ردیابی و تعیین خصوصیات بیولوژیکی و فیلوژنتیکی ویروس Y سیب زمینی (PVY) جدایه استان لرستان

فاطمه رحیمی¹، سید حسین وفائی^1* و سمیرا پاکباز²

¹ ایران، خرم آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد خرم آباد، گروه بیماری شناسی گیاهی

² ایران، خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی

تاریخ دریافت: 08/02/1400          تاریخ پذیرش: 17/07/1400

چکیده

بیماری‌های ویروسی از جمله عوامل محدودکننده تولید سیب‌زمینی در جهان هستند. ویروس Y سیب‌زمینی (PVY) گونه جنس Potyvirus از خانواده Potyviridae یکی از مهم‌ترین بیماری‌های محصول سیب‌زمینی می‌باشد. به منظور ردیابی ویروس، تعداد 135 نمونه از گیاهانی که علایم موزائیک، کوتولگی، موجی بودن حاشیه برگ، لکه‌های کلروتیک و تغییر شکل برگ را نشان می‌دادند، از مزارع سیب‌زمینی استان لرستان جمع‌آوری گردید. عصاره گیاهان مشکوک در مرحله چهار برگی روی گیاهان محکNicotiana glutinosa ، N. occidentalis وN. debneyi  مایه‌زنی گردید. پس از حدود ده روز علایمی نظیر زردی موضعی، رگبرگ­روشنی و موزائیک روی N. occidentalis و پیسه­ای شدن و نکروز موضعی روی N. glutinosa مشاهده شد. از گیاهان محک دارای علایم، استخراجRNA  کل صورت گرفت و با استفاده از آزمون RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی مربوط به بخشی از ناحیه ژنومی ژن CP و NIb ویروسPVY ، باندی در محدوده bp 1115 تکثیر شد و آلودگی نمونه‌ها به ویروس PVY اثبات شد. بررسی‌های فیلوژنتیکی نشان داد که جدایه ایرانی مورد مطالعه دارای 48/99-74/98 درصد همسانی ژنتیکی با دیگر توالی‌های ثبت شده در این ناحیه درNCBI  بود. نتایج تجزیه و تحلیل­های ژنتیکی نشان داد که جدایه­های ویروس PVY در دو گروه قرار گرفتند و جدایه ردیابی شده از استان لرستان در گروه II و در کنار جدایه‌های مربوط به کشور آلمان که متعلق به نژاد Wilga بودند، قرار گرفت. توالی نوکلئوتیدی قطعه مورد نظر درNCBI  به شماره دسترسی MT655949 ثبت گردید. این اولین گزارش از آلودگی مزارع سیب‌زمینی استان لرستان به ویروسPVY  به کمک آزمایشات مولکولی می‌باشد.

واژه های کلیدی: پوشش پروتئینی، توالی­یابی، خرم­آباد، سیب­زمینی،Potyvirus .

