نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه
2 گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه ارومیه
چکیده
به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات ارتفاع بوته، میزان کلروفیل، وزن تر کل، وزن خشک کل، وزن تر برگ، وزن خشک برگ، وزن تر ساقه، وزن خشک ساقه، تعداد برگ، تعداد ساقه، تعداد برگ به تعداد ساقه، وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه و وزن خشک کل به وزن تر کل در جمعیتهای مختلف یونجه زراعی، از نشانگرهای ISSR (Inter simple sequence repeat) استفاده شد. 16 آغازگر مورد استفاده، 117 مکان در 80 ژنوتیپ یونجه تولید کرد. میانگین تعداد مکانها 3/7 مکان برای هر آغازگر بود. میانگین میزان اطلاعات چند شکل (Polymorphism information content) (PIC) برای آغازگرها 77/0 و از 65/0 (UBC849) تا 93/0 (443) متغیر بود. برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط با صفات مورفولوژیک، تجزیه رگرسیون گام به گام بین دادههای ملکولی به عنوان متغیرهای مستقل و صفات مورفولوژیک به عنوان متغیرهای وابسته انجام گرفت. نشانگرهای مرتبط با صفات وزن خشک کل و وزن خشک برگ یکسان بودند. نشانگرهای مرتبط با صفات تعداد برگ و نسبت وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه به ترتیب Kourda و UBC849 بودند. بیشترین تغییرات مربوط به صفت میزان کلروفیل (82 درصد) توسط نشانگرهای A12، UBC812، UBC808، UBC849، 425، 456 و 848 تبیین شد، در حالیکه آغازگرهای 425 و UBC808، 15 درصد از تغییرات مربوط به صفت وزن تر برگ را تبیین کردند. اکثر آغازگرهای مورد استفاده روی صفات مورد مطالعه مؤثر بودند، بنابراین میتوان از این آغازگرها همراه با اطلاعات صفات مورفولوژیک در اصلاح یونجه زراعی جهت شناسایی والدین مناسب برای تهیه جمعیتهای نقشهیابی و تولید ارقام هیبرید استفاده کرد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Identification of ISSR markers associated with morphological traits in cultivated alfalfa (Medicago sativa L.) populations
نویسندگان [English]
1 Plant Breeding and Biotechnology Dept., Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, I.R. of Iran
2 Plant Breeding and Biotechnology Dept., Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, I.R. of Iran
چکیده [English]
ISSR markers were used to identify informative markers associated with traits plant high, chlorophyll content, total wet weight, total dry weight, leaf wet weight, leaf dry weight, stem wet weight, stem dry weight, number of leaves, number of stems and their ratio, ratio of leaf dry weight to stem dry weight and total dry weight to total wet weight in alfalfa populations. Sixteen ISSR primers amplified 117 loci among 80 alfalfa genotypes, with an average of 7.3 loci per primer. Polymorphic information content (PIC) ranged from 0.65 (UBC849) to 0.93 (443), with an average of 0.77. Stepwise regression analysis between molecular data as independent variables, and morphological data as dependent variables was performed to identify informative markers associated with the studied traits. ISSR loci associated with total dry weight and leaf dry weight were the same. ISSR markers, Kourd and UBC849, were associated with number of leaves and leaf dry weight to stem dry weight, respectively. The maximum variation of chlorophyll content (82%) was accounted by UBC808, UBC812, UBC849, A12, 848, 425 and 456 markers while UBC808 and 425 markers accounted for 15% of the variation of the leaf wet weight. Since most of the used ISSR primers showed significant association with the studied traits, therefore, it is possible to use these markers along with morphological traits in alfalfa breeding programs for identification of suitable parents to produce mapping populations and hybrid varieties.
کلیدواژهها [English]
شناسایی نشانگرهای ISSR پیوسته با صفات مورفولوژیک در جمعیتهای یونجه زراعی (Medicago sativa L.)
