بیان پروتئین نوترکیب EIT در شرایط شبیه ساز بی وزنی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان
مریم صلواتی فر 1
شیدا کاشان پور 2
علی هاتف سلمانیان 3
1 عضو هیات علمی ایران، تهران، پژوهشگاه هوافضا، وزارت علوم، تحقیقات و فناوری
2 دانشجوی کارشناسی ارشد پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
3 عضو هیات علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
10.22034/cmr.2023.2173
چکیده
باکتری بیماریزای E. coli O157:H7 قادر به ایجاد طیف وسیعی از عوارض همانند اسهال خونی و سندرم اورمی همولیتیک میباشد. به دلیل مشکلات موجود در درمان آنتی بیوتیکی، به نظر میرسد ایمن سازی، مناسبترین روش مبارزه با این باکتری باشد. پروتئینهای (Intimin)، Tir و EspA، سه پروتئین اصلی در اتصال باکتری مذکور به اپیتلیال دستگاه گوارش میباشند. از طریق ممانعت از اتصال پروتئینهای مذکور در مراحل ابتدائی بیماری مهار خواهد شد. محققان با انتخاب بخشهای مؤثر پروتئینهای مذکور و تولید یک پروتئین نوترکیب کایمر، ایمونوژن کارآمدی جهت پیشگیری از بروز این بیماری ارائه نموده اند. از این رو دستیابی به مقادیر بالای پروتئین نوترکیب در کنار حفظ کیفیت و کارایی آن، بسیار مهم میباشد. با توجه به افزایش بیان کمّی و کیفی برخی پروتئینهای نوترکیب در شرایط حذف نیروی جاذبه، در مطالعه پیش رو بیان پروتئین نوترکیب EIT در شرایط شبیه ساز بیوزنی بر روی دستگاه کلینواستت مورد بررسی قرار گرفت. پس از بهینه سازی شرایط بیان و تائید پروتئین نوترکیب با روشهای ایمنولوژیک، در شرایط بی وزنی بیان آن القاء گردید و پس از تخلیص پروتئین توسط ستون کروماتوگرافی، مقدار آن مورد سنجش قرار گرفت. یافتهها حاکی از آن بودند که علی رغم کاهش میزان بیان در شرایط بی وزنی که احتمالاً به دلیل عدم هوادهی مناسب محیط کشت بوده است، هم چنان پروتئین نوترکیب با کیفیتی مناسب در شرایط بی وزنی تولید گردید. انتظار میرود با بهینه سازی شرایط و استفاده از روشهای هوادهی در بی وزنی، تولید پروتئینهای نوترکیب به طور قابل توجهی افزایش یابد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله English

Expression of recombinant EIT protein under simulated microgravity conditions

نویسندگان English

maryam salavatifar 1
sheida Kashanpoor 2
Ali Hatef Salmanian 3
1 Department of Space Biology, Aerospace Research Institute, Ministry of Science Research and Technology, Tehran, Iran
2 student of NIGEB, Tehran. I.R. of Iran
3 Faculty member/ NIGEB
چکیده English

The pathogenic E. coli O157: H7 is capable of causing a wide range of complications, such as dysentery and hemolytic uremic syndrome. Due to the difficulties in antibiotic treatment, immunization seems to be the most appropriate way to fight this bacterium. Intimin, Tir, and EspA proteins are the three major proteins involved in the binding of the bacterium to the gastrointestinal tract. By inhibiting the binding of these proteins, colonization is limited and disease is inhibited. Selecting the effective portions of these proteins and producing a recombinant chimeric protein by binding them together, researchers have developed a suitable and effective immunogen to prevent the disease. Therefore, achieving high amounts of recombinant protein, along with maintaining its quality and efficiency, is very important. In the present study, due to the increase in the quantitative and qualitative expression of some recombinant proteins under gravity removal conditions, the expression of EIT recombinant proteins under simulated microgravity conditions on a clinostat device was investigated. After optimizing the expression conditions and confirming the recombinant protein using immunological methods, its expression was induced in weightlessness simulator conditions. After purification of the protein by chromatographic column, its amount was measured by standard methods. The results showed that despite the decrease in expression under weightlessness, probably due to lack of proper aeration of the culture medium, recombinant protein was produced with appropriate quality under weightlessness. It is expected that with optimizing the conditions and using aeration methods in weightlessness, the production of recombinant proteins to significantly increases.

کلیدواژه‌ها English

E. coli O157: H7 bacteria
Hemolytic uremic syndrome
EIT recombinant protein Simulated microgravity
Clinostat

بیان پروتئین نوترکیب EIT در شرایط شبیه ساز بی وزنی

مریم صلواتی فر1، شیدا کاشان پور2 و علی هاتف سلمانیان3*

1 ایران، تهران، وزارت علوم، تحقیقات و فناوری، پژوهشگاه هوافضا

2 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران

3 ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری کشاورزی

تاریخ دریافت: 15/04/1401          تاریخ پذیرش: 06/07/1401

چکیده

باکتری بیماری­زای E. coli O157:H7 قادر به ایجاد طیف وسیعی از عوارض همانند اسهال خونی و سندرم اورمی همولیتیک می­باشد. به دلیل مشکلات موجود در درمان آنتی بیوتیکی، به نظر می­رسد ایمن سازی، مناسب­ترین روش مبارزه با این باکتری باشد. پروتئین­های اینتیمین (Intimin)، Tir و EspA، سه پروتئین اصلی در اتصال باکتری مذکور به اپیتلیال سطحی دستگاه گوارش می­باشند. از طریق ممانعت از اتصال پروتئین­های مذکور در مراحل ابتدائی حمله باکتری، کلونیزاسیون محدود شده و بیماری مهار خواهد شد. محققان با انتخاب بخش­های مؤثر پروتئین­های مذکور و تولید یک پروتئین نوترکیب کایمر با اتصال آن­ها به یکدیگر، ایمونوژن مناسب و کارآمدی جهت پیشگیری از بروز این بیماری ارائه نموده اند. از این رو دستیابی به مقادیر بالای پروتئین نوترکیب در کنار حفظ کیفیت و کارایی آن، بسیار مهم می­باشد. با توجه به افزایش بیان کمّی و کیفی برخی پروتئین­های نوترکیب در شرایط حذف نیروی جاذبه، در مطالعه پیش رو بیان پروتئین نوترکیب EIT در شرایط شبیه ساز بی وزنی یا میکروگراویتی (ریز گرانش) بر روی دستگاه کلینواستت مورد بررسی قرار گرفت. پس از بهینه سازی شرایط بیان و تائید پروتئین نوترکیب با روش­های ایمنولوژیک، در شرایط ریز گرانش بیان آن القاء گردید و پس از تخلیص پروتئین توسط ستون کروماتوگرافی، مقدار آن با روش­های استاندارد مورد سنجش قرار گرفت. یافته­ها حاکی از آن بودند که علی رغم کاهش میزان بیان در شرایط ریز گرانش که احتمالاً به دلیل عدم هوادهی مناسب محیط کشت بوده است، هم چنان پروتئین نوترکیب با کیفیتی مناسب در شرایط ریز گرانش تولید گردید.