* نویسنده مسئول، تلفن: 09166634427، پست الکترونیکی: vafaei_h1353@yahoo.com

مقدمه

بیماری‌های ویروسی از جمله عوامل محدودکننده تولید سیب‌زمینی در جهان می‌باشند. شیوع ویروس Y سیب­زمینی Potato virus Y, (PVY) در سراسر جهان برای تولید کارآمد سیب­زمینی یک چالش مداوم است. تشخیص دقیق ویروس­هایی مانند PVY به دلیل تنوع گسترده بیولوژیکی و ژنتیکی نژادهای آن که طیف وسیعی از علایم و بیماری­ها را در ارقام مختلف سیب­زمینی و گونه­های خانواده بادنجانیان ایجاد می­کند، ذاتاً چالش برانگیز است (11). خانوادهPotyviridae  از مهم­ترین ویروس­های بیماری­زای گیاهی و یکی از بزرگ­ترین آن­ها است .در میان اعضاء این خانواده، ویروس PVY به­عنوان گونه تیپ در جنس Potyvirus ، یکی از مهم­ترین عوامل بیماری­زای گیاهی در جهان می­باشد که روی کیفیت و بازده محصولات خانواده بادنجانیان مانند توتون، سیب­زمینی، گوجه­فرنگی و فلفل مؤثر است (15). در برخی موارد، با توجه به واریته ویروس، رقم سیب­زمینی و شرایط آب و هوایی منطقه، این ویروس می­تواند بین 70-40 درصد خسارت وارد نماید (7). این موضوع در مزارع سیب­زمینی در ایران نیز بررسی شده وPVY  به عنوان مهم­ترین عامل کاهش بازدهی در سیب­زمینی شناخته شده است (6). حداقل 65 گونه شته (جنس­هایMacrosiphum  و Myzus) به صورت ناپایا قادر به انتقال PVY هستند که در این میان شته Myzus persicae کاراترین آنها می­باشد. همچنین انتقال این ویروس توسط غده­های سیب­زمینی و شیره گیاهی امکانپذیر است. غده­های آلوده که به عنوان اندام رویشی برای کاشت استفاده می­شوند به عنوان منبع اولیه آلودگی به شمار می­آیند (8 و 20). ویروس PVY با ژنوم RNA تک­رشته­ای مثبت و خطی (ssRNA) و اندازه حدود 10 کیلوباز تنها یک چارچوب خوانش باز (ORF) دارد و یک پلی پروتئین کد می­کند که توسط سه پروتئاز ویروسی (P1،Pro-HC  وNIa ) به ده پروتئین با وظایف مختلف (P1،  HC-Pro، P3،6K1، CI، 6K2، NIa،VPG ،  Nib وCP) شکسته می­شود (12). ژنوم PVY در انتهای '5 خود دارای ساختمان VPg و یک دنباله پلی­آدنین در انتهای '3 می­باشد(9). ویروس PVY در طبیعت دارای چند واریته مشخص می­باشد، به­طوری که پنج واریته PVY^O، PVY^C ،PVY^NTN  ، PVY^N و PVY^Wilga تاکنون در دنیا گزارش شده است (10). علایم این ویروس برحسب واریته ویروس و رقم سیب­زمینی کاملاً متفاوت می­باشد. به طوری که علایم ضعیف تا نکروز برگی شدید و مرگ بوته­های آلوده ممکن است دیده شود (16). واریته PVY^O باعث ایجاد علایم موزاییک خفیف تا شدید و ریزش برگ­ها در گیاه سیب­زمینی و علایم موزاییک و ابلقی در برگ­های توتون می شود. واریته PVY^N باعث ایجاد علایم نکروز رگبرگ در توتون، ابلقی خفیف و گاهی نکروز برگ­ها در گیاه سیب­زمینی می شود. واریته PVY^C باعث ایجاد علایم موزاییک و نکروز در برخی ارقام سیب­زمینی می­شود (18، 22 و 23). نوترکیبی­های زیادی بین دو گروهO  و N در نتیجه حضور همزمان این دو در یک گیاه ظهور کرده است. دو واریته مهم PVY^NTN وPVY^N-W از نوترکیبی بین دو واریته O و N بوجود آمده­اند (19). Visser (2012) نشان داد که موقعیت و طول قطعه­های نوترکیب و تنوع در محل ایجاد نوترکیبی باعث ایجاد واریته­های مختلف از جمله زیرگروه­هایN: O ، Wi-N وNTN  شده است (24). در طول دهه گذشته، روش­های مبتنی بر PCR به دلیل حساسیت، اختصاصیت و ظرفیت آن­ها برای انجام آزمایش­هایی با بازدهی بالا، به طور معمول برای تشخیص PVY مورد استفاده قرار گرفته­اند و با استفاده از روش­های مولکولی بخش­های مختلف ژنوم این ویروس ردیابی و تعیین ترادف شده است (11). در حال حاضر تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنوم کامل از جدایه­های مختلف این ویروس در دسترس می­باشد (14 و 17). در ایران نیز با استفاده از روش­های مولکولی این ویروس ردیابی و برخی بخش­های ژنومی آن تعیین ترادف و در اختیار بانک اطلاعات ژن قرار گرفته است (13). این مطالعه به منظور ردیابی مولکولی ویروس PVY در مزارع سیب­زمینی استان لرستان اجرا گردید.

