نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Thermostable Endo-1,4-β-D-glucanase, known as a density reducer in cellulose degradation, is one of the most widely used enzymes in industries. In this study, the thermostability of Endo-1, 4-β-D-glucanase produced by Bacillus sp. AGh1 which was isolated from a hot-spring in Ardabil province, Iran was evaluated. The enzyme production was optimized through two steps. Rice bran and yeast extract were determination as the effective factors for enzyme production by Plackett-Burman method, and optimization of culture medium was performed by Response Surface Methodology method. The amount of mentioned effective factors for producing the enzyme were 58.8 and 14.87 g L-1, respectively. The optimum temperature and pH for the enzyme activity were 70 ̊C and pH 5.6, respectively. Accordingly, Bacillus sp. AGh1 can produce endo-1,4-β-D-glucanase enzyme from rice bran as cheap raw material with suitable activity. Consequently, the enzyme has functional at the wide range of pH and may be applied which needs more studies.
کلیدواژهها English
بهینهسازی محیط کشت باسیلوس سویه AGh1 جهت تولید آنزیم اندو-4،1-بتا- دی-گلوکاناز و تعیین ویژگیهای آن
حسن دیبا1، جعفر همت1*، محسن واعظ1 و آرون گویال2
1 ایران، تهران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده زیستفناوری
2 هند، آسام، گواهاتی، موسسه فناوری گواهاتی هند، گروه علوم زیستی و مهندسی زیستی
تاریخ دریافت: 04/05/1402 تاریخ پذیرش: 19/09/1402
چکیده
آنریم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز مقاوم به حرارت که به عنوان آنزیم چگالیانداز در تجزیه سلولز شناخته میشود، یکی از آنزیمهای پرکاربرد در صنعت به شمار میآید. در این پژوهش، پایداری حرارتی آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از باسیلوس سویه AGh1 که از چشمه آبگرم استان اردبیل جداسازی شده بود، بررسی شد. سپس تولید آنزیم طی دو مرحله بهینه سازی گردید. نخست، سبوس برنج و عصاره مخمر به عنوان عوامل اثر گذار بر تولید آنزیم توسط آزمون پلکت- برمن، تعیین و سپس محیط کشت با روش سطح پاسخ بهینهسازی شد. مقدار بهینه این دو منبع اثر گذار بر تولید آنزیم شامل بهترتیب 8/58 و 87/14 گرم در لیتر مشخص شد. آنزیم در دمای 60 درجه سانتیگراد و pH 6 الی 10 ، 83 الی 94 درصد پایداری خود را حفظ کرد. دما و pH بهینه برای فعالیت آنزیم به ترتیب 70 درجه سانتیگراد و 6/5 بود. در این شرایط فعالیت آنزیم 12/0 ± 16/10 میکرومول در دقیقه در میلیلیتر بود. در این پژوهش مشخص شد که باکتری باسیلوس سویه AGh1 توان تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز با فعالیت نسبتاً مناسب با استفاده از ماده اولیه سبوس برنج به عنوان پسماند صنایع کشاورزی و ارزان دارد. با توجه به فعالیت مطلوب و خصوصیت مقاومت حرارتی آنزیم در دامنه وسیع pH، آنزیم تولیدی به عنوان آنزیمی با پتانسیل کاربرد بالا معرفی شد که نیازمند مطالعات تکمیلی است.
کلمات کلیدی: باسیلوس، سلولاز، پایداری حرارتی، اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز
* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: j.hemmat@gmail.com
مقدمه
بیشترین مقدار پلیمر زیستی موجود روی زمین مربوط به ترکیبات سلولزی است (12، 21) که تولید تقریبی 100 میلیارد تن در سال را به همراه دارند (12). سلولز در طبیعت بین گیاهان، جلبکها و قارچها دیده میشود (13)، بهطوریکه حدود 40 درصد ترکیبات کربن دار را به عنوان عنصر ساختمانی و شکل دهنده دیواره سلولی در گیاهان به خود اختصاص داده است (12). سلولازها که ترکیبات سلولزی را میشکنند، یکی از مهمترین آنزیمهای صنعتی برای اکثر فرآیندهای تبدیل زیستی به شمار رفته (1) و در صنایع مختلف نظیر غذا و نوشیدنی، غذای حیوانات، نساجی، چرم، کاغذ و خمیر کاغذ کاربرد وسیعی دارند. پلیمر سلولز را میتوان به عنوان منبع ارزشمندی از گلوکز یا دیگر ترکیبات مونو و اولیگوساکاریدی قابل تخمیر در تولید حلالهای اتانول، استون و بوتانول نیز دانست. آنزیمهای سلولازی که فیبر سلولزی را میشکنند، بهصورت خارج سلولی عمل کرده و برای این منظور فعالیت سه آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز (EC 3.2.1.4)( Endo-1,4-β-D-glucanase)، اگزو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز (EC 3.2.1.91)( Exo-1,4-β-D-glucanase) و بتا-گلوکوزیداز (EC 3.2.1.21)( β-glucosidase) به صورت متوالی و بهصورت هم افزا (Synergistic action) عمل میکنند (11، 6). از آنجاییکه آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز بهصورت تصادفی به بخشهای داخلی بیشکل زنجیره سلولزی حمله کرده و زنجیرههای جدید الیگوساکاریدی با طولهای متفاوت ایجاد میکند، بین سلولازها به آنزیم چگالی انداز معروف بوده و بیشترین کاربرد را در صنایع دارد (17).
با توجه به اینکه دمای بالا تأثیر بهسزایی در کاهش ویسکوزیته و افزایش حلالیت بسیاری از ترکیبات، بالاخص ترکیبات خاص پلیمری دارد، بازدهی واکنش در دمای بالا بیشتر بوده و بسیاری از واکنشهای صنعتی مرتبط با پلیمرها در دمای بالا انجام میشوند (17، 20). بسیاری از آنزیمهایی که در دمای بالا فعال هستند، از میکروارگانیسمهای ترموفیل یا ترموتولرنت به دست آمده اند. چنین میکروارگانیسمهایی که بر شرایط سخت فایق میآیند، دارای ویژگیهای خاص از جمله آنزیمهای جدید و مسیرهای بیوشیمیایی ویژه هستند (7، 25) که احتمال داشتن ویژگیهای متناسب با فرآیندهای صنعتی در آنزیمهای حاصل از آنها را بالا میبرد (29).
