نویسندگان

1 عضو هیات علمی دانشگاه پیام نور

2 مدرس گروه کشاورزی دانشگاه پیام نور

3 عضو هیات علمی/ دانشگاه پیام نور

4 عضو هیات عملی گروه زیست شناسی دانشگاه پیام نور

چکیده

مریم نخودی (L. Teucrium polium) از قدیمی‌ترین گیاهان دارویی می‌باشد که در طب سنتی کاربرد فراوان دارد. جهت تعیین میزان تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپ‌های مختلف مریم نخودی 17 ژنوتیپ‌ از این گونه با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت که 11 آغازگر دارای باندهای قابل امتیاز‌دهی بودند. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 48 باند چند شکل تولید کنند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 17 ژنوتیپ برابر 82/2 بود. آغازگرهای SC20، SC21 و SC59 با 6 باند بیشترین تعداد و آغازگر SC15 با 2 باند کمترین تعداد باند را تکثیر نمود. میانگین درصد چند شکلی (PPB%)، محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI)، شاخص نسبت چندگانه موثر (EMR) و شاخص تفکیک (RP) در بین آغازگرهای مورد بررسی به ترتیب برابر 485/۹۸، 361/۰، 525/۱ و 197/۴ بود. در حالت کلی و بر اساس تمام شاخص‌ها، مناسب‌ترین آغازگر‌ها برای بررسی گونه مریم نخودی، آغازگرهای SC59 و SC11 تعیین شد. بیشترین تشابه را ژنوتیپ‌های (گیلان غرب2) با (ثلاث2) (732/0) و کمترین تشابه را ژنوتیپ (نفت شهر) با ژنوتیپ‌های (گیلان غرب1) و (گیلان غرب2) (10/0) داشت. گروه‌بندی حاصل از تجزیه کلاستر نشان داد که ژنوتیپ‌ها در 2 گروه قرار گرفته که نتایج حاصل از گروه‌بندی با استفاده از تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) و تجزیه به مؤلفه‌های اصلی (PCoA) تایید گردید.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Genetic variation study of Teucrium polium genotypes in the west of Iran using SCoT molecular markers

نویسندگان [English]

  • Hooman Shirvani 2
  • MOSTAFA AMJADIAN 3
  • abdolmehdi noorian 4

2 2- Department of Agriculture, Payame Noor University, Iran

3 2- Department of Agriculture, Payame Noor University, Iran

4 Department of Biology, Payame Noor University, I.R. Iran

چکیده [English]

Teucrium polium L. is one of the well-known medicinal and aromatic plants. In this study, we have used the SCoT marker to determine genetic variation among 17 genotypes of Teucrium polium collected from Kermanshah province, Iran. All of the SCoT primers showed 48 polymorphic bands. The primers of Sc20, Sc59 and Sc21 showed the highest number of band (6 bands) and Sc15 showed the lowest number of bands (2 bands). The mean polymorphic information content (PIC=0.361), marker index (MI= 1.525), Effective multiplex ratio (EMR= 4.197), polymorphism percentage (98.485%) and Resolving Power (RP=2.837) indices were calculated for all primers. The greatest similarity was between Gilan-gharb2 and Salas2 stations with 0.732 values. The lowest genetic similarity was between Naft-Shahr with Gilan-gharb1 and Gilan-gharb2 stations with 0.1. The cluster analysis group showed that the genotypes were classified into two groups, and the results of the clustering were confirmed by the use of molecular variance analysis (AMOVA) and principal components analysis (PCoA).

کلیدواژه‌ها [English]

  • Teucrium polium
  • Genetic variation
  • molecular marker
  • SCoT

بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گونه مریم نخودی (L.Teucrium polium) در غرب ایران با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT

محسن فرشادفر1*، هومن شیروانی1، مصطفی امجدیان1 و عبدالمهدی نوریان2

1 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

2 ایران، کرمانشاه، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 26/7/1396            تاریخ پذیرش: 19/3/1397