واژه­های کلیدی: باکتری E. coli O157:H7، سندرم اورمی همولیتیک، پروتئین نوترکیب EIT، شبیه ساز بی وزنی، کلینواستت

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144787336  ،  پست الکترونیکی: salman@nigeb.ac.ir

مقدمه

 

سویه O157:H7 باکتری اشریشیاکلای انتروهموراژیک (Enterohemorrhagic Escherichia coli:EHEC) یک پاتوژن مهم غذایی می­باشد که سالانه منجر به بروز دو میلیون مورد بیماری حاد گوارشی در انسان می­گردد. باکتری EHEC بین انسان و دام مشترک بوده و از طریق آب و غذای آلوده به مدفوع دام، به انسان انتقال پیدا می­کند. این باکتری در روده کلونیزه شده و معمولاً منجر به کولیت هموراژیک خود محدود شونده می­گردد. با این وجود، 10-5 درصد از افراد آلوده، به سندرم اورمی همولیتیک (hemolytic uremic syndrome: HUS) نیز مبتلا می­شوند که عارضه ای تهدید کننده برای کلیه­های بیمار است. علاوه براین در مراحل پیشرفته بیماری، پاسخ­های التهابی در روده بزرگ بیماران مبتلا بروز نموده و حتی ممکن است به مرگ افراد به ویژه کودکان منجر گردد. درمان­های آنتی بیوتیکی باعث تشدید HUS شده و از این رو منع مصرف دارند (18و 37). از این رو واکسیناسیون یکی از روش­های امیدبخش برای مبارزه با این بیماری می­باشد و مطالعات گسترده ای در این خصوص در حال انجام می­باشد (29). ایجاد عفونت­های روده ای توسط این عامل بیماری زا، طی دو مرحله انجام می­پذیرد. ابتدا باکتری توسط اجزای سلولی مانند فیمریا و پروتئین­های اتصالی خود به سلول هدف متصل شده و متعاقب آن بافت هدف تخریب می­گردد. سپس با انتقال ترکیبات سمی تولید شده توسط باکتری به درون بافت، تخریب گسترده تر می­شود (24). براین اساس، کلونیزه شدن پیش نیاز اصلی شروع بیماری بوده و پروتئین­های کلیدی در این مرحله، کاندیدهای مهمی جهت مطالعات واکسن علیه باکتری EHEC می­باشند. اینتیمین (Intimin)، Tir و EspA سه پروتئین اصلی در اتصال باکتری مذکور به اپیتلیال سطحی دستگاه گوارش بوده و تحقیقات نشان داده­اند که از طریق ممانعت از اتصال آن­ها در مراحل ابتدائی حمله باکتری، کلونیزاسیون محدود خواهد شد و بیماری مهار می­گردد (31). مطالعات پیشین نشان داده­اند که پروتئین­های مذکور کاندیدهای مناسبی برای اهداف پیشگیرانه از بروز این بیماری بوده و توانسته­اند ایمنی مناسبی را علیه بیماری ایجاد نمایند (27و 35). از این رو محققان با انتخاب بخش­های مؤثر پروتئین­های مذکور و تولید یک پروتئین نوترکیب کایمر با اتصال آن­ها به یکدیگر، ایمونوژن مناسب و کارامدی جهت پیشگیری از بروز این بیماری ارائه نموده­اند (15، 26و 32). موجودات زنده، سلول­ها و مولکول­های آن­ها تحت تأثیر نیروهای وارده از محیط زیست خود قرار داشته و این نیروها بر فعالیت­های زیستی اثر گذار است. جاذبه، نیرویی است که به صورت مداوم به موجودات زنده ساکن بر روی کره زمین اعمال می­شود و همه جانداران تحت تأثیر این نیرو، تشکیل، رشد و تکامل یافته­اند (28). در شرایط حذف این نیرو )بی وزنی( مانند آن چه برای فضانوردان اتفاق می­افتد تحولاتی در سلول­ها و مولکول­های موجودات رخ می­دهد. در حقیقت ویژگی­های شرایط فقدان جاذبه که شامل تنش برشی کم، رسوب گذاری اندک و تلاطم ناچیز محیط می­باشد بر ویژگی­های جاندار اثرات قابل توجهی دارد (22). میکروب­ها نیز از این قاعده مستثنی نبوده و حذف یا کاهش جاذبه (ریز گرانش ) منجر به مجموعه­ای از تغییرات در فیزیولوژی نظیر سرعت رشد، تغییر نحوه مصرف سوبستراها، مقاومت به انواع تنش­ها مانند آنتی بیوتیک­ها و به علاوه تغییر در میزان و نوع متابولیت­های ثانویه می­شود (13). بررسی تغییرات رخ داده در شرایط بی وزنی واقعی در پروازهای فضایی، به دلیل محدودیت تکرار پذیری و هزینه­های بالا، محدود بوده و اکثر آزمایشات در شرایط شبیه سازی شده بر روی زمین انجام می­گردند (9). نظر به اینکه برخی پروتئین­های نوترکیب در شرایط واقعی فضا (12) و دستگاه­های شبیه ساز بی وزنی (Simulated microgravity: SMG) (14،12، 20، 25، 30 و 38) افزایش بیان داشته­اند، نتیجه گیری شده است که در شرایط ریز گرانش ، انرژی که سلول قبلاً برای فائق آمدن بر نیروی جاذبه به کار می­برده است را در مسیرهایی مانند بیوسنتز دیواره جهت فعال سازی مسیر حفظ تمامیت خود، تغییر بیان ژن­های پاسخ­گو به تنش و ساخت ترکیباتی که باعث افزایش تحمل تغییرات فشار اسمزی می­شوند مانند ترهالوز و گلیسرول معطوف می­نماید (7و 34). باتوجه به افزایش کمّی و کیفی برخی پروتئین­های نوترکیب تولید شده در شرایط ریز گرانش و همچنین قدرت پروتئین نوترکیب EIT در ایمنی زایی علیه عفونت­های چندگانه حاصل از E. coli: O157:H7، دراین پژوهش به منظور بهینه سازی تولید این کایمر پروتئینی نسبتاً بزرگ به عنوان کاندید واکسن، بیان آن در شرایط ریز گرانش با دستگاه کلینواستت مورد سنجش قرارگرفت.