مواد و روشها

نمونه­برداری از مزارع سیب­زمینی: به منظور ردیابی ویروس PVY طی بهار و تابستان سال 1398 از مزارع سیب‌زمینی استان لرستان شامل شهرستان‌های خرم­آباد (مرکز استان)، الشتر، دورود و بروجرد (شمال استان)، 135 نمونه مشکوک به آلودگی ویروسی جمع­آوری شد. شهرستان­های نام­برده به دلیل آب و هوای معتدل، مراکز کشت سیب­زمینی در استان می­باشند. نمونه­برداری در مزارع از برگ­های انتهایی و جوان بوته‌های موردنظر به­ویژه از گیاهان دارای علایم نکروز، کوتولگی، موزائیک، موجی شدن حاشیه برگ، لکه‌های کلروتیک و تغییر شکل برگ جمع­آوری شدند. نمونه‌ها به تفکیک در داخل کیسه پلاستیکی قرار گرفتند و در کنار یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. به منظور نگهداری طولانی مدت، بخشی از نمونه‌ها پس از انجماد سریع در ازت مایع، به فریزر 70- درجه سانتی­گراد منتقل شدند.

بررسی خصوصیات بیولوژیکی ویروس در گلخانه و استخراج RNA کل: باتوجه به ماهیت ویروس Y سیب‌زمینی (PVY) که دارای قابلیت انتقال مکانیکی از طریق عصاره شیره گیاهی می‌باشد، به منظور بررسی علایم بیماری بر روی گیاهان محک و نیز برای حفظ ویروس در گیاهان تکثیری، بذر گیاهان محک اختصاصی ویروس PVY، شامل سه رقم توتون occidentalis Nicotiana ، N.debneyi و N.glutinosa (تهیه شده از گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد) در گلخانه کشت و بعد از رسیدن به سن دو تا چهار برگی، مایه­‌زنی عصاره گیاه سیب­زمینی مشکوک به آلودگی با استفاده از بافر فسفات پتاسیم (K₂HPO₄ و KH₂PO₄) 1/0 مولار با 7pH: روی همه گیاهان محک انجام شد (3). مایه­زنی­ها در دو تکرار انجام پذیرفت. گیاهان تلقیح شده هر روز مورد بررسی قرار گرفته و علایم ایجاد شده از حدود یک هفته پس از مایه­زنی ثبت شد. استخراج RNA از گیاهان محک دارای علایم ویروسی با استفاده از کیت غیرستونی Total RNA Isolation (شرکت دنازیست آسیا) طبق دستورالعمل انجام شد. بدین منظور، میزان 50 میلی­گرم از بافت گیاهی خرد شده با ازت مایع به میکروتیوب 5/1 میلی­لیتری انتقال داده شد و یک میلی­لیتر بافر  G1به آن اضافه شد. در ادامه، موادی نظیر کلروفرم، ایزوپروپانول، بافر G2 و اتانول 70%، طی مراحل مختلف استخراج به میکروتیوب افزوده شدند و در مرحله نهایی به رسوب تشکیل شده، آب فاقد ریبونوکلئاز اضافه شد و سپس میکروتیوب در فریزر 70- نگهداری شد.

سنتز رشته مکمل cDNA و واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR): فرایند سنتز cDNA با استفاده از آنزیم نسخه­برداری معکوس و طبق دستورالعمل کیت تجاری شرکت سیناکلون انجام شد. برای این منظور میزان 5 میکروگرم از RNA کل استخراج شده به همراه 10 پیکومولار آغازگر برگشت در حجم 10 میکرولیتر مخلوط واکنش برای مدت پنج دقیقه در دمای 65 درجه سانتی­گراد حرارت داده شد و سپس بلافاصله به مدت دو دقیقه روی یخ قرارداده شد. سپس به میزان دو میکرولیتر dNTP (mM10)، چهار میکرولیتر 10X Buffer M-MuLV، 20 واحد آنزیم Ribonuclease inhibitor و 200 واحد آنزیم نسخه­بردار معکوس  M-MuLVبه مخلوط واکنش در حجم نهایی 20 میکرولیتر اضافه و برای مدت یک ساعت در دمای 42 درجه سانتی­گراد قرار داد شد. مخلوط واکنش برای توقف فعالیت آنزیم برای مدت پنج دقیقه در 70 درجه سانتی­گراد قرار داده شد.