مطالعاتی در زمینه دستیابی به آنزیمهای پایدار در دمای بالا از میکروارگانیسمهای ترموفیل یا ترموتولرنت حاصل از چشمههای آبگرم انجام شده است. موزدا و همکاران فعالیت سلولازی حاصل از دو سویه باسیلوس CH43 (Bacillus sp. CH43) و HR68 (Bacillus sp. HR68) جداسازی شده از چشمههای آبگرم زیمباوه را بررسی کرده و بیان داشتند که بهینه این فعالیت در pH 5 الی 5/6 و به ترتیب در دمای 65 و 70 درجه سانتیگراد بود. (19). عزیزی و همکاران باکتری ایزوپتریکولا واریابیلیس IDAH9 (Isoptericola variabilis) را از چشمههای آبگرم دهلران در ایلام جداسازی کردند و به بهینهسازی محیط کشت این سویه جهت بهبود تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز پرداختند و بیان کردند که این میکروارگانیسم بیشترین میزان تولید سلولاز را در غلظت 9 گرم در لیتر CMC، 6/5 گرم در لیتر آمونیوم سولفات، 6/0 درصد توئین 80 و 2 درصد سوکروز دارد. همچنین بیان داشتند که آنزیم تولیدی پایداری 1 ساعته در دمای 65 درجه سانتیگراد دارد (4). آزادیان و همکاران که سویه باسیلوس لچینیفورمیس AMF-07 (Bacillus licheniformis) را از یکی از چشمههای آبگرم استان کرمان جداسازی کرده اند، بیان نموده اند که آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از این سویه در رنج وسیع دما و pH به ترتیب 40 تا 80 درجه سانتی گراد و 6 الی 10 فعال بوده و دما و pH بهینه به ترتیب 70 درجه سانتیگراد و 9 دارد (3). شاجهان و همکاران باکتری ترموفیل باسیلوس لچینیفورمیس (Bacillus licheniformis) تولید کننده آنزیم سلولاز را از یکی از چشمههای آبگرم در هند جداسازی کرده و پس از بهینهسازی محیط کشت با RSM میزان فعالیت آنزیم سلولاز را تا 3 برابر افزایش دادند. (26). ایرفان و همکاران سویه باکتریایی باسیلوس آمیلولیکوئیفشیانس AK9 (Bacillus amyloliquefaciens) را از چشمه آب گرم تاتاپانی در کشمیر پاکستان جداسازی کردند که اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از این سویه در رنج وسیع دما و pH به ترتیب 50 تا 70 درجه سانتی گراد و 3 الی 6 فعال بوده و حداکثر پایداری آن در دما و pH بهینه برای فعالیت آنزیم به ترتیب 50 درجه سانتیگراد و 5 گزارش کرده اند (15). در این پژوهش جهت بررسی امکان استفاده از قابلیتهای باسیلوس سویه AGh1 که از قبل جداسازی شده بود (8)، پایداری حرارتی آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از آن در pHهای مختلف بررسی شد. سپس بهینهسازی محیط کشت باکتری با استفاده از پسماند صنایع کشاورزی به عنوان منابع ارزان قیمت جهت تولید اقتصادی و بیشتر آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز انجام شد. پس از آن، فعالیتهای بتا-گلوکوزیدازی و بررسی فیلتر کاغذی حاصل از این سویه نیز مطالعه شد.
مواد و روشها
دستیابی به سویه باکتریایی: سویه باکتریایی باسیلوس
AGh1 که از قبل جداسازی شده بود و محیط مندل و گلیسرول 15 درصد در دمای منفی 80 درجه سانتی گراد نگهداری میشد (8)، در این پژوهش استفاده شد.
سنجش فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکناز با روش CMC/DNS : بررسی فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز با روش CMC/DNS (Carboxymethyl cellulose/Dinitrosalicylic) انجام شد. بدینمنظور، محلول CMC-Na در بافر 05/0 مولار مختص به pH مورد آزمون تهیه شد. 5/0 میلیلیتر از سوبسترا در لوله آزمایش ریخته شد سپس 5/0 میلیلیتر محلول حاوی آنزیم به سوبسترا اضافه و 30 دقیقه در دمای مورد آزمون قرار گرفت. 3 میلیلیتر محلول DNS به لوله آزمایش اضافه شده و 5 دقیقه در آب جوش قرار داده شد و سریعاً به یخ در حال ذوب منتقل شد. پس از افزودن 20 میلیلیتر آب مقطر به لوله آزمایش و صفر کردن اسپکتروفتومتر، جذب نوری در طول موج 540 نانومتر خوانده شد. پس از محاسبه مقدار قند آزاد شده فعالیت آنزیم روی سوبسترای CMC-Na بر مبنای واحد بین المللی در هر میلی لیتر (میکرومول در دقیقه در میلیلیتر (µmol min-1 mL-1)) محاسبه شد(8، 9).
بررسی پایداری حرارتی آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در pHهای مختلف: پایداری حرارتی فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در زمانهای صفر، 2، 4، 6 و 8 ساعت در دمای 60 درجه سانتی گراد با روش CMC/DNS در pHهای 6، 8 و 10 سنجش شد. در این مرحله فعالیت آنزیمی در زمان صفر 100 درصد در نظر گرفته و با گذشت زمان، میزان فعالیت آنزیم باقیمانده به عنوان پایداری حرارتی در pH های مورد آزمون بررسی شد.
بهینهسازی محیط کشت: رسم منحنی رگرسیون خطی واحد تشکیل دهنده کلنی در هر میلیلیتر بر پایه جذب نوری: بهمنظور تلقیح یکسان ماده تلقیح در محیطهای کشت مورد بررسی، ابتدا از باکتری باسیلوس AGh1 در محیط کشت لوریا-برتانی (Luria-Bertani) آگار کشت خطی شبانه تهیه و یک کلنی در محیط کشت لوریا-برتانی براث با حجم 20 میلیلیتر در فالکون با ظرفیت اسمی 50 میلیلیتر تلقیح شد. بلافاصله پس از تلقیح و سپس هر 2 ساعت یکبار جذب نوری در طول موج 600 نانومتر و چگالی سلولی با روش شمارش کلنی با تکنیک پور پلیت انجام شد. شرایط کشت دمای 37 درجه سانتیگراد با سرعت شیکر 150 دور در دقیقه (RPM) بود. با توجه به معادله به دست آمده، هنگامیکه جذب نوری برابر با ضریبی از 108 واحد تشکیل دهنده کلنی در هر میلیلیتر (CFU mL-1)( Colony Forming Unit per milliliter) بود، به میزان 1 درصد حجمی/حجمی در محیطهای کشت مورد بررسی تلقیح میشد.
