نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه لرستان
2 عضو هیأت علمی دانشگاه لرستان
3 دانشگاه زابل
چکیده
آویشن کرک¬آلود (Thymus pubescens) یکی از گیاهان دارویی خانواده نعناعیان است. با توجه به مشکلات اصلاحی گیاهان دارویی، استفاده از نشانگرها در بررسی تنوع ژنتیکی آنها ابزار قدرتمندی محسوب می¬شود. در این تحقیق جهت تعیین تنوع ژنتیکی آویشن¬های کرک¬آلود از 30 آغازگر نیمه¬تصادفی از دو گروه آغازگرهای اینترونی و اگزونی استفاده شد. پس از مشاهده محصولهای واکنش زنجیره¬ای پلیمراز بر روی ژل آگارز و امتیازدهی باندهای DNA، تجزیه و تحلیل با نرم¬افزار DARwin5 انجام شد. کل آغازگرها 96 درصد چندشکلی نشان داد. بیشترین میزان اطلاعات چندشکلی و شاخص نشانگر در آغازگرهای اینترونی و اگزونی را به ترتیب آغازگرهایIT18-1 و ET12-27 تشکیل دادند. در هر دو گروه آغازگرها بیشترین شباهت ژنتیکی را دو توده با منشأ جغرافیایی یکسان تشکیل دادند و گروه¬بندی تجزیه خوشه¬ای با گروه¬بندی تجزیه مولفه¬های اصلی همخوانی داشت. نتایج نشان داد که آغازگرهای اینترونی بهتر از آغازگرهای اگزونی توانسته توده-های آویشن کرک¬آلود را از هم تفکیک کنند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Comparison of intron and exon markers in assessment of genetic diversity between Thymus pubescens
نویسنده [English]
چکیده [English]
Thymus pubescens is one of the medicinal plants of Lamiaceae, growing endemically in most regions (especially in north and west) of Iran. Molecular markers were used in genetic diversity studies of medicinal plants for breeding applications. In this study, 30 semi-random primers, including IT (intron targeting) and ET (exon targeting), were used for assessment of genetic diversity among Thymus pubescens accessions. DNA extracted from fresh leaves of Thyme and polymerase chain reaction products were separated on 1.5% agarose gel by electrophoresis. All of primers produced 559 bands which 96% of them were polymorphic. 302 and 257 polymorphic bands belong to IT and ET primers, respectively. The highest polymorphic information content (PIC) and marker index (MI) among IT and ET primers belonged to IT18-1 and ET12-27, respectively. Cluster analysis 0f IT and ET primers, using UPGMA method, Dice's similarity coefficient and DARwin5 software, divided accessions into three and four clusters, respectively. In both dendrogram, the highest genetic similarity showed between two accessions with similar geographical origin. Cluster analysis results were aligned with grouping of principal component analysis. Results of this study revealed that IT primers could discriminate Thymus pubescens accessions in compared with ET primers.
کلیدواژهها [English]
مقایسه نشانگرهای اینترونی و اگزونی در ارزیابی تنوع ژنتیکی آویشن کرکآلود (Thymus pubescens)
فرزانه مجیری1، احمد اسماعیلی1*، فرهاد نظریان فیروزآبادی1 و رضا مومنی2
1 خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات
2 زابل، دانشگاه زابل، دانشکده علوم، گروه آمار
تاریخ دریافت: 20/11/91 تاریخ پذیرش: 5/3/92
چکیده
آویشن کرکآلود (Thymus pubescens) یکی از گیاهان دارویی خانواده نعناعیان است. با توجه به مشکلات اصلاحی گیاهان دارویی، استفاده از نشانگرها در بررسی تنوع ژنتیکی آنها ابزار قدرتمندی محسوب میشود. در این تحقیق جهت تعیین تنوع ژنتیکی آویشنهای کرکآلود از 30 آغازگر نیمهتصادفی از دو گروه آغازگرهای اینترونی و اگزونی استفاده شد. پس از مشاهده محصولهای واکنش زنجیرهای پلیمراز بر روی ژل آگارز و امتیازدهی باندهای DNA، تجزیه و تحلیل با نرمافزار DARwin5 انجام شد. کل آغازگرها 96 درصد چندشکلی نشان داد. بیشترین میزان اطلاعات چندشکلی و شاخص نشانگر در آغازگرهای اینترونی و اگزونی را به ترتیب آغازگرهایIT18-1 و ET12-27 تشکیل دادند. در هر دو گروه آغازگرها بیشترین شباهت ژنتیکی را دو توده با منشأ جغرافیایی یکسان تشکیل دادند و گروهبندی تجزیه خوشهای با گروهبندی تجزیه مؤلفههای اصلی همخوانی داشت. نتایج نشان داد که آغازگرهای اینترونی بهتر از آغازگرهای اگزونی توانسته تودههای آویشن کرکآلود را از هم تفکیک کنند.