مواد و روشها

پلاسمید بیانی pET28a حاوی قطعه ژن eit نوترکیب (1680جفت باز) از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری دریافت گردید و با پرایمرهای عمومی T7 با استفاده از روش PCR، حضور ژن مذکور تائید شد. توالی پرایمرها به شرح ذیل بودند: T7 promoter: 5´TAATACGACTCACTATAGGG3´ وT7 terminator: 5´GCTAGTTATTGCTCAGCGG3´. پس از تائید حضور ژن، سویه مستعد BL21(DE3) باکتری E. coli  تهیه و پلاسمیدهای نوترکیب، براساس روش کوهن و همکارانش به داخل سلول­ها  وارد گردیدند (4). روند کار به طور خلاصه به این صورت بود که ابتدا میزبان باکتریایی مستعد شده با بافر کلرید کلسیم (100 میلی مولار) بر روی یخ به صورت سوسپانسیون درآمد. سپس پلاسمید pET28a حاوی قطعه ژن eit نوترکیب، به سوسپانسیون افزوده گشته و به مدت 30 دقیقه بر روی یخ قرارگرفت. به منظور ایجاد شوک حرارتی، به مدت 5 دقیقه به دمای 37 درجــه سانتیگراد (2 دقیقه در 42 درجــه سانتیگراد) منتقل شد و پس از اتمام زمان، به سرعت بر روی یخ قرارگرفت. سپس 1 میلی­لیتر محیط کشت LB فاقد آنتی بیوتیک به محلول افزوده و یک ساعت در دمای 37 درجــه سانتیگراد نگهداری شد. در نهایت محلول بر روی پلیت حاوی محیط LB جامد حاوی 50 میکروگرم بر میلی لیتر آنتی بیوتیک کانامایسین کشت داده شد. یکی از کلونی­های رشد نموده، به محـیط کشت LB  مـایع حاوی 50 میکروگرم بر میلی لیتر آنتی بیوتیک کانامایسین تلقیح گردید و به مدت یک شب در انکوباتور 37 درجــه سانتیگراد همراه با هوادهی قرار داده شد. در روز بعد 500 میکرولیتر از کشت شبانه به 50 میلی لیتر محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) تلقیح شد (نسبت 1:100( و در دمــای 37 درجــه سانتیگراد همراه با چرخش بر روی شیکر با سرعت 150-120 دور در دقیقه نگهداری گردید. پس از رسیدن جذب نوری محیط کشت به حدود 6/0 در طول موج 600 نانومتر، با استفاده از غلظت یک میلی مولار IPTG (ایزوپروپیل تیو بتا- دی گالاکتوزیـد) بیان پروتئین القاء گردید. جهت بررسی تأثیر فاکتور زمان بر میزان بیان پروتئین، توقف بیان در زمان­های 2 ساعت، 4 ساعت و یک شب پس از القاء انجام شد. جمع آوری رسوب سلولی )5 دقیقه/ RPM5000) توسط سانتریفیوژ انجام گردید و سپس با روش الکتروفورز روی ژل آکریل آمید 12 درصد (SDS-PAGE)، بیان پروتئین بررسی شد. به منظور مقایسه

میزان بیان پروتئین نوترکیب در شرایط ریز گرانش نسبت به جاذبه طبیعی زمین (g 1)، پس از بهینه سازی زمان بیان، از کشت شبانه به محـیط LB مـایع حاوی 50 میکروگرم بر میلی لیتر کانامایسین در سه ظرف به صورت زیر تلقیح گردید:

1- فالکون 50 میلی لیتری حاوی 5/1 حجم محیط LB  مـایع به همراه 50 میکروگرم بر میلی لیتر آنتی بیوتیک کانامایسین و شرایط هوادهی در شیکر با سرعت 150-120 دور در دقیقه به عنوان محیط کشت استاندارد.

2- فالکون 50 میلی لیتری پر از محیط LB  مـایع حاوی 50 میکروگرم بر میلی لیتر آنتی بیوتیک کانامایسین فاقد حباب بدون هوادهی در شرایط ریز گرانش بر روی دستگاه کلینواستت.

3- فالکون 50 میلی لیتری پر از محیط LB  مـایع حاوی 50 میکروگرم بر میلی لیتر آنتی بیوتیک کانامایسین فاقد حباب بدون هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی.

دستگاه کلینواستت به کار رفته در این تحقیق جهت شبیه سازی بی وزنی، از نوع یک محوره (دو بعدی) بود که از دفتر سازمان ملل متحد در امور فضای خارج از جو (United Nations Office at Vienna, The office for Outer Space Affairs) در اختیار پژوهشگاه هوافضا قرارگرفته بود. کلینواستت در واقع یک شبیه ساز بی وزنی است که دارای صفحه ای می­باشد که به آرامی و با سرعتی ثابت حول محور افقی (در جهت یا خلاف جهت عقربه ساعت) می‍چرخد. به دلیل چرخش حول یک محور منفرد جهت‍دار 90 درجه نسبت به بردار جاذبه زمین، جهت بردار جاذبه بر روی نمونه قرار گرفته بر روی آن، به صورت ریتمیک تغییر می کند، و از این رو میانگین بردار جاذبه بسیار به صفر نزدیک می شود. در واقع هر قدر نمونه­های قرار گرفته بر روی این دستگاه به مرکز نزدیکتر باشند میزان خطا کمتر خواهد بود. کاربرد واژه میکروگراویتی در مطالعات به این حقیقت اشاره دارد که نیروی گرانش، کاملاً برابر صفر نبوده بلکه بسیار کوچک و نزدیک به صفر می­باشند (8 و 11). دراین پژوهش براساس فاصله مرکز فالکون­ها از مرکز کلینواستت (2 سانتیمتر) و سرعت چرخش دستگاه که بر روی 15 دور در دقیقه در جهت چرخش عقربه ساعت تنظیم گردیده بود شتاب جاذبه g 005/0 محاسبه گردید (36). شکل 1 نمونه­ها بر روی دستگاه کلینواستت را نشان می­دهد. کلیه آزمون­ها در شرایط دمایی 37 درجه سانتیگراد، به مدت یک شب و در سه تکرار انجام گردید. در پایان مدت زمان مورد نظر برای بیان پروتئین، باکتری­ها توسط سانتریفیوژ )5 دقیقه/ RPM5000( جمع آوری گردیده و توسط روش SDS-PAGE بررسی نمونه­ها انجام شد (1).

