نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
2 دانش آموخته دانشگاه شاهرود
3 عضو هیات علمی دانشگاه شاهرود
4 عضو هیات علمی دانشگاه شهید بهشتی
5 عضو هیات علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری صنعت و محیط زیست، گروه مهندسی زیست فرآیند
چکیده
پپلیگالاکتورونازها (GH28)، عمدتاً در گیاهان سبب هیدرولیز سوبسترای پکتینی میشوند. پلیگالاکتورونازها به طور گسترده در گیاهان عالی و میکروارگانیسمها موجود میباشند. استخراج پلیگالاکتوروناز از منابع قارچی، به علت بازدهی بالای تولید، کاربرد فراوان دارد. در این پژوهش، قارچ M. phaseolina، عامل بیماری پوسیدگی ذغالی، برای تولید پلی گالاکتوروناز در محیط تولید آنزیم کشت و عصاره قارچی جدا گردید. بیشترین فعالیت پلیگالاکتورونازی محلول آنزیمی، در دمای 60 درجه سانتیگراد بود. این آنزیم از پایداری دمایی و اسیدیته بالایی برخوردار است بهطوریکه، نیمه عمرحرارتی آن در دمای 50 و 70 درجه سانتیگراد به-ترتیب حدود 627 و 345 دقیقه و میزان تغییرات انرژی آزاد غیر فعالسازی حرارتی آنزیم در دمای 70 درجه سانتیگراد تقریبا معادل 114 کیلو ژول بر مول بود که حاکی از پتانسیل بالای این آنزیم جهت کاربرد در صنایع میباشد. این آنزیم از پایداری بسیار بالایی در شرایط بسیار اسیدی و قلیایی برخوردار است. بررسی و مقایسه خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازهای منابع مختلف قارچی با استفاده از برنامه ProtParam نیز پلیگالاکتورونازهای M. phaseolina را در گروه پایدارترین پلیگالاکتورونازهای قارچی قرار داد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Extraction of a polygalacturonase from Macrophomiona phaseolina and analysis of its stability
نویسندگان [English]
5 Academic Staff
چکیده [English]
Polygalacturonases (GH28) hydrolyze the pectic substances, present mostly in plants. Polygalacturonases are widely distributed among some bacteria, fungi, and higher plants. Microbial polygalacturonases, mainly produced by fungi, are utilized in many large-scale industrial processes. Production of a polygalacturonase from a fungal phytopathogen, M. phaseolina was evaluated in this study. M. phaseolina was cultured in the production medium. The crude extract was separated from fungal cells. The highest enzyme activity was observed at 60 °C. This enzyme had a high stability at wide ranges of pH and temperature and exhibited a t1/2 of 400 min at 70 °C. The value for free energy of the heat inactivation at the temperature of 70 °C was about 108 kJ, suggesting its potential to be used as an industrial enzyme. Analysis of biochemical characteristics of polygalacturonase from different fungi using ProtParam demonstrated that the M. phaseolina polygalacturonase was amongst the most stable fungal polygalacturonases.