واژههای کلیدی: آویشن کرکآلود، تنوع ژنتیکی، اگزون، اینترون، چندشکلی
* نویسنده مسئول، تلفن: 09126054611 ، پست الکترونیکی: ahmad_ismaili@yahoo.com
مقدمه
آویشن (Thymus spp.) یکی از پرکاربردترین گیاهان دارویی و از خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است که به عنوان یک گیاه معطر و دارویی در کشاورزی و اقتصاد مطرح میباشد. این گیاه به صورت بومی در مناطق گستردهای از ایران به ویژه در مناطق غربی و شمالی رویش دارد. از نظر ردهبندی جنس آویشن پیچیده بوده و طبقهبندی آن مشکل است که علت این موضوع را میتوان به فراوانی گونهها و عدم ناسازگاری ژنتیکی بین گونهها نسبت داد. سطوح پلوئیدی متفاوتی حتی در بین گونههای مشابه آویشن دیده شده که نمایانگر پلیپلوئیدی فراوان در این جنس است (18).
آویشن کرکآلود با نام علمی Thymus pubescens Bioss. & kotschy ex Celak یکی از گونههای این جنس است. زمان گلدهی آن بهار و تابستان، رویشگاه آن دامنههای کوهستانی، شکاف سنگها در ارتفاعات منطقه خزری و ایرانی تورانی در ارتفاع 695 تا 3600 متر است (4). این گونه از نظر دامنه پراکنش در شمال عراق و نواحی مرکزی، غربی و شمال غربی ایران پراکنش دارد (24).
کارآیی یک برنامه اصلاحی انتخابی به وسعت تنوع ژنتیکی و قابلیت توارث یک صفت بستگی دارد (12). از آنجا که مبنای همه گزینشها وجود تنوع ژنتیکی است، بنابراین با افزایش تنوع ژنتیکی در یک جمعیت، حدود انتخاب چه طبیعی و چه مصنوعی وسیع تر میشود. از دیگر دلایل اهمیت بررسی تنوع ژنتیکی، استفاده در مدیریت مجموعههای ژنتیکی با هدف کاهش هزینهها، افزایش دقت و قابلیت استفاده در برنامههای اصلاحی است. بنابراین یکی از پایههای اساسی علم اصلاح نباتات به ویژه برای گیاهان دارویی، دسترسی و آگاهی از میزان تنوع در مراحل مختلف پروژههای اصلاحی است (10).
امروزه مطالعات اندکی بر روی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی صورت گرفته است، به طوری که در حال حاضر بیشتر گونههای گیاهان دارویی در معرض خطر انقراض قرار دارند. از مهم ترین کاربرد نشانگرها، بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان است. از بین انواع نشانگرها، نشانگرهای مولکولی به علت مستقل بودن از شرایط محیطی و دارا بودن چندشکلی بیشتر نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی مورد توجه زیادی قرار گرفته است. یک نوع از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز یا PCR، نشانگری است که توالی آنها بر اساس نواحی کدکننده (اگزون) و یا غیرکدکننده (اینترون) ژنوم گیاه طراحی شدهاند که به این نشانگر، نشانگر نیمهتصادفی ISJ (Intron exon Splice Junction) گفته میشود. این نشانگر توسط وینینگ و لانگریج (30) ابداع گردید و سپس توسط رافالسکی و همکاران (22) گسترش بیشتری یافت. محققین بیان کردند که این آغازگرها بسته به اینکه نواحی کدکننده و یا غیرکدکننده ژنوم را تکثیر کنند به ترتیب آغازگرهای مکان هدف اگزون یا ET و مکان هدف اینترون یا IT نامیده میشوند (23). توالی آغازگرهای نیمهتصادفی ISJ شامل نوکلئوتیدهای حفاظت شده و نوکلئوتیدهای تصادفی است (15 و 22). عدهای از محققین بیان نمودند که آغازگرهای ET دارای انتهای 5َ آغازگر اختصاصی است که با نواحی حفاظت شدهای از مکان هدف اینترون اتصال مییابند و نواحی اگزونی را تکثیر میکنند ولی آغازگرهای IT انتهای 3َ آنها اختصاصی است که به نواحی حفاظت شده مرز بین اگزون-اینترون اتصال مییابند و اینترونها را تکثیر میکنند (20، 21 و 30) (شکل 1).