بابک عبدالهی مندولکانی* و حیدر عزیزی
ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی
تاریخ دریافت: 10/7/90 تاریخ پذیرش: 25/4/91
چکیده
به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات ارتفاع بوته، میزان کلروفیل، وزن تر کل، وزن خشک کل، وزن تر برگ، وزن خشک برگ، وزن تر ساقه، وزن خشک ساقه، تعداد برگ، تعداد ساقه، تعداد برگ به تعداد ساقه، وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه و وزن خشک کل به وزن تر کل در جمعیتهای مختلف یونجه زراعی، از نشانگرهای ISSR (Inter simple sequence repeat) استفاده شد. 16 آغازگر مورد استفاده، 117 مکان در 80 ژنوتیپ یونجه تولید کرد. میانگین تعداد مکانها 3/7 مکان برای هر آغازگر بود. میانگین میزان اطلاعات چند شکل (Polymorphism information content) (PIC) برای آغازگرها 77/0 و از 65/0 (UBC849) تا 93/0 (443) متغیر بود. برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط با صفات مورفولوژیک، تجزیه رگرسیون گام به گام بین دادههای ملکولی به عنوان متغیرهای مستقل و صفات مورفولوژیک به عنوان متغیرهای وابسته انجام گرفت. نشانگرهای مرتبط با صفات وزن خشک کل و وزن خشک برگ یکسان بودند. نشانگرهای مرتبط با صفات تعداد برگ و نسبت وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه به ترتیب Kourda و UBC849 بودند. بیشترین تغییرات مربوط به صفت میزان کلروفیل (82 درصد) توسط نشانگرهای A12، UBC812، UBC808، UBC849، 425، 456 و 848 تبیین شد، در حالی که آغازگرهای 425 و UBC808، 15 درصد از تغییرات مربوط به صفت وزن تر برگ را تبیین کردند. اکثر آغازگرهای مورد استفاده روی صفات مورد مطالعه مؤثر بودند، بنابراین میتوان از این آغازگرها همراه با اطلاعات صفات مورفولوژیک در اصلاح یونجه زراعی جهت شناسایی والدین مناسب برای تهیه جمعیتهای نقشهیابی و تولید ارقام هیبرید استفاده کرد.
واژه های کلیدی: یونجه، نشانگرهای مثبت، صفات مورفولوژیک
* نویسنده مسئول، تلفن: 09122386990 ، پست الکترونیکی: b.abdollahi@urmia.ac.ir
مقدمه
یونجه (Medicago sativa L.) به عنوان یک گیاه دائمی از خانواده لگومینوز، مهم ترین گیاه علوفهای برای تغذیه دام است که پس از غلات، مهم ترین محصول اقتصادی در دنیا محسوب میشود. جنس Medicago دارای 56 گونه بوده که 22 گونه چندساله دگرگشن (از جمله گونه زراعی M. sativa) و 34 گونه یکساله خودگشن میباشد. اکثر گونههای چندساله تتراپلوئید (2n=4x=32) بوده ولی تعدادی از آنها دیپلوئید (2n=2x=16) میباشند (1، 9 و 11).
با توجه به اینکه تنوع گیاهان زراعی همبستگی مثبتی با پراکندگی جغرافیایی آنها دارد و گیاهان زراعی طی سالها زیستن در شرایط محیطی متفاوت حاوی ژنهای متنوعی شدهاند (16) بنابراین تنوع ژنتیکی زیادی در گیاهان داخل یک توده یونجه که در اقلیمهای مختلف جغرافیایی رشد میکنند وجود دارد (4 و 11). وجود چنین اختلاف ژنتیکی گسترده در بین افراد جمعیت یونجه، مطالعات مربوط به ژنتیک جمعیت این محصول را پیچیدهتر نموده است (10، 21 و 23). امروزه برخی برنامههای اصلاح یونجه بر اساس گزینش فنوتیپی و مورفولوژیکی استوار است. با توجه به محدود بودن تعداد نشانگرهای مورفولوژیکی و متأثر بودن آنها از عوامل محیطی، کاربرد اینگونه نشانگرها محدود است (7 و 26). نشانگرهای مولکولی بویژه نشانگرهای مبتنی بر DNA با ایجاد تعداد نامحدودی نشانگر و با حذف اثرهای ناشی از عوامل محیطی، توانسته است بسیاری از مشکلات مربوط به نشانگرهای مورفولوژیک را برطرف کند (20 و 21). از این رو، تعیین ارتباط بین نشانگرهای مولکولی و صفات