چکیده

مریم نخودی (L. Teucrium polium) از قدیمی­ترین گیاهان دارویی می­باشد که در طب سنتی کاربرد فراوان دارد. جهت تعیین میزان تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپهای مختلف مریم نخودی 17 ژنوتیپ از این گونه با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت که 11 آغازگر دارای باندهای قابل امتیاز­دهی بودند. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 48 باند چند شکل تولید کنند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 17 ژنوتیپ برابر 82/2 بود. آغازگرهای SC20، SC21 و SC59  با 6 باند بیشترین تعداد و آغازگر SC15 با 2 باند کمترین تعداد باند را تکثیر نمود. میانگین درصد چند شکلی (PPB%)، محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI)، شاخص نسبت چندگانه مؤثر (EMR) و شاخص تفکیک (RP) در بین آغازگرهای مورد بررسی به ترتیب برابر 485/۹۸،  361/۰، 525/۱ و 197/۴  بود. در حالت کلی و بر اساس تمام شاخصها، مناسب­ترین آغازگر­ها برای بررسی گونه مریم نخودی، آغازگرهای SC59 و SC11 تعیین شد. بیشترین تشابه را ژنوتیپهای (گیلان غرب2) با (ثلاث2) (732/0) و کمترین تشابه را ژنوتیپ (نفت شهر) با ژنوتیپهای (گیلان غرب1) و (گیلان غرب2) (10/0) داشت. گروه­بندی حاصل از تجزیه کلاستر نشان داد که ژنوتیپها در 2 گروه قرار گرفته که نتایج حاصل از گروه­بندی با استفاده از تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) و تجزیه به مؤلفه­های اصلی (PCoA) تایید گردید.

واژه های کلیدی: مریم نخودی، تنوع ژنتیکی، نشانگرمولکولی، SCoT

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183312331 ، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

براساس برآوردهای سازمان بهداشت جهانی، بیش از 80 درصد از جمعیت جهان در کشورهای در حال توسعه سلامتی خود را به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم، مدیون گیاهان دارویی هستند و در کشورهای پیشرفته نیز استفاده از ترکیبات شیمیایی گیاهان دارویی رو به افزایش است (4). به دلیل عوارض فراوان ناشی از استفاده از داروهای شیمیایی مصنوعی، استقبال چشمگیری از داروهای طبیعی با منشاء گیاهی شده است (10). جنس مریم نخودی (Teucrium L.) متعلق به تیره نعناع، شامل بیش از 340 گونه است و در کشور ایران 12 گونه از این جنس رویش دارد که گونه­های مختلف آندر طب سنتی به عنوان گیاه دارویی استفاده می­شوند. در استان کرمانشاه چهار گونه
(T. polium L., T.oriental L., T.oliverianum Ging. ex Benth, T.parvifolium Schreb ) از این جنس در اکثر مناطق استان (دالاهو، اسلام آبادغرب، گیلان­غرب، صحنه، سرپل­ذهاب و روانسر) رویش دارد (22). از 2000 سال پیش تا کنون، گونه­های مختلف L.  Teucriumگیاه دارویی شناخته شده و از آن به عنوان ضد تشنج، ضد التهاب، ضد درد، تب بر و التیام دهندگی زخم استفاده می­گردد (22). آگاهی دقیق از تنوع ژنتیکی موجود در ژرم‌پلاسم گیاهی ضمن حفظ ذخائر ژنتیکی گیاهی، قابلیت استفاده از آنها را در برنامه‌های اصلاحی تعیین می‌کند. همچنین کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی نسبی بین افراد و جمعیتها و روابط خویشاوندی بین آن‌ها، امکان سازماندهی ژرم‌پلاسم و تهیه جمعیتهای مناسب برای ترسیم نقشه ژنتیکی و مکان­یابی ژنها را فراهم می‌سازد (28). بیشتر به‌نژادگران معتقدند که کمبود تنوع ژنتیکی پیشرفتهای اصلاحی را در آینده مختل می‌کند (20). ارزیابی تنوع ژنتیکی در گیاهان برای برنامه‌های اصلاحی و حفاظت از ذخایر توارثی، حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در گونه گیاهی برای انتخاب والدین جهت رسیدن به هیبرید مناسب از اهمیت زیادی بر خوردار است (23). تنوع ژنتیکی می‌تواند به وسیله تخمین فاصله ژنتیکی با استفاده از اطلاعات شجره یا با استفاده از نشانگرهای مولکولی شناسایی شود (25). به ‌منظور تخمین این تنوع انواع مختلفی از سیستمهای نشانگری توسط به‌نژادگران گیاهی استفاده می‌شود که از جمله آنها می‌توان به نشانگرهای مورفولوژیکی و مولکولی شامل بیوشیمیایی و DNA اشاره کرد. نشانگرهای DNA امکان شناسایی مستقیم تنوع توالی ژنومی را در بین گیاهان فراهم می‌کنند که می‌تواند در تکمیل اطلاعات شجره‌نامه مورد استفاده قرار گیرند (24). نشانگر مولکولی SCoT یا کدونهای آغاز هدف واقع شده، روشی است که در آن پرایمرها بر اساس توالیهای آغازگر (ATG) طراحی شده و نواحی بین کدونهای آغازگر طی واکنش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر می­شود و تفاوتها آشکار می­شود (9). از نشانگر مولکولی SCoT در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی مانند جاتروفا (.L Jatropha curcas) و کاکوتی (L. Ziziphora tenuior) استفاده شده است که در مقایسه با نشانگرهای RAPD و ISSR تنوع ببشتری را نشان داده است (13 و 30).  هدف از این تحقیق شناسایی تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپهای مریم نخودی با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT در راستای بهبود ذخایر ژنتیکی کشور می­باشد.