 

شکل 1- نحوه قرار گیری نمونه­ها بر روی دستگاه کلینواستت. A. نحوه قرار گیری نمونه­ها بر روی صفحه کلینواستت. B. کلینواستت درون انکوباتور.

 

پروتئین­های بیانی در E. coli به صورت محلول (Soluble) یا نامحلول در فرم اجسام توده ای (Inclusion bodies) قرار می­گیرند. از این رو جهت بررسی، ابتدا رسوب سلولی حاصل از القاء بیان پروتئین، در بافر لیز کننده (NaH2PO4، NaCl،Imidazole ) همگن گردید. سپس توسط سونیکاسیون دو بار هر بار به مدت 2 دقیقه و با قدرت خروجی 100 درصد، دیواره­های سلولی شکسته شده و پس از سانتریفیوژ، رسوب و محلول رویی جدا گردید. محلول رویی حاوی پروتئین­های محلول (تحت عنوان فاز محلول) و رسوب، حاوی پروتئین به فرم نامحلول به همراه بقایای سلولی می­باشد. رسوب حاصله را در بافری حاوی اوره (NaH2PO4، Tris-HCl، اوره 8 مولار) حل نموده و پس از سونیکاسیون مانند مرحله قبل، به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد با هوادهی قرار داده شد. در انتها، پس از سانتریفیوژ، پروتئین­های نامحلول در محلول رویی (تحت عنوان فاز نامحلول) قرار گرفته و بقایای سلولی در رسوب باقی ماند. بررسی تمامی نمونه­ها با استفاده از روش SDS-PAGE انجام شد (1). به دلیل قرار گیری نشانه His-tag6 در ابتدای پروتئین EIT، به منظور تخلیص این پروتئین نوترکیب، از ستون کروماتوگرافی میل جذبی Ni-NTA (کیاژن) استفاده گردید. پروتئین­های نوترکیب موجود در هریک از فازهای محلول و نامحلول مرحله قبل، به صورت مجزا توسط ستون نیکل و طبق دستورالعمل شرکت سازنده تخلیص گردیدند. در هر مرحله خروجی ستون (E: Elution) به صورت جداگانه جمع آوری شد (23). جهت بررسی روند تخلیص پروتئین، روش SDS-PAGE مورد استفاده قرار گرفت. به منظور تأیید بیان پروتئین نوترکیب،

وسترن بلاتینگ انجام شد. دراین آزمون از آنتی بادی بر علیه دنباله هیستیدینی (Anti His tag) متصل بهHRP  (Horse Radish Peroxidase)، به عنوان آنتی بادی جهت ردیابی پروتئین نوترکیب استفاده گردید. تمامی نمونه­های مورد آزمایش به اضافه کنترل منفی (محیط کشت حاوی باکتری اما بدون القاء) توسط آزمون SDS-PAGE به طور کامل از یکدیگر تفکیک شده و سپس به غشاء PVDF منتقل گردید. پس از شستشو غشاء و قرار گیری در بافر مسدود کننده حاوی شیر خشک بدون چربی،Anti His tag جهت ردیابی پروتئین نوترکیب استفاده شد. جهت آشکار سازی از قرص­های DAB (Diaminobenzoic acid) به عنوان سوبسترای آنزیم استفاده گردید (2). در مرحله بعد، منحنی استاندارد به روش برادفورد جهت تعیین غلظت پروتئین نوترکیب، با استفاده از سرم آلبومین گاوی (سیناژن) به عنوان استاندارد، ترسیم شد و سپس غلظت پروتئین تخلیص شده در مقایسه با نمودار ترسیم شده، تعیین گردید (1).

تجزیه و تحلیل آماری نتایج: در انتها با استفاده از نرم افزار  GraphPad Prism 8نمودارها ترسیم شدند و از نرم افزار آماری SPSS، جهت مقایسه میزان بیان پروتئین­ها در شرایط مختلف بررسی گردید. مقدار p-value≤ 0.05 نشان دهنده اختلاف معنی دار بین گروه­ها در نظر گرفته شد.

نتایج

محصول اختصاصی مربوط به تکثیر ژن eit با روش PCR، با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگارز یک درصد تائید شد. باتوجه به این که از پرایمرهای عمومی T7 جهت تکثیر ژن eit استفاده شده بود به اندازه تقریبی bp150 به ابتدای ژن و bp150 به انتهای ژن اضافه گردیده است. بنابراین حدود 300 جفت باز به قطعه ژنی اضافه شده و مشاهده باندی حدود 2000 جفت باز براساس مارکر مولکولی، مؤید تکثیر ژن eit بود (شکل 2).

شکل 2- تائید حضور سازه ژنی eit با روش PCR. ستون 1: DNA مارکر 1 کیلو بازی (یکتا تجهیز، ایران)، ستون 2: محصول تکثیر ژن با پرایمرهای عمومی T7

بیان پروتئین نوترکیب، در ساعات مختلف پس از القاء با IPTG انجام پذیرفت. باتوجه به اینکه وزن مولکولی پروتیئن نوترکیب حدود 7/62 کیلو دالتون می­باشد، از ژل پلی آکریل آمید با غلظت 10 درصد استفاده گردید و مشاهده شد که بالاترین میزان بیان پروتئین نوترکیب EIT، در زمان دو ساعت پس از القاء صورت پذیرفته است (شکل 3).

 

شکل 3- بررسی و بهینه سازی بیان پروتئین نوترکیب EIT در زمان­های مختلف بر روی چند کلونی باکتریائی. ستون­های 1 و2: بیان 2 ساعت پس از القاء، ستون 3: نشانگر وزن مولکولی پروتئین، ستون 4: کنترل منفی حاوی ژن بدون القاء با IPTG، ستون­های 7-5: بیان 4 ساعت پس از القاء، ستون­های 10-8: بیان یک شب پس از القاء.