شکل 1- شمایی از مکان هدف آغازگرهای ISJ بر روی ژنوم (فلش جهت تکثیر در رشته الگو را نشان میدهد) (26)
محققین (26) در مطالعهای بر روی بریوفیتها گزارش کردند که برای تعیین نوع آغازگرهای ISJ از دو نوع IT و ET می بایست بیان نمود که بخشی و یا تمامی توالی آغازگر با کدام توالی شکل 1 مطابقت دارد و سپس بر اساس آنکه آن توالی مناطق اینترونی یا اگزونی را تکثیر میکند مشخص خواهد شد که به ترتیب آغازگر از نوعIT یا ET است. برای مثال آغازگر ISJ3 ('3TGCAGGTCA'5) مشابه توالی پایین در سمت راست شکل 1 میباشد که فلش جهت تکثیر را به سمت تکثیر اگزونها نشان میدهد پس این آغازگر از نوع ET است. اما آغازگر ISJ9 ('3AGGTGACCGACCTGCA'5) که بخش محافظت شده توالی (سمت چپ شکل 1) در اگزونها بوده ولی فلش جهت تکثیر را به سمت اینترونها نشان میدهد؛ پس این آغازگر از نوع IT است.
در مطالعهای با استفاده از آغازگرهای نیمهتصادفی، تنوع ژنتیکی 25 رقم تجاری و 14 رقم محلی لوبیا بررسی شد. از 50 آغازگر به کار رفته، شش آغازگر بر اساس تعداد قطعات تولیدی انتخاب شد. نتایج به دست آمده بیانگر کارآیی بالای این نوع آغازگرها در برآورد تنوع ژنتیکی ارقام لوبیا بوده است (20). وهابی و همکاران (28) به ارزیابی تنوع ژنتیکی 14 ژنوتیپ نخود علفی که از مکانهای مختلف ایران جمعآوری شده بود با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISJ پرداختند. نتایج مبنی بر عدم وجود همبستگی معنیداری بین تنوع حاصل از نشانگرهای مورفولوژیکی با نشانگر RAPD بود. در حالی که تنوع ژنتیکی نخودهای علفی با استفاده از نشانگرهای ISJ و RAPDوابستگی معنیدار بالایی را با طبقهبندی مورفولوژیکی نشان دادند. در این مطالعه دندروگرام حاصل از نشانگر RAPD با دندروگرام نشانگر ISJ مطابقت چندانی نداشت. سمیعی (7) در مطالعه خود بر روی تودههای شبدر ایرانی با نشانگر نیمهتصادفی ISJ گزارش کردند که گروهبندی حاصل از آغازگرهای ET توانست ارقام بهاره و پاییزه را بهتر از آغازگرهای IT جدا کند که احتمالاً به دلیل تکثیر بخشی از DNA توسط این نوع آغازگرهاست که صفت بهارهسازی را کنترل میکند.
مطالعات اخیر نشان داد که مطالعات ژنتیکی و اصلاحی محدودی روی گونه آویشن کرکآلود در داخل و خارج کشور انجام شده است، به طوری که تاکنون مطالعهای در مورد تنوع ژنتیکی آویشنT. pubescens با نشانگرهای ISJ صورت نگرفته است. در این مطالعه برای اولین بار به بررسی روابط خویشاوندی تودههای آویشن T. pubescens با استفاده از نشانگرهای ISJ از دو گروه نشانگرهای اینترونی و اگزونی پرداخته شده است.
مواد و روشها
مواد گیاهی مورد استفاده شامل 12 توده آویشن T. pubescensاز چند استان مختلف ایران بود که از مزرعه تحقیقاتی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور واقع در کرج تهیه گردید (جدول 1).
