrophic acidophile Acidithiobacillus ferrivorans CF27. Research in Microbiology. 165 (9): 753-760.
50- Thompson, J. D., Gibson, T. and Higgins, D. G. 2002. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Current Protocols in Bioinformatics. 2 (3):1-22.
51- Vieille, C., Burdette, D. S. and Zeikus, J. G. 1996. Thermozymes. Biotechnology Annual Review. 2: 1-83.
52- White, C., Shaman, A. K. and Gadd, G. M. 1998. An integrated microbial process for the bioremediation of soil contaminated with toxic metals. Nature Biotechnology. 16 (6): 572-575.
پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
دوره 30، شماره 1
خرداد 1396
صفحه 40-54
  • تاریخ دریافت: 12 اسفند 1394
  • تاریخ بازنگری: 14 آذر 1395
  • تاریخ پذیرش: 21 تیر 1395