مواد و روشها

در تحقیق انجام شده بذرهای 17 ژنوتیپ از گیاه دارویی مریم نخودی (T. polium L.) پس از شناسایی توسط کارشناسان بخش تحقیقات منابع طبیعی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه، جمع­آوری و پس از ثبت در هرباریوم این مرکز به منظور استخراج DNA در گلدان کشت گردید (جدول 1 و شکل 1).

 

شکل 1- محل جمع­آوری ژنوتیپهای مورد بررسی

استخراج DNA به روش CTAB تغییر یافته (6) برای هر ژنوتیپ در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه پیام نور مرکز کرمانشاه انجام گرفت. بعد از انتقال ۲۰ تا ۵۰ میلی­گرم نمونه خرد شده با ازت مایع به تیوب، ۸۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج (۴ گرم CTAB، ۳۶/۱۶ گرم NaCl، ۱۵/۳ گرم Tris-HCl، ۴۸/۱ گرم EDTA، ۴۰۰ میکرولیتر b-mercaptoetchanol در ۸=pH به حجم 100 میلی­لیتر) به تیوبها اضافه شد و به مدت یک ساعت نمونه­ها در حمام آبی با دمای ۶۵ درجه سانتی گراد قرار داده شدند. سپس به هر نمونه مقدار ۸۰۰ میکرولیتر محلول کلروفرم-ایزوآمیل الکل (24:1) اضافه گردید و به مدت 20 دقیقه خوب به هم زده شد تا محلول داخل تیوپ یکنواخت شود. پس از آن نمونه­ها را به مدت ۱۰ دقیقه با ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه، سانتریفیوژ و فاز رویی به یک تیوب تمیز منتقل گردید و به هر تیوب مقدار ۶۰۰ میکرولیتر محلول ایزوپروپانول سرد اضافه­ و به مدت یک ساعت در فریزر در دمای ۲۰- درجه قرار­داده شدند. سپس تیوبها به مدت ۱۵ دقیقه با ۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ­ گردید و بعد از آن فاز مایع به آرامی خالی و به هر تیوب مقدار ۶۰۰ میکرولیتر اتانول 80 درصد سرد اضافه و یک سانتریفیوژ کوتاه صورت گرفت و به آرامی فاز مایع خالی شد (این مرحله دو بار تکرار شد) در پایان نیز تیوبها در دمای اتاق قرار گرفتند تا خشک شوند و بعد به هر تیوب میزان ۱۰۰ میکرولیتر آب دو بار تقطیر استریل اضافه ­گردید. بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل ۸/۰ درصد آگارز و دستگاه اسپکتوفتومتر صورت گرفت. واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلی مولار MgCl2، 05/0 میلی­مولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به مقدار x1) انجام شد.

 

جدول 1- مشخصات ژنوتیپهای مورد استفاده در تحقیق

ارتفاع سطح دریا (متر)

طول جغرافیایی

عرض جغرافیایی

منطقه جمع آوری

کد ژنوتیپ

ژنوتیپ

1750

47

41

51

34

29

64

صحنه1

Te.p Ksh-Sah1

G1

600

46

31

00

34

15

60

سرپل1

Te.p Ksh-Sar1

G2

550

45

54

32

33

57

18

سومار

Te.p Ksh-Som

G3

1750

46

51

22

34

31

12

روانسر1

Te.p Ksh-Rav1

G4

1800

46

02

11

34

36

63

سرپل2

Te.p Ksh-Sar2

G5

870

46

00

27

34

25

08

سرپل3

Te.p Ksh-Sar3

G6

1450

46

18

21

33

57

58

گیلان غرب1

Te.p Ksh-Gil1

G7

1700

46

10

26

34

11

49

دالاهو1

Te.p Ksh-Dal1

G8

1700

46

10

26

34

11

49

دالاهو2

Te.p Ksh-Dal2

G9

365

45

36

31

34

21

49

نفت شهر

Te.p Ksh-Naf

G10

1570

46

12

70

34

17

67

دالاهو3

Te.p Ksh-Dal3

G11

1720

47

08

50

34

47

29

صحنه2

Te.p Ksh-Sah2

G12

1200

46

04

95

34

45

36

ثلاث1

Te.p Ksh-Sal1

G13

650

45

50

08

34

23

01

گیلان غرب2

Te.p Ksh-Gil2

G14

1700

46

33

39

34

21

31

اسلام آباد

Te.p Ksh-Esl

G15

1550

46

43

15

34

47

33

روانسر2

Te.p Ksh-Rav2

G16

1361

46

12

00

34

45

29

ثلاث2

Te.p Ksh-Sal2

G17

 

 

چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی­گراد و به مدت ۵ دقیقه و ۳۵ چرخه حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشت­سازی به ترتیب ۳۰  ثانیه و ۹۵ درجه سانتی­گراد، زمان اتصال آغازگر ۳۰ ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود (52 تا 60 درجه). همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی­گراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی­گراد انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد با بافر واکنش TBE یک درصد استفاده شد. به منظور تزریق نمونه در ژل، ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونه­گذاری به  DNA­های تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه به درون چاهکهای ایجاد شده در ژل آگارز بارگزاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت و سپس ژل را جهت رنگ­آمیزی در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرو­لیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت نمایان شده نوارها استفاده شد.

محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC= Polymorphic information content) از طریق فرمول  محاسبه شد، در اینجا p برابر با مجموع نوارهای هر لوکوس برای کلیه ژنوتیپ­ها است (8). همچنین شاخص نشانگری (MI= Marker Index) از رابطه MI= PIC × N×B به دست آمد که N تعداد کل باندها و β نسبت چندشکلی برای هر آغازگر بود (18). شاخص نسبت چندگانه مؤثر (EMR= Effective multiplex ratio) از رابطه EMR= NPB × β که از درصد چندشکلی (β) ضربدر تعداد نوارهای چند­شکل (NPB) به دست آمد (11) و قدرت تفکیک (RP= Resolving power) از رابطه RP=∑IB محاسبه گردید. RP=∑IB در رابطه [(IB=1-[2×(0.5-Pi و Pi نسبت افراد دارای نوار است (1). در پایان نیز داده­های حاصل، با استفاده از نرم افزارهای NTSYSpc 2.02e برای محاسبه ماتریس تشابه و آزمون مانتل (21)، DARwin 6 جهت تجزیه کلاستر و تجزیه به مؤلفه­های اصلی (16) وGenAlEx 6.2 برای تجزیه واریانس مولکولی (15) مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

بررسی پلی­مورفیسم: تنوع­ژنتیکی ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت که تنها 11 آغازگر دارای باندهای قابل امتیاز بودند. آغازگر­های SCoT در مجموع توانستند 48 باند تولید کنند که تنها یک باند همشکل مشاهده شد و سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 17 ژنوتیپ برابر 82/2 به دست آمد. آغازگرهای SC20،SC21  و   SC59با 6 باند بیشترین تعداد و آغازگر SC15 با 2 باند کمترین تعداد باند را تکثیر نمود. ژنوتیپ دالاهو3 بیشترین باند (30 باند) و ژنوتیپهای روانسر1 و دالاهو1 کمترین باند (11 باند) را در بین ژنوتیپهای مورد بررسی داشتند. شکل 2 الگوی باندی 17 ژنوتیپ مورد بررسی با استفاده از آغازگر ­ SC21را نشان می­دهد.

 

 

شکل 2- تصویر ژل الکتروفورزی 17 ژنوتیپ مورد بررسی برای آغازگر SC21

 

نتایج به دست آمده برای آغازگر­های استفاده شده در جدول 2 ارائه شده است. میانگین درصد چند شکلی در بین آغازگر­های مورد بررسی برابر 48/98 بود که درصد چند شکلی برای SC20 (33/83 درصد) و برای سایر آغازگرها میزان چند شکلی برابر 100 درصد بود. میانگین PIC در آغازگر­های مورد بررسی برابر 361/0 بود که بیشترین میزان PIC مربوط به آغازگرهای SC59 (44/0)، SC11 (44/0) و SC36 (42/0) بود که این آغازگرها بهتر از سایر آغازگر­ها بر اساس شاخص PIC توانست فاصله ژنتیکی ژنوتیپها را مشخص کند. آغازگر SC10 (29/0) با کمترین میزان PIC توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشت. میانگین شاخص RP برابر 837/2 بود که آغازگرهای SC59 (41/5) و SC11 (71/4) بیشترین میزان و آغازگر SC15 دارای کمترین میزان بود. همچنین میانگین شاخصهای MI و EMR به ترتیب برابر 52/1 و 19/4 بود. بیشترین میزان MI را آغازگرهای   SC59و SC11 و کمترین میزان را آغازگرهای  SC15و SC10 داشتند. همچنین برای شاخص EMR بیشترین میزان را آغازگرهای  SC59 و SC21 و کمترین میزان را آغازگر SC15 داشت.