جهت تکثیر cDNA، واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) با استفاده از دو میکرولیتر ازcDNA  (50 نانوگرم) و در حضور آغازگرهای اختصاصی رفت و برگشت مربوط به بخشی از ژن پروتئین پوششی (CP) و ژن NIb (PVYF: CAACTCCAGATGGAACAATTG3′′5 و 5′CCATTCATCACAGTTGGC3′ PVYR:) انجام پذیرفت (1). جهت انجام این واکنش از کیت 2x PCRBio Taq Mix Red شرکت systems Bio PCR انگلیس استفاده شد. محلول پایه واکنش شامل همه مواد مورد نیاز برای تکثیر به جز cDNA و آغازگرهای اختصاصی بود. واکنش در حجم نهایی 25 میکرولیتر و غلظت 10 پیکومول از هر آغازگر در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. برنامه PCR متشکل از یک چرخه­ 95 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه به منظور واسرشت­سازی اولیه و 35 چرخه شامل واسرشت سازی در 95 درجه سانتی­گراد به مدت 35 ثانیه، اتصال آغازگرها به رشته الگو به مدت 40 ثانیه در دمای 57 درجه سانتی گراد و گسترش رشته جدید در 72 درجه به مدت 45 ثانیه و به علاوه یک چرخه در دمای 72 درجه به مدت 10 دقیقه برای گسترش نهایی بود. محصولات تکثیر شده در واکنش RT-PCR، برای بررسی اندازه و کیفیت در ژل آگارز یک درصد و بافر TAE با ولتاژ 100 به مدت 45 دقیقه الکتروفورز شدند و از نشانگر یک kb به عنوان استاندارد جهت تعیین اندازه قطعات تکثیر شده استفاده شد.

تعیین توالی نوکلئوتیدی و ترسیم درخت فیلوژنی: از بین قطعات تکثیرشده ویروس PVY جدایه­های استان لرستان، یک جدایه انتخاب و جهت خالص­سازی و نیز تعیین ترادف نوکلئوتیدی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. ترادف توالی­یابی شده قطعه مورد مطالعه در آغاز با برنامه version 2.13 Chromas, بازبینی شد و جهت تأیید به کمک ابزارBlastn  با دیگر ترادف‌های ثبت شده از این ناحیه ژنومی در بانک ژن مورد مقایسه قرار گرفت. پس از تأیید صحت ویروس، به منظور مطالعه ناحیه ژنومی شامل بخشی از ژن CP و NIb ویروس PVY و تعیین جایگاه این جدایه ایرانی در مقایسه با سایر جدایه‌های ثبت شده در بانک ژن، درخت فیلوژنی با استفاده از نرم­افزار MEGA7 و با دو روشNeighbor-Joining (NJ)  و Maximum-Likelihood (ML) و بر اساس 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap رسم شد. به این منظور از توالی­های ثبت شده مربوط به ناحیه ژنومی مورد مطالعه در بانک ژن که مربوط به میزبان­های مختلف و مناطق جغرافیایی متفاوت بودند، جهت هم­ردیف­سازی استفاده شد. هم­ردیف­سازی چندگانه توالی­های ژنومی میان جدایه ایرانی با سایر جدایه­های ثبت شده در بانک ژن با استفاده از ابزار ClustalW در نرم­افزار MEGA7 صورت گرفت. توالی­های نوکلئوتیدی با استفاده از نرم­افزار (Open Reading Frame Finder) ORF finder به توالی­های آمینواسیدی ترجمه شدند. همچنین جهت ثبت توالی موردنظر در پایگاه اطلاعاتیNCBI  و اختصاص شماره دسترسی از ابزار BankIt کمک گرفته شد.

نتایج و بحث

نتایج آزمایشات گلخانه­ای: از بین 135 نمونه گیاهی جمع­آوری شده از مزارع سیب­زمینی استان لرستان که علایم مشکوک به ویروس PVY را نشان می دادند (شکل 1)، بیش از 100 نمونه در مطالعات گلخانه­ای مثبت ارزیابی شدند (جدول 1).