مورفولوژیک، میتواند گامی مؤثر در استفاده از گزینش جمعیتی باشد. پیوستگی ژنتیکی بین نشانگرها و مکانهای ژنی صفات کمی، محتملترین توجیه برای وجود رابطه بین نشانگرهای مولکولی و نمود صفات کمی است (24). استفاده از پیوستگی بین نشانگرهای مولکولی و ژنهای کنترل کننده صفات کمی، فرآیند اصلاح نباتات را تسریع کرده است به طوری که به جای ارزیابی صفات، گزینش غیرمستقیم به کمک نشانگرهای پیوسته صورت میگیرد. در بسیاری از مطالعات، نشانگرهای پیوسته با صفات که با استفاده از مطالعات مبتنی بر تجزیه پیوستگی در گذشته انجام گرفته است فاصله ژنتیکی زیادی را با صفات مورد مطالعه داشته و برای گزینش به کمک نشانگر و همسانهسازی بر اساس نقشه مفید نبودند. به علاوه در مطالعات مبتنی بر تجزیه پیوستگی، تعداد کمی از ژنوتیپها به عنوان والدین جمعیت در حال تفرق برای شناسایی چند شکلیهای مرتبط با صفات مورد مطالعه غربال می شوند که این خود محدودیت دیگری را ایجاد میکند، زیرا ممکن است نشانگرهای شناسایی شده در این والدین برای گزینش به کمک نشانگر در زمینههای ژنتیکی والدین و ارقام دیگر مفید نباشد. برای غلبه بر این محدودیتها در سالهای اخیر روش مکان یابی ارتباطی (Association mapping) یا تجزیه ارتباطی (Association analysis) معرفی شده است که نه تنها امکان مکانیابی دقیق ژنها را فراهم میکند، بلکه امکان شناسایی نواحی کروموزومی دیگری که در مطالعات مبتنی بر پیوستگی امکان پذیر نیستند را نیز میسر میسازد. کارآیی این روش در انسان نیز برای شناسایی و مکانیابی ژنهای کنترل کننده صفات مندلی نشان داده شده است. در علوم گیاهی نیز این روش رو به گسترش است (2، 3، 13 و 17). چنین بررسیهایی در ایران که به عنوان یکی از رستنگاههای اولیه یونجه منظور شده و تودههای محلی متنوعی دارد مهم است (7 و 8). تجزیه ارتباط در خزانه ژنی سیب زمینی با 600 رقم نشان داد که ارتباط معنیداری بین نشانگرهای PCR مبتنی بر ژن R1 (یک ژن عمده دخیل در مقاومت به بلایت دیررس سیب زمینی) و رسیدگی وجود دارد (13). ایواندیک و همکاران (14) با استفاده از 33 نشانگر SSR و روش تجزیه ارتباط، نشانگرهای مرتبط با زمان گلدهی تحت رژیمهای مختلف رشدی را در جو شناسایی کردند. خدارحمی و همکاران (18) با استفاده از روش تجزیه ارتباط، 5 نشانگر SSR مرتبط با سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) و 4 نشانگر مرتبط با ضریب آلودگی نهایی را در گندم برای مقاومت به زنگ زرد معرفی کردند. با توجه به اینکه هنوز استفاده از تجزیه ارتباط در یونجه برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط با صفات مورفولوژیک گزارش نشده است، هدف از این آزمایش شناسایی نشانگرهای مثبت و آگاهی بخش مرتبط و پیوسته با صفات مورفولوژیک در یونجه با استفاده از نشانگرهای ISSR و رگرسیون گام به گام بود.
مواد و روشها
مواد گیاهی مورد مطالعه در این تحقیق شامل 80 ژنوتیپ مربوط به 8 جمعیت قرهیونجه ملککندی، قرهیونجه ارومیه، محلی اصفهان، بغدادی، همدانی، آذربایجان اردوباد، الچی و ساکوئل (جدول 1) بودند. جمعیتها در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی در 3 تکرار روی خطوطی به طول یک متر کشت شده و صفات ارتفاع بوته (سانتیمتر)، میزان کلروفیل، وزن تر کل (گرم)، وزن خشک کل (گرم)، وزن تر برگ (گرم)، وزن خشک برگ (گرم)، وزن تر ساقه (گرم)، وزن خشک ساقه (گرم)، تعداد برگ، تعداد ساقه، تعداد برگ به تعداد ساقه، وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه و وزن خشک کل به وزن تر کل بر اساس 5 نمونه در هر تکرار اندازهگیری و ثبت شدند.