بررسی امکان استفاده
باکتری از پسماندهای کشاورزی به عنوان ماده اولیه: سبوس برنج، سبوس گندم و کاه برنج به عنوان پسماندهای کشاورزی جهت امکان استفاده باکتری برای تولید اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز بررسی شدند. وجود عناصر ضروری موجود در محیط کشت مندل (18) برای تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز نیز ارزیابی شد(8).. بدین منظور هشت محیط کشت مختلف (جدول 1) با استفاده از کربوکسی متیل سلولز-سدیم (CMC-Na)( Sodium-carboxymethyl cellulose)، سبوس برنج، سبوس گندم، کاه برنج، ترکیبات پایه محیط کشت مندل و عناصر ضروری (جدول 2) تهیه شد. مقدار استفاده از CMC-Na به میزان 10 گرم در لیتر و مقدار استفاده از سبوس برنج، سبوس گندم و کاه برنج به میزان 25 گرم در لیتر بود. برای استفاده از سبوسها و کاه، ابتدا آنها را با استفاده از دستگاه آسیاب کن، آسیاب کرده و از الک با مش 50 (297/0 میلیمتر) عبور داده شدند. pH، دما، حجم محیط کشت و دور همزن در زمان بهینهسازی به ترتیب برابر با 6، 37 درجه سانتیگراد، 100 میلیلیتر و 150 دور در دقیقه بودند. بررسیها در ارلنمایر بافلدار با ظرفیت اسمی 250 میلیلیتر انجام میشد. محیطهای کشت پس از تلقیح در دمای 37 درجه سانتیگراد با 150 دور در دقیقه به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. پس از گذشت زمان انکوباسیون، محیطهای کشت با ×g 5000 سانتریفیوژ شده و سنجش فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از سوپرناتانت انجام شد. محیط کشتی که بیشترین فعالیت آنزیمی در آن مشاهده شد برای بهینهسازی تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز انتخاب شد.
جدول 1- ترکیبات پایه و عناصر ضروری محیط کشت مندل
|
ترکیبات پایه |
عناصر ضروری |
|||||
|
ردیف |
ترکیب |
مقدار (گرم در لیتر) |
ردیف |
ترکیب |
مقدار (میلیگرم در لیتر) |
|
|
1 |
(NH4)2SO4 |
4/1 |
1 |
ZnSO4.7H2O |
4/1 |
|
|
2 |
KH2PO4 |
2 |
2 |
CoCl2 |
2 |
|
|
3 |
CaCl2 |
3/0 |
3 |
FeSO4.7H2O |
5 |
|
|
4 |
MgSO4.7H2O |
3/0 |
4 |
MnSO4.H2O |
56/1 |
|
|
5 |
Tween 80 |
3/0 |
|
|
|
|
جدول 2- محیطهای کشت مختلف ساخته شده برای بررسی امکان استفاده از پسماند شکاورزی و ضرورت وجود عناصر ضروری معرفی شده در محیط کشت مندل جهت تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز از باسیلوس سویه AGh1
|
شماره محیط کشت |
مشخصات |
|
1 |
ترکیبات پایه محیط کشت مندل به همراه CMC-Na و عناصر ضروری |
|
2 |
ترکیبات پایه محیط کشت مندل به همراه CMC-Na |
|
3 |
ترکیبات پایه محیط کشت مندل به همراه سبوس گندم و عناصر ضروری |
|
4 |
ترکیبات پایه محیط کشت مندل به همراه سبوس گندم |
|
5 |
ترکیبات پایه محیط کشت مندل به همراه سبوس برنج و عناصر ضروری |
|
6 |
ترکیبات پایه محیط کشت مندل به همراه سبوس برنج |
|
7 |
ترکیبات پایه محیط کشت مندل به همراه کاه برنج و عناصر ضروری |
|
8 |
ترکیبات پایه محیط کشت مندل به همراه کاه برنج |
بهینهسازی محیط کشت با استفاده از آزمونهای آماری: ابزارهای آماری نظیر پلکت-بورمن و سطح پاسخ (RSM)( Response Surface Methodology) به ترتیب برای مشخص کردن فاکتورهای اثرگذار و بهینهسازی شرایط برای تولید متابولیتها از میکروارگانیسمها، بهطور گسترده استفاده میشوند (29،16،2). بین آزمونهای آماری، استپ-سایزینگ برای مشخص کردن جهت اثر فاکتورها بر یکدیگر و دستیابی سریعتر و اقتصادیتر به نقطه هدف با استفاده از اثر متقابل فاکتورها بر یکدیگر کاربرد دارد (5). برای بهینهسازی محیط کشت از نسخه 18 نرم افزار مینیتب استفاده شد. pH، دما، حجم محیط کشت و دور همزن در زمان بهینهسازی به ترتیب برابر با 6، 37 درجه سانتیگراد، 100 میلیلیتر و 150 دور در دقیقه بودند. بررسیها در ارلنمایر بافلدار با ظرفیت اسمی 250 میلیلیتر انجام شد. ابتدا جهت تعیین فاکتورهای اثرگذار بر تولید اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز سویه باسیلوس AGh1 از طراحی فاکتوریل با طراحی پلکت- برمن (Plackett-Burman) استفاده شد. پس از تعیین ضرایب اثر متقابل بین فاکتورهای اثرگذار، بهبود شرایط کشت با تکنیک استپ-سایزینگ انجام شد. بهینهسازی نهایی با RSM انجام و صحت نتایج آزمون با استفاده از آزمون یک نمونهای t برای میانگین با شش تکرار بررسی شد. در این پژوهش میزان فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در فرآیند بهینهسازی محیط کشت به عنوان شاخصی بر میزان تولید این آنزیم در نظر گرفته شد.