 

پس از بررسی زمان مناسب جهت بیان، بررسی بیان پروتئین در شرایط ریز گرانش انجام شد اما به دلیل مسائل تکنیکی مربوط به دستگاه کلینواستت، زمان بیان یک شب مقرر گردید و نتایج  بر روی ژل SDS-PAGE نسبت مشاهده گردید (شکل 4). چنان­چه انتظار می­رفت نتایج نشان­دهنده میزان بیان بالاتر در فالکون نیمه پر در شرایط جاذبه طبیعی به دلیل هوادهی، نسبت به بقیه حالات بود.

 

شکل 4- بیان پروتئین EIT در شرایط مختلف به مدت یک شب. ستون 1: القاء بیان درون فالکون نیمه پر همراه با هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی، ستون 2: کنترل منفی بیان (بدون القاء با IPTG) درون فالکون نیمه پر همراه با هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی، ستون 3: بیان درون فالکون پر در شرایط جاذبه طبیعی، ستون 4: کنترل منفی بیان (بدون القاء با IPTG) درون فالکون پر در شرایط جاذبه طبیعی، ستون 5: مارکر پروتئین، ستون 6: القاء بیان درون فالکون پر در شرایط ریز گرانش ، ستون 7: کنترل منفی بیان (بدون القاء با IPTG) درون فالکون پر در شرایط ریز گرانش.

 

 

به منظور دست یابی به مقادیر کمّی پروتئین نوترکیب بیان شده EIT، در هریک از حالت­های محلول و یا نامحلول، پس از تخلیص توسط کروماتوگرافی میل جذبی با استفاده از ستون NI-NTA، نمونه­های خروجی از ستون جمع آوری شده و ابتدا بر روی ژل SDS-PAGE بررسی گردیدند (شکل­های 5 و 6).

 

 

شکل 5- خالص سازی پروتئین نوترکیب در فاز نامحلول. A. فالکون پر فاقد هوادهی در شرایط ریز گرانش B. فالکون پر فاقد هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی و C. فالکون همراه با هوادهی و شرایط جاذبه طبیعی. (ستون­ها به ترتیب شامل 1: محلول عبوری از ستون، 2: شستشو، 3: مارکر پروتئین، 4 تا 8: مراحل خالص سازی).

 

سپس جذب نوری نمونه­ها با روش برادفورد تعیین و غلظت­ها در مقایسه با منحنی استاندارد ترسیم شده توسط BSA )شکل 7)، تعیین گردیدند (جدول 1).

نرمال بودن داده­های حاصل از میزان بیان پروتئین در شرایط مختلف، در نرم افزار SPSS بررسی گردید و باتوجه به اینکه اکثراً داده­ها نرمال نبودند (P≤0.05) از تست ناپارامتری Mann-Whitney U جهت مقایسه میانگین غلظت پروتئین­های تولیدی استفاده گردید. نتایج حاکی از اختلاف معنی­دار میان اکثر گروه­های تحت آزمایش بود (شکل­های8 و 9) (P≤0.05).

 

شکل 6- خالص سازی پروتئین نوترکیب در فاز محلول. A. فالکون پر فاقد هوادهی در شرایط ریز گرانش ، B. فالکون پر فاقد هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی و C. فالکون همراه با هوادهی و شرایط جاذبه طبیعی. (ستون­ها به ترتیب شامل 1: محلول عبوری از ستون، 2: شستشو، 3: مارکر پروتئین، 4 تا 8: مراحل خالص سازی).

جدول 1- میانگین محتوای پروتئینی (میکروگرم/میلی لیتر) بیان شده در شرایط مختلف

انحراف معیار

میانگین محتوای پروتئین

فاز

شرایط نمونه

46/1

154

محلول

فالکون حاوی محیط کشت همراه با هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی

62/1

128

نامحلول

85/2

99

محلول

فالکون پر فاقد هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی

62/2

104

نامحلول

50/7

94

محلول

فالکون پر فاقد هوادهی در شرایط ریز گرانش

01/1

64

نامحلول

                                                                               

 

 

 

شکل 7- منحنی استاندارد برادفورد ترسیم شده توسط غلظت­های مختلف BSA

علاوه براین، غلظت پروتئین های تولیدی در تیمارهای مختلف به صورت محلول و نامحلول نیز با استفاده آزمون ناپارامتری T با یکدیگرمقایسه گردید که نتایج آن در شکل 10 ارائه گردیده است P≤0.05, Nonparametric T test)) ns: no significant)).

 

شکل 8- پروتئین­های تولیدی در تیمارهای مختلف. میزان غلظت پروتئین نوترکیب تخلیص شده با روش محلول ((Native در شرایط مختلف، اختلاف معنی دار نشان داد P≤0.05, Mann-Whitney U test)).

(***): p-value is less than 0.001; Ns: non-significant

 

 

شکل 9- پروتئین­های تولیدی در تیمارهای مختلف. میزان غلظت پروتئین نوترکیب تخلیص شده با روش نامحلول (Denature) در شرایط مختلف، اختلاف معنی دار نشان داد P≤0.05, Mann-Whitney U test)).

(***): p-value is less than 0.001;(****): p-value is less than 0.0001

پروتئین نوترکیب بیان شده باتوجه به دنباله هیستیدینی متصل به آن، از طریق روش وسترن بلاتینگ با آنتی بادی بر علیه His-tag و مشاهده باندهای مورد نظر شده بر روی غشاء PVDF، تائید گردید (شکل 11).

بحث

دانش زیست فناوری به سمت دوران جدیدی در حال پیشرفت است که در آن پروتئین­ها به عنوان دستاوردهایی با اهمیت در نظر گرفته می­شوند و تحقیق و توسعه روش­های تولیدی آن­ها، در دستور کار تحقیقات قرار گرفته است. روش سنتز شیمیایی پروتئین­ها اگرچه روشی کارآمد برای تولید مولکول­های کوچک پپتیدی است اما فرایندی پیچیده و هزینه بر بوده و برای تولید پروتئین­های بزرگ و پیچیده، مناسب نمی­باشد. از این رو تولید چنین پروتئین­هایی در مقیاس بالا به طور عمده مستلزم تولید در سیستم­های زنده است. از سوی دیگر تخلیص پروتئین­ها از منابع طبیعی فرایندی طولانی، پیچیده و زمان بر بوده و تولید در مقیاس بالا را با مشکل مواجه می­کند.

