نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

• حسین مهدی زاده ¹
• جعفر سلیمیان ²
• جعفر امانی ³
• راحله حلبیان ⁴
• زهرا نورمحمدی ⁵
• یونس پناهی ²

¹ کارمند

² مرکز تحقیقات آسیب های شیمیایی،پژوهشکده سیستم بیولوژی مسمویت‌ها، دانشگاه علوم پزشکی بقیة الله (عج)، ایران

³ مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران

⁴ هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله

⁵ گروه زیست‌شناسی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

چکیده

سابقه و هدف: CTLA4 گیرنده مهاری لنفوسیت های T می باشد. سازه کایمر متشکل از دمین خارج سلولی CTLA4 و بخش FC از آنتی بادی IgG1 انسانی با اتصال به لیگاندهای CD80 ( B7-1) و CD86 ( B7-2) بر روی سلول های عرضه کننده آنتی ژن APC)) مانع اتصال CD28 و در نتیجه مانع فعال شدن لنفوسیت T و مهار پاسخ ایمنی می شود. این سازه به نام داروی آباتاسپت جهت درمان بیماری آرتریت روماتوئید، در سال 2005 مجوز گرفت.

مواد و روش‌ها: در این تحقیق، سازه کایمرCTLA4-FC طراحی گردید و به کمک ابزارهای بیوانفورماتیک ویژگیهای آن بررسی شد. ژن سنتز شده در پلاسمید pET-28a کلون و در باکتری E.coli BL21DE3 ترانسفورم شد. پروتئین نوترکیب بیان و تخلیص شد و بررسی تمایل اتصال با روش فلوسایتومتری انجام شد. برای بررسی فعالیت بیولوژیک پروتئین نوترکیب از روش کشت لنفوسیتی مختلط ( MLR) استفاده شد.

یافته‌ها: ویژگی های بیوانفورماتیکCTLA4-FC نشان داد که ساختار طراحی شده جهت بیان در سلول پروکاریوت مناسب می باشد. پروتئین نوترکیب در باکتری با غلظتmg/L 10 بیان شد. نتایج وسترن بلاتینگ و الایزا صحت پروتئین را تایید کرد. نتایج فلوسایتومتری رابطه مستقیم بین غلظت پروتئین ها و میزان MFI را نشان داد. در تست MLR هم رابطه مستقیم بین غلظت پروتئین و مهار لنفوسیت های T تایید شد.

نتیجه گیری: پروتئین نوترکیب CTLA4-FC تولید شده در سلول باکتریایی به خوبی به گیرنده های CD80 وCD86 متصل شد و توانست سلول های T را مهار نماید. بنابراین می تواند کاندیدای خوبی برای تولید دارو باشد.

کلیدواژه‌ها

• بیوانفورماتیک
• آباتاسپت
• فلوسایتومتری
• CTLA4-FC

موضوعات

• بیوتکنولوژی

عنوان مقاله [English]

Expression of recombinant protein contain CTLA4 in bacteria and study of its biological activity

نویسندگان [English]

• hossein Mahdizadeh ¹
• jafar salimian ²
• jafar amani ³
• Raheleh Halabian ⁴
• Zahra Noormohammadi ⁵
• Yunes Panahi ²

¹ karmand

² Chemical Injuries Research Center, Systems Biology and Poisonings Institute, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran

³ Applied Microbiology Research Center, Systems Biology and Poisonings Institute, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran.

⁴ Applied Microbiology Research Center, Systems Biology and Poisonings Institute, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran.

⁵ Department of Biology, Science and Research branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

چکیده [English]

Aim and Background: The chimer structure consisting of the extracellular domain of CTLA4 and the FC fragment of human IgG1 antibody binds to CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2) ligands on APCs as a result inhibits CD28 binding and T lymphocyte activation. This structure, called Abatasept, was approved by the US FDA in 2005 to treat rheumatoid arthritis.



Material and methods: In this study, the CTLA4-FC chimer structure was designed and then some of its features were investigated using bioinformatics tools. The gene was then cloned into the pET-28a plasmid and transformed into E.coli BL21DE3. Recombinant protein was expressed and purified, and flow cytometry was used to evaluate the binding affinity. Mixed lymphocyte culture (MLR) method was also used to evaluate the biological activity of recombinant protein.



Results: Bioinformatics results showed that the designed structure of CTLA4-FC is suitable in terms of physicochemical properties, second and third structure, how it binds to the receptor, antigenic properties and mRNA properties. Recombinant protein was well expressed in bacteria. Purification was performed as required. Western blotting and ELISA results were positive and flow cytometry and MLR tests were acceptable.



Conclusion: Recombinant CTLA4-FC protein was produced in bacterial cells and bound well to CD80 and CD86 receptors and was able to inhibit T cells. So it can be a good candidate for drug production.

کلیدواژه‌ها [English]

• bioinformatics
• Abatasept
• CTLA4-FC
• flow cytometry