کلیدواژهها [English]
استخراج و بررسی پایداری و پارامترهای ترمودینامیکی یکی از پلیگالاکتورونازهای قارچ Macrophomiona phaseolina
الناز فهیمی بایرامی1و2، ناصر فرخی2و 3 و سعید امین زاده1*
1 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری صنعت و محیط زیست، گروه مهندسی زیست فرآیند
2 شاهرود، دانشگاه شاهرود، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات
3 تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده مهندسی فناوریهای نوین، گروه بیوتکنولوژی
تاریخ دریافت: 21/2/94 تاریخ پذیرش: 10/5/94
چکیده
پلیگالاکتورونازها (GH28)، عمدتاً در گیاهان سبب هیدرولیز سوبسترای پکتینی میشوند. پلیگالاکتورونازها به طور گسترده در گیاهان عالی و میکروارگانیسمها موجود میباشند. استخراج پلیگالاکتوروناز از منابع قارچی، به علت بازدهی بالای تولید، کاربرد فراوان دارد. در این پژوهش، قارچ M. phaseolina، عامل بیماری پوسیدگی زغالی، برای تولید پلی گالاکتوروناز در محیط تولید آنزیم کشت و عصاره قارچی جدا گردید. بیشترین فعالیت پلیگالاکتورونازی محلول آنزیمی، در دمای 60 درجه سانتی گراد بود. این آنزیم از پایداری دمایی و اسیدیته بالایی برخوردار است بهطوری که، نیمه عمر حرارتی آن در دمای 50 و 70 درجه سانتی گراد بهترتیب حدود 627 و 345 دقیقه و میزان تغییرات انرژی آزاد غیر فعالسازی حرارتی آنزیم در دمای 70 درجه سانتی گراد تقریباً معادل 114 کیلو ژول بر مول بود که حاکی از پتانسیل بالای این آنزیم جهت کاربرد در صنایع میباشد. این آنزیم از پایداری بسیار بالایی در شرایط بسیار اسیدی و قلیایی برخوردار است. بررسی و مقایسه خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازهای منابع مختلف قارچی با استفاده از برنامه ProtParam نیز پلیگالاکتورونازهای M. phaseolina را در گروه پایدارترین پلیگالاکتورونازهای قارچی قرار داد.
واژه های کلیدی: M. phaseolina، پلیگالاکتوروناز، پایداری حرارتی و اسیدیته، ProtParam
* نویسنده مسئول، تلفن: 44787412-021 ، پست الکترونیکی: aminzade@nigeb.ac.ir
مقدمه
در طبیعت میکروارگانیسم ها با پتانسیلهای مختلف موجود میباشند. آنها مجموعهای از آنزیمها را تولید مینمایند که در ابعاد تجاری مورد استفاده قرار میگیرند (8). در میان آنزیمها، پکتینازها بسیار حائز اهمیت و دارای پتانسیل فوقالعاده جهت ارائه در صنعت میباشند؛ بهطوری که 25 درصد از کل آنزیمهای با تولید تجاری صنایع غذایی را شامل میشوند (13 و 14). پکتینازها دارای کاربرد گسترده در صنایع گوناگون مانند نساجی، پردازش فیبرهای گیاهی(14) ، چای (6)، قهوه (13)، استخراج نفت، کاغذسازی (24 و 25) و خالص سازی ویروسهای گیاهی (26) میباشند و از اجزای کوکتل آنزیمی مورد استفاده جهت آمادهسازی غذای حیوانات میباشد (11). این آنزیمها دارای اهمیت بیولوژیکی، در تکنولوژی امتزاج پروتوپلاست و بیماریشناسی گیاهی میباشند. همچنین این آنزیمها، بهعنوان جایگزین عملی و اقتصادی فرآیندهای سنتی، جهت کاهش زبالههای آنیونی و آلودگیهای پساب صنایع کاغذسازی مورد استفاده قرار می گیرند (15 و 16). فرآیندهای صنایع گیاهی، منجر به ایجاد پساب حاوی مواد پکتینیمیگردند. کاربرد گسترده پلیگالاکتورونازها در صنایع پالایش زیستی فاضلابهای حاوی مواد پکتینی نیز گزارش شده است (11). پلیگالاکتورونازها، گروهی از آنزیمهای دارای ساختار گلیکوپروتئینی و عملکرد پکتینولیتیک میباشند که از طریق اکسیژن مولکول آب (حمله اکسیژن مولکول آب به کربن گروه کربونیل)، برش هیدرولیتیکی زنجیره پلیگالاکتورونیک اسید را کاتالیز مینمایند (27). مواد پکتینی ترکیب اصلی دیواره سلولهای گیاهی میباشند (1). پلیگالاکتورونازها با تجزیه پلیمرهای پکتینی دیواره سلولی، تشکیل کلنیهای قارچی را روی گیاه میسر میسازند (9، 12 و 21) و فاکتور اصلی تخریب بافتهای گیاهی در فرآیند نفوذ فیتوپاتوژن میباشند (4). این آنزیمها به طور گسترده در گیاهان عالی و میکروارگانیسمها موجود میباشند (32) و در میان خانواده آنزیمهای پکتینولیتیک بیشترین سهم مطالعات را به خود اختصاص دادهاند. تقریباً تمام ظرفیتهای تجاری آنزیمهای پکتینولیتیک متعلق به منابع قارچی میباشند (13). انتخاب منبع میکروبی مناسب جهت تولید پلیگالاکتورونازها به فاکتورهای مختلف، از قبیل ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی، مانند pH و پایداری حراتی آنزیمها بستگی دارد. با توجه به کاربرد گسترده آنزیم پلیگالاکتوروناز در صنایع گوناگون، مطالعه خواص بیوشیمیایی این آنزیمها جهت ارتقای سطح تولید و فعالیت آنها و نیز تعیین منبع مناسب تولید آنزیم ضروری میباشد. در این مطالعه تولید و بررسی ویژگیهای کاتالیتیکی و پایداری حرارتی و اسیدیته آنزیم پلیگالاکتوروناز قارچ M. phaseolina بهمنظور تعیین پتانسیل این آنزیم جهت کاربرد در صنعت و البته شناخت نسبی ساختار آنزیم، مورد توجه قرار گرفته است. خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازهای این قارچ و سایر منابع قارچی به لحاظ بیوانفورماتیکی نیز مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت.