 

جدول 2 – درصد چندشکلی، تعداد کل باند، محتوای اطلاعات چندشکلی، شاخص نشانگری، نسبت چندگانه مؤثر و شاخص قدرت تفکیک در آغازگرهای مورد بررسی

 

 


بررسی میزان تشابه ژنتیکی بین ژنوتیپها: تشابه ژنتیکی ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 10/0 تا 732/0 متغیر بود (جدول 3). بیشترین تشابه را ژنوتیپهای (گیلان غرب2) با (ثلاث2) (732/0) و کمترین تشابه را ژنوتیپ (نفت شهر) با ژنوتیپهای (گیلان غرب1) و (گیلان غرب2) (10/0) داشت. نمودار توزیع فراوانی نشان داد که بیشترین فاصله در بین ژنوتیپها در محدوده 60/0 و کمترین فاصله در 95/0 می­باشد (شکل 3).

 

جدول 3 – ماتریس مشابه ژنوتیپ ها برای پرایمرهای SCoT استفاده شده بر اساس ضریب دایس

 

 

شکل3–  نمودار توزیع فراوانی فواصل ژنتیکی بین ژنوتیپهای مورد بررسی


تجزیه خوشه­ای: دندرو­گرام حاصل از تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس برای ژنوتیپها در شکل 4 ارائه شده است. همچنان که ملاحظه می­گردد ژنوتیپها در 2 گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل ژنوتیپهای (روانسر1)، (سرپل2)، (دالاهو1)، (نفت شهر) و (اسلام آباد) بود. میانگین تشابه در این گروه برابر 420/0، که بیشترین تشابه را ژنوتیپ سرپل2 با اسلام آباد و کمترین تشابه را ژنوتیپ نفت شهر با اسلام آباد در این گروه داشتند. در گروه دوم شامل 12 ژنوتیپ (صحنه1)، (سرپل1)، (سومار)، (سرپل3)، (گیلان غرب1)، (دالاهو2)، (دالاهو3)، (صحنه2)، (ثلاث1)، (گیلان غرب2) و (ثلاث2) قرار گرفتند. میانگین تشابه در این گروه برابر 409/0، که بیشترین تشابه را ژنوتیپ (صحنه1) با (سرپل1) و کمترین تشابه را ژنوتیپ (گیلان غرب2) با (ثلاث2) در این گروه داشتند.


 

شکل 4- دندروگرام حاصل از داده­های نشانگر SCoT برای ژنوتیپهای مریم نخودی، اعداد روی شکل نشان دهنده روابط و تشابه ژنتیکی ژنوتیپهای مورد بررسی با یکدیگر می­باشد


تجزیه به مؤلفه­های اصلی (PCoA= Principal components analysis): بر اساس داده­های حاصل از آغازگر­های مورد بررسی تجزیه به مؤلفه­های اصلی برای ژنوتیپها انجام شد، که نتایج نشان داد محور مؤلفه­های اول و دوم به ترتیب 55/23 و 20/19 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 75/42 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مؤلفه­های اول و دوم دیاگرام پراکنشی ژنوتیپها رسم گردید (شکل 5)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشه­ای و ماتریس تشابه کاملاً مطابقت داشت و ژنوتیپها به دو گروه تقسیم شدند به نحوی که ژنوتیپهایی که دارای بیشترین تشابه در ماتریس تشابه بودند و در تجزیه خوشه­ای نیز در کنار یکدیگر قرار گرفته بودند، در تجزیه به مؤلفه­های اصلی نیز در کنار یکدیگر قرار گرفتند.

 

 

شکل 5- بای پلات ژنوتیپها برای نشانگر SCoT بر اساس محور مؤلفه­های اصلی اول و دوم


تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA= Molecular variance analysis): تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروه­بندی تجزیه خوشه­ای انجام شد (جدول 4)، که ژنوتیپها در داخل 2 گروه قرار گرفتند بر اساس آماره PhiPT در بین گروهها در سطح 5 درصد اختلاف معنی­دار وجود داشت به عبارت دیگر گروه­بندی به صورت صحیح انجام گرفته است. نتایج به دست آمده نشان داد که در درون گروهها تنوع بیشتر از بین گروهها می­باشد. بر این اساس تنوع در درون گروهها برابر 76 درصد و در بین گروهها تنوع برابر 24 درصد مشاهده گردید.

 

 

 

جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگر SCoT

منابع تغییرات

درجه آزادی

مجموع مربعات

میانگین مربعات

واریانس برآورد شده

درصد از واریانس

PhiPT

S.O.V

Df

SS

MS

Est. Var.