جدول 1- جمعیتهای یونجه مطالعه شده و منشأ آنها
تعداد افراد مورد مطالعه از هر جمعیت |
منشأ |
جمعیت |
10 |
ایران- خوی |
قره یونجه ملک کندی |
10 |
ایران- ارومیه |
قره یونجه ارومیه |
10 |
ایران- اصفهان |
محلی اصفهان |
10 |
ایران- کرمان |
بغدادی |
10 |
ایران- همدان |
همدانی |
10 |
آذربایجان |
آذربایجان اردوباد |
10 |
ترکیه |
الچی |
10 |
ترکیه |
ساکوئل |
جدول 2- توالی آغازگرهای ISSR استفاده شده، تعداد کل مکانهای تکثیر شده، محتوای اطلاعات چند شکل (*PIC) و دامنه اندازه باندی (جفت باز)
آغازگر |
توالی آغازگر |
تعداد مکانهای تکثیر شده |
تعداد مکانهای چند شکل |
PIC |
دامنه اندازه باندی (جفت باز) |
425 |
(CA)10G |
7 |
6 |
85/0 |
3000-800 |
426 |
(CAC)7T |
3 |
0 |
81/0 |
2500-250 |
438 |
(AC)9G |
5 |
5 |
92/0 |
4000-800 |
440 |
(AC)9C |
4 |
3 |
88/0 |
3000-1500 |
443 |
(AC)9T |
3 |
3 |
93/0 |
4500-1500 |
456 |
(ACC)6C |
7 |
5 |
73/0 |
1500-800 |
459 |
(TGC)6C |
3 |
2 |
89/0 |
1300-800 |
825 |
(AC)7T |
12 |
11 |
74/0 |
2500-500 |
848 |
(CA)8G |
10 |
9 |
76/0 |
3000-1500 |
A7 |
(AG)10T |
6 |
2 |
69/0 |
2200-600 |
A12 |
(GA)6CC |
7 |
4 |
77/0 |
2500-500 |
A13 |
(GT)6CC |
9 |
6 |
66/0 |
2000-700 |
B1 |
(TC)10C |
10 |
9 |
73/0 |
3500-1300 |
UBC808 |
(CA)7G |
12 |
10 |
72/0 |
3000-1000 |
UBC812 |
(GA)8A |
10 |
8 |
68/0 |
3000-600 |
UBC849
|
(GT)8CG |
9 |
8 |
65/0 |
2200-600 |
میانگین |
|
3/7 |
07/6 |
77/0 |
- |
*: Polymorphic information content
استخراج DNA ژنومی و تجزیه دادهها: بذور ابتدا در ظروف پتری جوانهدار شده و سپس به گلدان منتقل شدند. پس از رشد گیاهچهها در گلخانه از هر جمعیت، 10 نمونه به طور تصادفی انتخاب و از برگهای سالم و سبز هر گیاه نمونه برداری شد. استخراج DNA به روش CTAB(12) با تغییرات جزئی انجام گرفت. کیفیت و کمیت DNA استخراجی با روش اسپکتروفوتومتری و الکتروفورز ژل آگارز تعیین و سپس به غلظت 30 نانوگرم در میکرولیتر برای انجام واکنشهای PCR رقیقسازی شد. 16 آغازگر ISSR انتخاب و مورد استفاده قرار گرفتند (جدول 2). واکنش زنجیرهای پلیمراز در ترموسایکلر PerkinElmer–Applied Biosystems در حجم 20 میکرولیتر شامل 45 نانوگرم DNA ژنومی، بافر PCR یک برابر (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.3) ، 5/1 میلیمول MgCl2، 2/0 میکرومول از هر dNTP، 5/0 واحد آنزیم تک پلیمراز و 10 پیکومول از هر آغازگر انجام گرفت. چرخه دمایی واکنش زنجیرهای پلیمراز به صورت: 4 دقیقه واسرشت سازی اولیه در 94 درجه و 35 چرخه شامل 40 ثانیه در 94 درجه (جهت واسرشت سازی)، 40 ثانیه در 54 درجه (جهت اتصال آغازگرها) و 2 دقیقه در 72 درجه (جهت بسط) و بسط نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه بود. تفکیک محصولات تکثیری با استفاده از ژل آگارز 8/1 درصد ResoluteTm line Biozyme (شرکت بیوزایم) و بافر TBE نیم برابر (0.5 X) با ولتاژ 90 انجام شد و رنگآمیزی با اتیدیوم بروماید