مواد و روشها
قارچ M. phaseolina اهدایی آقای دکتر ابوالفضل سرپله از مؤسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور بود. پلیگالاکترونیکاسید، α-D-گالاکترونیکاسید و 5،3-دی-نیتروسالیسیلیکاسید (DNS) از شرکت سیگما و سایر مواد شیمیایی از شرکت مرک (Darmstadt,Germany) تهیه گردید.
تولید پلیگالاکتوروناز از قارچ M. phaseolina : قارچ M. phaseolina، پس از تکثیر در محیط مایع PDB، جهت نگهداری در محیط جامد PDA کشت شد. جهت القای تولید آنزیم پلیگالاکتوروناز، قارچ M. phaseolina در شرایط استریل از محیط PDA به محیط بهینه تولید پلیگالاکتوروناز (۵ گرم در لیتر پلیگالاکتورونیک اسید، ۳ گرم در لیتر سولفات آمونیوم، ۱۰ گرم در لیتر فسفات دیهیدروژن پتاسیم، ۲ گرم در لیتر سولفات منیزیم، 7/0 میلیگرم در لیتر بورات سدیم، 5/0میلیگرم در لیتر مولیبدات آمونیوم، ۱۰ میلیگرم در لیتر فروسولفات آهن، 3/0 میلیگرم در لیتر سولفات مس، 11/0 میلیگرم در لیتر سولفات منگنز، ۱۷/۶ میلیگرم در لیتر سولفات روی، 4 = pH) منتقل گردید و به مدت 72 ساعت در شیکر انکوباتور (35 درجه سانتی گراد و 180 دور در دقیقه) قرار گرفت. محیط کشت حاوی قارچ تکثیر یافته، از کاغذ صافی عبور داده شد. عصاره حاوی آنزیمهای ترشحی، مورد سنجش پایداری حرارتی و اسیدیته فعالیت پلیگالاکتورونازی قرار گرفت.