جدول 1- منشأ جغرافیایی تودههای آویشن کرکآلود (Thymus pubescens)
تودهها |
منشأ جغرافیایی |
تودهها |
منشأ جغرافیایی |
1 |
گیلان |
7 |
زنجان |
2 |
زنجان |
8 |
آذربایجان شرقی، مراغه |
3 |
قزوین |
9 |
آذربایجان شرقی، قره چمن |
4 |
آذربایجان غربی |
10 |
کردستان |
5 |
نامشخص |
11 |
زنجان |
6 |
نامشخص |
12 |
تهران |
از آنجا که معمولاً استخراج DNA در گیاهان دارویی به علت وجود ترکیبات بازدارنده و متابولیتهای ثانویه با مشکلاتی روبروست، به همین منظور برای به دست آوردن DNA ژنومی با کیفیت مطلوب، چندین روش استخراج DNA از برگهای جوان و شاداب آویشن مورد آزمایش قرار گرفت و سرانجام روش خانوجا و همکاران (17) با اندکی تغییرات انتخاب شد (9). به منظور تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده از دستگاه اسپکتروفتومتر و الکتروفورز بر روی ژل آگارز 8/0 درصد استفاده شد. از آنجا که توالی آغازگرهای ISJ از نظر تعداد نوکلئوتید متفاوت است (21، 22 و 29) واکنش PCR در دو مرحله مطابق با روش جزرتکویچ و همکاران (21) در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. سرانجام محصولات PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد بارگذاری شدند. پس از رنگآمیزی با اتیدیوم بروماید به مدت 15 دقیقه، زیر نور UV با دستگاه ژل نگار عکسبرداری صورت گرفت. برای تعیین روابط ژنتیکی نمونهها، باندهای تکثیر یافته از نشانگرهای ISJ به کد صفر (عدم وجود باند) و کد یک (وجود باند) تبدیل شدند. دندروگرام تجزیه خوشهای برای آغازگرهای IT و ETبا استفاده از نرمافزارDARwin5 ترسیم گردید. تعداد کل باندها، باندهای چندشکل و درصد چندشکلی برای هر آغازگر محاسبه گردید. همچنین دو شاخص میزان اطلاعات چندشکل یا PIC و شاخص نشانگر یا MI برای هر آغازگر بر اساس فرمول تیماپاه و همکاران (27) محاسبه شد و از بین آنها بهترین آغازگرهای IT و ETاز نظر چندشکلی بیشتر و پتانسیل تولید بیشترین باند معرفی شدند. تجزیه مؤلفههای اصلی آغازگرهای IT و ET نیز با نرمافزارNTSYS انجام شد (25).
نتایج
در این مطالعه پس از بررسی چندین آغازگر ISJ از نظر کمیت و کیفیت باندها، 30 آغازگر نیمهتصادفی ISJ شامل 16 آغازگر IT و 14 آغازگر ET انتخاب شد. این آغازگرها 559 باند چندشکل تولید کردند که 96 درصد چندشکلی را از کل 585 باند DNA شامل میشد (شکل 2).
شکل 2- محصول PCR آغازگر IT15-36 بر روی ژل 5/1 درصد آگارز. M: بیانگر سایز مارکر kb1، C: کنترل منفی، شماره چاهکها بیانگر شماره تودههاست.
کل آغازگرهای IT 302 باند چندشکل تولید کردند که 97 درصد از 311 باند تولید شده را شامل گردید. کل آغازگرهایET 257 باند چندشکل تولید نمودند که 94 درصد از کل 274 باند تولید شده را نشان داد. متوسط تعداد باند چندشکل به ازای هر آغازگر IT، 87/18 عدد و برای هر توده 17/25 عدد بود اما متوسط تعداد باند چندشکل به ازای هر آغازگر ET، 36/18 عدد و برای هر توده 42/21 عدد بود. نتایج به دست آمده با استفاده از آزمون t جفت نشده در سطح 05/0 نشان داد که تفاوت معنیداری بین این دو گروه آغازگر IT و ET از نظر متوسط درصد چندشکلی وجود ندارد. بیشترین میزان اطلاعات چندشکلی در آغازگرهای IT و ET به ترتیب مربوط به آغازگرهای IT18-1 و ET12-27 بود. همچنین این دو آغازگر بیشترین شاخص نشانگر را تشکیل دادند. شاخص نشانگر پتانسیل هر آغازگر جهت تولید باند بیشتر را نشان میدهد، بنابراین بالا بودن مقدار شاخص نشانگر نشان داد که این دو آغازگر نسبت به سایر آغازگرهای به کار رفته، پتانسیل بالایی در تولید باند بیشتر دارند. از بین آغازگرهای IT، آغازگر IT18-1 با 23 باند چندشکل بیشترین درصد چندشکلی (100 درصد) و آغازگر ISJ9 کمترین درصد چندشکلی (88 درصد) را نشان داد. از 14 آغازگر ET، آغازگر ET12-30 با 25 باند چندشکل بیشترین درصد چندشکلی (100 درصد) و آغازگرهای ET12-28 و ET18-6 کمترین درصد چندشکلی (82 درصد) را نشان دادند (جدول 2).