بررسی pH و دمای بهینه فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز: سویه باسیلوس AGh1 در محیط کشت بهینه در حجم 200 میلیلیتر در دمای 37 درجه سانتیگراد در ارلنمایر بافلدار با ظرفیت اسمی 500 میلیلیتر و 150 دور در دقیقه کشت داده شد. نمونهبرداری در زمانی که بیشترین فعالیت آنزیمی در کشت میکروارگانسیم مشاهده شده بود، انجام شد. بررسی بهینه فعالیت آنزیمی در دمای 60 درجه سانتیگراد در pHهای 4 الی 10 با فواصل 2/0 و بررسی دمای بهینه فعالیت در دمای 40 الی 90 با فواصل 5 درجه سانتیگراد انجام شد.
بررسی فعالیت
بتا-گلوکوزیداز و بررسی فعالیت اثر بر فیلتر کاغذی: سویه باسیلوس AGh1 در محیط کشت بهینه در حجم 200 میلیلیتر در دمای 37 درجه سانتیگراد و 150 دور در دقیقه در ارلنمایر بافلدار با ظرفیت اسمی 500 میلیلیتر کشت داده شد. نمونهبرداری در زمانی که بیشترین فعالیت آنزیمی در کشت میکروارگانسیم مشاهده شده بود، انجام شد. بررسی فعالیت بتا-گلوکوزیداز (β-glucosidase) و بررسی فعالیت اثر بر فیلتر کاغذی (FPase)( Filter paper assay) جهت سنجش قدرت تولید قند (12) در pH و دمای بهینه فعالیت اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز ارزیابی شدند.
نتایج
بررسی پایداری حرارتی آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در pHهای مختلف: پایداری حرارتی فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز طی زمانهای صفر، 2، 4، 6 و 8 ساعت در دمای 60 درجه سانتی گراد در سیستم بافری مختص به pH های 6، 8 و 10 در شکل 1 نشان داده شده است. آنزیم در pH 6 در زمانهای 2، 4، 6 و 8 ساعت به ترتیب 89/3 ± 59/90، 73/3 ± 26/63، 52/5 ± 47 و 78/1 ± 18/13 درصد فعالیت خود را حفظ کرده بود. در pH 8 در زمانهای 2، 4 و 6 ساعت به ترتیب 57/2 ± 36/83، 16/4 ± 39/59 و 43/2 ± 36/26 درصد از فعالیت خود را حفظ کرده بود و در ساعت هشتم غیر فعال شده بود. در pH 10 در زمانهای 2، 4، 6 و 8 ساعت به ترتیب 58/13 ± 35/94، 6/10 ± 69/67، 14/2 ± 25/50 و 11/3 ± 76/20 درصد فعالیت خود را حفظ کرده بود. با توجه به نتایج، رفتار مقاومت حرارتی آنزیم در pHهای 6 و 10 بیشتر از مقاومت حرارتی در pH 8 بود.
شکل 1- پایداری حرارتی آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در pH های 6، 8 و 10
بهینهسازی محیط کشت:
رسم منحنی رگرسیون خطی واحد تشکیل دهنده کلنی در هر میلیلیتر بر پایه جذب نوری: با استفاده از نرم افزار اکسل 2019 منحنی رگرسیون خطی واحد تشکیل دهنده کلنی در هر میلیلیتر بر پایه جذب نوری در طول موج 600 نانومتر رسم و معادله مربوطه محاسبه شد (شکل 2). با توجه به منحنی مشخص شد هنگامیکه جذب نوری در طول موج 600 نانومتر بین 15/0 تا 37/0 بود، تعداد باکتری ضریبی از 108 واحد تشکیل دهنده کلنی در هر میلیلیتر بود. از این رو جهت تلقیح یکسان باکتری در محیطهای کشت، هنگامی که جذب نوری در محیط کشت لوریا-برتانی براث بین دو عدد مذکور میرسید، تلقیح به میزان 1 درصدحجمی/حجمی در محیطهای کشت مورد بررسی انجام میشد.
بررسی امکان استفاده باکتری از سبوس برنج، سبوس گندم و کاه برنج در تولید آنزیم: با توجه به نتایج در شکل 3 مشخص شد که محیط کشت حاوی سبوس برنج و فاقد عناصر ضروری (محیط کشت شماره 6) نسبت به سایر محیطهای کشت تهیه شده فعالیت آنزیمی بالاتری داشت، بهطوریکه در ساعت 33 فرآیند تخمیر بیشترین فعالیت آنزیمی را در محیط کشت نشان داد. از این رو برای ادامه روند بهینهسازی محیط کشت، سبوس برنج به عنوان منبع سلولزی انتخاب و عناصر ضروری از ترکیبات محیط کشت حذف شدند. برای بهینهسازی محیط کشت از این مرحله به بعد نمونهها در ساعت 33 فرآیند تخمیر بررسی میشدند.
تعیین فاکتورهای اثرگذار بر تولید آنزیم: بررسیها در آزمون پلکت- برمن با ضریب اطمینان 90 (Confidence level) نشان دهنده اثرگذاری معنی دار فاکتورهای سبوس برنج و عصاره مخمر بر میزان فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در محیط کشت بودند. جدول 3 نتایج مربوط به فعالیت آنزیم در محیطهای کشت طراحی شده در آزمون پلکت- برمن و شکل 4 نمودار پرتو (Pareto) حاصل از تحلیل دادهها را نشان میدهند.