Var%

بین گروه­های کلاستر

1

219/26

219/26

562/2

24%

*24/0

درون گروه­های کلاستر

15

017/122

134/8

134/8

76%

 

کل

16

235/148

 

696/10

100%

 

*  اختلاف در سطح 5% معنی­دار

               


بحث و نتیجه گیری

همانطور که در قسمت نتایج نشان داده شد، با استفاده از آغازگر­های SCoT تنوع قابل ملاحظه­ای در بین ژنوتیپهای مریم نخودی (.T. polium L) وجود داشته و چند شکلی مطلوبی بر اساس مارکر SCoT در بین ژنوتیپها مشاهده شد.Noruzi Gharatape و همکاران (2012) به منظور بررسی ساختار و مقایسه تنوع ژنتیکی 77 فرد از 8 توده مختلف گیاه دارویی مریم نخودی (T. polium L.) از نشانگرهای ISSR استفاده کردند، 18 آغازگر مورد استفاده در آن مطالعه 198 مکان قابل امتیاز تولید نمودند که از این تعداد 184 مکان چند شکل بودند (14). میانگین درصد چند شکلی در بین آغازگر­های مورد بررسی برابر 48/98 بود. براساس نتایج این مطالعه با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT درصد چندشکلی بالایی مشاهده گردید، این نتایج با مطالعات دیگری که با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT بر روی نخود (Cicer. Sp)، انبه (.Mangifera indica L) و رمی (Boehmeria nivea L. Gaudich) انجام گردیده مطابقت داشت (2، 12 و 19). محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC)، یکی از شاخصهای مهم جهت مقایسه نشانگرهای مختلف، از نظر قدرت تمایز آنها به شمار می­رود. مقادیر بالای این معیار، دلالت بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه نشانگری داشته که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد. بنابراین، نشانگرهایی با محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) بالا برای تمایز ژنوتیپهای خویشاوندی نزدیک مفید هستند (27). این شاخص از صفر تا نیم در نشانگرهای غالب متغیر است و هرچه این عدد بزرگتر باشد بیانگر بالا بودن قابلیت پرایمر یا مارکر مورد استفاده در غربال نمودن ژنوتیپهاست. بهترین شاخص برای انتخاب پرایمر مناسب، شاخص قدرت تفکیک (RP) می­باشد، زیرا هم از تعداد افراد دارای باند و هم تعداد آلل تاثیر پذیری دارد (1). در حالت کلی و بر اساس کلیه شاخصهای مورد بررسی در این مطالعه مناسب­ترین آغازگر­ها برای بررسی­ گونه مریم نخودی (T. polium L.)، آغازگرهای SC59 و SC11 تعیین شد، که پیشنهاد می­گردد برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم دیگر ژنوتیپهای این گونه در تحقیقات بعدی استفاده گردند. Esfandiary و همکاران (2017) در بررسی تنوع ژنتیکی برخی از اکوتیپهای مختلف مریم نخودی (T. polium L.) با استفاده از نشانگر ISSR بر اساس شاخصهای درصد چندشکلی، قدرت تفکیک (RP) و محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) آغازگرهای برتر را جهت آنالیز ژرم­پلاسم این گونه معرفی نمودند (7).

میانگین تشابه بین ژنوتیپها در این مطالعه برابر 420/0 بود که پایین بودن تشابه ژنتیکی یاد شده نشان­دهنده تنوع­ژنتیکی خوب و قابل قبولی در بین ژنوتیپهای مریم نخودی (T. polium L.) بر اساس آغازگر­های مورد بررسی می­باشد. که این موضوع می­تواند به سبب طول بلند آغازگرهای SCoT و تکثیر انتخابی­تر باشد. هیبریداسیون بین ژنوتیپها با فاصله ژنتیکی زیاد می­تواند یک روش مناسب برای برنامه­های اصلاحی در این گیاه دارویی باشد. از آنجایی که نشانگر مولکولی SCoT تنوع را براساس مناطق ژنی نشان می­دهد (تکثیر نواحی با کدون آغاز)، استفاده از نتایج این تحقیق برای تلاقی نمونه­های با فواصل زیاد ژنتیکی در جهت هتروزیس به منظور اصلاح و افزایش ترکیبات می­تواند بسیار مؤثر باشد. با توجه به تنوع ژنتیکی بالای درون ژنوتیپهای مریم نخودی
(T. polium L.) غرب کشور، حفاظت در محل رویشگاه نمونه­ها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و و ایجاد بانک ژرم پلاسم و استفاده از روشهای تکثیر مناسب این گیاه توصیه می­شود.

در این تحقیق برای مشخص کردن  بهترین شاخص تشابه و تشخیص بهترین الگوریتم برای ترسیم مناسب­ترین دندروگرام برای گزارش نتایج، شاخصهای تشابه شامل دایس و جاکارد با روشهای اتصال میانگین (UPGMA) و اتصال مجاور (NJ) محاسبه و بر اساس ضرایب کوفنتیک حاصل از آزمون مانتل مقایسه شدند. با توجه به نتایج به دست  آمده الگوریتم UPGMA و شاخص دایس در آزمون مانتل ضریب کوفنتیک بالاتری نشان داد (91 درصد). همچنان که ملاحظه می­گردد ژنوتیپها در 2 گروه قرار گرفتند. Pesaraklu و همکاران (2012) در بررسی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیتهای مریم نخودی (T. polium L.) ایران با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD تنوع مطلوبی را در بین جمعیتهای مورد بررسی مشاهده و گزارش نمودند که این نشانگر کارآیی بالایی در تفکیک کردن جمعیتها از یکدیگر دارد به صورتی که تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تا حدودی تطبیق داشت (17). همچنین Boussaid و همکاران (2010) نیز با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت گیاه مریم نخودی (T. polium L.) را در کشور تونس مورد بررسی قرار داده و تنوع ژنتیکی بالایی درون جمعیت این گیاه به دست آوردند (3).