در این مطالعه تودههای آویشن T. pubescens بر اساس روش میانگین فواصل یا UPGMA و ضریب تشابه دایس در آغازگرهای اینترونی و اگزونی به ترتیب به سه و چهار گروه تقسیم شدند. در گروه اول دندروگرام آغازگرهای اینترونی تودههای آویشن T. pubescens از آذربایجان شرقی، کردستان، زنجان و دو توده با منشأ نامشخص قرار گرفتند. جمعیتهایی از زنجان، قزوین، آذربایجان غربی و گیلان در گروه دوم قرار گرفتند. توده آویشن کرکآلود از تهران به تنهایی یک گروه جداگانه را تشکیل داد. در گروه اول دندروگرام آغازگرهای اگزونی تودههایی از آویشن کرکآلود از آذربایجان شرقی، کردستان و زنجان که همگی از مناطق سردسیری کشور بودند مشاهده گردید. در گروه دوم آن جمعیتهایی از تهران، گیلان، آذربایجان غربی و قزوین قرار گرفتند. دو توده از آویشن کرکآلود زنجان هر کدام به تنهایی یک گروه جداگانه را تشکیل دادند.
جدول 2- نوع آغازگر، توالی آنها، تعداد باندهای چندشکل، درصد چندشکلی و دیگر شاخصهای تفکیک آغازگرهایISJ (حروف پررنگ توالیها بیانگر توالیهای حفاظت شده اگزونی و اینترونی است، شمارههای 1 تا 16 آغازگرهای IT و شمارههای 17 تا 30 آغازگرهای ET است)
شاخص نشانگر
|
میزان اطلاعات چندشکلی
|
درصد چند شکلی
|
باندهای چندشکل
|
کل باندها
|
توالی آغازگرها ('3-'5) |
نام آغازگر
|
ردیف
|
48/7 |
34/0 |
100 |
22 |
22 |
ACGTCCAGAC |
IT 10-1 |
1 |
92/5 |
37/0 |
94 |
16 |
17 |
ACGTCCAGGT |
IT 10-2 |
2 |
65/6 |
35/0 |
95 |
19 |
20 |
ACGTCCAGCA |
IT 10-3 |
3 |
76/5 |
36/0 |
94 |
16 |
17 |
ACGTCCACCA |
IT 10-4 |
4 |
8/6 |
34/0 |
100 |
20 |
20 |
ACGTCCAGAG |
IT 10-5 |
5 |
74/8 |
38/0 |
96 |
23 |
24 |
ACGTCCATCC |
IT 10-6 |
6 |
65/6 |
35/0 |
90 |
19 |
21 |
GAAGCCGCAGGTAAG |
IT 15-31 |
7 |
4/5 |
27/0 |
100 |
20 |
20 |
GACTCGCCAGGTAAG |
IT 15-32 |
8 |
35/7 |
35/0 |
100 |
21 |
21 |
GCGGCATCAGGTAAG |
IT 15-34 |
9 |
76/5 |
36/0 |
94 |
16 |
17 |
CGAAGCCCAGGTAAG |
IT 15-35 |
10 |
19/8 |
39/0 |
100 |
21 |
21 |
ACCTACCTGGGGCTC |
IT 15-36 |
11 |
43/9 |
41/0 |
100 |
23 |
23 |
CCGGCAGGTCAGGTAAGT |
IT 18-1 |
12 |
86/2 |
26/0 |
100 |
11 |
11 |
GCAGAGGGCCAGGTAAGT |
IT 18-2 |
13 |
4/7 |
37/0 |
100 |
20 |
20 |
CAGACCTGC |
(IT) ISJ1 |
14 |
6/7 |
38/0 |
100 |
20 |
20 |
CAGGGTCCCACCTGCA |
(IT) ISJ5 |
15 |
65/4 |
31/0 |
88 |
15 |
17 |
AGGTGACCGACCTGCA |
(IT) ISJ9 |
16 |
4/6 |
32/0 |
95 |
20 |
21 |
AGCAGGTGACTG |
ET 12-25 |
17 |
11/5 |
36/0 |
5/87 |
14 |
16 |
AGCAGGTGGACT |
ET 12-26 |
18 |
90/9 |
43/0 |
100 |
23 |
23 |
AGCAGGTCCTAG |
ET 12-27 |
19 |
88/5 |
42/0 |
82 |
14 |
17 |
AGCAGGTCCAAG |
ET 12-28 |
20 |
02/7 |
39/0 |
95 |
18 |
19 |
AGCAGGTCGTGA |
ET 12-29 |