سنجش فعالیت پلیگالاکتورونازی: میزان فعالیت پلیگالاکتورونازی محلول واکنش با استفاده از روش DNS (20) تخمین زده شد. در این روش، محلول واکنش برای مدت زمان مشخصی انکوبه گردید و با حرارت و معرف رنگی حاوی سود، واکنش متوقف شد و میزان فعالیت آنزیمی بر اساس میزان محصول تولیدی محاسبه گردید. فعالیت پلیگالاکتورونازی با اندازهگیری میزان واحدهای D-گالاکترونیک اسید آزاد شده (میزان محصولی که تولید شده است) به عنوان گروههای احیاءیی سنجیده شد. محلول سوبسترای پلیگالاکتورونیک اسید یک درصد وزنی/ حجمی در بافر استات 20 میلیمولار (4pH = ) و محلول رنگی3و5-دینیتروسالیسیلیک اسید (DNS) برای سنجش فعالیت آنزیم به کار رفت. . جهت سنجش فعالیت پلیگالاکتورونازی، 200 میکرولیتر محلول پروتئینی به 200 میکرولیتر محلول سوبسترا افزوده شد. ویال محتوی محلول واکنش بهمدت 45 دقیقه در بن ماری دمای 50 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از این مدت 400 میکرولیتر محلول رنگی 3 و 5 دی نیترو سالیسیک اسید(DNS) افزوده شد تا فعالیت آنزیمی متوقف گردد. ویالها به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار داده شد. پس از خنک شدن در دمای اتاق در g × 8000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید و جذب مایع رویی در 530 نانومتر خوانده شد. DNS قادر به شناسایی انتهای احیاءکننده گروه هیدروکسیل (OH-) کربن شماره یک کربوهیدرات میباشد و با آن تشکیل کمپلکسی میدهد که دارای جذب در طول موج 530 نانومتر میباشد. نواحی احیاءیD -گالاکتورونیک اسید تولیدی(در اثر فعالیت آنزیم پلیگالاکتوروناز بر سوبسترای پلیگالاکتورونیک اسید) در واکنش با معرف DNS، موجب افزایش جذب (رنگ قرمز تیره) در محلول واکنش میگردد. هر چه میزان جذب بالاتر(رنگ تشکیل شده تیرهتر) باشد، حاکی از تولید میزان بیشتری ازD -گالاکتورونیک اسید و به تبع آن فعالیت و غلظت (5) پلیگالاکتورونازی بیشتر میباشد.
بررسی تأثیر دما بر فعالیت آنزیم و به دست آوردن دمای بهینه (Temperature Profile): جهت تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیمی، تأثیر دماهای 20 تا 80 درجه سانتی گراد بر فعالیت آنزیم اندازهگیری شد. برای این منظور، 200 میکرولیتر از محلول سوبسترا به 200 میکرولیتر آنزیم، افزوده شد و به مدت 15 دقیقه در دماهای 20 تا 80 درجه سانتی گراد قرار گرفت. بعد از گذشت این زمان به مخلوط سوبسترا و آنزیم، 400 میکرولیتر DNS اضافه گردید و از طریق سنجش فعالیت آنزیمی جذب هر کدام از نمونهها در 530 نانومتر خوانده شد.
بررسی غیر فعال شدن حرارتی برگشتناپذیر آنزیم در زمانهای مختلف و در درجه حرارت 70 درجه سانتی گراد: بهمنظور بررسی غیر فعالسازی حرارتی برگشتناپذیر پلیگالاکتوروناز، آنزیم در دماهای 50 و 70 درجه سانتی گراد در زمانهای صفر تا 60 دقیقه انکوبه و سپس در حضور محلول سوبسترای پلیگالاکتورونیک اسید، مورد سنجش فعالیت آنزیمی، قرار گرفت. باقیمانده فعالیت آنزیمی از طریق رابطه (1) محاسبه میشود (3):
رابطه 1 Residual PG activity % = 100(At/Ao)
در این رابطه At میزان فعالیت آنزیم در زمان t و بر حسب ثانیه، A0 میزان فعالیت آنزیم در زمان صفر میباشد.
غیر فعال شدن حرارتی آنزیم اغلب با مدل کینتیکی first-order توصیف میشود. یعنی فعالیت آنزیم به صورت لگاریتمی خطی با گذشت زمان کاهش پیدا میکند که به صورت رابطه (2) نشان داده میشود (3):
رابطه 2 Ln(At/AO)= -kt
در این رابطه At میزان فعالیت آنزیم در زمان t و A0 میزان فعالیت اولیه آنزیم، t زمان تیمار آنزیم و k ثابت سرعت غیر فعال شدن میباشد.
محاسبه پارامترهای ترمودینامیکی: میزان انرژی آزاد برای غیر فعال سازی آنزیم پلیگالاکتوروناز (ΔG#)، با استفاده از رابطه (3) محاسبه میگردد (3):
رابطه 3 ΔG# = -RT ln(kh/KBT)
که (6.62 × 10-34 J.s) h ثابت پلانک و (1.3806 × 10-23 JK-1) KB ثابت بولتزمن میباشد.