صورت گرفت. برای تعیین اندازه نوارها نیز از نشانگر اندازه O'GeneRulerTM (شرکت فرمنتاس) استفاده شد (شکل 1). پس از امتیازدهی الگوهای نواری به صورت یک و صفر و ارزیابی فنوتیپی صفات در مزرعه، برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط و پیوسته با صفات مورفولوژیک مورد مطالعه، تجزیه رگرسیون گام به گام با در نظر گرفتن مکانهای نشانگری به عنوان متغیرهای مستقل و صفات مورفولوژیک به عنوان متغیرهای وابسته انجام گرفت. تجزیههای آماری با استفاده از نرمافزارهای SPSS نسخه 15 (19) و Popgene نسخه 31/1 (25) انجام گرفت.
جدول 3- نتایج رگرسیون گام به گام بین صفات مورفولوژیک و داده های مولکولی برای شناسایی نشانگرهای مثبت در جمعیتهای یونجه مورد مطالعه
سطح معنی داری |
R2 تصحیح شده |
مکان ژنی |
صفات گیاهی |
041/0 |
43/0 |
425, 456, 848, UBC812 |
ارتفاع بوته |
038/0 |
82/0 |
UBC808, UBC849, UBC812, A12, 848, 425, 456 |
میزان کلروفیل |
134/0 |
41/0 |
425, 848, UBC808, A13 |
وزن تر کل |
006/0 |
40/0 |
UBC812, UBC849, A13, 425 |
وزن خشک کل |
028/0 |
15/0 |
425, UBC808 |
وزن تر برگ |
012/0 |
36/0 |
UBC812, UBC849, A13, 425 |
وزن خشک برگ |
031/0 |
45/0 |
425, 848, 456, UBC808, A13 |
وزن تر ساقه |
006/0 |
42/0 |
425, 848, UBC808, A13 |
وزن خشک ساقه |
112/0 |
19/0 |
Kourda |
تعداد برگ |
121/0 |
79/0 |
443, 440, 825, Kourda, UBC808, UBC812, A13 |
تعداد ساقه |
009/0 |
43/0 |
438, 440, 825, UBC849 |
تعداد برگ به تعداد ساقه |
018/0 |
37/0 |
UBC849 |
وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه |
042/0 |
44/0 |
825, Kourda, UBC849 |
وزن خشک کل به وزن تر کل |
|
|
شکل 1 - الگوی باندی آغازگر UBC808 روی جمعیتهای محلی اصفهان ( 10 فرد اول از سمت راست) و آذربایجان اردوباد ( 10 فرد دوم از سمت راست)، نشانگر اندازه O'GeneRulerTM (شرکت فرمنتاس) یک کیلوباز میباشد
نتایج و بحث
از 16 آغازگر ISSR مورد استفاده، 15 آغازگر الگوی باندی مشخص و چندشکل و یک آغازگر (426) الگوی باندی مشخص ولی مونومورف تولید کردند (جدول 2). 117 مکان توسط 16 آغازگر تکثیر شد که از این تعداد 91 مکان چند شکل (78 درصد) بودند. متوسط مکانهای چندشکل برای هر آغازگر 07/6 بود. چندشکلی بالای حاصل در پژوهش حاضر را میتوان به کارآیی بالای روش ISSR، وسعت مناطق جغرافیایی نمونه برداری شده، هتروزیگوسیتی و دگرگشنی یونجه و به تعداد زیاد ژنوتیپهای مورد بررسی نسبت داد (23 و 26). همچنین از آنجایی که در روش ISSR، آغازگرها مکمل نواحی ریز ماهوارهای میباشند که در یوکاریوتها با فراوانی بالا در سراسر ژنوم پراکندهاند بنابراین استفاده از این روش می تواند سطح بالایی از چندشکلی را آشکار سازد (5 و 27). جبارزاده و همکاران (2010) نیز در مطالعه گونههای مختلف رز، چندشکلی بالای نشانگرهای ISSR را گزارش نمودند (15). لی و همکاران (2008) در مطالعه برخی والدین سیب زمینی شیرین در چین گزارش نمودند که نشانگرهای ISSR قادرند نمونههای مورد