شکل 1- علایم مشکوک به ویروس  PVYدر نمونه­های جمع­آوری شده از مزارع سیب‌زمینی استان لرستان. الف) موزائیک و موجی شدن حاشیه بر، ب) موزائیک، زردی و تغییرشکل در برگ­های جوان و کوتولگی.

جدول 1- تعداد و محل نمونه‌های سیب زمینی و میزان آلودگی آنها به PVY در استان لرستان در بهار و تابستان 1398

حدود یک هفته پس از مایه­زنی مکانیکی ویروس PVY روی گیاهان محک N.occidentalis علایم موزائیک و رگبرگ­روشنی ابتدا در برگ­های مایه­زنی شده و سپس به طور سیستمیک در کل گیاه ظاهر شد. همچنین با گذشت زمان لکه­های نکروتیک به صورت نقاط کوچک روی برگ­ها پدیدار شد. علایم روی گیاه N.glutinosa بعد از حدود دو هفته به ­صورت موزائیک، لکه‌های نکروتیک و رگبرگ­روشنی مشاهده شد. مایه­زنی مکانیکی روی گیاه N.debneyi حتی پس از حدود یک ماه هیچ­گونه علایمی ایجاد نکرد (شکل 2).

شکل 2- علایم ایجاد شده روی گیاهان محک در گلخانه پس از مایه­زنی مکانیکی با ویروس PVY. الف) علایم سیستمیک رگبرگ روشنی و لکه­های نکروتیک روی گیاه N.occidentalis سه هفته بعد از مایه­زنی. ب) علایم سیستمیک موزائیک و رگبرگ روشنی روی گیاه N.occidentalis دو هفته بعد از مایه­زنی. ج) علایم موزائیک، نکروز، رگبرگ روشنی و تغییرشکل برگ روی گیاه N.glutinosa دو هفته بعد از مایه‌زنی. د) عدم ظهور علایم روی گیاه N. debneyi دو هفته بعد از مایه­زنی.

علایم مزرعه­ای و نتایج آزمایشات گلخانه­ای در این پژوهش با نتایج به دست آمده از آزمایشات دیگر پژوهشگران روی این ویروس مطابقت دارد. قاسم زاده و همکاران (1391) نمونه‌هایی با علایم موزائیک، ابلقی، موجی شدن حاشیه برگ‌ها، کوتولگی، نکروز و مرگ گیاه را از مزارع سیب­زمینی استان اردبیل گزارش نمودند. علایم ویروس PVY بر روی گیاه محک توتون بیشتر به­صورت موزائیک و روشن شدن برگ‌ها بود (5). در تحقیق گیلانی و همکاران (1395) در مزارع سیب­زمینی علایم اولیه شامل نکروز، پیسک، زردی برگچه‌ها، ریزش برگ‌ها و در برخی موارد مرگ زودرس بوته‌های آلوده بود که به دلیل فاکتورهایی از قبیل واریته ویروس، رقم سیب­زمینی، زمان آلودگی و شرایط محیطی بسیار متفاوت بود. نتایج حاصل از تلقیح ویروس روی گیاهان محک توتون نیز علایم کلروز و نکروز به­صورت توأم بود (6).

نتایج نسخه برداری معکوس، واکنش زنجیره ای پلیمراز و تعیین ترادف جدایه های ویروس: در واکنش RT-PCR، آغازگرهای اختصاصی قطعه­ای به طول 1115 جفت باز از ناحیه ژنومی بخشی از ژن CP و NIb ویروس PVY را در نمونه­های دارای علایم تکثیر نمودند(شکل 3).