جهت محاسبه میزان نیمه عمر حرارتی آنزیم، از رابطه (4) استفاده میشود (3):
رابطه 4 T1/2 = ln(2) /k (min-1)
که در آن t1/2 نیمه عمر حرارتی آنزیم و k ثابت سرعت غیر فعال سازی است که از روی شیب منحنی لگاریتم درصد فعالیت نسبت به زمان قابل محاسبه میباشد.
بررسی پایداری آنزیم در pHهای مختلف: جهت بررسی پایداری فعالیت پلیگالاکتورونازی محلول پروتئینی در pHهای مختلف، ابتدا بافر مخلوط 5 میلیمولار از فسفات سدیم، استات سدیم و گلایسین در pHهای 3 تا 12 تهیه شد. محلولهای آنزیمی به هر یک از بافرهای مخلوط (pHهای 3 تا 12) افزودهشد و این محلولهای آنزیمی در pHهای مختلف به مدت 90 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. بعد از گذشت این زمان، محلول سوبسترای پلیگالاکتورونیک اسید به نمونهها افزوده شد و ویالهای محتوی محلول واکنش بهمدت 15 دقیقه در بنماری و در دمای بهینه فعالیت آنزیم قرار گرفت. سپس از طریق سنجش فعالیت آنزیمی، جذب هر کدام از نمونهها در 530 نانومتر خواندهشد.
بررسی و مقایسه بیوانفورماتیکی خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازهای M. phaseolina و سایر منابع قارچی: توالی پروتئینی پلیگالاکتورونازهای قارچی از سایتCaZy (www.afmb.cnrs-mrs.fr/cazy) جمعآوری گردید. تمامی این آنزیمها در خانواده 28 طبقهبندی شدهاند. تنها پلیگالاکتورونازهایی که به عنوان اندو و اگزو پلیگالاکتوروناز معرفی شدهاند جهت آنالیز استفاده شد. نتایج آنالیز ژنوم M. phaseolina، حاکی از وجود هفت پلیگالاکتوروناز در این قارچ، با شماره دستیابی 40792390، 407922771، 407917170، 407925949، 407924329، 407921266، 407920911 و 407925004 در پایگاه داده های بیوتکنولوژی (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) میباشد. خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازهای قارچ M. phaseolina و سایر منابع قارچی با استفاده از برنامه ProtParam (/tools/ch.expasy.www//:http) مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت (10).
نتایج و بحث
اغلب فرآیندهای آنزیمی در صنعت، در دمای بسیار بالا صورت میگیرند و در این رابطه آنزیمهای ترموفیل از اهمیت ویژهای برخوردار میباشند. افزایش حلالیت سوبسترا و سرعت واکنش و کاهش خطر آلودگی میکروبی که عمدتاً از منبع استخراج آنزیم ناشی میشود، از مزایای مهم استفاده از دمای بالا در این صنایع میباشند. اکثر پلیگالاکتورونازها در محدوده دمایی 40-30 درجه سانتی گراد فعالیت مینمایند (13) اما معدودی از آنها مانند پلیگالاکتورونازهای جدا شده از Bacillus licheniformis (27) و Fusarium oxysporum (23)، ترموفیل میباشند و دارای اپتیمم فعالیت در محدوده دمایی50 تا 60 درجه سانتی گراد میباشند (13) در این مطالعه پلیگالاکتوروناز قارچ M. phaseolina در دمای 60 درجه سانتی گراد دارای بیشترین میزان فعالیت بود. همچنین مشخص گردید آنزیم مورد بررسی در دماهای 70 و 80 درجه سانتی گراد دارای بیش از 50 درصد فعالیت حداکثر میباشد (شکل 1).
شکل1 - بررسی تأثیر دما بر میزان فعالیت آنزیم پلیگالاکتوروناز در حضور سوبسترای پلیگالاکتورونیک اسید و 3pH = ، آنزیم در دمای 60 درجه سانتی گراد دارای فعالیت بیشینه می باشد.