از تجزیه به مؤلفه­های اصلی به عنوان روشی مکمل برای تجزیه خوشه­ای که منجر به استفاده بهینه و استخراج حداکثر اطلاعات از داده­های مولکولی می­شود استفاده می­گردد. در مجموع 75/42 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید، این موضوع به نوبه خود مـی­تــواند نشان دهنـده پراکــنش گستــرده آغــازگــرهای مختـلف بـــر روی ســطح ژنــوم و همه کروموزوم­های مریم نخودی (T. polium L.) باشد. میزان توجیه مؤلفه اول و دوم در این تحقیق با نتایج Zamani  و همکارن (2010) مطابقت داشت (30). در بررسی Tabtib (2014) بر روی 8 جمعیت گونه Teucrium polium با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR تنوع بالایی بر اساس آغازگرهای مورد بررسی مشاهده و از تجزیه کلاستر و تجزیه به مؤلفه­های اصلی برای گروه بندی جمعیتها استفاده شد (26).

همچنین از کاربرد­های تجزیه واریانس مولکولی می­توان در تعیین تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها و تعیین حد مطلوب خوشه در تجزیه خوشه­ای اشاره کرد، به این صورت که در هر گروه در نقطه برش دندروگرام به عنوان یک جمعیت و جمعیتهای درون آن به عنوان افراد جمعیت در نظر گرفته می­شود و برای هر نقطه برش یک تجزیه واریانس انجام گیرد. نقطه­ای که بیشترین تمایز بین گروهها به وجود آید، به عنوان نقطه مناسب برش دندروگرام انتخاب خواهد شد. نتایج به دست آمده نشان داد که در درون گروهها تنوع بیشتر از بین گروهها می­باشد. بر این اساس تنوع در درون گروهها برابر 76 درصد و در بین گروهها تنوع برابر 24 درصد مشاهده گردید. در مطالعه Tabtib (2014) بر روی 8 جمعیت مریم نخودی (T. polium L.) نتایج تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که تنوع در درون جمعیتها بیشتر از بین جمعیتها می­باشد، به صورتی که تنوع در درون جمعیتها برابر 77 درصد و در بین جمعیتها برابر 23 درصد گزارش گردید (26). در بررسی Zamani و همکاران (2016) بر روی کاکوتی (Ziziphora tenuior L.) با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT تنوع بین جمعیتها 11 درصد و درون جمعیتها 89 درصد گزارش گردید (29).

 

سپاسگزاری

این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه پیام نور انجام شده است. که از این بابت از مسئولان مربوطه تشکر و قدردانی می­شـود. در ضمن کلیه حقوق مادی و معنوی آن متعلق به دانشگاه پیـام نـور می­باشد.