پس از توالی­یابی قطعه تکثیر شده، هم­ردیف­سازی چندگانه (Multiple sequence alignment) توالی نوکلئوتیدی تعیین شده با استفاده از ابزار Blastn نشان داد که جدایه مورد بررسی بر اساس ترادف نوکلئوتیدی ناحیه مورد مطالعه کاملاً متعلق به ویروس PVY بوده و از قابلیت بررسی فیلوژنتیکی مناسبی با جدایه‌های ثبت شده در بانک ژن برخوردار می‌باشد. توالی نوکلئوتیدی قطعه موردنظر به شماره دسترسی MT655949 و با نام جدایهLorestan  در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت گردید. جدایه مورد مطالعه به ترتیب دارای 48/99-74/98 و 44/95-89/88 درصد تشابه نوکلئوتیدی و آمینواسیدی با دیگر توالی‌های ثبت شده در این ناحیه در NCBI بود. نتایج حاصل از مقایسه جدایه لرستان با سایر جدایه­های موجود در بانک ژن، بالاترین درصد تشابه (48/99) در سطح نوکلئوتیدی بین جدایه لرستان و جدایه­های ثبت شده از کشور آلمان (AM113988 وKY848023) را نشان داد. جهت تعیین روابط فیلوژنتیکی و مشخص نمودن منشاء تکاملی، درخت فیلوژنتیکی جدایه لرستان به همراه هفده جدایه دیگر از ویروس PVY موجود در بانک ژن از سایر نقاط دنیا (جدول 2)، بر اساس تطابق ترادف نوکلئوتیدی با دو روش Joining-Neighbor و Maximum likelihood با استفاده از نرم­افزار MEGA7  و بر اساس 1000 تکرار رسم گردید.

شکل3- الف) الکتروفورز محصول RT-PCR در ژل آگارز 1% رنگ آمیزی شده با Safe Stain، از سمت راست، چاهک اول: مارکر 1kb، چاهک یک تا 7 محصول PCR نمونه های آلوده به PVY سیب­زمینی و تکثیر باند در محدوده bp 1115 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و چاهک آخر: شاهد منفی. ب) مارکر 1kb.

جدول 2- ویژگی جدایه های PVY موجود در بانک اطلاعاتی ژن استفاده شده در تحلیل تبارزائی

نتایج نشان­دهنده یکسان بودن توپولوژی دندروگرام رسم شده در هر دو روش NJ و ML بود. به همین دلیل تنها درخت فیلوژنتیکی رسم شده به روش  NJنمایش داده شد که بر اساس آن جدایه­های مورد بررسی PVY در دو گروه اصلی (II  وI) قرار می­گیرند. گروه I با چهار زیرگروه شامل جدایه­هایی از کشورهای کانادا، آمریکا، برزیل، کنیا، مصر، چین، سوریه و چندین کشور از اتحادیه اروپا نظیر انگلیس، سوئیس و لهستان می­باشد. این گروه از نظر جغرافیایی یک گروه نامتجانس را تشکیل می­دهد. همچنین جدایه­های واقع در گروه I از میزبان­های متفاوت مانند سیب­زمینی، گوجه­فرنگی و یا توتون جدا شده بودند. جدایه ردیابی شده از استان لرستان جدا شده از سیب­زمینی در یک گروه مجزا (گروه II) و در کنار جدایه‌های مربوط به کشور آلمان (AM113988 و KY848023) جدا شده از میزبان سیب­زمینی قرار گرفت که بیانگر رابطه ژنتیکی بالای این جدایه­ها با یکدیگر می­باشد (شکل 4).

شکل 4- درخت فیلوژنتیکی رسم شده بر پایه مقایسه توالی بخشی از ناحیه ژن CP و NIb ویروس PVY به کمک نرم­افزار Mega7 با روش Joining-Neighbor و بر اساس 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap.