پایداری دمایی پروتئینهای ترموفیل ویژگی ذاتی است و به ترتیب و نوع اسیدهای آمینه موجود در ساختار اول آنها بستگی دارد. پایداری دمایی پروتئینها، نتیجه بهینه نمودن برهمکنشهای درون مولکولی، تراکم ساختاری و آرایش داخلی اسیدهای آمینه هیدروفوب و در سطح پروتئین قرار گرفتن اسیدهای آمینه هیدروفیل میباشد. پایداری آنزیم پلیگالاکتوروناز در دماهای 50 و 70 درجه سانتی گراد بررسی گردید (شکل 2). این آنزیم پس از 60 دقیقه تیمار در این دماها، حدود 93 درصد از فعالیت خود را حفظ نمود. در هیچ یک از مطالعاتی که تاکنون در مورد پایداری حرارتی پلیگالاکتورونازهای منابع گوناگون صورت گرفته این میزان از پایداری حرارتی آنزیم گزارش نشده است بهطوری که مارتینز و همکاران (2013) دمای اپتیمم فعالیت آنزیم را 60 درجه سانتی گراد گزارش نمودند، با اینحال آنها اعلام نمودند این آنزیم نسبتاً ترموفیل، پس از 60 دقیقه انکوباسیون در دمای 60 درجه سانتی گراد ، 90 درصد فعالیت خود را از دست میدهد (19).
شکل 2 - نمودار بررسی پایداری حرارتی پلیگالاکتوروناز در زمانهای 20 و 60 دقیقه در دماهای 50 و 70 درجه سانتی گراد، این آنزیم پس از 60 دقیقه تیمار در دمای 50 و70 درجه سانتی گراد، 93 درصد از فعالیت خود را حفظ نمود.
محاسبه نیمه عمر حرارتی و میزان انرژی آزاد برای غیر فعال سازی حرارتی آنزیم (ΔG#) با استفاده از ثابت سرعت غیر فعالسازی حرارتی آنزیم صورت گرفت. این ثابت، معادل شیب خطوط نمودار غیر فعالسازی حرارتی برگشتناپذیر آنزیم می باشد که در دمای 50 درجه سانتی گراد معادل (min/1) 0011/0 تخمین زده شد (شکل 3). بههمین ترتیب ثابت سرعت غیر فعالسازی آنزیم در دمای 70 درجه سانتی گراد معادل(min/1) 002/0 تخمین زده شد. نتایج نشان داد پلیگالاکتوروناز قارچ M. phaseolina در دمای 50 و 70 درجه سانتی گراد احتمالاً بهترتیب دارای نیمه عمر حرارتی معادل تقریباً 627 و 345 دقیقه میباشد. مقدار نیمه عمر حرارتی پلیگالاکتوروناز این قارچ بسیار بزرگتر از مقدار محاسبه شده برای پلیگالاکتوروناز Tetracoccosporium sp. (01/63 دقیقه)(3) و Aspergillus giganteus (30 دقیقه)(22)، در دمای 60 درجه سانتی گراد، میباشد که بر پایداری حرارتی بسیار بالای پلیگالاکتوروناز قارچ M. phaseolina دلالت دارد. مقدار تغییرات انرژی آزاد غیر فعالسازی حرارتی آنزیم در دمای50 و 70 درجه سانتی گراد، بهترتیب حدود 109 و 114 کیلو ژول بر مول بود. میزان بالای این پارامتر حاکی از ثبات قابل ملاحظه ساختمان شیمیایی و سهبعدی آنزیم و مقاومت آن نسبت به حرارت میباشد. بنابراین مشخص گردید، آنزیم قادر به حفظ فعالیت خود در درجه حرارت بسیار بالا در مدت زمان طولانی میباشد. مقدار تقریباً مشابهی برای تغییرات انرژی آزاد غیر فعالسازی حرارتی پلیگالاکتوروناز Tetracoccosporium sp. (35/94 کیلوژول بر مول)(3) و Erwinia carotovora (83 تا 1/86 کیلوژول بر مول)(17) تخمین زده شده است.