شکل 2- منحنی رگرسیون خطی چگالی سلولی (واحد تشکیل دهنده کلنی در هر میلیلیتر) بر پایه جذب نوری در طول موج 600 نانومتر
شکل 3- روند تعییرات فعالیت آنزیمی (میکرومول در دقیقه در میلیلیتر) در محیطهای کشت مورد بررسی طی 48 ساعت اول فرآیند
شکل 4- نمودار پرتو حاصل از تحلیل دادهها در آزمون پلکت- برمن
بهینه سازی شرایط تولید آنزیم: برای بهبود شرایط آنزیم از تکنیک استپ-سایزینگ استفاده شد، بهطوریکه برای تعیین ضرایب دو فاکتور مؤثر بر تولید اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز یعنی سبوس برنج و عصاره مخمر و همچنین از بین بردن اثر بالقوه فاکتورهای غیر مؤثر بر ضرایب این دو فاکتور، آزمون طراحی فاکتوریل دو سطحی (2-Level Factorial Design) با 5 نقطه مرکزی (5 center points) با استفاده از نسخه 18 نرم افزار مینیتب بهصورت مولد پیش فرض (Default generator) طراحی شد. مقادیر حد پایین و حد بالا برای سبوس برنج به ترتیب 5 و 5/12 گرم در لیتر، مقادیر حد پایین و حد بالا برای عصاره مخمر به ترتیب 3 و 6 گرم در لیتر و مقادیر سایر فاکتورها برابر با محیط کشتی بود که بیشترین فعالیت آنزیمی در آزمون پلکت- برمن دیده شده بود (محیط کشت شماره 15 در جدول 3). نتیجه طراحی آزمایش 9 محیط کشت بود که به همراه نتایج حاصل در جدول 4 آمده اند. نتایج فعالیت آنزیمی محیطهای کشت با ضریب اطمینان 95 و بهصورت دو طرفه تحلیل شدند. با توجه به تحلیل دادهها، ضرایب برای سبوس برنج و عصاره مخمر به ترتیب برابر با 64/0 و 74/0 بود.
جدول 4- محیطهای کشت تهیه شده برای آزمون طراحی فاکتوریل دو سطحی (مقادیر بهصورت گرم در لیتر و واحد فعالیت آنزیمی در ستون نتایج میکرومول در دقیقه در میلیلیتر است.)
|
نتایج |
عصاره مخمر |
سبوس برنج |
Blocks |
CenterPt |
RunOrder |
StdOrder |
|
68/3 |
6 |
5 |
1 |
1 |
1 |
3 |
|
48/0 |
3 |
5/12 |
1 |
1 |
2 |
2 |
|
98/2 |
3 |
5 |
1 |
1 |
3 |
1 |
|
45/4 |
5/4 |
75/8 |
1 |
0 |
4 |
5 |
|
76/4 |
5/4 |
75/8 |
1 |
0 |
5 |
8 |
|
74/5 |
6 |
5/12 |
1 |
1 |
6 |
4 |
|
12/4 |
5/4 |
75/8 |
1 |
0 |
7 |
6 |
|
26/4 |
5/4 |
75/8 |
1 |
0 |
8 |
9 |
|
34/4 |
5/4 |
75/8 |
1 |
0 |
9 |
7 |
از آنجاییکه که ضرایب برای سبوس برنج برابر با 64/0 و برای عصاره مخمر برابر با 74/0 بود، محاسبه ارزشهای کدگذاری شده (Coded value) جهت تهیه محیطهای کشت مختلف برای بهبود شرایط کشت بهصورت ذیل انجام شد:
با استفاده از فرمول 4، ارزش کدگذاری شده مربوط به عصاره مخمر محاسبه شد:
|
|
(4) |
بنابراین:
با استفاده از فرمول 5، متغیر کدگذاری (Coded variable) شده مربوط به عصاره مخمر محاسبه شد:
|
|
(5) |
بنابراین:
با استفاده از فرمول 6، استپ سایز مربوط به مقدار عصاره مخمر محاسبه شد:
|
|
(6) |
بنابراین:
و در نهایت: 4/1 ≈ استپ سایز مربوط به مقدار سبوس برنج
با توجه به نتایج حاصل از معادلات 3 الی 6، به ازای هر واحد از سبوس برنج، 4/1 واحد از عصاره مخمر تغییر کرد. از این رو محیطهای کشت جدول 5 ساخته شده و فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در آنها بررسی شد. با توجه به نتایج حاصل از 16 محیط کشت مختلف تهیه شده، مشخص شد که فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز توسط سویه باسیلوس AGh1 هنگامی بیشترین بازدهی را دارد که سبوس برنج به میزان 57 گرم در لیتر و عصاره مخمر به میزان 8/22 گرم در لیتر باشد. با توجه به اینکه مقدار به دست آمده عصاره مخمر عدد بالایی بود و این احتمال وجود داشت که طی استپ-سایزینگ فاکتور عصاره مخمر از حد بهینه عبور کرده باشد، فاکتور سبوس برنج به میزان 57 گرم در لیتر، ثابت و فاکتور عصاره مخمر در جهت معکوس استپ-سایزینگ تغییر داده شد تا اثر این تغییر بر میزان فعالیت اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز بررسی شود.
جدول 5- محیطهای کشت ساخته شده از روی استپ-سایزینگ و نتایج مربوطه (مقادیر بهصورت گرم در لیتر و واحد فعالیت آنزیمی در ستون نتایج میکرومول در دقیقه در میلیلیتر است.)
|
نتایج |
سطوح فاکتورها |
Step |
|||
|
واقعی |
کدگذاری شده |
||||
|
عصاره مخمر |
سبوس برنج |
عصاره مخمر |
سبوس برنج |
||
|
15/5 |
6 |
5/12 |
0 |
0 |
مقادیر کنونی |
|
29/5 |
4/7 |
25/16 |
925/0 |
8/0 |
1 |
|
38/5 |
8/8 |
20 |
85/1 |
6/1 |
2 |
|
43/5 |
2/10 |
75/23 |
775/2 |
4/2 |
3 |
|
57/5 |
6/11 |
27 |
7/3 |
4 |
4 |
|
68/5 |
13 |
75/30 |
625/4 |
6/5 |
5 |
|
87/5 |
4/14 |
5/34 |
55/5 |
2/7 |
6 |
|
95/5 |
8/15 |
25/8 |
475/6 |
8 |
7 |
|
18/6 |
2/17 |
42 |
5/7 |
8/8 |
8 |
|
27/6 |
6/18 |
75/45 |
425/8 |
6/9 |
9 |
|
39/6 |
20 |
5/49 |
931/9 |
4/10 |
10 |
|
54/6 |
4/21 |
25/53 |
275/10 |
2/11 |
11 |
|
71/6 |
8/22 |
57 |
2/11 |
12 |
12 |
|
62/6 |
2/24 |
75/60 |
125/12 |
8/12 |
13 |
|
52/6 |
6/25 |
5/64 |
05/13 |
6/13 |
14 |
|
34/6 |
27 |
25/68 |
975/13 |
4/14 |
15 |
بدین منظور، محیطهای کشت جدول 6 تهیه و فعالیت آنزیمی در آنها بررسی شد.