 

 

شکل 10- غلظت پروتئین­های تولیدی در تیمارهای مختلف به صورت محلول و نامحلول اختلاف معنی دار نشان داد P≤0.05, Nonparametric T test)).

)**(: p-value is less than 0.01; )****(: p-value is less than 0.0001; Ns: non-significant

 

شکل11- تائید پروتئین نوترکیب با روش وسترن بلاتینگ. ستون 1: فالکون نیمه پر با هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی، ستون 2: فالکون پر فاقد هوادهی در شرایط جاذبه طبیعی، ستون 3: فالکون پر فاقد هوادهی در شرایط شبیه ساز ریز گرانش ، ستون 4: کنترل مثبت (پروتئین حاوی دنباله هیستیدینی)، ستون 5: مارکر وزن مولکولی.

 

خوشبختانه فناوری DNA نوترکیب ابزاری مقرون به صرفه را در امر تولید پروتئین­های مختلف به صورت تجاری فراهم آورده است و با کمک این فناوری، پروتئین­های مختلف با کاربردهای صنعتی، دارویی، آنزیمی و کشاورزی، در میزان انبوه تولید می­شوند (6 و16). باکتری E. coli شناخته­ترین و پرکاربردترین میزبان در زمینه تولید پروتئین نوترکیب می­باشد. اما علی رغم مزایای بسیار، کاربرد آن با مشکلاتی نیز روبرو است. مهمترین مانع، تشکیل اجسام توده ای حاصل از اتصالات نابجا میان پروتئین­های تولید شده می­باشد که باعث غیر فعال شدن محصول می­گردند. تحقیقات گسترده به منظور برطرف نمودن این معضل در حال انجام می­باشد که از جمله می­توان به تغییر شرایط رشد باکتری، تغییر سطوح بیان پروتئین، تغییرات مهندسی بر روی توالی پروتئین مورد نظر و یا حتی بیان همزمان با چاپرون­های مولکولی اشاره نمود (10 و 33). همچنین قرار گیری سلول­ها تحت استرس­هایی چون تنش اسمزی و یا شوک حرارتی،حلالیت برخی پروتئین­های نوترکیب را ارتقاء می­بخشد (9). علی رغم پیشرفت­های زیاد در این مقوله، همچنان موانعی چند در تولید این دست پروتئین­ها پیش روی محققان می­باشد. با سرعت بخشیدن به اکتشافات انسان در فضا، ارزیابی چگونگی واکنش­های متابولیکی میکروارگانیسم­ها در محیط­های فضا در حال گسترش است. پیشرفت پروازهای فضایی و فناوری شبیه سازی بر روی زمین، درک ما را از تأثیرات جاذبه بر روی زمین و بی وزنی در فضا بر روی میکروارگانیسم­ها ارتقاء داده است. لازم به ذکر است که موارد متعددی وجود دارند که در آن­ها اثرات ریز گرانش با استفاده از دستگاه­های شبیه ساز، با تأثیرات حاصل از قرارگرفتن در معرض بی وزنی واقعی در طول پروازهای فضایی اندکی متفاوت باشد زیرا عوامل موثر دیگری غیر از بی وزنی مانند تابش کیهانی، ارتعاشات ایجاد شده توسط موشک و شتاب در هنگام پرتاب و فرود فضاپیما وجود دارند که می­توانند بر رشد و متابولیسم میکروارگانیسم­ها تأثیر بگذارند. با این حال به دلیل موانع موجود جهت انجام آزمایشات در شرایط بی وزنی واقعی مانند هزینه بسیار بالا و محدودیت تکرارپذیری، آزمون­هایی که نیازمند بهره برداری از شرایط فضا هستند، ابتدا با استفاده از شبیه ساز­های زمینی آن انجام می­پذیرند (11). مطالعات متعدد نشان داده­اند که پروازهای فضایی و آزمایش­های شبیه ساز آن می­توانند باعث تغییر در سرعت رشد و تولید متابولیت­های ثانویه و همچنین تغییرات عمومی در بیان ژن، تنظیم عملکرد پروتئین­ها و انتقال متابولیت­ها در میکروارگانیسم­ها شوند (3 و 17). تحقیقات وسیع ژنومیکس و پروتئومیکس که توسط هوآنگ فو و همکاران انجام پذیرفته است به بررسی دلایل افزایش بیان پروتئین نوترکیب بتاگلوکورونیداز در شرایط SMG در میزبان E. coli پرداخته است. نتایج این پژوهش نشان داده است که ژن­های مربوط به ریبوزوم و RNA پلی مراز که مستقیماً با افزایش بیان پروتئین­ها ارتباط دارند، در شرایط SMG افزایش بیان داشته­اند (14). همچنین ثابت شده است چاپرون­های مولکولی که تاخوردن مؤثر پروتئین­ها پس از ترجمه وگردهمایی پلی پپتیدها به کمک آن­ها انجام می­پذیرد، در شرایط SMG افزایش بیان را نشان داده­اند. علاوه براین فعالیت برخی آنزیم­های تولید شده در شرایط SMG، بسیار بیشتر از شرایط جاذبه طبیعی بوده است (13و 5). باتوجه به شواهد فوق و نیاز مبرم به تولید پروتئین­های نوترکیب با ویژگی­های کمّی وکیفی بالاتر و به دلیل معضلات پیش رو در درمان آنتی بیوتیکی عفونت حاصل از باکتری E. coli آنتروهموراژیک سویه O157:H7 (EHEC)، دراین پژوهش اقدام به بررسی تأثیر شرایط ریز گرانش بر میزان و کیفیت