مطالعه را با کارآیی بالایی از همدیگر متمایز سازند (20). تعداد مکانها از سه برای آغازگرهای 443 و 459 تا 12 برای آغازگرهای 825 و UBC808 متغیر بود. میانگین تعداد مکانها برای آغازگرهای مورد استفاده، 6/7 مکان به ازای هر آغازگر بود. دامنه اندازه مکانها از 500 (آغازگرهای 825 و A12) تا 4500 جفت باز (آغازگر 443) متغیر بود. میزان اطلاعات چند شکل (PIC) از 65/0 تا 93/0 به ترتیب برای آغازگرهای UBC849 و 443 متغیر بود. میانگین PIC برای مکانهای مورد مطالعه 77/0 بود (جدول 2) که بیانگر کارآیی نشانگرهای ISSR در تمایز جمعیتهای یونجه می باشد. همچنین تعداد زیاد مکانهای تکثیر شده در این آزمایش نشان میدهد که تعداد کمی از آغازگرهای ISSR با میزان اطلاعات چندشکل بالا، میتواند تعداد زیادی نمونه و جمعیتهای مختلف یونجه را تفکیک کند. قبلا نیز تحقیقات مختلفی کارایی بالای نشانگرهای ISSR را در مطالعات مرتبط با تعیین تنوع ژنتیکی و روابط تکاملی در گونههای گیاهی مختلف نشان داده است (4، 15 و 20). شکل یک الگوی باندی آغازگر UBC808 را روی جمعیتهای محلی اصفهان و آذربایجان اردوباد نشان می دهد.
به منظور تعیین ارتباط بین صفات یادداشت شده و دادههای مولکولی و شناسایی نشانگرهایی که بالقوه قابلیت پیوستگی با این صفات را دارند از روش رگرسیون گام به گام استفاده شد. نتایج نشان داد که مکانهای تکثیری توسط آغازگر 425 با بیشترین تعداد صفت مرتبط است (جدول 3). این آغازگر 7 مکان را در جمعیتهای مورد مطالعه نشان داد. کمترین تعداد نشانگر موثر برای صفات تعداد برگ (آغازگر Kourda) و وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه (UBC849) شناسایی شد. محمدی و همکاران (1389) کمترین تعداد نشانگر SSR مؤثر (یک نشانگر) را برای صفت وزن خشک برگ در یونجه گزارش نمودند (8). آغازگر 440 با تغییرات دو صفت تعداد ساقه و نسبت تعداد برگ به تعداد ساقه ارتباط داشت. این آغازگر 4 مکان را در جمعیتهای مورد مطالعه نشان داد. نشانگرهای مرتبط با دو صفت وزن خشک کل و وزن خشک برگ یکسان بودند (UBC812، UBC849، A13 و 425). محمدی و همکاران (1389) همبستگی مثبت و معنی داری را بین این دو صفت گزارش نمودند (8). شناسایی نشانگرهای مشترک برای برخی صفات در این آزمایش میتواند ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی مکانهای مربوطه باشد (3، 6 و 17). بیشترین تعداد نشانگر مثبت برای صفات میزان کلروفیل و تعداد ساقه شناسایی شد تعدادی از نشانگرهای مؤثر در این دو صفت نیز یکسان بود. بیشترین تغییرات مربوط به صفت میزان کلروفیل (82 درصد) توسط آغازگرهای 425، 456، 848، A12، UBC808، UBC812 و UBC849 تبیین شد، در حالی که آغازگرهای 425 و UBC808 فقط 15 درصد از تغییرات مربوط به صفت وزن تر برگ را تبیین کردند. عزیزی و همکاران (1390) با استفاده از تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) و تجزیه کلاستر گزارش نمودند که نشانگرهای تولیدی توسط آغازگرهای ISSR مورد استفاده در این مطالعه همبستگی کمتری با همدیگر دارند و قادرند جمعیتهای