مطالعات صورت گرفته تاکنون، پایداری پلیگالاکتورونازهای منابع مختلف را در pHهای اسیدی (18)، قلیایی (17) و یا در بازه میانی اسیدیته (7، 28، 29، 30 و 31) گزارش نمودهاند. بررسی پایداری اسیدیته پلیگالاکتوروناز M. phaseolina نشان داد ساختار آنزیم در pHهای 2 تا 12 از پایداری قابل توجهی برخوردار میباشد. بهطوری که در pH های 2 و 12 پس از 90 دقیقه بهترتیب حدود 60 و 50 درصد فعالیت آنزیم حفظ گردید. امینزاده و فرخی (2013) گزارش نمودند پلیگالاکتوروناز
M. phaseolina، در3 = pH دارای حداکثر فعالیت آنزیمی می باشد (2). براساس نتایج حاصل از بررسی پایداری اسیدیته پلیگالاکتوروناز M. phaseolina در مطالعه حاضر، آنزیم در pH 5 و 7 بهمیزان 14 درصد، پایداری بیشتری نسبت به pH بهینه نشان داد. همچنین مشخص شد میزان پایداری آنزیم پس از 90 دقیقه تیمار در pH بهینه، بیشتر از میزان پایداری پس از 30 دقیقه تیمار در این pH است. بهنظر میرسد ساختار آنزیم جهت داشتن حداکثر فعالیت در pH بهینه تا حدی از حالت فولدینگ خارج و همچنین احتمالاً شکل تاخورده کامل آنزیم در این pH تشکیل نمیشود. میزان پایداری در pHهای 7 تا 12 کاهش یافت و بهنظر میرسد بررسی حدواسطهای ساختار آنزیمی در این pH ها امکانپذیر باشد. تاکنون چنین گزارشی از الگوی پایداری اسیدیته پلیگالاکتورونازها ارائه نشده است.
شکل 3 - نمودار بررسی غیر فعال شدن حرارتی برگشتناپذیر آنزیم در زمانهای مختلف و در دمای 50 درجه سانتی گراد، شیب خط معادل ضریب سرعت غیرفعالسازی آنزیم در این دما میباشد.
بررسی و مقایسه بیوانفورماتیکی خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازهای M. phaseolina و سایر منابع قارچی: خصوصیات بیوشیمیایی تمامی اندو و اگزو پلیگالاکتورونازهای قارچی(جدول1) و پلیگالاکتورونازهای M. phaseolina (جدول 2) مورد بررسی قرار گرفت. بررسی خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازها با استفاده از برنامه protparam نشان داد، وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه ایزو الکتریک پیشبینی شده، دارای تنوع فاحشی بین انواع پلیگالاکتورونازها در منابع مختلف قارچی میباشد. مطالعات انجام گرفته بر روی ساختار مولکولی ایزوآنزیمهای مختلف این آنزیم نشان داده است که توالی اسید آمینهای کلیه ایزوآنزیمها جز در بخشی از ناحیه کربوکسیلی آنها، که جایگاه فعال آنزیم در آن قرار دارد، دارای همولوژی بسیار کمی میباشد و این عامل سبب بروز خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متفاوت ایزوآنزیمهای مختلف این آنزیم در بین سویههای مختلف قارچی و حتی در درون یک سویه، خصوصاً از نظر وزن مولکولی و pH ایزوالکتریک آنها شده است (18). شاخص ناپایداری پروتئینها بیانگر میزان پایداری آنها در لوله آزمایش میباشد به طوری که پروتئینهایی با شاخص کمتر از 40 جزء پروتئینهای پایدار تقسیمبندی میشوند (8). شاخص ناپایداری اندوپلیگالاکتورونازها بین (67/5) در قارچ Heterobasidion aff.annosum که دارای اندوپلیگالاکتوروناز با 79 اسید آمینه تا 39/36 در قارچ Aspergilus niger که دارای اندوپلیگالاکتوروناز با 495 اسید آمینه میباشد، متفاوت است، که حاکی از پایداری این آنزیم در قارچ H.annosum نسبت به قارچ A.niger میباشد. میزان شاخص ناپایداری پلیگالاکتورونازهای قارچ M. phaseolina نیز بر پایداری این آنزیمها دلالت دارد. همانطور که اشاره شد، پایداری حرارتی و فعالیت پلیگالاکتورونازها در فرآیندهای بیوتکنولوژیکی بسیار حائز اهمیت میباشد. شاخص آلیفاتیک به عنوان یک عامل مهم به منظور برآورد مقاومت پروتئینها در برابر حرارت میباشد، پلیگالاکتورونازهای قارچ M. phaseolina براساس این پارامتر نیز در گروه پایدارترین پلی گالاکتورونازهای قارچی قرار میگیرد.