پروتئین نوترکیب  EITبه عنوان یکی از کاندیدهای حفاظت بخش واکسن علیه باکتری مذکور نمودیم. باکتری E. coli یک باکتری هوازی-بی هوازی اختیاری بوده و به عنوان میزبانی تولید کننده، هم در شرایط حضور اکسیژن و هم عدم حضور آن، ادامه حیات داده و از انرژی حاصل از شکستن قند استفاده می­نماید. میزان انرژی آزاد شده از شکستن یک مولکول گلوکز در زمان در دسترس بودن اکسیژن نسبت به نبود آن، در حدود 18 برابر بیشتر می­باشد (21). به دلیل نیاز به انرژی بسیار بالا جهت بیان پروتئین، در دسترس بودن اکسیژن، فاکتوری تأثیر گذار در بازده تولید است به نحوی که دراین مطالعه با قرار دادن باکتری در ظرف حاوی محیط کشت با درب نفوذ پذیر و درون انکوباتور شیکردار، بیان پروتئین بیشتری بود اما به دلیل چرخش دستگاه کلینواستت، لاجرم درب ظرف حاوی باکتری بسته بوده وامکان اکسیژن رسانی وجود نداشت. علاوه براین به منظور غلبه بر نیروی تنش برشی برای برقراری شرایط ریز گرانش، ظرف محیط کشت باید فاقد هر گونه فضای خالی (حباب) می­بود. دراین شرایط پس از گذشت مدت زمانی اندک، تمامی اکسیژن محلول در محیط کشت مصرف شده و گلوکز، به جای ورود به چرخه کربس، به سمت گلیکولیز رفته که بازده انرژی بسیار پایین تری دارد. از این رو بیان پروتئین در شرایط بدون هوادهی، باید بسیار کم می­بود. اما مشاهده نمودیم که میزان این پروتئین نوترکیب در فاز محلول در حالت ریز گرانش حدود 60 درصد میزان آن در شرایط جاذبه طبیعی همراه با هوادهی و در فاز نامحلول در حالت ریز گرانش 50 درصد میزان آن در شرایط جاذبه طبیعی بود که در صورت اکسیژن رسانی امکان افزایش بیان محتمل بود. علاوه براین در شرایط واقعی فضا با وجود برقراری بی وزنی، محیط فاقد اکسیژن نخواهد بود و لذا انتظار می­رود تنفس هوازی انجام شده و بنابراین بیان پروتئین بالاتر باشد. Qi و همکاران در مطالعه­ای به سنجش میزان بیان پروتئین نوترکیب بتا-گلوکوزیداز در میزبان P. pastoris در شرایط ریز گرانش در دستگاه شبیه ساز LSMMG (Low-shear modeled microgravity) که در آن نیز امکان تبادل گازی وجود دارد پرداختند. نتایج حاکی از افزایش بیان 21/2 برابری پروتئین مذکور در شرایط ریز گرانش نسبت به شرایط جاذبه طبیعی بود (25). به علاوه در پژوهشی که توسط هوانگفو و همکاران انجام پذیرفته است مشخص گردیده که بیان پروتئین نوترکیب بتا-گلوکوزیداز در شرایط ریز گرانش در دستگاه شبیه ساز HARV (High-aspect rotating-wall vessel) که امکان تبادل گازها وجود دارد، در میزبان E. coli، تا حدود 52 درصد نسبت به شرایط جاذبه طبیعی افزایش بیان داشته است (13). بنابراین انتظار می­رود با برقراری شرایط جهت انجام تبادلات گازی از طریق غشایی نیمه تراوا و یا استفاده از بیوراکتور در شرایط ریز گرانش، همچنین تغییر میزبان بیانی به میزبانی با شرایط بی هوازی اجباری، بتوان بر مشکل عدم اکسیژن رسانی غلبه نمود و به بررسی اثر یک جانبه ریز گرانش بر میزان بیان پروتئین نوترکیب پرداخت (19). دراین مطالعه مشاهده گردید که بیشتر پروتئین EIT نوترکیب در فاز محلول قرارگرفته بود به نحوی که در شرایط جاذبه طبیعی، میزان پروتئین بیانی در حالت نامحلول، 83 درصد میزان پروتئین محلول بود اما این نسبت در ریز گرانش به 68 درصد کاهش یافت. همچنین در شرایط ریز گرانش، نسبت پروتئین نوترکیب مورد نظر که در فاز محلول قرارگرفته بود، نزدیک به 60 درصد پروتئین کل بود (مجموع محلول و نامحلول) در حالی­ که این نسبت، در شرایط جاذبه طبیعی، 6/54 درصد ارزیابی شد. این موضوع نشان داد که در شرایط ریز گرانش، پروتئین EIT بیشتر در فاز محلول قرار گرفته که این امر، در تخلیص این پروتئین نوترکیب نسبتاً سنگین از باکتری بسیار مهم می­باشد. نتایج حاصل از پژوهش پیش رو نشان دادند که ریز گرانش به عنوان محیطی با شرایط ویژه، جهت افزایش بیان پروتئین­های نوترکیب قابل بررسی و آزمون­های پیشرفته­تر می­باشد و درک چگونگی تأثیر جاذبه بر ترجمه و تاخوردگی پروتئین­ها می­تواند برای کشف پتانسیل­های جدید به منظور افزایش تولید پروتئین­های نوترکیب فعال از نظر زیستی و تجاری به کار رود.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و پژوهشگاه هوافضا جهت انجام آزمایشات قدردانی می­گردد. منابع مالی این پژوهش توسط محققین تامین گردیده است.