1- Altıntas, S., Toklu, F., Kafkas, S., Kilian, B., Brandolini, A., and Zkan, H.O. (2008). Estimating genetic diversity in durum and bread wheat cultivars from Turkey using AFLP and SAMPL markers. Plant Breeding, 127: 9-14.
2- Amirmoradi, B., Talebi, R., and Karami, E. (2012). Comparison of genetic variation and differentiation among annual Cicer species using start codon targeted (SCoT) polymorphism, DAMD-PCR, and ISSR markers. Plant Systema tics and Evolution, 298:1679-1688.
3- Boussaid, M., Boulia, A., Bejaui, A., and Messaoud, C. (2010). Genetic diversity and population structure of Teucrium polium (Lamiaceae) in Tunisia. Biochemical Genetics, 48:57-70.
4- Canter, P. H., Thomas, H., and Ernst, E. (2005). Bringing medicinal plants into cultivation: Opportunities and challenges for biotechnology. Trends in biotechnology, 23(4):180-185.
5- Collard, B.C.Y., and Mackill, D.J. (2009). Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants. Plant Molecular Biology Reporter, 27:86–93.
6- Doyle, J.J., and Doyle J.L. (1987). A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissues. Phytochem Bull, 19:11–15.
7- Esfandyari, S., Farshadfar, M., Safari, H., Shirvani, H., and Esfandyari, S. (2017). Genetic variability of Teucrium polium ecotypes using ISSR molecular markers. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 25 (1): 135-147. (In Farsi).
8- Hou, Y., Yan, Z., and Wei, Y. (2005). Genetic diversity in barely from west China based on RAPD and ISSR analysis Barely. Genetics Newsletter, 35:9-22.
9- Kalendar, R. (2007). FastPCR: a PCR primer design and repeat sequence searching software with additional tools for the manipulation and analysis of DNA and protein. Available at www.biocenter.helsinki.fi/programs/fastpcr.htm; 2007.
10- Kumar, J., and P. Gupta, K. (2008). Molecular approaches for improvement of medicinal and aromatic plants. Plant Biotechnology Reports, 2:93-112.
11- Kumar, M., Mishra, G P., Singh, R., Kumar, J., Naik, P K., and Singh Sh.B. (2009). Correspondence of ISSR and RAPD markers for comparative analysis of genetic diversity among different apricot genotypes from cold arid deserts of Trans-Himalayas. Physiology and Molecular Biology of Plants, 15(3): 225-236.
12- Luo, C., He, X. H., Chen, H., Hu, Y., and Ou, S.-J. (2012). Genetic relationship and diversity of Mangifera indica L.: revealed through SCoT analysis. Genetic Resources and Crop Evolution, 59:1505-1515.
13- Mulpuri, S., Muddanuru, T., and Francis, G. (2013). Start codon targeted (SCoT) polymorphism in toxic and non-toxic accessions of Jatropha curcas L. and development of a codominant SCAR marker. Plant Science, 207:117-127.
14- Noruzi Gharatape, R., Bernusi, I., Moghadam, A.F., Abdollahi Mandulakani, B., and Jafari, M. (2012). Assessment of genetic diversity in different masses of medicinal plant Teucrium polium using ISSR markers. The 12th Iranian Genetics Congress, Tehran, Iran. (In Farsi).
15- Peakall, R., and Smouse, P.E. (2006). GENALEX 6: Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes. 6:288-295.
16- Perrier, X., and Jacquemoud-Collet, JP. (2006). DARwin soft ware, http://darwin.cirad.fr/darwin
17- Pesaraklu, A., Mianabadi, M., Bagherieh, Najjar MB., Sattarian, A., and Baghizadeh, A. (2013). Genetic diversity of different populations of Iranian Teucrium polium L. using RAPD markers. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 21 (1): 24-36.(In Farsi).
18- Powell, W., Morgante, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogel, J., Tingey, S., and Rafalski, A. (1996). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding, 2: 225-238.
19-  Pratik, S., Maya, K., Sourav, J., Sabyasachi, M., Amit, S.,  Karmakar, P.G., and Ray, D.P. (2015). Start codon targeted (SCoT) polymorphism reveals genetic diversity in wild and domesticated populations of ramie (Boehmeria nivea L. Gaudich.), a premium textile fiber producing species. Meta Gene, 3:62-70.
20- Rajaram, S. (2010). International wheat breeding. The Proceeding of 11th Iranian Crop Science Congress: Crop Production, Pp: 225-238.
21- Rohlf, F., and Taxonomy, N. P.N. (1998). Multivariate Analysis System, Version 2.02. New York: Exeter Software, Applied Biostatistics Inc.
22- Sajadi, S.E., and Shokouhinia, Y. (2010). Composition of the essential oil of Teucrium chamaedrys L. subsp syspirense (c. koch) growing wild in Iran. Journal of essential oil bearing plants, 13(2):175-180.
23- Singh, S.K. (2003). Cluster analysis for heterosis in wheat (Triticum aestivum L.). Indian Journal of Genetics. 63(3):249-250.
24- Solimani, V.D., Baum, B. R., and Jahason, D.A. (2002). AFLP and pedigree based genetic diversity estimates cultivars of durum wheat (Triticum turgidum L.). Theoretical and Applied Genetics, 104:350-357.
25- Stachel, M., Lelley, T., Grausgruber, H., and Vollmann, J. (2000). Application of microsatellites in wheat (Triticum aestivum L.) for studying genetic differentiation caused by selection for adaptation and use. Theoretical and Applied Genetics, 100:242–248.
26- Tabtib, B. (2014). Assessment of genetic differentiation of two Mediterranean subspecies of Teucrium. Bulletin of the Georgian national academy of sciences, 8(1):72-76.
27- Thimmappaiah, W., Santhosh, G., Shobha, D., and Melwyn, GS. (2008). Assessment of genetic diversity in cashew germplasm using RAPD and ISSR markers. Sciatica Horticulture, 118: 1-7.
28- Virk, P. S., Ford-Lloyd, B. V., Jackson, M.T., and Newbury, H. J. (1995). Use of RAPD for the study of diversity within plant germplasm collections. Heredity, 74: 170-179.
29- Zamani, N., Zamani, W., and Mirzaei, K. (2016). Genetic diversity analysis of Ziziphora tenuior L. using SCoT markers. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 24 (2): 176-189. (In Farsi).