جمعبندی
نتایج حاصل از بررسی میزان فعالیت و پایداری حرارتی و اسیدیته پلیگالاکتورونازی که توسط قارچ M. phaseolina تولید گردید، حاکی از ثبات بسیار بالای ساختار شیمیایی و مولکولی این آنزیم و مقاومت بسیار بالای آن نسبت به حرارت و شرایط گوناگون اسیدیته میباشد. بنابراین این قارچ به عنوان منبع مناسب جهت تولید آنزیم پلیگالاکتوروناز به منظور استفاده در صنعت، پیشنهاد میگردد.
جدول 1 - خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازهای منابع مختلف قارچی |
|
|||||||||
ProtParam |
|
|
||||||||
شاخص آلیفاتیک |
شاخص ناپایداری |
نقطه ایزوالکتریک |
وزن مولکولی (دالتون) |
ماهیت پلیگالاکتورونازی |
قارچها |
|
||||
04/75 |
88/21 |
85/4 |
1/38812 |
اندو |
Alternaria macrospora |
|
||||
03/84 |
92/31 |
51/5 |
1/49161 |
اگزو |
Emericella nidulans |
|
||||
53/74 |
39/36 |
28/4 |
5/50782 |
اندو |
Aspergillus niger |
|
||||
35/86 |
71/32 |
64/4 |
2/48383 |
اگزو |
Aspergillus niger |
|
||||
48/69 |
48/32 |
26/4 |
4/49014 |
اندو |
Bispora sp. MEY-1 |
|
||||
41/78 |
15/27 |
94/5 |
7/35005 |
اندو |
Botryotinia fuckeliana |
|
||||
68/78 |
23/38 |
97/4 |
0/49468 |
اگزو |
Botryotinia fuckeliana |
|
||||
06/75 |
07/29 |
70/4 |
1/46722 |
اندو |
Botrytis fabae |
|
||||
43/72 |
96/14 |
97/4 |
3/155652 |
اندو |
Chondrostereum purpureum |
|
||||
03/71 |
84/29 |
56/8 |
4/51654 |
اگزو |
Fusarium oxysporum f. cubense |
|
||||
10/76 |
67/24 |
13/6 |
8/38769 |
اندو |
Gibberella intermedia |
|
||||
20/96 |
67/5 |
93/7 |
7/7915 |
اندو |
Heterobasidion aff. annosum |
|
||||
44/85 |
77/21 |
09/7 |
5/38145 |
اندو |
Penicillium sp. CGMCC 1669 |
|
||||
65/72 |
92/30 |
21/5 |
2/39368 |
اندو |
Sclerotinia sclerotiorum |
|
||||
85/58 |
54/34 |
38/6 |
3/28644 |
اگزو |
Sclerotinia sclerotiorum |
|
||||
91/72 |
96/20 |
93/8 |
9/37517 |
اندو |
Thanatephorus cucumeris |
|
||||
جدول 2 - خصوصیات بیوشیمیایی پلیگالاکتورونازهای M. phaseolina |
||||||||||
شاخص آلیفاتیک |
شاخص ناپایداری |
نقطه ایزوالکتریک |
وزن مولکولی (دالتون) |
شماره دستیابی |
||||||
46/74 |
81/33 |
41/4 |
6/46542 |
gi|407923909| |
||||||
61/67 |
96/33 |
77/4 |
8/44328 |
gi|407922771| |
||||||
48/87 |
19/22 |
4/6 |
8/37429 |
gi|407917170| |
||||||
61/67 |
32/29 |
4/4 |
2/54638 |
gi|407925949| |
||||||
63/75 |
6/21 |
4/4 |
9/38198 |
gi|407924329| |
||||||
51/77 |
64/34 |
58/4 |
7/48671 |
gi|407921266| |
||||||
60/81 |
78/29 |
49/4 |
9/41316 |
gi|407920911| |