  1. Harrison, R.G., and Bagajewicz, J., 2015. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli, Insoluble Proteins, PP: 403-408.
  2. Hayat, S.M., Farahani, N., Golichenari, B., and Sahebkar, A., 2018. Recombinant protein expression in Escherichia coli ( coli): what we need to know. Current pharmaceutical design, 24(6), PP: 718-725.
  3. Huang, B., Li, D.G., Huang, Y., and Liu, C.T., 2018. Effects of spaceflight and simulated microgravity on microbial growth and secondary metabolism. Military Medical Research, 5(1), PP: 1-14.
  4. Huang, Y., Gou, X., Hu, H., Xu, Q., Lu, Y., and Cheng, J., 2012. Enhanced S‐adenosyl‐l‐methionine production in Saccharomyces cerevisiae by spaceflight culture, overexpressing methionine adenosyltransferase and optimizing cultivation, Journal of applied microbiology, 112(4), PP: 683-694.
  5. Huangfu, J., Kim, H.S., Xu, K., Ning, X., Qin, L., Li, J., and Li, C., 2020. Omics analysis reveals the mechanism of enhanced recombinant protein production under simulated microgravity. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 8, 30 p.
  6. Huangfu, J., Qi, F., Liu, H., Zou, H., Ahmed, M.S., and Li, C., 2015. Novel helper factors influencing recombinant protein production in Pichia pastoris based on proteomic analysis under simulated microgravity. Applied microbiology and biotechnology, 99(2), PP: 653-665.
  7. Khanifar, J., Hosseini, R.H., Kazemi, R., Ramandi, M.F., Amani, J., and Salmanian, A.H., 2019. Prevention of EHEC infection by chitosan nano-structure coupled with synthetic recombinant antigen. Journal of microbiological methods, 157, PP: 100-107.
  8. Klaus, A., Saga, Y., Taketo, M.M., Tzahor, E., and Birchmeier, W., 2007. Distinct roles of Wnt/β-catenin and Bmp signaling during early cardiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(47), PP: 18531-18536.
  9. Limbach, C., Hauslage, J., Schäfer, C., and Braun, M., 2005. How to activate a plant gravireceptor. Early mechanisms of gravity sensing studied in characean rhizoids during parabolic flights. Plant Physiology, 139(2), PP: 1030-40.
  10. Mühlen, S., and Dersch, P., 2020. Treatment Strategies for Infections With Shiga Toxin-Producing Escherichia coli. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 6(10), 169 p.
  11. Muntari, B., Amid, A., Mel, M., Jami, M. S., and Salleh, H. M., 2012. Recombinant bromelain production in Escherichia coli: process optimization in shake flask culture by response surface methodology. AMB express, 2(1), PP: 1-9.
  12. Navran, S., 2007. Rotary bioreactor for recombinant protein production, Cell Technology for Cell Products Springer, PP: 567-569.
  13. Nelson, D.L., Lehninger, A.L., and Cox, M.M., 2008. Lehninger principles of biochemistry: Macmillan.
  14. Nickerson, C.A., Ott, C.M., Wilson, J.W., Ramamurthy, R., and Pierson, D.L., 2004. Microbial responses to microgravity and other low-shear environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68(2), PP: 345-361.
  15. Nurjayadi, M., Afrizal, R., Hardianto, D., and Agustini, K., 2019. Variations of binding, washing, and concentration of imidazole on purification of recombinant Fim-C Protein Salmonella typhi with Ni-NTA Resin, In Journal of Physics: Conference Series(Vol. 1402, No. 5, 055055 p). IOP Publishing.
  16. Oliveira, A.F., Cardoso, S.A., Almeida, F.d., de Oliveira, L.L., Pitondo-Silva, A., Soares, S. G., and Hanna, E.S., 2012. Oral immunization with attenuated Salmonella vaccine expressing Escherichia coli O157: H7 intimin gamma triggers both systemic and mucosal humoral immunity in mice. Microbiol Immunol, 56(8), PP: 513-522.
  17. Qi, F., Kaleem, I., Lv, B., Guo, X., and Li, C., 2011. Enhancement of recombinant β‐D‐glucuronidase production under low‐shear modeled microgravity in Pichia pastoris, Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 86(4), PP: 505-511.
  18. Rad, H.S., Mousavi, S.L., Rasooli, I., Amani, J., and Nadooshan, M.R.J., 2013. EspA-Intimin chimeric protein, a candidate vaccine against Escherichia coli O157: H7. Iranian journal of microbiology, 5(3), 244 p.
  19. Rahjerdi, A.K., Jafari, M., Motamedi, M.J., Amani, J., and Salmanian, A.H., 2019. Immunogenic Evaluation of Bivalent Vaccine Candidate against Enterohemorrhagic and Enterotoxigenic Escherichia coli. Iranian Journal of Immunology, 16(3), PP: 200-211.
  20. Rea, G., Cristofaro, F., Pani, G., Pascucci, B., Ghuge, S.A., Corsetto, P.A., Imbriani, M., Visai, L., and Rizzo, A.M., 2016. Microgravity-driven remodeling of the proteome reveals insights into molecular mechanisms and signal networks involved in response to the space flight environment. Journal of proteomics, 137, PP: 3-18.
  21. Rojas-Lopez, M., Monterio, R., Pizza, M., Desvaux, M., and Rosini, R., 2018. Intestinal pathogenic Escherichia coli: Insights for vaccine development, Frontiers in microbiology, 9, 440 p.
  22. Saarinen, M.A., and Murhammer, D.W., 2000. Culture in the rotating-wall vessel affects recombinant protein production capability of two insect cell lines in different manners, In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 36(6), PP: 362-366.
  23. Saeedi, P., Yazdanparast, M., Behzadi, E., Salmanian, A.H., Mousavi, S.L., Nazarian, , and Amani, J., 2017. A review on strategies for decreasing E. coli O157: H7 risk in animals. Microbial pathogenesis, 103, PP: 186-195.
  24. Sahshorpour, M., Amani, J., Jafari, M., and Salmanian, A.H., 2014. Expression of recombinant chimeric EspA-intimin protein in Nicotiana tobaccum for oral vaccine development. Journal of Plant Genetic Researches, 1(1), PP: 77-94.
  25. Schlegel, S., Rujas, E., Ytterberg, A.J., Zubarev, R.A., Luirink, J., and De Gier, J.W., 2013. Optimizing heterologous protein production in the periplasm of coli by regulating gene expression levels. Microbial cell factories, 12(1), PP: 1-12.
  26. Senatore, G., Mastroleo, F., Leys, N., and Mauriello, G., 2018. Effect of microgravity & space radiation on microbes. Future microbiology, 13(07), PP: 831-847.
  27. Thuthikkadu Indhuprakash, S., Karthikeyan, M., Gopal, G., Ambi, S.V., Sekaran, S., Palaniappan, B., and Diraviyam, T., 2021. Antibody therapy against antibiotic-resistant diarrheagenic Escherichia coli: a systematic review. Immunotherapy, 13(15), PP: 1305-1320.
  28. United Nations, 2013. Teacher’s Guide to Plant Experiments in Microgravity, Human Space Technology Initiative.
  29. Warr, A.R., Kuehl, C.J., and Waldor, M.K., 2021. Shiga toxin remodels the intestinal epithelial transcriptional response to Enterohemorrhagic Escherichia coli. PLoS Pathogens, 17(2), e1009290 p.
  30. Xiang, L., Qi, F., Dai, D., Li, C., and Jiang, Y., 2010. Simulated microgravity affects growth of Escherichia coli and recombinant β-D-glucuronidase production. Applied biochemistry and biotechnology, 162(3), PP: 654-661.

 

پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
دوره 36، شماره 4
زمستان 1402
صفحه 372-388

  • تاریخ دریافت 15 تیر 1401
  • تاریخ بازنگری 31 مرداد 1401
  • تاریخ پذیرش 06 مهر 1401