21 |
75/8 |
35/0 |
100 |
25 |
25 |
AGCAGGTGGTAC |
ET 12-30 |
22 |
3/3 |
30/0 |
100 |
11 |
11 |
ACTTACCTGGGCCAG |
ET 15-31 |
23 |
8/6 |
34/0 |
91 |
20 |
22 |
ACTTACCTGGGCCACG |
ET 15-32 |
24 |
64/8 |
36/0 |
96 |
24 |
25 |
ACTTACCTGGCCGTG |
ET 15-33 |
25 |
56/7 |
34/0 |
100 |
21 |
21 |
ACTTACCTGGCCGAG |
ET 15-34 |
26 |
29/6 |
37/0 |
100 |
17 |
17 |
ACTTACCTGCCGCAG |
ET 15-35 |
27 |
32/4 |
27/0 |
84 |
16 |
19 |
ACTTACCTGGGGCTC |
ET 15-36 |
28 |
64/3 |
26/0 |
82 |
14 |
17 |
ACTTACCTGCCTACGCGG |
ET 18-6 |
29 |
6/7 |
38/0 |
95 |
20 |
21 |
TGCAGGTCA |
(ET) ISJ3 |
30 |
60/6 |
35/0 |
96 |
6/18 |
5/19 |
|
میانگین |
|
نتایج گروه بندی دندروگرام آغازگرهای اگزونی نشان داد که نمونههای آویشن استان زنجان در کل دندروگرام به طور پراکنده قرار گرفتهاند. نمونه استان تهران با شرایط اقلیمی متفاوت با تودههای آویشن مناطق سردسیری کشور در یک گروه قرار گرفته است. در حالی که در دندروگرام آغازگرهای اینترونی توده آویشن تهران یک گروه جداگانه را تشکیل داد. میتوان نتیجه گرفت که نتایج حاصل از دندروگرام تجزیه خوشهای آغازگرهای اینترونی با منشأ جغرافیایی تودهها مطابقت داشت اما چنین مطابقتی در دندروگرام آغازگرهای اگزونی با منشأ جغرافیایی مشاهده نشد (شکل 3).
(الف)
(ب)
شکل 3- دندروگرام تجزیه خوشهای آویشن کرکآلود (Thymus pubescens) با آغازگرهای IT (الف) و ET (ب) بر مبنای روش UPGMA با نرمافزار DARwin5
در هر دو دندروگرام بیشترین شباهت ژنتیکی بین دو توده 8 و 9 با کمترین bootstrap از مراغه و قرهچمن استان آذربایجان شرقی دیده شد. اعداد روی دندروگرام مقادیر bootstrap را نشان میدهد که هر چه این مقدار بیشتر باشد بیانگر آن است که نمونههای آن گروه با درصد اعتماد بالایی در این گروهبندی قرار دارند. مقادیر پایین bootstrap نشان دهنده بیشترین شباهت تودهها به یکدیگر است. اگرچه از نظر متوسط چندشکلی تفاوتی چندانی بین دو نوع آغازگر اینترونی و اگزونی دیده نشد ولی در مجموع نتایج نشان داد که آغازگرهای اینترونی نسبت به آغازگرهای اگزونی بهتر توانستهاند تودههای آویشن کرکآلود را بر اساس منشأ جغرافیایی تفکیک کنند.
آزمون تجزیه مؤلفههای اصلی برای تعیین نحوه پراکندگی نشانگرهای اینترونی و اگزونی در سطح ژنوم صورت گرفت. نتایج حاصل از آن نشان داد که در نشانگرهای اینترونی، سه مؤلفه اول 70/41 درصد و در نشانگرهای اگزونی، سه مؤلفه اول 10/40 درصد از واریانس کل بین تودههای آویشن T. pubescens را توجیه نموده است. به عبارتی دیگر هر دو نوع آغازگرها توزیع مناسبی در سطح ژنوم گیاه داشتهاند اما آغازگرهای اینترونی بهتر توانستند ژنوم آویشن کرکآلود را پوشش دهند و در ارزیابی تنوع ژنتیکی تودههای آویشن کرکآلود بهتر عمل کردهاند (شکل 4).