با توجه به اینکه گروه I در برگیرنده جدایه­هایی از سه میزبان سیب­زمینی، گوجه­فرنگی و توتون می­باشد، جدایی میزبانی با گروه­بندی فیلوژنتیکی ایجاد شده همخوانی ندارد. همچنین هم­گروه شدن برخی از جدایه­ها از مناطق مختلف جهان با یکدیگر که انطباقی با قرابت جغرافیایی ندارند، نشان می­دهد که انتشار گسترده و جهانی PVY نمی­تواند تنها به وسیله ناقلین شته­ای صورت گیرد و احتمال نقش صادرات و واردات این محصول در جهان از طریق بذر و غده تقویت می­شود .در تحقیقی که توسط قاسم زاده و همکاران (1391) صورت گرفت از آغازگرهای عمومی جنس Potyvirus برای ردیابی استفاده شد و بخشی از منطقه ژنومی NIb به اندازه 350 نوکلئوتید تعیین ترادف شد. نتایج بررسی آنها نشان داد که جدایه‌های استان اردبیل در بررسی تبارزایی در کنار جدایه­‌هایی از آمریکا، کانادا، انگلیس، فرانسه و لهستان قرار گرفتند. در بیشتر گزارشات قبلی که بر اساس دیگر نواحی ژنومی ویروس PVY بود، جدایه‌های ایرانی با جدایه­های اروپایی هم­گروه شدند که این شباهت را احتمالاً ناشی از انتقال بذر به داخل ایران از این مناطق می­دانند (3). بغدادی و همکاران (1394) با استفاده از آزمون RT-PCR و ترادف نوکلئوتیدی ژن CP و NIb، نژادهای ویروس PVY را در مزارع سیب‌زمینی استان گلستان ردیابی کردند. مقایسه نتایج ردیابی مولکولی نشان داد که بین جدایه­های ایرانی و خارجی تفاوت ژنتیکی زیادی وجود داشت و ترسیم درخت فیلوژنی، جدایه­های ایرانی را در کنار جدایه­های برزیل قرار داد (1).

حصول نتایج متفاوت در درخت­های تبارزایی مربوط به جدایه های ایرانی ویروس Y سیب­زمینی (PVY) در این مطالعات نشان­دهنده تفاوت جدایه‌ها در مناطق مختلف ایران است و احتمال افزایش وقوع نوترکیبی ژنتیکی در بخش‌های مختلف ایران وجود دارد. نوترکیبی ژنتیکی نقش مهمی در تکامل ویروس­ها دارد. احتمال دیگر برای تفاوت ژنتیکی جدایه‌های ایرانی می­تواند ناشی از فشار انتخابی ارقام سیب­زمینی کاشته شده در ایران باشد که به دلیل تفاوت این ارقام در کیفیت واکنش به ویروس، می­توانند باعث ایجاد فشار انتخابی روی جمعیت ویروس، حذف برخی جدایه­ها و تکامل و بقاء جدایه­های دیگری شود (21). در مطالعه حاضر نیز جدایه­های گزارش شده از سایر نقاط ایران به دلیل تفاوت­های ژنتیکی و نیز عدم مطابقت کامل توالی مبتنی بر ناحیه ژنومی مورد مطالعه در جدایه لرستان با توالی دیگر جدایه­های ایرانی، در ترسیم درخت فیلوژنتیکی و تجزیه و تحلیل همسانی و میزان شباهت استفاده نشدند.

بر اساس نتایج به­دست آمده از آغازگرهای اختصاصی و بررسی نواحی ژنومی توالی­یابی شده، جدایه مورد بررسی متعلق به خانواده Potyviridae، جنسPVY  و به احتمال زیاد نژاد Wilga می­باشد. برای اطمینان بیشتر و قاطعیت در مورد نژاد ویروس باید نواحی بیشتری از ژنوم جدایه لرستان توالی­یابی شود. در پژوهشی که در سال 1396 روی جدایه­های استان خوزستان مربوط به ویروس PVY انجام شد، مشخص شد که جدایه­های PVY ردیابی شده از کشتزارهای شلغم از نظر توالی ناحیه  CPهمسان جدایه­های کشورهای چین و سوریه متعلق به نژاد NTN و یا  Wilgaمی­باشند (3). این اولین گزارش از ردیابی ویروس PVY در مزارع سیب­زمینی استان لرستان بر اساس آزمایشات مولکولی و تعیین توالی نوکلئوتیدی مربوط به جدایه گزارش شده از این استان می­باشد. ویروسهای گیاهی از عوامل محدود کننده در کشاورزی هستند و استفاده از ارقام مقاوم استراتژی مناسبی جهت مدیریت این عوامل می باشد. مقاومت وابسته به بیمارگر یکی از روشهای ایجاد ارقام مقاوم است که از بخشی از مواد ژنتیکی ویروس از جمله ژن CP و ژنهای دیگر استفاده می­شود (2 و 4). جهت جلوگیری از خسارت ویروس، ردیابی ویروس از روی سایر میزبان­های اقتصادی و علف­های هرز به عنوان منبع زمستان­گذران و ردیابی و تعیین نژادهای ویروس پیشنهاد می­شود.