جدول 6- محیطهای کشت تهیه شده با ثابت نگهداشتن سبوس برنج و تغییر در فاکتور عصاره مخمر (مقادیر بهصورت گرم در لیتر و واحد فعالیت آنزیمی در ستون نتایج میکرومول در دقیقه در میلیلیتر است).
|
ردیف |
مقدار عصاره مخمر |
میزان فعالیت |
|
1 |
8/22 |
57/6 |
|
2 |
4/21 |
61/6 |
|
3 |
20 |
65/6 |
|
4 |
6/18 |
62/6 |
|
5 |
2/17 |
54/6 |
|
6 |
8/15 |
67/6 |
|
7 |
4/14 |
78/6 |
|
8 |
13 |
84/5 |
|
9 |
6/11 |
49/5 |
|
10 |
2/10 |
98/4 |
|
11 |
8/8 |
79/4 |
|
12 |
4/7 |
75/4 |
|
13 |
6 |
64/4 |
با توجه به دادههای جدول 6 مشخص شد که افزایش عصاره مخمر از 6 تا 4/14 گرم در لیتر در محیط کشت، افزایش فعالیت آنزیم را به همراه داشت. از این رو، محدوده بین حد پایین و حد بالا در آزمون RSM جهت بهینهسازی تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز توسط سویه باسیلوس AGh1 به صورت ذیل در نظر گرفت شد:
مقادیر برای سبوس برنج: 25/53 و 75/60 گرم در لیتر
مقادیر برای عصاره مخمر: 13 و 8/15 گرم در لیتر
بهینهسازی محیط کشت جهت تولید آنزیم با استفاده از آزمون RSM : آزمون RSM با تکنیک طراحی مرکب مرکزی (CCD) (Central Composite Design) با دو فاکتور متغیر سبوس برنج با مقادیر به ترتیب حد پایین و حد بالا 25/53 و 75/60 گرم در لیتر و عصاره مخمر با مقادیر به ترتیب حد پایین و حد بالا 13 و 8/15 گرم در لیتر با استفاده از 18 نرم افزار مینیتب طراحی شد. در این آزمون 13 محیط کشت توسط نرم افزار معرفی شد که در جدول 7 به همراه نتایج آمده اند. نتایج فعالیت آنزیمی محیطهای کشت طراحی شده با ضریب اطمینان 95 و بهصورت دو طرفه تحلیل شدند که حاکی از بی معنی بودن عدم برازش (Lack-of-fit) بود، در نتیجه بهینهسازی پیش از مرحله RSM به اتمام رسیده بود. شکل 5 نمودارهای طرح کانتور (Contour plot) و طرح سطحی (Surface Plot) را مبنی بر اثر متقابل دو فاکتور سبوس برنج و عصاره مخمر بر میزان فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در محیط کشت نشان میدهد. نمودارها نشان می دهند هنگامی که مقادیر دو فاکتور سبوس برنج و عصاره مخمر در حد بهینه باشند، آنزیم فعالیت بیشتر از 2/7 میکرومول در دقیقه در میلیلیتر خواهد داشت. از این رو شش محیط کشت با مقادیر میانگین (سبوس برنج برابر با 5/58 گرم در لیتر و عصاره مخمر برابر با 87/14 گرم در لیتر) تهیه و صحت نتایج آزمون با استفاده از آزمون یک نمونهای t برای میانگین بررسی شد که تحلیل نتایج مبنی بر صحت پیشبینی نرم افزار بود. در نهایت فرمول محیط کشت بهینه شده شامل 4/1 گرم در لیتر (NH4)2SO4، 6/0 گرم در لیتر KH2PO4، 3/0 گرم در لیتر CaCl2، 3/0 گرم در لیتر MgSO4.7H2O، 4 گرم در لیتر پپتون، 87/14 گرم در لیتر عصاره مخمر، 8/58 گرم در لیتر سبوس برنج و 2/0 میلیلیتر Tween 80 بود.
بررسی pH و دمای بهینه فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز : فعالیت اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز در pH 4 الی 10 با فواصل 2/0 در دمای 60 درجه سانتیگراد انجام شد. نتایج بیانگر pH بهینه 6/5 برای فعالیت آنزیمی بود. همچنین فعالیت آنزیم در دمای 40 الی 90 با فواصل 5 درجه سانتیگراد بررسی شد که نتایج بیانگر بهینه فعالیت در دمای 70 درجه سانتیگراد بود (شکل 6). فعالیت آنزیم در pH و دمای بهینه برابر با 12/0 ± 10 میکرومول در دقیقه در میلیلیتر بود.
جدول 7- آزمون RSM طراحی شده با تکنیک CCD (مقادیر بهصورت گرم در لیتر و واحد فعالیت آنزیمی در ستون نتایج میکرومول در دقیقه در میلیلیتر است.)
|
StdOrder |
RunOrder |
PtType |
Blocks |
سبوس برنج |
عصاره مخمر |
فعالیت آنزیمی |
||
|
8 |
1 |
1 - |
1 |
57 |
3799/16 |
68/6 |
||
|
1 |
2 |
1 |
1 |
53 |
13 |
42/6 |
||
|
11 |
3 |
0 |
1 |
57 |
4/14 |
15/7 |
||
|
10 |
4 |
0 |
1 |
57 |
4/14 |
37/7 |
||
|
4 |
5 |
1 |
1 |
75/60 |
8/15 |
97/6 |
||
|
2 |
6 |
1 |
1 |
75/60 |
13 |
75/6 |
||
|
9 |
7 |
0 |
1 |
57 |
4/14 |
19/7 |
||
|
13 |
8 |
0 |
1 |
57 |
4/14 |
28/7 |
||
|
5 |
9 |
1 - |
1 |
6967/51 |
4/14 |
51/6 |
||
|
7 |
10 |
1 - |
1 |
57 |
4201/12 |
14/6 |
||
|
12 |
11 |
2 |
1 |
57 |
4/14 |
25/7 |
||
|
6 |
12 |
1 - |
1 |
3033/62 |
4/14 |
85/6 |
||
|
3 |
13 |
1 - |
1 |
25/53 |
8/15 |
78/6 |
||
|
ب) |
الف) |
|
||||||
|
|
|
|
||||||
شکل 5- نمودار طرح کانتور (الف) و طرح سطحی (ب) بیانگر اثر متقابل دو فاکتور سبوس برنج و عصاره مخمر بر میزان فعالیت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز
سنجش فعالیت های بتا-گلوکوزیدازی و بررسی فیلتر کاغذی: با سنجش فعالیت های بتا-گلوکوزیداز و بررسی فیلتر کاغذی در دمای 70 درجه سانتیگراد و pH 6/5، مشخص شد که محلول حاصل از محیط کشت باکتری فعالیت بتاگلوکوزیداز برابر با 12/0 ± 16/4 میکرومول در دقیقه در میلیلیتر و فعالیت FPase برابر با 09 ± 45/2 میکرومول در دقیقه در میلیلیتر داشت.