(الف)
(ب)
شکل 4- نمودار دو بعدی تجزیه مؤلفههای اصلی تودههای آویشن کرکآلود (Thymus pubescens) با آغازگرهای IT (الف) و آغازگرهای ET (ب)
بحث
تعداد باند تکثیر شده و میزان چندشکلی بالا (96 درصد چندشکلی) در تودههای آویشن مورد مطالعه بیانگر کارآیی بالای آغازگرهای ISJ در ارزیابی تنوع ژنتیکی آنها بوده است. اما از نظر متوسط درصد چندشکلی اختلاف معنیداری بین آغازگرهای اینترونی و اگزونی دیده نشد. هاشمی پترودی و همکاران (16) در مطالعهای برای انگشتنگاری 8 هیبرید برنج و والدین آنها از 21 آغازگر نیمهتصادفی ISJ از دو گروه آغازگرهای IT و ET استفاده کردند که متوسط تعداد باند به ازای هر آغازگر و هر ژنوتیپ به ترتیب 41/15 و 56/11 بود و بیشترین چندشکلی را آغازگرهای IT، 10 و 15 نوکلئوتیدی داشتند. رمضانی و همکاران (6) در مطالعه تنوع ژنتیکی گلرنگ با نشانگرهای ISJ بیان کردند که تفاوت معنیداری از نظر درصد چندشکلی بین دو گروه آغازگرهایIT و ET مشاهده نشد. در بعضی مطالعات دیده شده که آغازگرهای ET نتایج رضایت بخشی را نسبت به آغازگرهای IT داشتهاند. فراهانی و ارزانی (14) در مطالعه تنوع ژنتیکی 20 ژنوتیپ گندم دوروم همراه با سه هیبرید 1F و لاینهای پدری آنها با نشانگرهای نیمهتصادفی ISJ گزارش کردند که آغازگرهای ET نسبت به آغازگرهای ITقطعات باندی بیشتر و با وضوح بالاتری تولید کردند.
انصاری (3) در مطالعه تنوع ژنتیکی 40 ژنوتیپ تریتیکاله و یک رقم گندم دوروم با آغازگر نیمهتصادفی ISJ بیان کردند که متوسط تعداد باند به ازای هر آغازگر 7/12 عدد باند و تعداد باندهای تکثیر شده به ازای هر آغازگر از 10 تا 16 عدد باند متغیر بود. همچنین آغازگرهای ET نسبت به آغازگرهای IT قطعات باندی بیشتر با وضوح بالاتر و درصد چندشکلی بیشتری تولید کردند. اسماعیلی و همکاران (2) به بررسی تنوع ژنتیکی 25 ژنوتیپ گندم دیم (شامل 23 رقم و لاین گندم نان و 2 رقم گندم دوروم) با استفاده از نشانگرهای ISJ پرداختند. آنها در این مطالعه از 32 آغازگر نیمهتصادفی استفاده نمودند که از بین آنها 17 آغازگر بین ارقام گندم چندشکلی نشان داد. فابریکی اورنگ و همکاران (8 ) در مطالعه تنوع ژنتیکی تودههای بومی خربزه ایرانی (Cucumis melo L.) با 11 آغازگر ISSR بیان کردند که متوسط تعداد باند به ازای هر آغازگر 5/10 عدد بود. آغازگرهای به کار رفته شاخص نشانگر (MI) بالاتری نسبت به سایر آغازگرها داشتند. دندروگرام تجزیه خوشهای نیز تنوع بالایی را در بین ژنوتیپها آشکار کرد.
مطالعات نشان داده است که تاکنون مطالعات مورفولوژیکی بر روی گونهT. pubescens انجام نشده است. در مورد مطالعات مولکولی نیز فقط در برخی موارد تنوع ژنتیکی این گونه همراه با چند گونه دیگر آویشن مورد ارزیابی قرار گرفته است. برای نمونه، علمداری و همکاران (11) تنوع ژنتیکی گونههای Thymus daenensis، Thymus migricus،T. pubescens وThymus fedtschenkoi را با نشانگر RAPD مورد مطالعه قرار دادند که نتایج حاصل از آن نشان داد که نشانگرRAPD برای تعیین لوکوسهای چندشکل و تخمین فواصل ژنتیکی آویشن مناسب است. همچنین مهرپور و همکاران (19) با بررسی سطوح پلوئیدی سه جمعیت آویشن T. pubescens بیان کردند که نمونههای منطقه تسوج آذربایجان شرقی دارای سطح پلوئیدی دیپلوئید و مناطق نیکنامده و شمشک در استان تهران سطح پلوئیدی تتراپلوئید دارند. آنها عدد پایه کروموزومی را 5=x گزارش کردند. در مطالعهای ابدالی و همکاران (1) به ارزیابی تنوع چهار رقم زیتون شمال کشور با صفات مورفولوژیک و نشانگر RAPD پرداختند. از بین 20 آغازگر به کار رفته 4 آغازگر چندشکلی بالایی را آشکار کرد و نتایج این تحقیق نشان داد که ارقام زیتون با تفاوت 33 تا 45 درصد به عنوان ارقام مجزا تفکیک شدهاند.