مختلف یونجه را متمایز سازند (4). بنابراین میتوان گفت نشانگرهای مورد بررسی توزیع یکنواختی در ژنوم یونجههای زراعی مورد مطالعه دارند و شاید این مورد دلیلی بر پیوستگی تعداد بیشتری از نشانگرهای ISSR تولیدی در این مطالعه با صفات زراعی مورد مطالعه باشد. توالییابی نشانگرهای تولیدی توسط آغازگرهای دارای R2 بالا و مقایسه آنها با توالیهای موجود در بانکهای اطلاعاتی به اطمینان استفاده از آنها در برنامههای انتخاب به کمک نشانگر و همسانهسازی ژن بر اساس نقشه میافزاید. محمدی و همکاران (1389) با استفاده از نشانگرهای SSR و رگرسیون گام به گام 17 نشانگر را در یونجه شناسایی نمودند که رابطه معنیداری با حداقل یکی از 11 صفت مورفولوژیک مطالعه شده نشان دادند (8). رشیدی و همکاران (1387) با استفاده از نشانگرهای SSAP، 32 نشانگر را در گندم شناسایی نمودند که حداقل با یکی از صفات زراعی مورد بررسی رابطه معنیداری داشت (2). اسکات و همکاران (2005) از نشانگرهای AFLP برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مهم زراعی در چاودار استفاده کردند. آنها 3 نشانگر پیوسته با صفت تاریخ خوشهدهی را شناسایی نمودند که با مکانهای کنترل کننده این صفت در کروموزوم 7 پیوستگی نشان دادند و گزارش نمودند که نشانگرهای AFLP و رگرسیون گام به گام برای شناسایی نشانگرهای آگاهی بخش برای صفات زراعی مفید میباشند (22). عبدالهی مندولکانی و همکاران (1389) برای شناسایی نشانگرهای مثبت مرتبط با صفات مورفولوژیک در بادام زمینی از تجزیه ارتباط با استفاده از نشانگرهای SSR استفاده نمودند و بیان کردند که این روش برای شناسایی مکانهای آگاهی بخش مرتبط با صفات مورفولوژیک مفید و مطمئن بوده و نشانگرهای مؤثر حاصل از این مطالعات میتواند در برنامههای گزینش به کمک نشانگر و تهیه جمعیتهای نقشهیابی استفاده شوند (3). نتایج مطالعه حاضر و تحقیقات یاد شده نشان میدهد که چنانچه از آغازگرهای بیشتری استفاده شود میتوان به شناسایی نشانگرهایی که دارای همبستگی بالا با صفات مرتبط با عملکرد و اجزای عملکرد باشند امید داشت و از آنها در پژوهشهای دیگر استفاده نمود. البته لازم است نشانگرهای شناسایی شده در چنین مطالعاتی در جمعیتهای بزرگ و همچنین در جمعیتهای در حال تفرق مورد آزمون قرار گیرد تا از پیوستگی آنها با صفات مربوطه اطمینان به عمل آید و بدین ترتیب کارآیی استفاده از این نشانگرها در برنامههای اصلاحی افزایش یابد. همچنین با توجه به اینکه اکثر نشانگرهای تولیدی توسط آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق بر روی صفات مورد مطالعه مؤثر بودند بنابراین احتمال دارد بتوان از این آغازگرهای ISSR در برنامههای اصلاحی یونجه برای شناسایی والدین مناسب برای تهیه جمعیتهای نقشهیابی و تولید ارقام هیبرید استفاده کرد.
سپاسگزاری
بدین وسیله نگارندگان مراتب تقدیر و تشکر خود را از دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه و پژوهشکده بیوتکنولوژی دانشگاه ارومیه که امکانات لازم را برای انجام این تحقیق فراهم نمودند، اعلام مینمایند.