بحث
مطالعات بسیاری در زمینه دستیابی به آنزیمهای پایدار در دمای بالا از میکروارگانیسمهای ترموفیل یا ترموتولرنت انجام شده است. موزدا و همکاران دو سویه باسیلوس CH43 (Bacillus sp. CH43) و HR68 (Bacillus sp. HR68) مولد سلولاز را از چشمههای آبگرم زیمباوه جداسازی کردند. سلولاز حاصل از هر دو سویه pH بهینه فعالیت 5 الی 5/6 را داشتند. دمای بهینه فعالیت برای آنزیم حاصل از سویه باسیلوس HR68 برابر با 65 درجه سانتیگراد و در مورد سویه باسیلوس CH43 برابر با 70 درجه سانتیگراد بود. آنزیم حاصل از سویه باسیلوس CH43 در دمای 50 درجه سانتیگراد در بازه pH 6 الی 10 و حاصل از سویه باسیلوس HR68 در بازه 6 الی 8 فعالیت داشتند (13).
الف)
ب)
شکل 6 – pH بهینه (الف) و دمای بهینه (درجه سانتیگراد) (ب) فعالیت اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز (میکرومول در درقیقه در میلیلیتر) حاصل از محیط کشت بهینه سویه باسیلوس AGh1
تای و همکاران سویه باکتریایی ژئوباسیلوس ترمولورانس T4 (Geobacillus thermoleovorans T4) را از پساب کارخانه نیشکر در تایوان جداسازی کردند که توانایی ترشح آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز پایدار در حرارات داشت، بهطوریکه در دمای 100 درجه سانتیگراد و pH 7 بیش از 10 درصد از فعالیت اولیه خود را حفظ کرده بود (28). سوکوماران و همکاران در پژوهشی مروری به بررسی سلولازهای باکتریایی و نقش آنها در صنایع مختلف و همچنین بهترین شیوه تولید آنزیم سلولاز از آنها پرداخته و خاطرنشان کردند که تولید سلولازهای باکتریایی و استفاده از آنها در صنایع از نظر اقتصادی بسیار مقرون به صرفه است. در این پژوهش بهترین روش برای تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز از سویههای باکتریایی، تخمیر غوطه ور (Submerged Fermentation) بیان شده است (27). ابراهیم و ال-دیوانی باکتریهای ترموفیل انوکسیباسیلوس فلاویترموس EFP1 (Anoxybacillus flavithermus EFP1)، جئوباسیلوس ترمودنیتریفیکانس EFP2 (Geobacillus thermodenitrificans EFP2) و جئوباسیلوس استئاروترموفیلوس EHP3 (Geobacillus stearothermophilus EFP3) با قابلیت تجزیه CMC را از چشمههای آبگرم مصر جداسازی کردند. بهینه فعالیت آنزیم حاصل از این سویهها در دمای 75 درجه سانتیگراد و pH 5/7 گزارش شده است (14). راستگی و همکاران سویههایی را از نمونههای کمپوست جداسازی کردند که قادر به تجزیه CMC و سبوس بودند. از میان سویههای جداسازی شده، سویهی جئوباسیلوس WSUCF1 به دلیل دارا بودن بالاترین میزان تولید و فعالیّت سلولازی در محیط کشت مایع نسبت به دیگر سویهها، انتخاب و دمای بهینه برای فعالیّت آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از آن 70 درجه سانتیگراد و pH بهینه آن را 5 گزارش کردند (24). پودوسوکورسکایا و همکاران به بررسی سویهی ترموفیل فرویدوباکتریوم ریپایریوم (Fervidobacterium riparium) سلولولیتیک هوازی جداسازی شده از چشمهی آب گرم پرداخته و دمای بهینهی فعالیت آنزیم را 65 درجه سانتیگراد گزارش شده کردند (22). گوآر و تیواری موفق به جداسازی و تولید اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز ترموفیل و قلیادوست از باکتری باسیلوس والیسمورتیس RG-07 (Bacillus vallismortis RG-07) شدند. آنها دما و pH بهینه برای فعالیّت آنزیم را به ترتیب 65 درجه سانتیگراد و 7 گزارش کردند. این آنزیم 75 درصد فعالیّتش را در دمای 95 درجه سانتیگراد با pH 9 حفظ میکرد (10). عزیزی و همکاران طی پژوهشی موفق به جداسازی باکتریهای سلولوتیک از چشمههای آب گرم دهلران در ایلام شدند. در این پژوهش به غربالگری میکروارگانیسمهای تولید کننده سلولاز پرداخته شد، سپس محیط کشت باکتری که از قدرت بالاتر سلولوتیک برخوردار بود را بهینه کرده و پس از شناسایی سویه جداسازی شده را ایزوپتریکولا واریابیلیس IDAH9 (Isoptericola variabilis IDAH9) نامگذاری کردند. این میکروارگانیسم بیشترین میزان تولید سلولاز را در غلظت 9 گرم در لیتر CMC، 6/5 گرم در لیتر آمونیوم سولفات، 6/0 درصد توئین 80 و 2 درصد سوکروز داشت. آنزیم تولیدی پایداری 1 ساعته در دمای 65 درجه سانتیگراد داشت (4). آزادیان و همکاران سویه باسیلوس لچینیفورمیس AMF-07 (Bacillus licheniformis) را از یکی از چشمههای آب گرم استان کرمان جداسازی کرند. اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از این سویه در رنج وسیع دما و pH به ترتیب 40 تا 80 درجه سانتی گراد و 6 الی 10 فعال بوده و دما و pH