تجزیه مؤلفههای اصلی یکی از روشهای چندمتغیره است که کاربرد زیادی در تنوع ژنتیکی دارد. این روش در واقع ابزار دیگری برای نمایش پراکنش تودههاست که به عنوان روشی مکمل برای تجزیه خوشهای به کار میرود. در این مطالعه نتایج آن بیانگر توزیع مناسب آغازگرهای نیمهتصادفی در سطح ژنوم گیاه آویشن کرکآلود بوده است. همچنین نتایج آن با نتایج دندروگرام تجزیه خوشهای هماهنگی کامل داشت.
نتایج این مطالعه اولین گزارش از تنوع ژنتیکی گونه T. pubescens با آغازگرهای اینترونی و اگزونی بود. این تحقیق توانایی بالای نشانگرهای نیمهتصادفی ISJ به خصوص نشانگرهای اینترونی را در تعیین تنوع ژنتیکی و بررسی روابط خویشاوندی تودههای آویشن کرکآلود نشان داد. انتهای '3 آغازگر مهم ترین قسمت جهت اتصال آغازگر در واکنش PCR میباشد (13) و به همین دلیل عدهای از محققین بیان کردند که آغازگرهای اینترونی با انتهای '3 اختصاصی در تکثیر قطعات DNA از دقت و کارآیی بیشتری برخوردارند (15 و 22). همچنین نتایج آغازگرهای IT تا حد زیادی مطابقت تنوع جغرافیایی با تنوع مولکولی را نشان داد که ممکن است بیانگر قرابت ژنتیکی و خویشاوندیهای احتمالی موجود بین برخی از تودههای مورد مطالعه باشد. قرار گرفتن برخی تودههای رویشگاههای یک استان در گروههای مجزا (مانند تودههای استان زنجان) و همچنین گروهبندی تودههای برخی از استانها در کنار هم ممکن است ناشی از جابه جایی ژرم پلاسم و یا سایر عوامل تکاملی ناشناخته باشد. حاجی کرم و همکاران (5) در بررسی تنوع ژنتیکی 86 نمونه Aegilops tauschii نواحی شمال ایران با نشانگر SSR گزارش کردند که دندروگرام تجزیه خوشهای با استفاده از ضریب تشابه دایس و روش UPGMA قادر به گروه بندی نمونهها بر اساس مناطق جغرافیایی نبود که علت آن را مربوط به تنوع ژنتیکی زیاد بین نمونهها دانستند و بیان کردند که با استفاده از نشانگر SSR میتوان شناسنامه مولکولی نمونهها را تهیه نمود. پراکنش نمونهها در تجزیه مختصات اصلی نیز 12 درصد تغییرات را توجیه نمود که 5/6 درصد آن مربوط به بعد اول و 5/5 درصد آن توسط بعد دوم توجیه گردید.
از نتایج به دست آمده میتوان برای سایر مطالعات ژنتیکی و اصلاحی تودههای آویشن استفاده نمود. پیشنهاد میشود هر گاه به دلایلی نیاز به انتخاب یک گروه از آغازگرهای ISJ با دقت و کارآیی بالا باشد، جهت کاهش حجم کار و مقدار هزینههای تحقیق آغازگرهای اینترونی (IT) به علت گروه بندی بهتر تودههای آویشن کرکآلود مناسب تر به نظر میرسد.
تشکر و قدردانی
از مسئولین محترم مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور به خصوص جناب آقای دکتر حسن مداح عارفی به خاطر در اختیار گذاشتن نمونههای آویشن تشکر و قدردانی به عمل می آید. از مسئولین مرکز تحقیقات داروهای گیاهی رازی دانشگاه علوم پزشکی لرستان که تأمین مالی این طرح را برعهده داشتند نیز قدردانی میگردد.