بهینه به ترتیب 70 درجه سانتیگراد و 9 داشت (3). شاجهان و همکاران باکتری ترموفیل باسیلوس لچینیفورمیس تولید کننده آنزیم سلولاز را از یکی از چشمههای آبگرم در هند جداسازی کرده و پس از بهینهسازی محیط کشت با RSM میزان فعالیت آنزیم سلولاز را تا 3 برابر افزایش دادند. مقدار مواد مورد بررسی در محیط کشت پس از بهینهسازی شامل 21/19 گرم در لیتر CMC، 06/25 میلیگرم در لیتر CaCl2.6H2O و 96/2 میلیلیتر در لیتر Tween 20 بودند (26). ایرفان و همکاران سویه باکتریایی باسیلوس آمیلولیکوئیفشیانس AK9 (Bacillus amyloliquefaciens) را از چشمه آب گرم تاتاپانی (Tatta Pani) در کشمیر پاکستان جداسازی کردند که اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از این سویه در رنج وسیع دما و pH به ترتیب 50 تا 70 درجه سانتی گراد و 3 الی 6 فعال بوده و حداکثر پایداری آن در دما و pH بهینه برای فعالیت آنزیم به ترتیب 50 درجه سانتیگراد و 5 بود (15). در این پژوهش پایداری حرارتی آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از سویه باکتریایی باسیلوس AGh1 که از قبل جداسازی شده بود در دمای 60 درجه سانتیگراد در pHهای 6، 8 و 10 ارزیابی شد. آنزیم در pH 6 در زمانهای 2، 4، 6 و 8 ساعت به ترتیب 89/3 ± 59/90، 73/3 ± 26/63، 52/5 ± 47 و 78/1 ± 18/13 درصد فعالیت خود را حفظ کرده بود. در pH 8 در زمانهای 2، 4 و 6 ساعت به ترتیب 57/2 ± 36/83، 16/4 ± 39/59 و 43/2 ± 36/26 درصد از فعالیت خود را حفظ کرده بود. در pH 10 در زمانهای 2، 4، 6 و 8 ساعت به ترتیب 58/13 ± 35/94، 6/10 ± 69/67، 14/2 ± 25/50 و 11/3 ± 76/20 درصد فعالیت خود را حفظ کرده بود. نتایج حاکی از ان است که آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از سویه باکتریایی باسیلوس AGh1 علاوه بر پایداری حرارتی بالا، توان فعالیت در محدوده وسیع pH داشت. با توجه به نتایج این پژوهش و مطالعه قبلی که آنزیم در pH 4 در زمانهای 2 و 4 ساعت به ترتیب 4/5 ± 69/86، 75/3 ± 71 درصد فعالیت خود را حفظ کرده بود (8)، به نظر میرسد سویه حاضر قابلیت عملکردی مناسبی در طیف وسیع pH داشت باشد.
توجه روزافزونی برای استفاده از ضایعات و پسماندهای کشاورزی به عنوان منابع اولیه بالقوه برای کشت میکروارگانیسمها و تولید ترکیبات با ارزش افزوده بالا وجود دارد (1، 23). سلولازها کمپلکسی آنزیمی از سه گروه هستند که بهطور همافزایی عمل کرده و میتوانند پیوندهای گلوکوزیدی ß(1→4) را هیدرولیز نمایند. این گروهها شامل بتا 1و4- اندوگلوکاناز، سلوبیوهیدرولاز و بتا گلوکوزیداز هستند (30). در این پژوهش امکان استفاده از سبوس برنج، سبوس گندم و کاه برنج به عنوان پسماند صنایع کشاورزی و ماده اولیه ارزان جهت تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز از سویه باسیلوس AGh1 بررسی شد. با توجه به نتایج مشخص شد که فعالیت آنزیم در محیطهای کشت حاوی سبوس برنج، چه در حضور عناصر ضروری معرفی شده در محیط کشت مندل (18) به عنوان محیط کشت پر کاربرد در جداسازی میکروارگانیسمهای تجزیه کننده سلولاز و چه فاقد این عناصر ضروری، نسبت به سایر محیطهای کشت تهیه شده فعالیت آنزیمی بالاتری داشت (محیطهای کشت شماره 5 و 6 در جدول 2). بین این دو محیط، محیط کشت فاقد عناصر ضروری دو مزیت جهت انتخاب برای ادامه روند پژوهش داشت، اول اینکه بیشترین فعالیت آنزیمی در محیط کشت زودتر مشاهده شده بود و دیگری اینکه نیازی به عناصر ضروری به عنوان ماده اولیه برای فرآیند تخمیر نبود.
در این پژوهش بهینهسازی محیط کشت جهت تولید اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز حاصل از سویه باسیلوس AGh1 انجام و مشخص شد که فاکتورهای سبوس برنج و عصاره مخمر اثر معنیدار بر تولید آنزیم اندو-4،1-بتا-دی-گلوکاناز از سویه باسیلوس AGh1 دارند. بهطوریکه پس از اتمام مراحل بهینهسازی محیط کشت فعالیت آنزیم بیشتر از 2/7 میکرومول در دقیقه در میلیلیتر شد که 3/1 برابر بیشتر از فعالیت در محیط کشت اولیه حاوی سبوس برنج بود. با توجه به نتایج این پژوهش میتوان استنباط کرد که آنزیم معرفی شده به عنوان آنزیمی پایدار در دمای 60 درجه سانتی گراد و محدوده وسیع pH (4 الی 10)، با بهینه دمای 70 درجه سانتیگراد و بهینه pH برابر با 6/5، قابلیت توسعه مطالعات و بهکارگیری دارد.
سپاسگزاری
از مرکز مطالعات و همکاریهای علمی بین المللی به خاطر حمایت از این مطالعه در قالب طرح مصوب شماره 4000152 ، سپاسگزاری می گردد.
پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
